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Neuroscience

मस्तिष्क संरचनाओं को लक्षित करने और केमोजेनेटिक न्यूरोमॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने के लिए केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रेरित रक्त-मस्तिष्क बाधा खोलना

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61352
Automatic Translation
1, 1
1Department of Bioengineering, Rice University

Summary

यह प्रोटोकॉल केंद्रित अल्ट्रासाउंड रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) खोलने, परिणामी जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन और हिस्टोलॉजिकल परीक्षणों के माध्यम से केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स की न्यूरोमॉड्यूलेशन गतिविधि के माप के माध्यम से जीन वितरण के लिए आवश्यक कदमों को चित्रित करता है।

Abstract

ध्वनिक रूप से लक्षित केमोजेनेटिक्स (एटीएसी) विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के गैर-आक्रामक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। एटीएसी केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) प्रेरित रक्त-मस्तिष्क बाधा खोलने (एफयूएस-बीबीबीओ), एडेनो से जुड़े वायरल (एएवी) वैक्टर के साथ जीन वितरण, और इंजीनियर, केमोजेनेटिक, प्रोटीन रिसेप्टर्स और उनके आत्मीय लिगेंड के साथ सेलुलर सिग्नलिंग के सक्रियण के संयोजन के माध्यम से इस तरह के नियंत्रण को प्राप्त करता है। एटीएसी के साथ, एकल नॉनइनवेसिव अल्ट्रासाउंड एप्लिकेशन का उपयोग करके मिलीमीटर परिशुद्धता के साथ बड़े और छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों दोनों को ट्रांसड्यूस करना संभव है। यह पारगमन बाद में एक दवा का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में दीर्घकालिक, गैर-आक्रामक, डिवाइस-मुक्त न्यूरोमॉड्यूलेशन की अनुमति दे सकता है। चूंकि एफयूएस-बीबीबीओ, एएवी और केमोजेनेटिक्स का उपयोग कई जानवरों में किया गया है, इसलिए एटीएसी को अन्य पशु प्रजातियों में उपयोग के लिए स्केलेबल भी होना चाहिए। यह पेपर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर विस्तार करता है और बताता है कि एमआरआई-मार्गदर्शन के साथ छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों में एफयूएस-बीबीबीओ के साथ जीन वितरण को कैसे अनुकूलित किया जाए, लेकिन जटिल एमआरआई-संगत एफयूएस डिवाइस की आवश्यकता के बिना। प्रोटोकॉल, माउस लक्ष्यीकरण और संयम घटकों के डिजाइन का भी वर्णन करता है जो किसी भी प्रयोगशाला द्वारा 3 डी-मुद्रित किया जा सकता है और विभिन्न प्रजातियों या कस्टम उपकरणों के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। प्रजनन क्षमता में सहायता के लिए, प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि एटीएसी विकास में माइक्रोबबल, एएवी और वेनिपंक्चर का उपयोग कैसे किया गया था। अंत में, एटीएसी का उपयोग करने वाले अध्ययनों की प्रारंभिक जांच का मार्गदर्शन करने के लिए एक उदाहरण डेटा दिखाया गया है।

Introduction

सर्किट-विशिष्ट न्यूरोमॉड्यूलेशन प्रौद्योगिकियों का उपयोग, जैसे कि ऑप्टोजेनेटिक्स1,2 और केमोजेनेटिक्स 3,4,5, ने न्यूरोनल-सर्किट विकारों के रूप में मनोरोग स्थितियों की हमारी समझ को उन्नत किया है। न्यूरोनल सर्किट का अध्ययन करना मुश्किल है और मस्तिष्क विकारों के इलाज में नियंत्रित करना और भी कठिन है क्योंकि वे आमतौर पर विशिष्ट सेल प्रकार, मस्तिष्क क्षेत्रों, आणविक सिग्नलिंग मार्गों और सक्रियण के समय द्वारा परिभाषित होते हैं। आदर्श रूप से अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए, इस तरह के नियंत्रण को गैर-आक्रामक रूप से लागू किया जाएगा, लेकिन सटीक और गैर-आक्रामक न्यूरोमॉड्यूलेशन दोनों को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, जबकि न्यूरोएक्टिव दवाएं मस्तिष्क तक गैर-आक्रामक रूप से पहुंच सकती हैं, उनमें पूरे मस्तिष्क में अभिनय करके स्थानिक विशिष्टता की कमी होती है। दूसरी ओर, विद्युत गहरे मस्तिष्क उत्तेजना विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को नियंत्रित कर सकती है लेकिन विशिष्ट सेल प्रकारों को नियंत्रित करने में कठिनाई होती है और सर्जरी और डिवाइस प्लेसमेंट की आवश्यकता होतीहै।

ध्वनिक रूप से लक्षित केमोजेनेटिक्स7 (एटीएसी) स्थानिक, सेल-प्रकार और लौकिक विशिष्टता के साथ न्यूरोमॉड्यूलेशन प्रदान करता है। यह तीन तकनीकों को जोड़ती है: स्थानिक लक्ष्यीकरण के लिए केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रेरित रक्त-मस्तिष्क बाधा उद्घाटन (एफयूएस-बीबीबीओ), सेल-प्रकार के विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में जीन को गैर-प्रमुख रूप से वितरित करने के लिए एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (एएवी) का उपयोग, और दवा प्रशासन के माध्यम से चुनिंदा रूप से ट्रांसक्रिप्टेड तंत्रिका सर्किट को संशोधित करने के लिए केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स को इंजीनियर करना। एफयूएस एक एफडीए-अनुमोदित तकनीक है जो मिलीमीटर स्थानिक परिशुद्धता के साथ मानव मस्तिष्क सहित ऊतकों के भीतर गहराई से ध्यान केंद्रित करने की अल्ट्रासाउंड की क्षमता का लाभ उठाती है। उच्च शक्ति पर, एफयूएस का उपयोग गैर-आक्रामक लक्षित पृथक्करण के लिए किया जाता है, जिसमें आवश्यक कंपकंपी8 के लिए एफडीए-अनुमोदित उपचार शामिल है। एफयूएस-बीबीबीओ कम तीव्रता वाले अल्ट्रासाउंड को व्यवस्थित रूप से प्रशासित माइक्रोबबल के साथ जोड़ता है, जो अल्ट्रासाउंड फोकस पर रक्त वाहिकाओं में झूलता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीयकृत, अस्थायी (6-24 घंटे) और बीबीबी9 का प्रतिवर्ती उद्घाटन होता है। यह उद्घाटन प्रोटीन 9,10, छोटे अणु11, और वायरल वैक्टर 7,12,13,14 को कृन्तकों 10 और गैर-मानव प्राइमेट्स 15 में महत्वपूर्ण ऊतक क्षति के बिना मस्तिष्क में वितरण की अनुमति देता है। एफयूएस-बीबीबीओ16,17 के लिए नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं, जो इस तकनीक के संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों को दर्शाता है।

एएवी का उपयोग करके वायरल जीन डिलीवरी भी सीएनएस विकारों के लिए नैदानिक उपयोग में तेजी से आगे बढ़ रही है, हाल ही में एफडीए और यूरोपीय संघ के नियामक अनुमोदन प्रमुख मील के पत्थर के रूप में हैं। अंत में, केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स18, जैसे डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर ड्रग्स (डीआरईडी) द्वारा सक्रिय, न्यूरोसाइंटिस्टों द्वारा ट्रांसजेनिक या ट्रांसेटेडजानवरों में न्यूरोनल उत्तेजना पर औषधीय नियंत्रण प्रदान करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। डीआरईडीडी जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) हैं जिन्हें आनुवंशिक रूप से अंतर्जात लिगेंड के बजाय सिंथेटिक केमोजेनेटिक अणुओं का जवाब देने के लिए इंजीनियर किया गया है, जैसे कि इन लिगेंड का प्रणालीगत प्रशासन खूंखार-व्यक्त न्यूरॉन्स की उत्तेजना को बढ़ाता है या कम करता है। जब इन तीन तकनीकों को एटीएसी में जोड़ा जाता है, तो उनका उपयोग स्थानिक, सेल-प्रकार और अस्थायी परिशुद्धता के साथ चयनित तंत्रिका सर्किट के नॉनइनवेसिव मॉड्यूलेशन के लिए किया जा सकता है।

यहां, हम सरल 3 डी मुद्रित लक्ष्यीकरण उपकरण का उपयोग करके चूहों में एफयूएस-बीबीबीओ के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों के सटीक लक्ष्यीकरण के लिए कार्यप्रणाली को शामिल करके एफयूएस-बीबीबीओ11 के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का विस्तार और अद्यतन करते हैं। हम, एटीएसी को एफयूएस-बीबीबीओ का एक आवेदन भी दिखाते हैं। हम केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स को ले जाने वाले एएवी के वितरण के लिए आवश्यक कदम दिखाते हैं, और हिस्टोलॉजी द्वारा जीन अभिव्यक्ति और न्यूरोमॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करते हैं। यह तकनीक जीन अभिव्यक्ति या न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए बड़े या कई मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए विशेष रूप से लागू होती है। उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स के एक विस्तृत क्षेत्र को आसानी से एफयूएस-बीबीबीओ के साथ ट्रांसड्यूस किया जा सकता है और केमोजेनेटिक्स का उपयोग करके मॉड्यूलेटेड किया जा सकता है। हालांकि, एक वैकल्पिक तकनीक, इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के साथ जीन वितरण के लिए बड़ी संख्या में इनवेसिव इंजेक्शन और क्रैनियोटॉमी की आवश्यकता होगी। FUS-BBBO और इसके अनुप्रयोग, ATAC, को विभिन्न आकारों के जानवरों तक बढ़ाया जा सकता है, जहां मस्तिष्क क्षेत्र बड़े होते हैं और आक्रामक रूप से लक्षित करने के लिए कठिन होते हैं।

Protocol

सभी प्रयोग कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किए गए थे, जहां डेटा मूल रूप से जेओएस द्वारा प्राप्त किया गया था।

1. पशु दोहन और छवि मार्गदर्शन हार्डवेयर का डिजाइन और 3 डी-प्रिंटिंग

  1. Szablowski प्रयोगशाला वेबसाइट से फ़ाइलों का उपयोग करें: घटकों के 3 डी-प्रिंटिंग के लिए https://www.szablowskilab.org/downloads ।
  2. सुनिश्चित करें कि मुद्रण सामग्री एमआरआई में कम संवेदनशीलता है लेकिन एमआरआई-दृश्यमान समर्थन है। सामग्री और अभिकर्मक अनुभाग में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों का विवरण देखें।
  3. सामग्री का बार-बार परीक्षण करके और पहनने की साइटों का अवलोकन करके कई उपयोगों के साथ सामग्री के क्षरण के लिए जिम्मेदार है जिसे प्रबलित किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि मुद्रित दीवारें कम से कम 2 मिमी मोटी हैं।
  4. लक्ष्यीकरण परिशुद्धता में सुधार करने के लिए उच्च परिशुद्धता 3 डी प्रिंटर का उपयोग करें।
  5. प्लास्टिक 3 डी मुद्रित घटकों के विचलन से बचने के लिए गुरुत्वाकर्षण और अन्य बलों का मुकाबला करें, घटकों को उनकी लंबाई के साथ समर्थन करके और यदि कोई झुकाव देखा जाता है तो 3 डी मुद्रित दीवारों की मोटाई बढ़ाएं।
  6. पूर्वकाल/पश्चवर्ती, मध्य/पार्श्व, पृष्ठीय/उदर, साथ ही याव, पिच और झुकाव सहित कई अक्षों में परिशुद्धता के लिए जिम्मेदार है।
  7. एफयूएस-बीबीबीओ प्रदर्शन करके और लक्षित स्थिति से विचलन रिकॉर्ड करके लक्ष्यीकरण की सटीकता का परीक्षण करें।
  8. यदि मोटरचालित स्टीरियोटैक्सिक सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो वीडियो पर एफयूएस-बीबीबीओ लक्ष्यीकरण प्रक्रिया को रिकॉर्ड करके सामग्री लोच पर गतिशील आंदोलन के प्रभावों का मूल्यांकन करें, और 3 डी मुद्रित सामग्री की दीवारों को मोटा करके किसी भी विचलन को सही करें।

2. अल्ट्रासाउंड प्रणाली विवरण

  1. आठ-तत्व वलयाकार सरणी ट्रांसड्यूसर (व्यास = 25 मिमी, प्राकृतिक फोकल बिंदु = 20 मिमी; एपर्चर (एफ) = 0.8)) के साथ एक अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करें और शेव माउस सिर पर जेल लगाकर डिगैस्ड अल्ट्रासाउंड जेल के साथ सिर को आवास दें।
    नोट: पिछले अध्ययन7 में उपयोग किए गए ट्रांसड्यूसर की केंद्र आवृत्ति 1.5 मेगाहर्ट्ज थी, पल्स अवधि 10 एमएस थी, और पल्स पुनरावृत्ति आवृत्ति 120 सेकंड से अधिक 1 हर्ट्ज थी। दबाव को ऑप्टिकल फाइबर हाइड्रोफोन का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था और 0.36-0.45 एमपीए के बीच बनाए रखा गया था। 1.5 मेगाहर्ट्ज और पार्श्विका हड्डी के लिए खोपड़ी21 के माध्यम से 18% ध्वनिक क्षीणन मान लें। एक सुरक्षित बीबीबी उद्घाटन और एएवी वितरण के लिए उपयुक्त शर्तों की सीमा को कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै 7,14,22.

3. पशु तैयारी

  1. मेडिकल-ग्रेड हवा के साथ 2% पर आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन का उपयोग करके एक माउस को एनेस्थेटाइज करें। प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के लिए एक स्पर्श चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। फिर, मलहम ट्यूब के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए एकल-उपयोग बाँझ क्यू-टिप का उपयोग करके कॉर्नियल सुखाने को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
    नोट: एफयूएस-बीबीबीओ की विशिष्ट प्रक्रिया 30 मिनट से 2 घंटे के बीच हो सकती है, और संज्ञाहरण को पूरे समय बनाए रखा जाना चाहिए।
  2. माउस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, हेपरिनाइज्ड सेलाइन (10 यू / एमएल) के साथ एक साफ कैथेटर धो लें।
    नोट: 25-35 ग्राम माउस के लिए एक उपयुक्त कैथेटर में 30 ग्राम सुई और पीई 10 ट्यूबिंग होती है।
  3. इसके बाद 70% इथेनॉल पैड के साथ माउस पूंछ कीटाणुरहित करें। पूंछ-नस कैथेटर को पार्श्व पूंछ की नस में रखें और इसे ऊतक गोंद के साथ सुरक्षित करें। इसके प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए कैथेटर में पूंछ की नस से रक्त के बैकफ्लो का निरीक्षण करें।
  4. माउस के सिर को शेव करें और फिर ऊतक गोंद सूखने के बाद डिपिलेशन क्रीम का उपयोग करें ताकि इंसोनेशन के दौरान अल्ट्रासोनिक जेल के नीचे हवा के बुलबुले फंसने की संभावना को कम किया जा सके।
  5. माउस को 3 डी-मुद्रित एमआरआई गाड़ी में रखें, सामने के दांतों को काटने की पट्टी पर और सिर को नाक के अंदर रखें (चित्रा 1 ए)।
  6. कुंद कान सलाखों से संपर्क करने वाली साइट पर चमड़े के नीचे 10 μL लिडोकेन तक इंजेक्ट करें। फिर, खोपड़ी पर कुंद सलाखों को सुरक्षित करें और दबाव की सुरक्षित मात्रा लागू करें, इस बात का ध्यान रखें कि श्वास नली पर दबाव लागू न करें क्योंकि यह सांस लेने में बाधा डालता है। यह पुष्टि करने के लिए 30 सेकंड के लिए श्वास का निरीक्षण करें कि जानवर 1/सेकंड की दर से स्वतंत्र रूप से सांस ले रहा है।
  7. लक्ष्यीकरण गाइड को कान की सलाखों से कनेक्ट करें, चरण 3.6 (चित्रा 1 बी) के रूप में श्वास की जांच करें, और हर मिनट प्रक्रिया के दौरान श्वास की निगरानी जारी रखें। 1/सेकंड से ऊपर एक श्वास दर एनेस्थीसिया के नुकसान के संकेतों में से एक है। हर 5 मिनट में पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी जारी रखें जब चूहे एमआरआई स्कैनर में नहीं होते हैं या यदि श्वास दर 1/सेकंड से ऊपर बढ़ जाती है।
  8. एमआरआई गाड़ी को एमआरआई धारक में स्थानांतरित करें और फिर एक चुंबक के बोर के अंदर।
    नोट: हार्डवेयर का डिज़ाइन 7 टी एमआरआई के अंदर 72 मिमी कॉइल के लिए अनुकूलित है।
  9. स्कैनर में माउस को स्थानीयकृत करने के लिए एक एमआरआई अनुक्रम प्राप्त करें।
  10. उपकरण निर्माता के विशिष्ट निर्देशों के अनुसार, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके मस्तिष्क की संपूर्णता प्राप्त करने के लिए 3 डी फास्ट लो एंगल शॉट (फ्लैश) अनुक्रम का चयन करें। इको समय: 3.9 एमएस, पुनरावृत्ति समय: 15 एमएस, उत्तेजना पल्स कोण: 15 डिग्री, मैट्रिक्स आकार: 130 x 130 x 114, रिज़ॉल्यूशन: 350 x 200 x 200 μm प्रति वोक्सेल, औसत: 1, अधिग्रहण समय: 3 मिनट 42s
  11. एमआरआई सिस्टम से एफयूएस सिस्टम को नियंत्रित करने वाले कंप्यूटर पर फ़ाइलों को स्थानांतरित करें।
  12. एमआरआई-निर्देशित लक्ष्यीकरण करने के लिए सॉफ़्टवेयर में इमेजिंग अनुक्रम खोलें, जहां छवि चित्र 1 सी के रूप में दिखाई देनी चाहिए।

4. एमआरआई-निर्देशित लक्ष्यीकरण

नोट: कस्टम-डिज़ाइन किए गए लक्ष्यीकरण गाइड के उपयोग के साथ, एमआरआई के भीतर अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर रखना आवश्यक नहीं है, न ही ब्रेग्मा और लैम्ब्डा लाइनों पर स्टीरियोटैक्स को शून्य करके लक्ष्यीकरण करने के लिए त्वचा को संक्रमित करना आवश्यक है। लक्ष्यीकरण प्रक्रिया निष्पादित करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.

  1. गाड़ी को एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के भीतर रखें। इसे डबल-साइडेड टेप के साथ एक धातु ब्लॉक का उपयोग करके और स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के दो समर्थन पदों के खिलाफ गाड़ी को दबाकर सुरक्षित करें।
  2. डेटा मैनेजर में फ़ाइलों का चयन करके, मेनू विकल्प लाने के लिए राइट-क्लिक करके और 'तुरंत स्थानांतरण' का चयन करके चल रहे एफयूएस मार्गदर्शन सॉफ़्टवेयर के साथ कंप्यूटर पर एमआरआई छवियों को स्थानांतरित करें।
  3. एफयूएस मार्गदर्शन सॉफ्टवेयर खोलें और 'ओपन सीक्वेंस' पर क्लिक करके और इमेजिंग अनुक्रम की सभी फ़ाइलों को लोड करके छवि लोड करें।
  4. राइट-क्लिक और 'रिफॉर्मेट' दबाकर छवि को तीन अक्षों में पुन: स्वरूपित करें।
  5. राइट-क्लिक करके ट्रांसड्यूसर को परिपत्र लक्ष्यीकरण गाइड (चित्रा 1 सी) में स्थानीयकृत करें।
  6. धनु दृश्य में, पानी के स्नान और ट्रांसड्यूसर आवास की मोटाई के लिए एक आभासी ट्रांसड्यूसर की ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करें (इस मामले में - 8.2 मिमी ऊपर की ओर, चित्रा 1 डी)।
  7. प्रक्षेपवक्र योजनाकार में लक्षित किए जाने वाले क्षेत्र को इंगित करें और एक स्प्रेडशीट में निर्देशांक नोट करें (इस मामले में - मिडब्रेन, जैसा कि चित्रा 1 डी में है)।
  8. लक्ष्यीकरण की वांछित गहराई में डायल करें (इलेक्ट्रॉनिक प्रक्षेपवक्र में जेड-मान (चित्रा 2) और स्प्रेडशीट में निर्देशांक नोट करें।
  9. 'सेंड ट्रैजेक्टरी' और 'निष्पादित' दबाकर प्रत्येक बिंदु को लक्षित करें (चित्रा 2)।
    नोट: यह तब किया जाता है जब एक माउस वाहक मोटर्स के अंदर रखा जाता है। हालांकि, एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर उच्च सटीकता के साथ एक ही लक्ष्यीकरण प्राप्त किया जा सकता है।
  10. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के साथ एमआरआई के निर्देशांक को सहसंबंधित करने के लिए, कस्टम-माउंटेड ट्रांसड्यूसर को एक लक्ष्यीकरण गाइड पर रखें और तब तक अनुवाद करें जब तक कि तीन लक्ष्यीकरण बोल्ट (चित्रा 3, तत्व ए) में से प्रत्येक ट्रांसड्यूसर धारक (चित्रा 3, तत्व बी) और लक्ष्यीकरण गाइड (चित्रा 3, तत्व सी) दोनों के माध्यम से नहीं जा सकता। सुनिश्चित करें कि बोल्ट तनाव या झुकाव में नहीं हैं।
  11. ट्रांसड्यूसर को पूर्वकाल / पीछे की दिशा में 10.56 मिमी आगे का अनुवाद करें जब तक कि यह उसी स्थान पर स्थित न हो जहां एमआरआई पर लक्ष्यीकरण गाइड का केंद्र दिखाई देता है।
  12. वर्चुअल ट्रांसड्यूसर (चित्रा 3 ए, तत्व ए) के केंद्र से लक्षित क्षेत्र (चित्रा 3 ए, तत्व बी) तक की दूरी निर्धारित करें, और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर को इन निर्देशांक में ले जाएं।
  13. इंजेक्शन समाधान की तैयारी के लिए आगे बढ़ें।

5. इंजेक्शन समाधान तैयारी

नोट: माइक्रोबबल समाधान दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। नतीजतन, पतली सुइयों के माध्यम से जोरदार मिश्रण या तेजी से इंजेक्शन माइक्रोबबल को ध्वस्त कर सकता है और बीबीबी खोलने की प्रभावकारिता को कम कर सकता है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोबबल पानी की तुलना में हल्के होते हैं और एक ट्यूब, कैथेटर या सिरिंज (चित्रा 4) के शीर्ष पर तैर सकते हैं उदाहरण के लिए, एक स्वचालित इंजेक्टर में। हर इंजेक्शन से तुरंत पहले माइक्रोबबल समाधान को फिर से निलंबित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

  1. 1.5 एमएल ट्यूब में सिरिंज का उपयोग करके 0.8 एमएल खारा निकालें।
  2. एक सिरिंज का उपयोग करके, उसी 1.5 एमएल ट्यूब में 0.1 एमएल एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट जोड़ें और मिलाएं।
  3. गैर-सक्रिय माइक्रोबबल23,24 समाधान को कमरे के तापमान पर लाएं।
  4. इनसोनेशन से ठीक पहले, माइक्रोबबल सक्रियण डिवाइस में 45 सेकंड के लिए माइक्रोबबल ्स को सक्रिय करें।
  5. धीरे-धीरे (~ 3 सेकंड से अधिक) तरल की मध्य गहराई से 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज और 21 ग्राम सुई का उपयोग करके 0.1 एमएल माइक्रोबबल ्स निकालें।
  6. चरण 5.3 में तैयार कंट्रास्ट एजेंट और खारा के घोल में 0.08 एमएल माइक्रोबबल जोड़ें। 15 सेकंड के लिए हाथ से टैप करके मिलाएं।
  7. एएवी की अंतिम सांद्रता शरीर के वजन (वीपी / जी) के प्रति ग्राम 0.5-2 x 1010 वायरल कणों के साथ, डिलीवरी के लिए कार्गो (इस मामले में एएवी 9) को पूंछ की नस कैथेटर में 30 ग्राम सुई के माध्यम से इंजेक्ट करें, एटीएसी - एएवी के मामले में केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स ले जाने वाले, या एक नकारात्मक नियंत्रण, जैसे कि जीएफपी को उसी प्रमोटर के तहत ले जाने वाले एएवी।
  8. फ्लोटेशन से बचने के लिए फिर से 15 सेकंड के लिए हाथ से माइक्रोबबल मिलाएं (चित्रा 4)।
  9. इसके तुरंत बाद, सुई संलग्न किए बिना एक सिरिंज के माध्यम से माइक्रोबबल समाधान के 200 μL को एस्पिरेट करें। सुई की कमी माइक्रोबबल पर कतरनी बलों को कम कर देगी।
  10. सिरिंज को उल्टा करें और प्लंजर को ऊपर और नीचे दबाकर मिलाएं।
  11. 30 ग्राम सुई संलग्न करें और, अभी भी उल्टे रहते हुए, धीरे-धीरे माइक्रोबबल ्स को बाहर धकेलें जब तक कि सुई के अंत में बूंदें दिखाई न दें।

6. इंसोनेशन प्रक्रिया

  1. इंसोनेशन के लिए पैरामीटर सेट करें: 10 एमएस पल्स अवधि, 120 दोहराव, हर एस, और खोपड़ी पर 0.30-0.45 एमपीए दबाव।
  2. लक्ष्यीकरण गाइड को हटा दें, और माउस सिर पर डिगैस्ड अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें, जिससे कोई बुलबुले न बनें।
  3. ट्रांसड्यूसर को कम करें और इसे सीधे कान बार धारक के फ्लैट पर रखें, और निर्देशांक में स्टीरियोटैक्सिक उपकरणों में डायल करें (चित्रा 5)।
  4. AAV (0.5-2 x 1010 VP / g) के समाधान को इंजेक्ट करें।
  5. 15 सेकंड के लिए माइक्रोबबल और एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट समाधान मिलाएं और 80 μL प्रति 30 ग्राम माउस में इंजेक्ट करें।
  6. तुरंत 'भेजें' और 'निष्पादित' दबाकर 120 सेकंड के लिए अल्ट्रासाउंड लागू करें।
  7. यदि एक से अधिक साइट लक्षित हैं, तो ट्रांसड्यूसर को उस साइट पर ले जाएं और चरण 4.7-4.9 से स्प्रेडशीट में निम्नलिखित संख्याओं को लक्षित करने वाली गहराई को समायोजित करें। फिर प्रत्येक इनसोनेटेड साइट के लिए चरण 6.5-6.6 दोहराएं।

7. बीबीबी ओपनिंग का एमआरआई मूल्यांकन।

नोट: बीबीबी उद्घाटन के एमआरआई मूल्यांकन को कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै। बीबीबी खोलने के स्थान को चूहों में उज्जवल क्षेत्रों के रूप में देखा जा सकता है जिन्हें टी 1-भारित जीडी कंट्रास्ट एजेंट का इंजेक्शन मिला था।

  1. अल्ट्रासाउंड आवेदन के बाद, चरण 3.10 में एमआरआई अनुक्रम रिकॉर्ड करें।
  2. एमआरआई स्कैनर से माउस निकालें, और संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति देने के लिए इसे एक रिकवरी पिंजरे में रखें। संकट, वजन घटाने या अन्य मानवीय समापन बिंदुओं के संकेतों के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें। अप्रत्याशित प्रतिकूल घटनाओं के होने पर किसी भी उपचार के साथ आगे बढ़ने के लिए पशु चिकित्सा कर्मचारियों और संस्थागत आईएसीयूसी दिशानिर्देशों से परामर्श करें।

8. एक केमोजेनेटिक लिगैंड के साथ ड्रेड उत्तेजना।

  1. एक केमोजेनेटिक रिसेप्टर चुनें। डीआरईडीडी के लिए, जीक्यू युग्मित मार्ग19 के माध्यम से न्यूरोनल सक्रियण के लिए एचएम 3 डीक्यू रिसेप्टर, जीआई / ओ युग्मित मार्ग20 के माध्यम से न्यूरोनल गतिविधि के निषेध के लिए एचएम 4 डी रिसेप्टर या साल्विनोरिन-बी लिगैंड25 का उपयोग करके जीएस युग्मित मार्गों के माध्यम से न्यूरॉन्स के सक्रियण के लिए केओआरडी रिसेप्टर चुनें।
  2. क्लोज़ापाइन-एन-ऑक्साइड (सीएनओ) को 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ लवण में घोलें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट सीएनओ स्टोर करें।
  3. सीएनओ 19, या एक अन्य केमोजेनेटिक लिगैंड26,27,28 को इंट्रापरिटोनियल मार्ग के माध्यम से 0.3 -10 मिलीग्राम / किग्रा के बीच एकाग्रता पर प्रशासित करें।
  4. यदि व्यवहार पर सीएनओ के प्रभाव ों को दर्ज किया जाना है, तो डीआरईडी19 की अधिकतम सक्रियता प्राप्त करने के लिए दवा प्रशासन के बाद 15-45 मिनट के भीतर व्यवहार गतिविधि को रिकॉर्ड करना शुरू करें।
  5. यदि न्यूरोनल सक्रियण का विश्लेषण वांछित है, तो इंजेक्शन के 60-120 मिनट बाद हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए चूहों का उपयोग करें।
  6. कार्डियक छिड़काव के माध्यम से इच्छामृत्यु के लिए आगे बढ़ें (अनुभाग 9 देखें)।

9. जीन अभिव्यक्ति और केमोजेनेटिक सक्रियण का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन

नोट: एक बार प्रयोगात्मक समापन बिंदु (जैसे, व्यवहार अध्ययन का अंत, जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक समय) प्राप्त हो जाने के बाद, जीन अभिव्यक्ति के स्थान और उपस्थिति की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है।

  1. एक केमोजेनेटिक लिगैंड के साथ सक्रियण के बाद, ऊतकों को संरक्षित करने के लिए कार्डियक छिड़काव करें।
    1. एक आईपी इंजेक्शन के माध्यम से बाँझ खारा में केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा) / ज़ाइलेज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रण के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण की पुष्टि करें और सुनिश्चित करें कि श्वास दर लगभग 1/सेकंड तक कम हो गई है। इच्छामृत्यु की पुष्टि होने तक हीटिंग पैड के माध्यम से थर्मल सहायता प्रदान करें।
    2. हेपरिन प्रति एमएल की 10 इकाइयों के साथ 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मलिन (एनबीएफ) और पीबीएस तैयार करें।
      नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।
    3. प्रत्येक बफर को अलग-अलग 50 एमएल ट्यूबों में डालें और कनेक्ट करें, और पीबीएस / हेपरिन समाधान के साथ 25 ग्राम तितली कैथेटर से जुड़े एक पेरिस्टालिक पंप को प्राइम करें।
    4. अंगों को टेप के साथ एक शोषक नीले पैड से संलग्न करें और सुनिश्चित करें कि जानवर को पैड पर लापरवाह स्थिति में रखा गया है। परिधीय अंगों के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए फर को कीटाणुरहित करें यदि उन्हें एकत्र करने की आवश्यकता होती है।
    5. पेरिटोनियल गुहा को एक अनुप्रस्थ चीरा द्वारा खोलें, डायाफ्राम को उजागर करें।
    6. पूर्ववर्ती / पीछे की धुरी के साथ सर्जिकल कैंची के दो कट के माध्यम से रिबकेज खोलें।
    7. दिल को उजागर करें और सुई को बाएं कक्ष में रखें (हृदय के दाईं ओर जैसा कि लापरवाह देखा जाता है) और चरण 9.1.3 में तितली कैथेटर में रखें।
    8. रक्त बहिर्वाह की अनुमति देने के लिए दाहिने वेंट्रिकल में एक छोटा सा चीरा लगाएं।
    9. पीबीएस / हेपरिन के साथ रक्त को बाहर निकालना शुरू करने के लिए पेरिस्टालिक पंप चालू करें।
      नोट: यदि यह चरण पर्याप्त रूप से नहीं किया जाता है, तो फॉर्मेलिन के साथ निर्धारण के दौरान रक्त का थक्का जम जाएगा और उचित छिड़काव को रोक देगा।
    10. सभी रक्त को बाहर निकालने और स्पष्ट पीबीएस दाएं वेंट्रिकल से बाहर आने के बाद, एक पेरिस्टालिक पंप के इनलेट को एनबीएफ समाधान में स्विच करें और प्रति माउस 25 एमएल के लिए छिड़काव शुरू करें।
    11. मस्तिष्क निकालें, एनबीएफ के कम से कम 4 एमएल में रखें और 24 घंटे के लिए पोस्ट-फिक्स करें।
  2. 50 μm अनुभाग मोटाई का उपयोग करके एक वाइब्रेटोम पर कोरोनल अनुभागों का उपयोग करके मस्तिष्क को विभाजित करें।
  3. प्रत्येक खंड को 24 अच्छी प्लेट के एक कुएं में रखें जो पूरे मस्तिष्क में अनुभागों को संग्रहीत करता है।
  4. फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, एमचेरी या एमसिट्रिन) से जुड़े केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करें, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत स्थान की पुष्टि करने के लिए अभिव्यक्ति दिखाने वाले वर्गों की पहचान करने के लिए। अभिव्यक्ति मंद होने की संभावना है।
  5. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके फ्लोरोफोरे के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग करें:
    1. 0.5 एमएल घोल में 3 खंड रखें जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी के मेजबान का 10% सीरम हो और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. शुरुआती बिंदु के रूप में 1:500 का उपयोग करते हुए, 1:250 - 1:1,000 कमजोर पड़ने पर एक प्राथमिक एंटीबॉडी के समाधान में वर्गों को स्थानांतरित करें।
    3. पैराफिन फिल्म के साथ सील किए गए माइक्रोप्लेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी वाले वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    4. एक बार में 5 मिनट के लिए पीबीएस, 3x के साथ अनुभागों को धोएं।
    5. 10% सीरम में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के प्रति कुएं में 0.5 एमएल जोड़ें।
    6. कमरे के तापमान में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. एक बार में 5 मिनट के लिए पीबीएस, 3x के साथ अनुभागों को धोएं।
    8. एक जलीय माउंटिंग माध्यम के साथ स्लाइड पर माउंट करें जिसमें एक परमाणु दाग (जैसे, DAPI) होता है।
  6. पूरे अनुभाग के टाइल स्कैन करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्थानीयकरण और प्रसार का मूल्यांकन करें।
  7. लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति पिक्सेल तीव्रता को मापकर अभिव्यक्ति की तीव्रता का मूल्यांकन करें और इंट्राक्रैनील इंजेक्शन नियंत्रण के खिलाफ तुलना करें।
  8. वैकल्पिक रूप से, डीएपीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं, या सेल-विशिष्ट मार्करों की तुलना में केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स के खिलाफ दाग वाली कोशिकाओं की गिनती करके सकारात्मक न्यूरॉन्स के प्रतिशत का मूल्यांकन करें।
  9. 50 μm अनुभाग पर हेमटोक्सीलिन धुंधला प्रदर्शन करके ऊतक क्षति का मूल्यांकन करें और कोशिकाओं के नुकसान, सेल मलबे के संचय और सकल क्षति के अन्य संकेतों के लिए इमेजिंग करें।
  10. सेल-टारगेटिंग की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, केमोजेनेटिक रिसेप्टर और सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए नीचे वर्णित डबल इम्यूनोस्टेनिंग करें। फिर, चरण 9.8 के रूप में सेल-पॉजिटिव गणना करें।
    1. एक द्वितीयक एंटीबॉडी के मेजबान के 10% सीरम वाले घोल के 0.5 एमएल में 3 खंड रखें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. शुरुआती बिंदु के रूप में 1:500 का उपयोग करते हुए, 1:250 - 1:1,000 कमजोर पड़ने पर केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स के फ्लोरोसेंट मार्कर के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के समाधान में वर्गों को स्थानांतरित करें। एक अलग मेजबान प्रजाति से एक दूसरा प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें जो रुचि के सेल-विशिष्ट मार्कर (जैसे, कैमकिया) के खिलाफ लक्षित है।
    3. पैराफिन फिल्म के साथ सील किए गए माइक्रोप्लेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी वाले वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    4. एक बार में 5 मिनट के लिए पीबीएस, 3x के साथ अनुभागों को धोएं।
    5. दोनों द्वितीयक एंटीबॉडी के मेजबान-प्रजातियों के 10% सीरम में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के प्रति कुएं में 0.5 एमएल जोड़ें।
      नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी में एक अलग फ्लोरोफोरे होना चाहिए और चरण 9.10.2 में प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रतिक्रियाशील होना चाहिए।
    6. कमरे के तापमान में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. एक बार में 5 मिनट के लिए पीबीएस, 3x के साथ अनुभागों को धोएं।
    8. स्लाइड्स पर माउंट करें और परमाणु दाग युक्त एक जलीय माउंटिंग माध्यम से ठीक करें।

10. सी-फॉस के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ न्यूरोनल सक्रियण का मूल्यांकन करें

  1. सी-फॉस प्राथमिक एंटीबॉडी और परमाणु दाग से अलग फ्लोरोसेंट टैग के साथ एक द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल के बिंदु 9.5 में सी-फॉस धुंधला करें।
  2. केमोजेनेटिक रिसेप्टर द्वारा लक्षित क्षेत्र में सी-फॉस और परमाणु दाग दोनों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
  3. केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाले चूहों के समूह में सी-फॉस पॉजिटिव नाभिक के प्रतिशत का विश्लेषण करें और एक केमोजेनेटिक लिगैंड या वाहन नियंत्रण के साथ इलाज किया जाए और जंगली-प्रकार के चूहों के समूह में जिन्हें केमोजेनेटिक लिगैंड या वाहन नियंत्रण के साथ इलाज किया जाता है।

Representative Results

एटीएसी प्रोटोकॉल करने का पहला कदम वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एफयूएस-बीबीबीओ का लक्ष्यीकरण है। उदाहरण के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हिप्पोकैम्पस को एफयूएस-बीबीबीओ के साथ लक्षित किया गया था, और कंट्रास्ट एजेंट और एएवी 9 ले जाने वाले डीआरईडीडी को चूहों में इंजेक्ट किया गया था, इसके बाद एक फ्लैश 3 डी एमआरआई अनुक्रम था जो माउस मस्तिष्क की छवियों को प्राप्त करता है। हिप्पोकैम्पल क्षेत्र (चित्रा 6) और मस्तिष्क के अन्य हिस्सों (चित्रा 7) में एक टी 1 सिग्नल वृद्धि हासिल की गई थी। कई हफ्तों के बाद, लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के अंदर ड्रेड व्यक्त किए गए थे। जबकि कई ड्रेड एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (जैसे एमचेरी) से जुड़े होते हैं, फॉर्मलाडेहाइड के साथ छिड़काव और निर्धारण की प्रक्रिया इन प्रोटीनों की प्रतिदीप्ति को काफी कम करने के लिए पाई गई थी। एमचेरी या डीआरईडीएडी के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग ने पिछले अनुभव के आधार पर अभिव्यक्ति (चित्रा 8) का अधिक विश्वसनीय पता लगाया। पिछले प्रयोगों में, ~ 85% चूहों ने एफयूएस-बीबीबीओ7 के बाद अभिव्यक्ति दिखाई। डीआरईडीडी की अभिव्यक्ति के पर्याप्त स्तर के लिए एक सरल परीक्षण सेलुलर स्तर पर उनकी कार्यक्षमता का परीक्षण कर रहा है। यह किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक केमोजेनेटिक लिगैंड या एक खारा नियंत्रण प्रदान करके, जैसे कि सीएनओ19, डेसक्लोरोक्लोज़ापाइन 28, या अन्य29, और कार्डियक छिड़काव और निर्धारण से 2 घंटे पहले प्रतीक्षा करना। मस्तिष्क के वर्गों को तब सी-फॉस प्रोटीन30 के लिए सह-इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था, जो न्यूरॉन्स की बढ़ी हुई गतिविधि को इंगित करता है, और खूंखार के लिए। प्रयोग को सफल माना गया था, अगर डीआरईडीडीएस के साथ लक्षित मस्तिष्क की साइट ने उस समूह में सी-फॉस पॉजिटिव न्यूरोनल नाभिक की काफी अधिक संख्या दिखाई, जिसे खारा7 प्राप्त करने वाले समूह की तुलना में केमोजेनेटिक लिगैंड प्राप्त हुआ या एक विपरीत साइट की तुलना में जो एफयूएस-बीबीबीओ के अधीन नहीं था। ध्यान दें, इनमें से कुछ लिगेंड के लिए विशेष रूप से डीईडी की अभिव्यक्ति के बिना न्यूरॉन्स को सक्रिय करने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, सीएनओ को चूहों में क्लोज़ापाइन के निम्न स्तर में चयापचय दिखाया गया है, जो बीबीबी को पार करता है और उच्च शक्ति27 के साथ डीआरईडीडी को सक्रिय करता है। हालांकि, इसे गैर-विशिष्ट स्थानों से बांधने के लिए भी दिखाया गया था। हर प्रयोग की तरह, केमोजेनेटिकअध्ययन में सभी उचित नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। वांछित व्यवहार या हिस्टोलॉजिकल परख पर अकेले दवा के प्रभाव को बाहर करने के लिए, प्रक्रियाओं के बिना, जंगली प्रकार के चूहों को केमोजेनेटिक लिगैंड का प्रशासन एक संभावित नियंत्रण है। एक अन्य नियंत्रण चार समूहों को शामिल करना हो सकता है: ड्रेड + लिगैंड, ड्रेड + वाहन, ईजीएफपी + लिगैंड, ईजीएफपी + वाहन, जो एफयूएस-बीबीबीओ और केमोजेनेटिक लिगैंड के साथ जीन वितरण दोनों के किसी भी संभावित प्रभाव के लिए जिम्मेदार होगा।

Figure 1
चित्रा 1: एटीएसी में एफयूएस के एमआरआई-निर्देशित लक्ष्यीकरण की प्रक्रिया। (ए) कान की सलाखों, नाक शंकु और एक मंच के साथ माउस प्लेसमेंट जिसे एमआरआई स्कैनर के अंदर फिट किया जा सकता है। (ख) एमआरआई में दिखाई देने वाली एक 3डी-मुद्रित मार्गदर्शिका (नीला) कान बार फ्रेम के सिरों से जुड़ी होती है और फिर सतह एमआरआई कॉइल के धारक के साथ सुरक्षित होती है जिसमें चार स्नैप-ऑन बोल्ट (अर्ध-पारदर्शी नीला) होता है। (ग) एमआरआई (बाएं पैनल) में 3 डी-मुद्रित गाइड की उपस्थिति, जिसमें गाइड के निचले भाग के साथ संरेखित ट्रांसड्यूसर (पीला अर्धवृत्त) के आभासी प्रतिनिधित्व का एक निचला हिस्सा है। दाहिना पैनल कोरोनल दृश्य से एमआरआई पर 3 डी-मुद्रित गाइड की उपस्थिति दिखाता है। उज्ज्वल सर्कल एक पॉलीजेट समर्थन सामग्री से बना था जिसमें एक मजबूत एमआरआई कंट्रास्ट है। क्रॉस प्लास्टिक के साथ बनाया गया था। एक पीला सर्कल ट्रांसड्यूसर स्थान का प्रतिनिधित्व करता है जिसे एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के अंदर गाइड के साथ संकेंद्रित रूप से संरेखित किया गया था। (घ) मस्तिष्क संरचनाओं को लक्षित करने के लिए एक वर्चुअल ट्रांसड्यूसर को चूहों के ऊपर जेड-दिशा में ले जाया गया ताकि अल्ट्रासाउंड शंकु/आवास की मोटाई से मिलान किया जा सके। इस मामले में, पानी के स्नान की मोटाई के कारण, ट्रांसड्यूसर को सटीक लक्ष्यीकरण के लिए गाइड से 8.2 मिमी ऊपर ले जाया गया था। एमआरआई इमेजिंग डेटा का उपयोग करके मस्तिष्क संरचनाओं का चयन किया गया था, और उनके एमआरआई निर्देशांक तब लिखे गए थे और स्टीरियोटैक्सिक मशीन में दर्ज किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर का इंटरफ़ेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमआरआई समन्वय स्थान को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से मिलान करने की प्रक्रिया। (ए) एक ट्रांसड्यूसर धारक के भीतर तीन छेद एमआरआई गाइड के भीतर तीन छेदों के साथ संरेखित किए गए थे, और तीन शंक्वाकार लक्ष्यीकरण बोल्ट पूरी असेंबली में फ्लेक्स पैदा किए बिना डाले गए थे। (b) आदर्श रूप से, सभी तीन बोल्ट छेद के केंद्र में बैठेंगे। (ग) यदि संरेखण में कोई अशुद्धता है, तो सभी तीन बोल्ट फिट नहीं होंगे, उदाहरण के लिए, 1° के छोटे, संभावित अदृश्य याव के मामले में, केवल एक बोल्ट फिट होगा जबकि विपरीत बोल्ट एमआरआई गाइड पर फंस जाएंगे। वैकल्पिक रूप से, पूरी सभा का फ्लेक्स दिखाई दे सकता था क्योंकि बोल्ट को मजबूर किया गया था। (घ) बोल्ट-फिटिंग का विस्तृत दृश्य। बोल्ट को सर्वोत्तम सटीकता के लिए संकेंद्रित रूप से रखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सिरिंज के भीतर माइक्रोबबल का तेजी से पुनर्वितरण। (a) मिश्रण के 5 सेकंड बाद सिरिंज की तस्वीर ली गई थी। (ख) एक मिनट बाद, एक स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली परत थी जिसमें कुछ बुलबुले 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज के शीर्ष के पास केंद्रित थे। यह उदाहरण, विशेष रूप से, माइक्रोबबल के समाधान का उपयोग करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमआरआई गाइड के केंद्र पर ट्रांसड्यूसर के केंद्र को रखने की प्रक्रिया। (क) इस पेपर में दर्शाए गए मॉडलों में, लाल वाहक को चित्र 3ख में दर्शाई गई स्थिति से 1056 मिमी आगे बढ़ने के लिए अभिकल्पित किया गया है। (बी) सोनिकेशन से पहले नीले एमआरआई गाइड को हटा दिया गया था, और अल्ट्रासाउंड मार्ग सुनिश्चित करने के लिए माउस और ट्रांसड्यूसर (नारंगी) के बीच एक अल्ट्रासाउंड जेल लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: बीबीबी उद्घाटन का एमआरआई विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) बीबीबी उद्घाटन का अक्षीय दृश्य। तीर के साथ नामित उज्ज्वल क्षेत्र एमआरआई टी1 कंट्रास्ट एजेंट के अतिरिक्त को दर्शाता है। (ख) पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस और हिप्पोकैम्पस के ऊपर कॉर्टेक्स का कोरोनल दृश्य जिसे एफयूएस-बीबीबीओ (तीर) से लक्षित किया जाता है। (ग) एफयूएस-बीबीबीओ (तीर) से लक्षित केंद्रीय हिप्पोकैम्पस का कोरोनल दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: इस पेपर में वर्णित तीन-बोल्ट लक्ष्यीकरण प्रणाली का उपयोग करके 4 मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने का उदाहरण। एरोहेड वाले क्षेत्रों ने दिखाया कि बीबीबी ने एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट के प्रसार के साथ साइटों को खोला। चार साइटों को लगातार लक्षित किया गया था, प्रत्येक बीबीबी खुलने के बीच ~ 150 सेकंड, नीचे से ऊपर तक। तस्वीर आखिरी बीबीबी उद्घाटन के 2 मिनट के भीतर ली गई थी। स्केल बार 2 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: ड्रेड अभिव्यक्ति का पता लगाना।  (क) डीआरईडीडी से जुड़े फ्लोरोफोरे के लिए इम्यूनोस्टेनिंग, इस मामले में एमचेरी कुछ अध्ययनों में पता लगाने का एक विश्वसनीय तरीका था। (ख) एक अन्य प्रतिनिधि खंड में जिसमें (क) के समान परिस्थितियों का उपयोग करते हुए हिप्पोकैम्पस को लक्षित किया गया है, एमचेरी की प्रतिदीप्ति ने अपने आप में मजबूत पृष्ठभूमि और अपेक्षाकृत कमजोर संकेत उत्पन्न किए हैं। (ग) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक माउस जिसे एएवी का प्रणालीगत इंजेक्शन प्राप्त हुआ, लेकिन एफयूएस-बीबीबीओ से नहीं गुजरा, का उपयोग किया गया। एमचेरी इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कोई महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति नहीं पाई जा सकती है। स्केल बार 500 मिमी हैं (ए, सी में डेटा अनुमतियों के साथ7 से अनुकूलित, कॉपीराइट 2020 नेचर-स्प्रिंगर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एटीएसी को विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के सफल न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए कई तकनीकों के सफल कार्यान्वयन की आवश्यकता होती है, जिसमें सटीक एमआरआई-निर्देशित लक्ष्यीकरण, एफयूएस-बीबीबीओ और जीन अभिव्यक्ति का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन शामिल है। इमेजिंग-निर्देशित एफयूएस-बीबीबीओ के साथ छोटे मस्तिष्क संरचनाओं के लक्ष्यीकरण को सरल बनाने के लिए 3 डी-प्रिंट करने योग्य घटक विकसित किए गए थे।

एमआरआई निर्देशित केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एमआरआईजीएफयूएस) प्रशासन कई चुनौतियों का सामना करता है। सबसे पहले, विशिष्ट एमआरआई कॉइल में सीमित स्थान होता है जिसे केवल एक नमूने को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और अल्ट्रासाउंड हार्डवेयर नहीं। एमआरआई के बड़े बोर उपकरण की लागत को बढ़ाते हैं और छवि की गुणवत्ता को कम करते हैं, क्योंकि संकेत एक कॉइल32 के भरण कारक से संबंधित है। नतीजतन, एमआरआई में एक पशु छवि के शीर्ष पर रखा गया कोई भी एफयूएस हार्डवेयर इमेजिंग गुणवत्ता से समझौता करेगा। दूसरा, एमआरआई-संगत उपकरणों को डिजाइन करना मुश्किल और महंगा है। एमआरआई संगत सामग्री को डायमैग्नेटिक होने की आवश्यकता होती है, रेडियोफ्रीक्वेंसी विकिरण के दौरान एडी धाराओं को बनाने की कम प्रवृत्ति होती है, और उच्च चुंबकीय क्षेत्रों में कम चुंबकीय संवेदनशीलता होती है। किसी भी प्रवाहकीय सामग्री में, एडी धाराओं या इसकी चुंबकीय संवेदनशीलता का निर्माण भी इमेजिंग गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। अंत में, उपलब्ध एमआरआई-संगत सामग्रियों में आमतौर पर सटीक लक्ष्यीकरण मशीनों जैसे स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के उत्पादन में उपयोग की जाने वाली धातुओं की तुलना में यंग के मोडुलिन और स्थायित्व कम होते हैं। स्थितिगत समायोजन के लिए उपयोग किए जाने वाले मोटर्स को एमआरआई-संगत होने की आवश्यकता होती है और उनके आकार के कारण एमआरआई बोर के बाहर रखा जाता है। इन मोटर्स को एमआरआई-संगत सामग्री का उपयोग करके एमआरआई बोर के अंदर ट्रांसड्यूसर से दूरी पर जोड़ा जाना चाहिए। प्लास्टिक के विकृत होने, मजबूत आकार के घटकों को लागू करने के लिए बोर के अंदर पर्याप्त जगह की कमी, और पूरे मस्तिष्क में लक्ष्यीकरण स्थितियों को बदलने के लिए अपर्याप्त जगह के मुद्दों ने पिछले काम में लक्ष्यीकरण सटीकता को प्रभावित किया है।

इन समस्याओं को हल करने के लिए, स्कैनर के बाहर एमआरआई और एफयूएस-बीबीबीओ प्रशासन में इमेजिंग करने का निर्णय लिया गया था। एमआरआई-मार्गदर्शन की अनुमति देने के लिए, चूहों को 3 डी-मुद्रित संयम के अंदर रखा गया था जिसमें एक एमआरआई-दृश्यमान लक्ष्यीकरण गाइड था जिसका उपयोग एमआरआई और स्टीरियोटैक्स समन्वय स्थान दोनों में माउस मस्तिष्क संरचनाओं को स्थानीयकृत करने के लिए किया जा सकता था। चूंकि माउस खोपड़ी और लक्ष्यीकरण गाइड दोनों कान बार धारकों (चित्रा 1ए, बी) से मजबूती से जुड़े हुए हैं, इसलिए एमआरआई छवि के भीतर स्थानिक निर्देशांक को सहसंबंधित करने और स्टीरियोटैक्सिक उपकरणों को शून्य करने के लिए एक लक्ष्यीकरण गाइड का उपयोग किया जा सकता है। संयम में मूविंग पार्ट्स नहीं होते हैं और इसमें ट्रांसड्यूसर नहीं होता है, जिसने हमें एमआरआई के अंदर फिट होने के लिए इसे मजबूत और पर्याप्त रूप से छोटा बनाने की अनुमति दी और ट्रांसड्यूसर के इलेक्ट्रॉनिक्स से सिग्नल हस्तक्षेप को हटा दिया। लक्ष्यीकरण गाइड के अंदर की जगह खोखली हो गई है क्योंकि कुछ सामग्रियों के लिए 3 डी-मुद्रित समर्थन एमआरआई (चित्रा 1 सी) में दिखाई दे रहा है। स्टीरियोटैक्स अंशांकन को सक्षम करने के लिए असेंबली में छेद पेश किए गए थे (चित्रा 3)। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को स्टीरियोटैक्स के इलेक्ट्रोड धारक से जोड़ा गया था, और लक्ष्यीकरण अनुभाग 4 (चित्रा 1 डी) में वर्णित के रूप में किया गया था। ट्रांसड्यूसर को कान की सलाखों के आवास द्वारा इसकी लंबाई के साथ समर्थित किया जाना चाहिए, जिससे स्तर तल से किसी भी विचलन को रोका जा सके। डोर्सो-वेंट्रल दिशा में लक्ष्यीकरण एक वलयाकार सरणी में चरण-शिफ्ट का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

व्यावहारिक लक्ष्यीकरण परिशुद्धता अल्ट्रासाउंड फोकसिंग और खोपड़ी क्षीणन द्वारा निर्धारित की जाती है। एफयूएस-बीबीबीओ प्रक्रिया को चूहों 11 के लिए विस्तार से वर्णित किया गया है और इसे कई अन्य मॉडल जीवों23,33,34 और मनुष्यों में 16,17 में लागू किया गया है। अल्ट्रासाउंड फोकस आकार के बीच संबंध आवृत्ति के व्युत्क्रमानुपाती होता है, जहां उच्च आवृत्तियों के परिणामस्वरूप अधिक सटीक वितरण हो सकता है। हालांकि, खोपड़ी का क्षीणनआवृत्तियों 35 के साथ बढ़ता है जिससे खोपड़ी गर्म हो सकती है और कॉर्टिकल क्षेत्रों को नुकसान हो सकता है। सटीक लक्ष्यीकरण रणनीति मस्तिष्क साइट पर निर्भर करेगी। जिन साइटों पर एक पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम दबाव मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर फिट बैठता है, वे स्ट्रेटम, मिडब्रेन और हिप्पोकैम्पस जैसे कई मस्तिष्क संरचनाओं में अनुमानित और सुरक्षित बीबीबी खोलने की अनुमति देते हैं। मस्तिष्क के आधार के पास के क्षेत्र चूहों में एक विशिष्ट चुनौती पैदा करते हैं। माउस मस्तिष्क डोर्सो-वेंट्रल दिशा में लगभग 8-10 मिमी मापता है, जो कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसड्यूसर के पूर्ण-चौड़ाई आधे अधिकतम आकार के बराबर है। नतीजतन, खोपड़ी के तल पर लक्ष्यीकरण से कान नहरों, मुंह या विंडपाइप में मौजूद हड्डियों और हवा से अल्ट्रासाउंड प्रतिबिंब हो सकता है जिससे उच्च और निम्न दबाव के अप्रत्याशित पैटर्न हो सकतेहैं। इनमें से कुछ दबाव एक जड़त्वीय गुहिकायन सीमा को पार कर सकते हैं जिसे रक्तस्राव औरऊतक क्षति का कारण दिखाया गया है। खोपड़ी के आधार के पास स्थित क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए, इंटरसेक्शनल एटीएसी7 का उपयोग करना बेहतर हो सकता है, जहां इंटरसेक्शनल जेनेटिक्स38 का उपयोग जीन अभिव्यक्ति को एक छोटे क्षेत्र में प्रतिबंधित करने के लिए किया जाता है, जो एफयूएस बीम के साथ लक्षित होता है। इंटरसेक्शनल एटीएसी के प्रकाशित उदाहरण में, डोपामिनर्जिक कोशिकाओं में जीन संपादन एंजाइम (सीआरई38) व्यक्त करने वाले एक ट्रांसजेनिक जानवर को डोपामिनर्जिक कोशिकाओं वाले क्षेत्र के उपखंड में अल्ट्रासाउंड के साथ लक्षित किया गया है। अंत में, कॉर्टिकल क्षेत्रों को एफयूएस के साथ लक्षित किया जा सकता है, लेकिन अल्ट्रासाउंड का विवर्तन और प्रतिबिंब असमान दबाव प्रोफाइल के कारण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल कॉर्टिकल क्षेत्रों के लक्ष्यीकरण को कवर नहीं करता है क्योंकि यह उपयोग की गई प्रजातियों पर अत्यधिक निर्भर होगा; हालांकि, हिप्पोकैम्पस 7 (जैसे, चित्रा 7) के ऊपर कॉर्टेक्स के कुछ लक्ष्यीकरण को देखा गया है जो दर्शाता है कि कम से कम चूहों में, यह संभव है।

एक केमोजेनेटिक एक्टिवेटर और खुराक की पसंद विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं पर निर्भर करेगी। लेखकों के अध्ययन7 में से एक सहित कई अध्ययनों ने कोई महत्वपूर्ण गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया नहीं दिखाई,39,40, जबकि उच्च खुराक (जैसे, 10 मिलीग्राम / किग्रा) साइड इफेक्ट्स पैदा कर सकती है, कम से कम कुछ मामलों में41। हालांकि, सभी व्यवहार प्रयोगों के साथ, सीएनओ और इसके मेटाबोलाइट्स42 की संभावित ऑफ-टारगेटेड गतिविधि के कारण उचित नियंत्रण31 आवश्यक हैं। इस तरह के नियंत्रणों में जानवरों को सीएनओ और खारा नियंत्रण का प्रशासन शामिल हो सकता है, जो खतरनाक को व्यक्त करते हैं और जंगली प्रकार के जानवरों को सीएनओ का प्रशासन करते हैं, या कुछ विशिष्ट मामलों में मस्तिष्क के इप्सी- और मस्तिष्क के विपरीत साइटों की तुलना करते हैं जो क्रमशः केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं और नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, हाल के शोध में 28,29,43 की बेहतर विशिष्टता के साथ कई नए ड्रेड एगोनिस्ट का पता चला है। अन्य केमोजेनेटिक रिसेप्टर्स 5,25,44 का उपयोग एटीएसी प्रक्रिया के साथ संयोजन के रूप में भी किया जा सकता है।

जीन अभिव्यक्ति का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन हर जानवर के लिए आवश्यक पोस्टमार्टम है। जानवरों का एक छोटा सा अंश एफयूएस-बीबीबीओ7 के बाद खराब जीन अभिव्यक्ति दिखाता है। इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति की स्थानिक सटीकता और विशिष्टता दिखाना आवश्यक है क्योंकि गलत-लक्ष्यीकरण संभव है। ध्यान दें, कुछ एएवी प्रतिगामी या एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग क्षमता45 दिखा सकते हैं और सटीक अल्ट्रासाउंड लक्ष्यीकरण के बावजूद अल्ट्रासाउंड के साथ लक्षित साइट से दूर अभिकर्मक का कारण बन सकते हैं। यदि व्यक्त केमोजेनेटिक रिसेप्टर एक फ्लोरोफोरे से जुड़ा हुआ है या सह-व्यक्त करता है, तो ऊतक वर्गों में फ्लोरोफोरे की इमेजिंग स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति की तीव्रता का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त हो सकती है। हालांकि, ऊतक निर्धारण प्रक्रिया से कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, और एमचेरी प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग जो अक्सर डीआरईडीडीएस के साथ उपयोग किया जाता है, ने पिछले अध्ययनों में बेहतर संकेत दियाहै। अंत में, मस्तिष्क के कुछ हिस्सों (जैसे, हिप्पोकैम्पस में दानेदार कोशिका परत) में न्यूरॉन्स के घनत्व के कारण, संलयन के विपरीत, आईआरईएस के तहत व्यक्त परमाणु-स्थानीयकृत फ्लोरोफोरे का उपयोग करना, सेल-गिनती करने के लिए फायदेमंद हो सकता है क्योंकि नाभिक को आसानी से विभाजित किया जा सकता है और परमाणु दाग के साथ प्रतिरूपित किया जा सकता है, जैसे कि डीएपीआई या टीओ-प्रो -3। सी-फॉस स्टेनिंग द्वारा न्यूरोमॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने के लिए, किसी भी प्रतिदीप्ति संकेत के बजाय परमाणु काउंटरस्टेनिंग और सी-फॉस पॉजिटिव नाभिक की गिनती करना अनिवार्य है। कुछ मामलों में, सेलुलर मलबे प्रतिदीप्ति दिखा सकते हैं और सकारात्मक कोशिकाओं के माप को भ्रमित कर सकते हैं।

एफयूएस-बीबीबीओ के साथ दवा और जीन वितरण की सीमाओं में इनवेसिव इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के साथ डिलीवरी की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन और बड़ी मात्रा में इंजेक्शन दवाओं या वायरल वैक्टर की आवश्यकता शामिल है। इसके अतिरिक्त, जबकि मस्तिष्क में एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन के परिणामस्वरूप एक इंजेक्शन साइट पर विशेष वितरण होता है, एफयूएस-बीबीबीओ एक अंतःशिरा मार्ग का उपयोग करता है जिसके परिणामस्वरूप परिधीय ऊतकों को संभावित वितरण होता है। न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए केमोजेनेटिक्स का उपयोग करने की सीमाओं में एक धीमा टाइमस्केल शामिल है, जो कुछ व्यवहार प्रोटोकॉल के लिए अपर्याप्त हो सकता है जिसके लिए न्यूरोमॉड्यूलेशन की तीव्रता में तेजी से बदलाव की आवश्यकता होती है।

Disclosures

हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

इस शोध को ब्रेन एंड बिहेवियर फाउंडेशन, एनएआरएसएडी यंग इन्वेस्टिगेटर अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। कई 3 डी मुद्रित घटक मूल रूप से फैबियन राबुसो (छवि निर्देशित चिकित्सा, फ्रांस) द्वारा डिजाइन किए गए थे। लेखक पांडुलिपि तैयार करने में तकनीकी सहायता के लिए जॉन हीथ (कैलटेक) और मार्गरेट स्विफ्ट (कैलटेक) को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21-gauge needles (BD) Fisher Scientific 14826C
25-gauge butterfly catheter Harvard Bioscience 725966
30-gauge needles (BD) Fisher Scientific 14826F
Absorbent blue pad Office Depot 902406
Anti-c-Fos antibody Santa Cruz Biotechnology SC-253-G
Anti-mCherry antibody Thermofisher PA534974
Bruker Biospec 70/30 Bruker custom includes the RF coils
Clozapine-n-oxide Tocris 4936
Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components ImageGuidedTherapy, Szablowski lab custom download from szablowskilab.org/downloads
Custom MRIgFUS machine ImageGuidedTherapy N/A
Definity microbubbles Lantheus DE4
Degassed aquasonic/ultrasound gel Fisher Scientific 5067714
Depilation crème Nair n/a
Eight-element annular array transducer Imasonic Inc. custom
Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) Office Depot 599893
Heparin Sigma-Aldrich H3149-25KU
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson Veterinary 07-890-8598
Neutral buffered formalin (10%) Sigma-Aldrich HT501128-4L
Optical fiber hydrophone Precision Acoustics
PE10 tubing Fisher Scientific NC1513314
Peristaltic pump
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich 524650-1EA
Prohance contrast agent Bracco 0270-1111-04
Saline Fisher Scientific NC9054335
Secondary antibody, Donkey-anti goat ThermoFisher A-11055
Secondary antibody, Donkey-anti rabbit ThermoFisher 84546
Surgical scissors (straight) Fisher Scientific 17467480
ThermoGuide Software ImageGuidedTherapy
Tissue glue (Gluture) Fisher Scientific NC9855218
Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) Fisher Scientific 14823434
VeroClear 3D printable material Stratasys RGD810
Vialmix microbubble activation device Lantheus VMIX
Vibrating microtome Compresstome VF-300
Xylazine Sigma-Aldrich X1251-1G

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रिट्रेक्शन इश्यू 166 केंद्रित अल्ट्रासाउंड रक्त-मस्तिष्क बाधा केमोजेनेटिक्स एमआरआई-निर्देशित अल्ट्रासाउंड ध्वनिक रूप से लक्षित केमोजेनेटिक्स केमोजेनेटिक्स एएवी जीन वितरण
मस्तिष्क संरचनाओं को लक्षित करने और केमोजेनेटिक न्यूरोमॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने के लिए केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रेरित रक्त-मस्तिष्क बाधा खोलना
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Szablowski, J. O., Harb, M. Focused… More

Szablowski, J. O., Harb, M. Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation. J. Vis. Exp. (166), e61352, doi:10.3791/61352 (2020).

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