Summary
We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.
Abstract
Genexpressieanalyse van menselijk nierweefsel is een belangrijk hulpmiddel om homeostase en ziektepathofysiologie te begrijpen. Het verhogen van de resolutie en diepte van deze technologie en het uitbreiden ervan tot het niveau van cellen in het weefsel is nodig. Hoewel het gebruik van single nuclear en single cell RNA sequencing wijdverspreid is geworden, behouden de expressiehandtekeningen van cellen verkregen uit weefseldissociatie geen ruimtelijke context. Lasermicrodissectie (LMD) op basis van specifieke fluorescerende markers zou de isolatie van specifieke structuren en celgroepen van belang met bekende lokalisatie mogelijk maken, waardoor ruimtelijk verankerde transcriptomische handtekeningen in nierweefsel kunnen worden verwerving. We hebben een LMD-methodologie geoptimaliseerd, geleid door een op fluorescentie gebaseerde vlek, om vijf verschillende compartimenten in de menselijke nier te isoleren en daaropvolgende RNA-sequencing uit waardevolle menselijke nierweefselmonsters te geleiden. We presenteren ook kwaliteitscontroleparameters om de toereikendheid van de verzamelde specimens te kunnen beoordelen. De workflow die in dit manuscript wordt beschreven, toont de haalbaarheid van deze aanpak om subsegmentale transcriptomische handtekeningen met veel vertrouwen te isoleren. De hier gepresenteerde methodologische benadering kan ook worden toegepast op andere weefseltypen met vervanging van relevante antilichaammarkers.
Introduction
Technologische vooruitgang bij het bestuderen van weefselmonsters heeft het begrip van de gezondheidstoestand en ziekte in verschillende organen verbeterd. Dergelijke vooruitgang heeft onderstreept dat pathologie kan beginnen in beperkte regio's of in specifieke celtypen, maar toch belangrijke implicaties heeft voor het hele orgaan. Daarom is het in het huidige tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde belangrijk om de biologie op zowel cel- als regionaal niveau te begrijpen en niet alleen wereldwijd1. Dit geldt met name voor de nier, die bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen en structuren die differentieel initiëren en/of reageren op pathologische stress. De pathogenese van verschillende soorten menselijke nierziekte is nog steeds niet goed begrepen. Het genereren van een methodologie om veranderingen in genexpressie in specifieke buisvormige segmenten, structuren of gebieden van het interstitium in de menselijke nier te bestuderen, zal het vermogen vergroten om regiospecifieke veranderingen te ontdekken die kunnen informeren over de pathogenese van ziekte.
Menselijke nierbiopsie-exemplaren zijn een beperkte en kostbare hulpbron. Daarom moeten technologieën die transcriptomics in nierweefsel ondervragen, worden geoptimaliseerd om weefsel te bezuinigen. De beschikbare methoden om transcriptomics op cel- en regionaal niveau te bestuderen omvatten single cell RNA sequencing (scRNaseq), single nuclear RNaseq (snRNaseq), in situ spatial hybridization en laser microdissection (LMD). Dit laatste is zeer geschikt voor een nauwkeurige isolatie van regio 's of structuren die van belang zijn binnen weefselsecties , voor downstream RNA-sequencing en -analyse2,3,4,5. LMD kan worden gebruikt om te vertrouwen op identificatie van specifieke celtypen of structuren op basis van gevalideerde markers met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming tijdens dissectie.
De unieke kenmerken van lasermicrodissectie ondersteunde regionale transcriptomics omvatten: 1) het behoud van de ruimtelijke context van cellen en structuren, die eenmalige celtechnologieën aanvult waar cellen worden geïdentificeerd door expressie in plaats van histologisch; 2) de technologie informeert en wordt geïnformeerd door andere beeldvormingstechnologieën omdat een antilichaammarker expressiehandtekeningen definieert; 3) het vermogen om structuren te identificeren, zelfs wanneer markers veranderen in ziekte; 4) detectie van laag uitgedrukte transcripties in ongeveer 20.000 genen; en 5) opmerkelijke weefseleconomie. De technologie is schaalbaar voor een nierbiopsie met een dikte van minder dan 100 μm van een kern die nodig is voor voldoende RNA-acquisitie en maakt het gebruik van gearchiveerd bevroren weefsel mogelijk, dat algemeen beschikbaar is in grote repositories of academische centra6.
In het daaropvolgende werk beschrijven we de regionale en bulk transcriptomics-technologie in detail, geoptimaliseerd met een nieuw protocol voor snelle fluorescentiekleuring voor gebruik met menselijk nierweefsel. Deze aanpak verbetert klassieke LMD-verkenningen omdat het afzonderlijke expressiegegevens biedt voor de subsegmenten interstitium en nephron in tegenstelling tot geaggregeerde tubulo-interstitiële expressie. Inbegrepen zijn de kwaliteitsborgings- en controlemaatregelen die zijn genomen om strengheid en reproduceerbaarheid te waarborgen. Het protocol maakt visualisatie van cellen en interessegebieden mogelijk, wat resulteert in een bevredigende verwerving van RNA uit deze geïsoleerde gebieden om downstream RNA-sequencing mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd voor gebruik door de Institutional Review Board (IRB) van de Indiana University.
OPMERKING: Gebruik dit protocol met niernefrectomieweefsel (tot 2 cm in zowel de X- als de Y-afmetingen) dat bewaard is gebleven in de optimal cutting temperature (OCT) verbinding en bewaard bij -80 °C. Voer al het werk uit op een manier die RNA-vervuiling beperkt, gebruik schone wegwerphandschoenen en een gezichtsmasker. Zorg voor de netheid van alle oppervlakken. De apparatuur waarvoor dit protocol is geoptimaliseerd, is een lasermicrodissectiesysteem met gepulseerde UV-laser.
1. Cryosectioning
- Stel 1,2 μm LMD PPS-membraan (poly(p-fenyleensulfide) dia's gedurende 30 minuten bloot aan UV-licht (in een weefselkweek laminaire stroomkap), vlak voor cryosectioning. Bewaar de dia's op kamertemperatuur voor optimale weefselaanh hechting.
- Koel de cryostaat tot -20 °C. Reinig de werkoppervlakken en installeer een nieuw snijblad.
- Plaats een kleine schuifdoos (gereinigd met RNase oppervlaktedecontaminatieoplossing) in de cryostatkamer om dia's met vers gesneden weefsel op te slaan.
- Bevestig het monster in OCT aan een weefselhouder en laat het enkele minuten in evenwicht zijn om de kamertemperatuur te bereiken en de hechting tussen het OCT-blok en de houder te versterken. Help het proces met behulp van een warmteafzuiger.
- Snijd het monster tot een dikte van 12 μm en breng het aan op de gespecialiseerde LMD-dia met behulp van de schuifadapter. Elke dia bevat één nefrectomiesectie per dia of maximaal twee nierbiopsiesecties per dia. Bewaar de glijbanen op -80 °C met een droogmiddelpatroon en in een goed gesloten plastic zak om te voorkomen dat overtollig vocht zich ophoopt in de schuifdoos.
- Label elke dia met een voorbeeld-ID, datum en dianummer.
- Gebruik de dia's met monsters binnen 10 dagen na de begindatum van cryosectioning.
2. Laser microdissectie
- Bereid vlak voor de kleuring de Antilichaammix (Ab-Mix) in 10% BSA in RNase-vrije PBS door het volgende toe te voegen: 4 μL FITC-Phalloidine, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antilichaam direct geconjugeerd naar Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitor en 89,2 μL van 10% BSA in PBS (om een volume van 100 μL te bereiken).
OPMERKING: Alternatieve antilichamen kunnen worden gebruikt in plaats van het THP-antilichaam. Bijvoorbeeld, 2 μL megalin/LRP2 antilichaam, direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 568, kan worden gebruikt om de proximale tubule te labelen. De Ab-Mix bevat LRP2- of THP-antilichamen (om respectievelijk proximale tubuli of dikke opgaande ledematen te visualiseren). Andere antilichamen kunnen worden gevalideerd op basis van de behoeften van de gebruiker. - Was de glijbaan in ijskoud (-20 °C) 100% aceton gedurende 1 minuut en verplaats deze naar de vochtigheidskamer.
- Was de bovenkant van de glijbaan met RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
- Was de bovenkant van de glijbaan met 10% BSA in RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
- Breng de Ab-Mix 5 min aan.
- Was de bovenkant van de glijbaan met 10% BSA in RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
- Droog de glijbaan 5 minuten aan de lucht en laad deze op het laser microdissectie snijplatform.
- Installeer de opvangbuizen (autoclaved 0,5 ml microcentrifugebuizen) die geschikt zijn voor PCR-werk en die 50 μL extractiebuffer uit de RNA-isolatiekit bevatten.
- Ga verder met LMD. Voltooi elke LMD-sessie binnen ten hoogste 2 uur.
- Verzamel pre- en post-LMD-immunofluorescentiebeelden, met behulp van de microscoopcamera om de dissectie te valideren voor interoperatorvariabiliteit, evenals archiefdoeleinden, training en kwaliteitsbeoordeling van het uitgevoerde protocol. Om 0,5 – 1 ng RNA te verkrijgen, is een minimum van 500.000μm 2-gebied vereist. Dit vereist vaak het gebruik van maximaal 8 x12 μm dikke secties om een voldoende hoeveelheid materiaal te verkrijgen voor alle subsegmenten van belang.
- Identificeer interessegebieden door kleuring, morfologie en locatie en verwijder ze met laservermogen groter dan 40.
OPMERKING: Hier zijn de dissectiecriteria. De proximale tubule wordt gedefinieerd door FITC-Phalloidin en LRP2-etikettering. Het dikke oplopende ledemaat wordt gedefinieerd door THP-etikettering. Het verzamelkanaal wordt gedefinieerd door nucleaire morfologie (DAPI) en afwezigheid van andere vlekken. De glomerulus wordt gedefinieerd door FITC-Phalloidin en morfologie. Het interstitium wordt gedefinieerd als het gebied tussen bevlekte tubuli.
- Verkrijg een bulk transversale expressiehandtekening door twee secties van 12 μm op een LMD-dia aan te brengen en de hele secties in extractiebuffer te ontleden.
- Na voltooiing van het LMD-proces sluit u de verzamelmicrocentrifugebuizen en veegt u deze krachtig om ervoor te zorgen dat de inhoud van de dop naar de onderkant van de buis wordt verplaatst
- Centrifugeer de buizen op 3.000 x g gedurende 30 s.
- Incubeer de buizen gedurende 30 minuten in een waterbad van 42 °C.
- Centrifugeer de buizen gedurende 2 minuten op 3.000 x g.
- Breng de supernatant over in een nieuwe buis van 0,5 ml en bewaar deze in -80 °C.
3. RNA-isolatie
OPMERKING: Voor dit RNA-isolatieprotocol hebben we een protocol aangepast van een commerciële RNA-isolatiekit. Het protocol van de fabrikant is aangepast om te voldoen aan de kwaliteitscontrolevereisten voor het project.
- Voeg 250 μL geconditioneerde buffer (CB) toe aan elke RNA-zuiveringskolom (PC) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer alle pc's gedurende 1 min bij 16.000 x g.
- Voeg 50 μL 70% ethanol (meegeleverd in de Kit) toe aan de buizen met weefselmonsters. Meng de monsters goed door op en neer te spuiten. Niet vortex. Niet centrifugeren.
- Breng het mengsel over in geconditioneerde pc's en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 100 x g (om RNA te binden), volg snel met centrifugeren gedurende 30 s bij 16.000 x g (om de stroom erdoorheen te verwijderen). Herhaal deze stap als er meer dan 1 buis met weefselmonsters beschikbaar is voor een bepaald subsegment.
- Voeg 100 μL Wash Buffer 1 (WB1) toe aan de pc's en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g.
- Bereid 40 μL DNase per monster voor (Voeg 5 μL DNase toe aan 35 μL RDD-buffer). Voeg vervolgens 40 μL van het mengsel direct toe aan het membraan van de pc en incub gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 40 μL WB1 toe aan het membraan van de pc en centrifugeer gedurende 15 s bij 8.000 x g.
- Voeg 100 μL Wash Buffer 2 (WB2) toe aan het pc-membraan en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g.
- Voeg 100 μL WB2 toe aan het membraan van pc, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 x g, onmiddellijk gevolgd door centrifugeren gedurende 1 min bij 16.000 x g.
- Breng de pc over naar een nieuwe buis van 0,5 ml.
- Voeg 12 μL Elution Buffer (EB) toe aan het membraan en incub gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke volume van alle samengevoegde ontlede weefselmonsters is dus 12 μL per subsegment.
- Centrifugeer de monsters gedurende 1 min bij 1.000 x g en vervolgens gedurende 2 minuten bij 16.000 x g.
- Breng 2 μL over in een verse buis voor Bioanalyzer-analyse (om vriesdooigebeurtenissen te voorkomen).
- Bewaar alle buizen in -80 °C tot ze klaar zijn voor verdere verwerking.
4. RNA-sequencing
- Beoordeel elk monster, bedoeld voor sequencing, op kwaliteit met behulp van een commerciële Bioanalyzer en een chip die is gewijd aan het meten van kleine hoeveelheden RNA.
- De volgende parameters voor kwaliteitscontrole (QC) voorafgaand aan de voorbereiding en sequencing van de bibliotheek zijn vereist: hoeveelheid RNA groter dan 4 ng voor bulk en groter dan 0,5 – 1 ng voor elk subsegment; Het percentage transcripties langer dan 200 nucleotiden (DV200) moet groter zijn dan 25% voor LMD-specimens (optimaal > 75%).
- Voer de voorbereiding van de bibliotheek uit met een commerciële cDNA-bibliotheekvoorbereidingskit die bedoeld is voor kleine hoeveelheden gedegradeerd RNA. Voor de commerciële kit vermeld in het supplement, raden wij het gebruik van Optie 2, die een minimum DV200 van 25% en geen fragmentatie vereist. Sommige sequencingtechnologieën vereisen mogelijk hogere minimale DV200-drempels, zoals 30%7.
- Voeg cDNA-adapters en indexen toe.
- Zuiver de RNAseq-bibliotheken met behulp van magnetische kraaltechnologie.
- Put de ribosomale cDNA uit met behulp van een commerciële rRNA-verwijderingskit voordat de RNAseq-bibliotheekversterkingsstap wordt uitgevoerd.
- Zuiver de uiteindelijke RNAseq-bibliotheek met behulp van magnetische kraaltechnologie bij een cDNA-bibliotheekconcentratie van 2 ng/μL.
- Voer RNA-sequencing uit van 75 bp gekoppeld uiteinde op een commercieel sequencingsysteem met 30 miljoen reads/sample voor bulk en 100 miljoen reads/sample voor subsegmentale secties.
- Gebruik een referentie-RNA (25 μg) bij elke sequencingrun om het batch-effect te regelen. De initiële concentratie van ons referentie-RNA is 1 μg/μL, terwijl de uiteindelijke concentratie die in sequencing wordt gebruikt 25 ng/μL is. Voer het referentie-RNA uit als een afzonderlijk monster tijdens de bibliotheekvoorbereiding en voer elke keer met alle LMD-specimens uit.
- Voer gegevensanalyse uit met behulp van de FastQC-applicatie om de kwaliteit van sequencing, intergene en mitochondriale reads te beoordelen en om leesbewerkingen te bepalen die aan een gen worden toegeschreven.
- Gebruik Integrative Genomics Viewer (IGV) voor uitlijning en edgeR/rbamtools voor transcriptieexpressiemetingen.
- Verwijder monsters met minder dan 100.000 leesbewerkingen. Quantile normaliseert de ruwe waarden in de gegevensset na het filteren van laag uitgedrukte genen op een door de gebruiker gedefinieerde drempelwaarde.
- Kwantificeer de expressie als een verhouding tussen het subsegment van belang en het gemiddelde van alle andere subsegmenten en log2-transformatie. De relatieve expressie van hetzelfde gen kan worden vergeleken in subsegmenten en monsters; het is echter niet ideaal om relatieve expressie tussen twee verschillende genen te vergelijken vanwege mogelijke verschillen in afbraak tussen genen en RNA-soorten.
- Voer een verrijkingsanalyse uit om genexpressie te vergelijken voor een reeks makers die specifiek zijn voor elk nephron-subsegment, terwijl referentie-RNA-monsters in batches worden vergeleken. Een batch-effect binnen 1 standaardafwijking van gemiddelde expressie met R-waarde > 0,9 wordt als acceptabel beschouwd. Extra normalisatie is vereist voor een hogere batch-effectscore. Elke uitvoering die afwijkt van het geaccepteerde batch-effect kan worden gemarkeerd. De Q30 moet groter zijn dan >90% voor elke sequencingrun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monsters
We presenteren gegevens van negen referentie nefrectomieën (3 exemplaren verkregen aan de Indiana University en 6 specimens verkregen via Kidney Precision Medicine Project), gebruikmakend van het rapid fluorescence kleuringsprotocol om niernefronsegmenten en interstitiële gebieden te isoleren. De secties die in dit proces werden gebruikt, werden verkregen van overleden nierdonoren of niet-aangetaste tumornectectomie. Deze monsters hadden geen pathologisch bewijs van ziekte zoals gevisualiseerd in de H&E-vlek uit aaneengesloten secties (figuur 1A).
Laser Microdissectie Kwaliteitscontrole
Identificatie van buisvormige subsegmenten in de nier wordt bereikt door antilichaamkleuring van unieke buisvormige markers, evenals morfologie en structurele oriëntatiepunten. Figuur 1B-C illustreert de kleuring en microdissectie van buisvormige subsegmenten uit een representatieve nefrectomie. Dit wordt bereikt door te beitsen met DAPI (kernen), FITC-Phalloidin (F-actine) en een extra antilichaam indien nodig. De gebruikte fluorescentiekleuring maakte het mogelijk om niersubsegmenten met een hoge mate van vertrouwen te visualiseren, verder geleid door morfologische kenmerken en ruimtelijke positionering van de beeldstructuren (figuur 2). Glomeruli worden bijvoorbeeld onthuld door falloline en DAPI-vlekken met een zeer onderscheidende morfologie. Op dezelfde manier worden verzamelkanalen gevisualiseerd met behulp van nucleaire morfologie en de afwezigheid van andere vlekken. Het megalin/LRP2 antilichaam (direct geconjugeerd naar Alexa Fluor 568) wordt hier gebruikt om proximale tubuli te identificeren. De dikke opgaande ledemaat wordt gevisualiseerd met behulp van een Tamm-Horsfall eiwit (THP) antilichaam (direct geconjugeerd naar Alexa Fluor 546). Daarentegen wordt het interstitium langs het buitenste membraan van de tubuli verwijderd en omvat het stromale en immuuncellen, evenals kleine haarvaten.
Om voldoende RNA van 0,5 – 1 ng per subsegment te verkrijgen, proberen we een minimumoppervlakte van 500.000 μm2te ontleden. Hiervoor zijn over het algemeen vijf tot acht 12 μm dikke secties (1 sectie per dia) nodig om voldoende materiaal voor alle subsegmenten te verkrijgen. Dissectie van een dia wordt voltooid in minder dan 2 uur om de RNA-kwaliteit te behouden, waardoor men ~ 4 segmenten per dia kan snijden. Verworven weefsel uit hetzelfde subsegment wordt samengevoegd van meerdere dia's voor downstream sequencing. Een pre- en post-LMD immunofluorescentiebeeld wordt verkregen om de verzameling van subsegmenten van belang te valideren met behulp van een aangesloten camera. Figuur 3 definieert de slagingspercentages van dissectiegebied en minimale RNA-input. Het slagingspercentage van het voldoen aan de minimale oppervlakte-invoer was >90% in deze representatieve gegevensset. Als het bronweefsel een kleine hoeveelheid van de CD of interstitium heeft, is er een mogelijkheid dat het dissectiegebied lager zal zijn dan 500.000 μm2 voor deze segmenten na gebruik van 8 dia's. Extra dia's kunnen worden gesneden, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker; echter, zoals te zien is in figuur 3, als het gebied dicht bij 500.000 μm2ligt , heeft het gewenste aantal gedetecteerde genen een hoog slagingspercentage (100%) en het totale leessuccespercentage is 98,6% (1 exemplaar viel onder de QC-metriek). Er was dus genoeg weefsel om voldoende gen- en leestellingen te bereiken zonder extra weefsel te gebruiken.
Kwaliteitscontrole van sequencing-invoer
Het geselecteerde commerciële bibliotheekvoorbereidings- en sequencingplatform maakt reproduceerbare metingen van transcriptieexpressie mogelijk, zelfs met lage hoeveelheden sterk gedegradeerd RNA. De minimale RNA-ingang is 500 pg en de minimale DV200 (verhouding van leeslengte langer dan 200 nucleotiden) is meer dan 25%. Er is geen minimale RIN. Sequencing met 100 miljoen reads per sample, we proberen de beschikbare reads te verzadigen om laag uitgedrukte transcripties te detecteren. Het totaal aantal leesbewerkingen kan worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker.
Het is eenvoudig om voldoende RNA te verkrijgen uit twee 12 μm bulkdoorsneden, dus we streven naar een hogere totale mRNA-minimumhoeveelheid van 4 ng voor bulksequentiering. Zoals afgebakend in het protocol, vereist elk subsegment 0,5-1 ng in totaal RNA. De optimale RNA-concentratie ligt na isolatie boven de 50 pg/μL. RNA-hoeveelheden die lager zijn dan dit, kunnen leiden tot verminderde gendetectie en waargenomen leestellingen. De meeste monsters leveren >20.000 gedetecteerde genen op en >1 miljoen reads. Een DV200 van meer dan 25% voor alle specimens is vereist door de fabrikant (>75% wordt als optimaal beschouwd). Hoewel RIN wordt gemeten, vermindert het proces van lasermicrodissectie RIN en zijn de RNA-sequencingplatforms geoptimaliseerd voor gefragmenteerd RNA. RNA-kwantiteit en -kwaliteit worden beoordeeld door een bioanalysant voorafgaand aan de sequencing. De snelle vlek vermindert de hoeveelheid tijd dat het weefsel wordt blootgesteld aan kamertemperatuur en waterige omstandigheden, waardoor de afbraak van RNA zoveel mogelijk wordt geminimaliseerd. De DV200-metriek voor kwaliteitscontrole voor sequencing-invoer is ook te vinden in figuur 3.
Kwaliteitscontrole van sequencing-uitvoer
Downstream-gegevensverwerking maakt gebruik van quantile normalisatie om vergelijking tussen monsters in verschillende batches mogelijk te maken. Een minimum aantal gendetecties van 10.000 en een minimale leestelling van 1 miljoen worden gebruikt als drempelwaarden om monsters op te nemen in kwantulair normalisatie. Monsters met lagere gendetectie of leestellingen zijn uitgesloten van quantile normalisatie en daaropvolgende vergelijkende analyses. Slechts 1 op de 98 ontleede subsegmentale monsters voldeed niet aan deze drempelwaarden (figuur 3). Het derde kwartaal (aandeel van de gelezen gegevens dat met een betrouwbaarheid van 99,9% in kaart is gebracht) is voor elk sequencing-experiment meer dan 93% geweest (figuur 4).
We sequentieren een menselijk referentie-RNA (25 ng) bij elke sequencingrun om correctie voor batch-effect mogelijk te maken als een dergelijke correctie gewenst of vereist is. Het gemeten batch-effect moet binnen 1 standaardafwijking van de gemiddelde expressie met een R-waarde > 0,9 liggen. Als het batch-effect hoger is, is extra normalisatie vereist voor die sequencing-uitvoering. Hier is het batch-effect lager dan 3% in de vier sequencing-experimenten in figuur 4. Batch-effect wordt dus meestal verholpen met quantile normalisatie voor alle sequencing-uitvoeringen, agnostisch voor het referentie-RNA. Er is nog geen correctie op basis van het referentie-RNA geïmplementeerd, maar deze informatie is beschikbaar en kan worden gebruikt afhankelijk van de doelstellingen van een bepaalde analyse.
Strengheid en reproduceerbaarheid
Het is belangrijk om strengheid aan te tonen bij het identificeren van celtypen en structuren. Na lasermicrodissectie testen we op de verrijking van bekende markers in de glomeruli, PT, TAL, CD en interstitium in vergelijking met de andere compartimenten (Tabel 1). Een verrijkingsanalyse wordt gebruikt om genexpressie te vergelijken voor vooraf bepaalde verwachte markers. Genexpressie wordt overgebracht als log 2-ratio's van de expressie van het subsegment van belang in vergelijking met het gemiddelde van de andere subsegmenten. Deze expressiemetriek is gekozen voor menselijke monsters omdat het de interpersoonlijke variabiliteit vermindert, waardoor vergelijkingen tussen cel- en compartimenttypen tussen specimens worden vergemakkelijkt. De ruwe leesbewerkingen en kwantificeerde genormaliseerde leesbewerkingen kunnen echter ook in alternatieve analyses worden vergeleken. Figuure 5 illustreert voorbeelden van immunohistochemische kleuring van deze 5 geselecteerde bekende markers, zoals gepresenteerd in de Human Protein Atlas.
Zo presenteren we orthogonale gegevensbronnen die vertrouwen geven aan het juiste subsegment dat wordt verzameld: 1) de beeldvorming die de antilichaamvlek en morfologie van het segment / compartiment omvat, en 2) de expressie-output met bekende markers wordt uitgedrukt in het overeenkomstige subsegment.
De regionale transcriptomische analyse van genen uitgedrukt in elk subsegment maakt nieuwe en ondergewaardeerde markeridentificatie mogelijk. Figuur 6 illustreert een voorbeeld van één marker voor elk subsegment geïdentificeerd door middel van LMD regionale transcriptomics die ook een specifieke immunohistochemische kleuring van het overeenkomstige nephron subsegment opleverden.
Om reproduceerbaarheid aan te tonen en het effect van operatorvariabiliteit te begrijpen, hebben we een experiment uitgevoerd op een tumornefrectomiemonster. Dit exemplaar had de glomeruli, PT en TAL opnieuw ontleed om het vertrouwen van de RNA-sequencingresultaten te vergroten en dient nu als een nuttige technische replicering. Maanden na elkaar onderging dit monster een tweede geval van cryosectioning, antilichaamkleuring, LMD-dissectie, RNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en RNA-sequencing (figuur 7) van de glomeruli-, PT- en TAL-compartimenten. De twee versies (v1 en v2) werden vergeleken. De compartimenten glomerulaire, PT en TAL waren sterk gecorreleerd met r2-waarden >0,95, vergelijkbaar met het minimale batch-effect van ons referentie-RNA.
Figuur 1: Representatieve beelden van het nierweefsel.
(A) H&E-vlek van een menselijk referentienierweefsel. (B) Immunofluorescent beeld van menselijk referentienierweefsel met bevlekte dikke oplopende ledemaatsegmenten voorafgaand aan LMD en (C) onmiddellijk na dissectie van enkele dikke oplopende ledemaatstructuur. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van referentie renale subsegmenten, gevisualiseerd op 20x met behulp van een specifieke immunofluorescente kleuringsbenadering.
(A) a Glomerulus, (B) Proximale Tubule, (C) Dikke opgaande ledemaat, (D) Verzamelkanaal, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 door ANOVA). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwaliteitscontrolestatistieken in segmentale transcriptomics.
(A) Meer dan 90% van de proefmonsters voldeed aan de ingangsdrempel van het dissectiegebied van 500.000 μm2. (B) Alle monsters, behalve één, voldeden aan de gewenste RNA-ingang van ten minste 500 pg. (C) 100% van de proefmonsters voldeed aan de minimale DV200-drempel van de fabrikant van 25% en (D) 100% van de monsters voldeed aan onze minimumdrempel van 10.000 gedetecteerde genen. (E) Alle monsters, met uitzondering van één, bereikten een totaal leesaantal van ten minste 1 miljoen. Zoals verwacht correleren lagere dissectiegebieden met verminderde RNA-concentraties, lagere gentellingen en lagere leestellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Volgorde kwaliteitscontrole.
(A) Sequencing-uitvoeringen met behulp van een referentie-RNA (niet gekwantificeerd genormaliseerd) worden vergeleken met de gemiddelde expressie van alle uitvoeringen. Er is een sterke correlatie met het minimale batch-effect (alle R >0,969). (B) Meer dan 93% van onze reads in alle runs werden met veel vertrouwen in kaart gebracht (Q30 of 99,9%). Houd er rekening mee dat Q30-waarden per rijstrook worden verstrekt met meerdere rijstroken per run. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van immunohistochemische kleuring om de geselecteerde bekende markers te identificeren.
Afbeeldingen zijn afgebeeld voor (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Immunohistochemiebeelden zijn afkomstig uit de Human Protein Atlas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van immunohistochemische kleuring ter illustratie van de expressie van niet-traditionele markergenen in relevante subsegmenten.
Afgebeelde transcripties met overeenkomstige immunohistochemie zijn (A) SHANK3 in glomerulus, (B) ACSM2B in proximale tubulus, (C) RAP1GAP in het dikke opgaande ledemaat en (D) L1CAM in het verzamelkanaal. Immunohistochemiebeelden zijn afkomstig uit de Human Protein Atlas. (*= p < 0,0001 door ANOVA) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Correlatie tussen twee verschillende dissecties met afzonderlijke sequencing van hetzelfde monster.
Er werd een hoge mate van correlatie waargenomen tussen verschillende dissecties in de (A) glomerulus, (B) proximale tubule en (C) dikke oplopende lus van Henle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Markering | Segment | Vouwwissel | p-Waarde |
| NPHS1 | Glomerulus | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Proximale Tubule | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Dik opklimmend ledemaat | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Het verzamelen van Kanaal | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Interstitium | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabel 1: Representatieve gemiddelde waarden voor elk subsegment van belang voor drie nefrectomiemonsters, in vergelijking met de resterende subsegmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transcriptomics op basis van LMD is een nuttige technologie die genexpressie verankert naar specifieke gebieden in het weefsel. De basis van deze technologie en de mogelijke toepassing ervan in de nier is eerder beschreven8. Optimalisatie, modernisering en stroomlijning van fluorescentie-gebaseerde dissectie specifiek gericht op hoge nauwkeurigheid dissectie voor downstream RNA sequencing is echter minder alomtegenwoordig. Omdat deze methodologie ruimtelijk geaard is in het weefsel, heeft het het potentieel om nieuwe of ondergewaardeerde markers in weefselstructuren te onthullen, vooral in ziektetoestanden. In feite kunnen veel gemeenschappelijke markers van cellen veranderen met ziekte, dus alleen vertrouwen op de cel RNA-expressiemarkers voor identiteitsberechting zonder de ruimtelijke context kan een uitdaging zijn in ziektetoestanden. Daarom zal de ruimtelijk verankerde LMD-benadering waarschijnlijk een basis-waarheidsplatform aanvullen en bieden voor vele andere transcriptomische technologieën zoals single cell en single nuclear RNA sequencing, die cellen definiëren door voornamelijk door hun genexpressieprofiel9. Bovendien biedt de diepte van de genexpressie van LMD (tot 20.000 genen per monster) een ander voordeel en belangrijke locatie om gegevens uit meerdere bronnen te koppelen en rekening te houden met veranderingen in genexpressie die mogelijk niet zichtbaar zijn zonder een bepaalde diepte. De overweging van weefseleconomie is een ander positief kenmerk van deze technologie, waarbij een dikte van minder dan 100 μm totaal uit een bevroren blok voldoende zou kunnen zijn voor een volledige LMD-dataset. Hierdoor kan overgebleven weefsel worden gebruikt voor andere analytische doeleinden.
De LMD heeft beperkingen. Een verwachte beperking van laser microdissectie transcriptomic data acquisitie is de lagere doorvoer aard. Toekomstige automatisering kan van belang zijn voor het verbeteren van de schaalbaarheid10,11. Twee extra beperkingen van LMD transcriptomics omvatten de afhankelijkheid van expertise en de impact van weefselkwaliteit op gegevensresultaten. Onbedoelde verzameling van cellen en materiaal buiten het interessesegment is een bekende beperking omdat verrijkte celcompartimenten worden verzameld, geen enkele cel. LMD vertrouwt op de vaardigheid van een gebruiker om de weefselstructuur te begrijpen en vereist daarom een bepaalde domeinexpertise. Individuen moeten dus worden opgeleid om relevante regio's in de nier te identificeren met en zonder antilichaamkleuring. Ten slotte kan het effect van weefselkwaliteit van invloed zijn op de downstreamgegevenskwaliteit. Het LMD-protocol leidt tot weefseldegradatie, dus de kwaliteit van het uitgangsmateriaal is belangrijk. Dit protocol werd echter geoptimaliseerd op gearchiveerde biopsieën met verschillende monsters van slechts matige kwaliteit. De opgenomen gegevens laten zien dat het geselecteerde transcriptomische platform robuust is.
De gebruikte isolatiekit en de downstreammethodologie van RNA-sequencing moeten specifiek worden afgestemd op de verwachte mate van RNA-degradatie. Het hier beschreven kleuringsprotocol werd aangenomen omdat het het meest gunstige effect had op het minimaliseren van een dergelijk effect. In dit protocol werd weefsel ingebed in LGO om toekomstige vergelijkingen tussen andere transcriptomische technologieën te vergemakkelijken. Formaline vast weefsel kan echter een alternatief zijn.
De gegevens in dit manuscript onthullen de voordelen van regionale transcriptomics, waaronder de optimalisatie, kwaliteitscontrolestatistieken en technologische resultaten. De vaststelling van strenge preanalytisch en analytisch kwaliteitscontrolecriteria en de vaststelling van solide bewijs van strengheid en reproduceerbaarheid is essentieel voor elke methodologie. Toekomstige toepassingen van regionale transcriptomics kunnen in grote lijnen worden gegroepeerd in biologische toepassingen, technische vooruitgang en analytische vooruitgang. Toekomstige biologische toepassingen kunnen gericht zijn op het ondervragen van weefsel van niet-gewonde, gewonde en regenererende tubuli, evenals tubuli in de nabijheid van ontstekingen. Deze compartimenten kunnen in dezelfde biopsie worden geïdentificeerd, zowel door traditionele morfologische markers als door antilichaamvlekken voor "pathway" specifieke markers. De twee antilichaammarkers gevalideerd voor gebruik in deze technologie, megalin en uromodulin, worden sterk uitgedrukt in respectievelijk de proximale tubulus en dikke opgaande ledemaat. Het is echter mogelijk dat deze markers worden verminderd in ernstig ziek weefsel. In deze situaties kan aanvullende antilichaamvalidatie van padspecifieke markers of nieuwe markers die hun expressieniveau niet wijzigen, dit probleem oplossen.
LMD is waarschijnlijk een geschikte methode om te gebruiken bij transcriptomic ondervraging van andere organen. De selectie en optimalisatie van antilichamen die werken voor snelle kleuring zal noodzakelijk zijn. Een antilichaam dat werkt in een regelmatig kleuringsprotocol werkt mogelijk niet noodzakelijkerwijs voor het snelle kleuringsprotocol, waarvoor waarschijnlijk antilichamen met hoge affiniteit nodig zijn. Een primair geconjugeerd antilichaam minimaliseert de stappen die nodig zijn en kan voordelen bieden. Vervoeging van een antilichaam tegen fluorforen kan echter de binding veranderen en proefexperimenten moeten worden uitgevoerd voordat deze reagentia in het protocol worden opgenomen.
Tot slot beschrijven we een pijpleiding voor lasermicrodissectie op basis van fluorescentie om specifieke gebieden en structuren in de menselijke nier te isoleren om een transcriptomische analyse mogelijk te maken. Deze aanpak biedt belangrijke voordelen en kan worden uitgebreid naar andere weefsels om een op weefsel gebaseerde moleculaire ondervraging te bieden. Regionale transcriptomics vullen andere transcriptomische technologieën aan door een histopathologisch anker te bieden om expressie te begrijpen, wat helpt bij de interpretatie van de biologie en de handtekening van gezondheid en ziekte. Deze technologie past van nature in de visie voor het bouwen van een transcriptomic atlas van de nier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Algemeen: De auteurs willen de onderzoekers van het Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) bedanken voor hun gracieuze steun en advies.
Financiering: De NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) heeft dit werk ondersteund; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Onderzoek in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), onder awardnummer U2CDK114886.
Beschikbaarheid van gegevens en materialen: Gegevens worden gearchiveerd in de Gene Expression Omnibus (GEO # pending)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
