Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61363
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Lehigh University

Summary

המטרה של הליך זה היא לנתח את רקמת שריר האורך גב (DLM) כדי להעריך את השלמות המבנית של צמתים עצביים שריריים DLM (NMJs) במודלים של מחלות ניווניות באמצעות מלנוגסטר Drosophila.

Abstract

Drosophila משמש מודל שימושי להערכת מבנה סינפטי ותפקוד הקשורים למחלות ניווניות. בעוד עבודה רבה התמקדה צמתים עצביים שריריים (NMJs) בזחלי Drosophila, הערכת שלמות סינפטית בדרוזופילה למבוגרים קיבל הרבה פחות תשומת לב. כאן אנו מספקים שיטה פשוטה עבור ניתוח של שרירי האורך גב (DLMs), אשר נדרשים עבור יכולת טיסה. בנוסף לטיסה כקריאה התנהגותית, ניתוח זה מאפשר הן סינפסות DLM ורקמות שריר להיות מותן לניתוח מבני באמצעות נוגדנים תיוג פלורסנטית עבור סמנים סינפטיים או חלבונים של עניין. פרוטוקול זה מאפשר הערכה של השלמות המבנית של סינאפסות בדרוזופילה למבוגרים במהלך הזדקנות כדי מודל מתקדם, תלוי גיל הטבע של רוב מחלות ניווניות.

Introduction

תפקוד סינפטי הוא בין סימני ההיכר המוקדמים ביותר הידועים של רוב המחלות ניווניותהעיקריות 1,,2,,3,,4,,5,,6. עם זאת, מעט מאוד ידוע לגבי איך ליקויים מבניים ופונקציונליים אלה מתייחסים לשלבים מאוחרים יותר של התקדמות המחלה. Drosophila הוכיחה להיות מערכת מודל שימושי להבנת צמיחה ופיתוח סינפסה באמצעות זחל NMJs7,,8,,9. עם זאת, שלב instar הזחל השלישי נמשך רק כמה ימים, הגבלת התועלת שלהם בלימוד מתקדם, תלוי גיל ניוון עצבי. חלופה להערכת NMJs זחל היא לבחון מבנים סינפטיים ב Drosophila למבוגרים, כגון סינפסות שנוצרו על שרירי האורך גב (DLMs)הנדרשים לטיסה 10,11, 12,13,1314,,15,16. סינאפסות טריפתיות אלה מאורגנות מבחינה מבנית באופן דומהל-17סינאפסות יונקים , מה שמספק יתרון ייחודי להערכת מודלים של מחלות ניווניות.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לניתוח השלמות המבנית של NMJs למבוגרים במודל Drosophila של ניוון עצבי. שיטות קודמות של DLM, מחקרים, הדגישו את החשיבות של שימור רקמת שרירלמגוון יישומים 18,19,,20,,21,,22,,23., הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מקיפה כדי לשמר הן רקמת עצבית והן רקמת שריר לחקור מחלות ניווניות. מרכיב מרכזי נוסף בחקר מחלות אלה הוא היכולת להבין אובדן עצבי באופן תלוי גיל. עבודה קודמת מספקת הבנה ביקורתית ועמיקה של האופן שבו ה-DLM NMJs נוצרים במהלך מטמורפוזהלבגרות מוקדמת 11,12,14,15,16,24. הפרוטוקול שלנו קובע שיטה לבנות על עבודה זו כדי לחקור DLM NMJs באופן תלוי גיל בהזדקנות ומחלות ניווניות.

Protocol

1. דור זבובים טרנסגנים

  1. כדי ליצור זבובים טרנסגניים לניסוי זה, לאסוף OK371-Gal425 זבובים נקבה בתולה וזכרים של UAS-TDP-43M337V 26 (איור 1A) על ידי זבוביםמסטימים עם CO 2 על משטח למיין.
  2. מיין זבובים מרדים לתוך בקבוקונים עם מדיה Drosophila סטנדרטית עבור הצלב. מקום בקבוקונים עם תווית ב 25 °C עבור הדור הבא להגיח.
    הערה: נקה את המבוגרים מהקלעונים לפני שהצולה תצא כדי להבטיח את הגנוטיפ הנכון.
  3. ברגע שצאים מגיחים, אספו את הזבובים הטרנסגניים לתוך בקבוקונים ומיין לפי מין כדי להתחיל להזדקן לתנאים ניסיוניים.
  4. לאחר איסוף הזבובים, מעבירים זבובים למזון טרי כל יומיים עד שהזבובים בני 21 ימים.

2. הכנה לפירוק

  1. כדי להתכונן לנתחים, להשיג תמיסת מלח פוספט בטמפרטורת החדר (1 x PBS), צלחת 10 ס"מ מצופה אלסטומר סיליקון, קצוות ישרים לנתח מספריים, קבוצה אחת של מפסים קהים, P200 פיפטה וטיפים פיפטה, 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge, מספריים משרדיים סטנדרטיים, 70% אתנול, צלחת פטרי 6 ס"מ, ו 32% פורמלדהיד מדולל 4% עם PBS 1x.
  2. צינורות תווית עבור כל גנוטיפ או מצב ולהוסיף 900 μL של 1x PBS (חדר זמני) ו 150 μL של 32% פורמלדהיד לכל שפופרת. ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות בעת הכנת 4% פורמלדהיד קיבעון.
  3. מבריש 6\u201210 זבובים לכל קבוצה ישירות מהמבעון עם CO2 ולשקוע זבובים לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ עם 70% אתנול. לחץ עף למטה לתוך האתנול באמצעות מברשת צבע כדי להבטיח כי דגימות שקועות לחלוטין. זה יסיר את שכבת השמן על העורון החיצוני.

3. בידוד בית החזה וקביבעון

  1. לפני לנתח כל דגימה, להוסיף כ 7\u201210 מ"ל של 1x PBS לצלחת הניתוח מצופה אלסטומר סיליקון. אמצעי אחסון זה אמור להבטיח כי דגימות הרקמה שקועות לחלוטין.
  2. מעבירים זבוב אחד לצלחת החתכים מ-70% אתנול באמצעות ממחלצות קהות ואוחזים בכנפיים או ברגליים.
  3. למקד את הדגימה בצלחת הקטע תחת מיקרוסקופ לנתח. לאחר מכן לשקוע הדגימה 1x PBS, בזהירות להסיר את הכנפיים באמצעות דומונט בוטה #5 משקולות עדינות.
  4. באמצעות Vannas קצה ישר חיתוך האביב מספריים, להסיר את הרגליים על ידי יצירת חתך קטן בצד הגיאנל של צינור. בשלב 3.8, חתך זה יאפשר לפורמלדהיד לחדור את הרקמה.
  5. קח את המספריים ביד אחת והחזק את המקרנים ביד השנייה כדי למקם את הצד הפתחי של הזבוב למעלה. תוך החזקת הדגימה במקום עם הממחצות הקהות, הסר את הראש והבטן עם המספריים.
  6. העבר את בית החזה המבודד באמצעות קצה פיפטה ששונה לתוך הצינור המסומן, ממדרגה 3.2.
    הערה: הגדר את הפיפטה ל- 40 μL כדי להימנע מהוספת PBS 1x נוסף ל- fixative.
  7. חזור על שלבים 3.2\u20123.6 לעיל עבור כל דגימה.
  8. תקן דגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את התיקון באמצעות פיפטת פסטר וזרוק אותו במיכל הפסולת המתאים מתחת למכסה האדים. לשטוף דגימות שלוש פעמים עם 1.5 מ"ל של 1x PBS כל באמצעות פיפטה פסטר. להשלים שטיפה רביעית באמצעות רק 750 μL ולהשאיר טישו 1x PBS.
    הערה: בשלב זה, דגימות רקמה יכולות להישאר ב- 4 °C עד 3 ימים לפני שתמשיך לשלבים הבאים.

4. הקפאת הבזק וריסטורי בית החזה

  1. לפני תחילת הקטעים, מלאו בקבוקון Dewar בחנקן נוזלי עם כפפות מגן הקפאה מתאימות ומשקפיים בטיחותיים. להשיג מפסק להב, להבי נוצות, זוג אחד של מפסים עדינים, קרח, קר כקרח 1x PBS, פינצטה cryogenic.
  2. הכינו דלי קרח כדי לשמור על 1 pBS קר כקרח.
  3. השתמש במפסק הלהב כדי לתפוס את להב הנוצה בזווית, ולכופף את הלהב כדי לשבור חתיכה קטנה. מפסק הלהב יכול לנעול את הלהב בעמדה לשימוש כאזמל קטן.
    הערה: להב אחד אמור להימשך עבור כל הקבוצות. החלף אם להב נשבר או הופך למשעמם.
  4. הוסף קצה פיפטה נקי P200 ולהסיר 1/5th של הקצה כדי להעביר דגימות.
  5. להכין צינור microcentrifuge חדש עבור כל קבוצה ולהוסיף 200 μL של 1x PBS לכל שפופרת. הצינור השני הזה ישמש לאיסוף ההכנות הסופיות של DLM.
  6. הסר את כל 1x PBS מצינורות באמצעות פיפטה פסטר.
  7. לובש ציוד מגן נכון, לשקוע הצינור לתוך בקבוקון חנקן נוזלי עבור 10 s עם פינצטה cryogenic.
    הערה: הצינורות צריכים להיות סגורים בחוזקה כדי למנוע את הצינור מתפוצץ.
  8. הסר את הצינור מהחנקן הנוזלי ולהוסיף כ 300 μL של כקרח קר 1x PBS לדגימות עם פיפטה פסטר. שמור את הדגימות על קרח.
  9. הוסף PBS 1x קר כקרח לצלחת 10 ס"מ פירוק מצופה אלסטומר סיליקון ולחלק את בית החזה הראשון עם 200 μL pipette שונה.
  10. מקם את צד החזה למעלה. ביד אחת להשתמש זוג משעמם של מלקות כדי למקם את בית החזה וביד השנייה להשתמש זוג מלקות בסדר כדי להסיר חלק גנגוליון בית החזה כדי לחשוף את קו האמצע של בית החזה.
  11. השתמש בקו האמצע של בית החזה כמדריך כדי לבצע חתך רדוד דרך 1/3rd של בית החזה עם הלהב.
  12. הסר את הלהב מבית החזה ומקם את בית החזה בזווית של 45 מעלות עם המנוריים הקהים. הכנס מחדש את הלהב וחתוך ישר את קו האמצע של בית החזה. זה יגרום לשני המיטוראס.
  13. קח המיטוהורקס אחד בכל פעם ולהסיר את הרקמה העודפת תחת סיבי שריר DLM F(איור 1B),הסיבים האווריריים ביותר. השתמש בלהב כדי לבצע בזהירות חתכ אחד או שניים כדי להסיר את הרקמה העודפת מבלי לפגוע ב- DLMs.
  14. לאחר בידוד, להעביר את המיטוהרקס לצינור הנכון עם PBS 1x.
  15. חזור על שלבים 4.6\u20124.14 עד 10 hemithoraces לנתח לכל קבוצה נעשות.

5. כתמים מבניים

  1. לאחר תוחם את דגימות בית החזה, מקם את הרקמה במאגר חסימה (PBS אחד עם סרום עזים רגיל של 0.1% ו-0.2% Triton X-100 ב-pH 7.4) כדי לחלחל לרקמה ולמנוע כתמים לא ספציפיים. השתמש בפיפטה פסטר כדי להסיר עודף 1x PBS ולהוסיף 1.5 מ"ל של מאגר חסימה לכל שפופרת. לחסום טישו לפחות 1 שעה ב 4 ° C.
  2. להכין את הדגימות עבור כתמים מבניים באמצעות נוגדן פלואורסצנטית, חזרת peroxidase 488 (אנטי HRP-488) תוך דילול של 1:200 ו Phalloidin-647 תוך דילול של 1:1000 בחסימת מאגר כדי להכתים נוירונים מוטוריים ורקמות שריר, בהתאמה. לעשות מספיק כתם יש 150 μL לכל שפופרת. לאחסן את הכתם ב 4 מעלות צלזיוס מכוסה בנייר כסף או בקופסה כהה עד מוכן לכתמים.
  3. לאחר החסימה, הסר את מאגר החסימה העודף עם פיפטת פסטר זכוכית.
  4. לפני חלוקת הכתם המבני, מערבולת הכתם. להוסיף 150 μL של הכתם לכל שפופרת. מניחים את הדגימות בקופסה כהה על המסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
  5. הסר את הכתם ולשטוף את הרקמות ארבע פעמים ב 1.5 מ"ל של חדר temp 1x PBS עם 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות על המסובב בקופסה כהה. הדגימות מוכנות כעת להטענה לשקופית.

6. רקמת הרכבה

  1. לאחר שטיפת דגימות PBST, להכין שקופית מיקרוסקופ כדי הר רקמה לכתמים. הכן אספקה נוספת כולל תלושי כיסוי זכוכית, פיפטה P200, 200 μL פיפטה טיפים, מספריים, תגבורת ברורה, מלקות קצה ישר, אנטי עמעום פלורסנט הרכבה מדיה, לק, ותיבה כהה כדי לכסות את השקופיות.
  2. תייג את השקופית כדי לזהות את הדגימות ולנקות את השקופית באמצעות קימוויפ כדי לוודא שאין כתמים.
  3. כדי להבטיח שדגימות ההמיטהורקס לא יינזקו על-ידי תעודת הכיסוי, בנה "גשר" באמצעות תוויות חיזוק. לוקחים תווית חיזוק אחת, חותכים אותה לשניים, ומלמקם כל חצי כ-15 מ"מ זה מזה. מרחק זה חייב להיות קטן יותר מרוחב תעודת הכיסוי. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להשלים "גשר" בגובה 5 תוויות.
  4. קח את הפיפטה P200 ולשנות עצה על ידי חיתוך1/5 th של הקצה כדי להעביר את הדגימות לשקופית. יש להעביר דגימות אל המגלשה במרכז הגשר.
  5. קח את הקצה של מחיקת מעבדה ולהסיר כל PBST עודף. באמצעות מקציות, לסדר את DLMs כך שכל הדגימות פונים לצד השריר כלפי מטה וצד הציוף כלפי מטה.
  6. באמצעות קצה פיפטה P200 רגיל, להחיל 70 μL של מדיה הרכבה על השקופית, הימנעות בועות אוויר. לחלק את התקשורת בתבנית מעגלית בתוך התגבורת החל מבחוץ למרכז.
  7. מניחים תלוש כיסוי מעל התגבורת.
  8. השתמש לק לציפוי הקצוות החיצוניים סביב ההיקף של כיסוי. למרוח בנדיבות כדי ליצור חותם מלא של הרקמה.
  9. מניחים את המגלשה על משטח שטוח בחושך, ומאפשרים לפחות 10 דקות לייבש ולמנוע הלבנת תמונות או אובדן פלואורסץ. כעת ניתן להשתמש בשקופית להדמיה מיידית, או לאחסן בדרך אחרת בתיקיית שקופיות ב- -20 °C לתצוגה מאוחרת יותר.

7. חלופה: הכתמה עם נוגדנים ראשוניים

הערה: סעיף זה הוא אופציונלי ויש להשתמש בו ישירות בין סעיפים 4 ו- 5 אם תרצה.

  1. כדי להכתים רקמה עם נוגדנים ראשוניים, לשקוע רקמת חיץ חסימה לפחות 1 שעות.
  2. הכן נוגדן ראשי עם דילול נכון בחסימת מאגר. לכל הפחות, להכין מספיק תערובת נוגדנים יש 150 μL לכל קבוצה. שים לב שהדגימות לא נשמרות. יש לאחסן ב-4°C עד להכנה לשימוש.
  3. הסר מאגר חסימה עודף באמצעות פיפטה פסטר. מערבולת קצרה הנוגדן הראשי ולהוסיף 150 μL של תערובת נוגדנים לכל קבוצה ולמקם דגימות ב 4 מעלות C לילה.
  4. ביום שלמחרת, להסיר נוגדן ראשי ולשטוף רקמת 4 פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל אחד על סיבוב.
  5. הכן כתמים משניים במאגר חסימה. הוסף את הכתם המשני לדגימה ולאחר מכן לשמור אותו טמפרטורת חדר במשך 2 שעות בתיבה כהה על המסובב.
    הערה: הכתמים המשניים יכולים לכלול גם HRP ופאלואידין.
  6. לאחר הדגירה 2 שעות, כדי להסיר את רקמת לשטוף כתמים משני 4 פעמים במשך 5 דקות עם PBST ולהמשיך הרכבה.

Representative Results

הדור של זבובים טרנסגניים המביעים חלבון זפת מחייב אנושי של מוטציה 43 kDa (TDP-43M337V)מיוצג על ידי השרטוט(איור 1A). פעולה זו מדגימה את היישום של מערכת Gal4/UAS הבינארית ב Drosophila27. האיור מתאר המיטוהורקס עם שישה סיבי שריר, A\u2012F הולך מסיב הגב ביותר A ל F האוורירי ביותר(איור 1B)11,,12. כדי להעריך את שלמות סינפטית, NMJs היו מוכתמים HRP ופאלודין (איור 1C\u2012E). נוירונים מוטוריים במוטציות TDP-43M337V (איור 1F)יש מעט עד ללא כתמי HRP עד יום 21, בעוד WT (אורגון-R) נשארשלם (איור 1C). אין הבדלים גלויים בהכתמת שרירים (איור 1D,G). השינויים מורפולוגיה ברוטו שנצפו ב מוטציות TDP-43M337V מדגים כיצד שלמות סינפטית יכולה להיות מעורבת במודל מחלה ניוונית של טרשת רוחבית amyotrophic (ALS) באמצעות מודל DLM למבוגרים. בנוסף כתמים מבניים, הכתמת NMJs DLM יכול גם לספק הערכה של שלמות סינפטית עם presynaptic (איור 2A\u2012R) ופוסט synaptic (איור 2S\u2012X) סמנים. יחד, תוצאות אלה להמחיש כיצד פרוטוקול פעולה זה יכול להיות מיושם על לימוד רקמת DLM במחלות ניווניות.

היבט מרכזי אחד של דיסטוריה זו היא היישום של חנקן נוזלי פלאש להקפיא את הרקמה כדי להפוך את bisection קל יותר. השירות של חנקן נוזלי מדגים זבובי WT עם חנקן נוזלי שבו רקמת שריר אין נזק או סיביםחתוך (איור 3A\u2012C). ללא חנקן נוזלי, הרקמה יכולה להיות קשה יותר לנתח. לדוגמה, בעקבות פרוטוקול זה ודילוג על שלב ההקפאה של הבזק חנקן נוזלי מאפשר לרקמות להיות רגישות יותר לנזק מכלי הניתוח כגוןנוירונים פגומים (איור 3D)או סיבי שרירפגומים (איור 3E). היישום של חנקן נוזלי מסייע למנוע נזק לרקמות שעלול להתרחש בעת עבודה עם רקמת DLM ללא קשר לגנוטיפ של הדגימה(איור 3C ו 3F).

Figure 1
איור 1: התרפסות הדרגתית של סינמפסות DLM במודל Drosophila של ALS. (א)הדור של זבובים טרנסגניים ALS המביעים צורה מוטנטית אנושית של חלבון זפת מחייב של 43 kDa (TDP-43) מוצגים בסכמטי. (ב)האיור מתאר את הצורה והכיוון של המיטוהרקס בדרוסופילה בוגרת. באמצעות הפרוטוקול, אנו יכולים לצפות באובדן הדרגתי של שלמות סינפטית של סינפסות DLM NMJ באמצעות כתם מבני של נוירונים מוטוריים עם HRP (ירוק) ורקמות שריר עם פאלואידין (מגנטה). המודל שלנו מתאר את אובדן שלמות סינפטית במודל בוגר של ALS באמצעות הדור של זבובים בוגרים המביעים מוטציה של TDP-43אנושי M337V בנוירונים מוטוריים (איור 1F\u2012H) בהשוואה WT ( איור 1C\u2012E)זבוביםבסיבי שריר C. החצים מדגישים דוגמאות של סינפסה WT (איור 1C) ודוגמה לאובדן שלמות סינפטית. סרגל קנה מידה =20 μm בהגדלה 63x. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הערכת שלמות סינפטית באמצעות סמנים פרה-סינפטיים ב-NMJs למבוגרים. ניתן גם להעריך את שלמות סינפטית באמצעות סמנים פרסינפטיים ו postsynaptic בזבובי WT כי הם 14 ימים ישנים בסיבי שריר C. סמנים presynaptic Synapsin (B), Syntaxin (H), ו Bruchpilot (BRP) (N) מוכתמים יחד עם HRP (A, G, M). הכתמים מתארים את ההתמקמות של סמנים אלה למסופים הקדם-סינפטיים (C, I, O). בהגדלה גבוהה יותר, התמונות ממחישות את ההתקליזציה של Synapsin (E), Syntaxin (K) ו BRP (Q) עם HRP (D, J ו- P) בפירוט רב יותר (איור F, L ו- R). אנו גם מראים קולטן גלוטמט סמן postsynaptic III (GluRIII) (T)שיתוף מוכתם עם HRP (S). ההכתמה ההתקוטה התועלת מדגימה את התועלת של סמנים אלה (U). בהגדלה גבוהה יותר, התמונות המייצגות מדגימות את הלוקליזציה (X) של GluRIII (W) ו-HRP (V) לרקמות השריר הפוסט-סינפטיות ולמסופים הטרום-סינפטיים, בהתאמה. סרגל קנה מידה עבור לוחות A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U מייצגים 20 μm בהגדלה של פי 63. סרגל קנה מידה עבור לוחות D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R ו- 2V-2X מייצג 10 μm בהגדלה של פי 63. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כלי חנקן נוזלי עבור דיסטורי DLM. כדי להדגים את השירות של חנקן נוזלי עבור ניתוחי DLM, אנו מראים השוואה של היום 21 WT זבובים עם ובלי חנקן נוזלי מסיב שריר C. עם חנקן נוזלי, פאלואידין(B)נשאר שלם ואינו מסכן את כתמי HRP (A, C). ללא חנקן נוזלי, רקמת השריר הופכת לחוטית וקשה לגז (E) וכתמים HRP (D, F) הופך בסכנה עקב שגיאה טכנית. חצים לבנים מראים אזור ללא נזק לשרירים עם חנקן נוזלי(B)ורקמות שריר פגומות(E). סרגל קנה מידה = 20 μm בהגדלה 63x. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

באמצעות השיטות המתוארות בפרוטוקול זה, אנו מספקים גישה פשוטה עבור פירוק של רקמת DLM ולהדגים כיצד ניתן להחיל זאת כדי להעריך את שלמות סינפטי באמצעות כתמים מבניים סמנים סינפטיים ב Drosophila למבוגרים. צעד קריטי אחד בפרוטוקול שעושה את רקמת DLM קל יותר לנתח הוא הקפאת הבזק עם חנקן נוזלי. ללא שלב זה, הרקמה היא פחות מוצקה וקשה יותר לחתוך בדיוק כפי שנצפה איור 3. פרוטוקול זה מתבסס על שיטות פעולה קודמות כדי לאפשר שימור של נוירונים מוטוריים ורקמות שריר18,19,20,21,22,23. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי בעת ביצוע החתך את קו האמצע עבור bisection, זה יכול להיות קשה לקבל שתי הכנות נקיות לכל בית החזה. דרך אחת להבטיח לפחות המיטוהורקס אחד לכל זבוב, אתה יכול בכוונה לחתוך לצד אחד של בית החזה כדי לקבל הכנה אחת נקייה. עם שינוי זה, ייתכן שיהיה עליך גם להסיר רקמה עודפת נוספת מהחתך כדי לנקות את הדגימה עם מפסק הלהב. עבור אלה החדשים בטכניקה זו, עם תרגול מתמשך, דיוק bisection יגדל.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחוקרים להעריך בקלות את השלמות המבנית של NMJs DLM למבוגרים בכל עת לאורך תוחלת החיים שלהם. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה היא היכולת לגשת שלמות סינפטית במודלים של מחלות ניווניות באמצעות סמנים סינפטיים. אנו מדגימים כי יישום זה יכול לעזור לדמיין שינויים מורפולוגיה ברוטו עם כתמים מבניים (איור 1C\u2012H). בנוסף, ניתן להעריך שלמות סינפטית עם כתם של סמנים presynaptic כולל אך לא רק Synapsin28 (איור 2A\u2012F), Syntaxin29 (איור 2G\u2012L) ו BRP30 (איור 2M\u2012R). רקמת השריר postsynaptic ניתן גם להעריך באמצעות נוגדן המשנה קולטן גלוטמט III31 (איור 2S\u2012X), המדגים את השירות של פרוטוקול זה.

החוקרים יכולים גם להשתמש בשיטת ניתוח זו כדי להשלים נתונים פונקציונליים כדי לבחון באופן מקיף את השלמות המבנית של סינופסות הקשורות למגוון רחב של מחלות. סינאפסות אלה מאפשרות גם ניתוח פונקציונלי באמצעות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות32,33,34 וטיסה10. פרוטוקול זה יכול גם לספק נוחות גישה לרקמות עבור יישומים רבים ואסה. מחקרים עתידיים, לדוגמה, יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לכמת שינויים סינפטיים באמצעות כימות הצפיפות ומספר הסינאפסות15,16. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן בוחן באופן ספציפי שלמות סינפטית של נוירונים מוטוריים, פרוטוקולים משלימים להערכת אובדן תאי שריר יכול להתבצע גם עם ניתוח זה באמצעות הכתמת TUNEL35. כדי לבחון אובדן עצבי, ניתוח של גנגליון בית החזה36 יכול לשמש גם עם כתמי TUNEL. אנו מצפים כי הניתוח המתואר כאן יהיו יישומים נוספים מחקרים עתידיים הערכת פתולוגיות הקשורות לגיל, כמו גם מחלות ניווניות.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 NS110727) ל-D.T.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Tissue preservation
Alexa Fluor 568 goat anti mouse Fisher Scientific A11031 Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit Fisher Scientific A11036 Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
anti- Bruchpilot (BRP) antibody Developmental Studies Hybridoma Bank NC82 Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.
anti-GluRIII antibody Gift from Aaron DiAntonio N/A Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.
anti-Synapsin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3C11 Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.
anti-Syntaxin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 8C3 labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.
BenchRocker Genesee Scientific 31-302 Rotating samples during staining
Blade Breaker Fine Science Tools 10053-09 Used for holding feather blade
cover slips Fisher Scientific 12548A For mounting tissue
cryogenic gloves VWR 97008-198 protect hands from liquid nitrogen
cryogenic tweezers VWR 82027-432 Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen
dewar flask-1900 mL Thomas Scientific 5028M54 Hold liquid nitrogen
Feather Blades Electron Microscopy Sciences 72002-01 Scalpel Blades
Fine Forecps x 2 Fine Science Tools 11252-20 One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.
FITC-conjugated anti HRP Jackson Laboratories 123-545-021 Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration
freezer box (Black) Fisher Scientific 14100F Protects samples from light
glass pasteur pipettes VWR 14637-010 Used to transfer samples
glass slides Fisher Scientific 12550143 For mounting tissue
mounting media (vectashield) anti-fade VWR 101098-042 Mounting media retains fluorescent signaling
nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 Seals microscope slides
normal goat serum Fisher Scientific PCN5000 Prevents non-specific binding of antibodies
paint brush Genesee Scientific 59-204 Transferring flies
PBS Fisher Scientific 10-010-023 Saline solution for dissecting and staining
Phalloidin 647 Abcam AB176759 Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration
plastic petri dish (100 mm) VWR 25373-100 Dissection dish
reinforcement labels W.B. Mason AVE05722 Provides support for glass coverslip over the mounted tissue
sharpening block Grainger 1RDF5 Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair
slide folder VWR 10126-326 Sample storage
standard office scissors W.B. Mason ACM40618 Cutting reinforcement labels
Sylgard 184 Electron Microscopy Sciences 24236-10 Coating for dissection dish
Triton-X-100 Electron Microscopy Sciences 22140 Helps to permeabilize tissue
Vannas Disssection Sissors Fine Science Tools 1500-00 Ued for removing fly legs and making an incision on thorax

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS. Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).
  2. Lodato, M. A., et al. Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons. Science. 359, 555-559 (2018).
  3. López-Erauskin, J., et al. ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS. Neuron. 100, 816-830 (2018).
  4. Munsie, L., et al. Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N. Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).
  5. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Aβ and synaptic dysfunction. Neuron. 39, 409-421 (2003).
  6. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science. 298, 789-791 (2002).
  7. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).
  8. Jan, L., Jan, Y. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).
  9. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  10. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).
  11. Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
  12. Fernandes, J., VijayRaghavan, K. The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster. Development. 118, 215-227 (1993).
  13. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
  14. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila. Development. 125, 1769-1779 (1998).
  15. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila. Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).
  16. Hebbar, S., Fernandes, J. J. A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila. Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).
  17. Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. A tripartite synapse model in Drosophila. PloS One. 6, (2011).
  18. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).
  19. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).
  20. Llamusi, B., et al. BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Disease Models & Mechanisms. 6, 184-196 (2013).
  21. Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila. Development. 140, 136-146 (2013).
  22. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464, 287-291 (2010).
  23. Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance. Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).
  24. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila. Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).
  25. Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).
  26. Ritson, G. P., et al. TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97. Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  28. Klagges, B. R., et al. Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila. Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).
  29. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).
  30. Wagh, D. A., et al. a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
  31. Marrus, S. B., DiAntonio, A. Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release. Current Biology. 14, 924-931 (2004).
  32. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).
  33. Maccioni, R., et al. Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS. Scientific Reports. 8, 16002 (2018).
  34. Siddiqi, O., Benzer, S. Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).
  35. Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation. Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).
  36. O'Sullivan, A., et al. Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight. Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).

Tags

מדעי המוח גיליון 159 שרירי אורכי גב DLMs צומת עצבי שרירי NMJ ניוון עצבי Drosophila אימונוהיסטוכימיה IHC גיל
הדמיה ניוון סינפטי ב <em>דרוזופילה למבוגרים</em> בשיתוף עם ניוון עצבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sidisky, J. M., Babcock, D. T.… More

Sidisky, J. M., Babcock, D. T. Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (159), e61363, doi:10.3791/61363 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter