Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur rheologischen Charakterisierung von Schleim vor, der sich auf Kiemenrechen (GRs) des Silberkarpfens befindet. Viskoelastische Eigenschaften von GR-Schleim, die durch Messung von Viskositäts-, Speicher- und Verlustmodulen erhalten werden, werden auf die scheinbare Streckgrenze untersucht, um den Filterfütterungsmechanismus in GRs zu verstehen.
Abstract
Der Silberkarpfen, Hypophthalmichthys molitrix, ist ein invasiver planktfressender Filterfüttererfisch, der aufgrund seines hocheffizienten Filterfütterungsmechanismus die natürlichen Wasserwege des oberen Mississippi-Beckens befallen hat. Die charakteristischen Organe, die als Kiemenrechen (GRs) bezeichnet werden und in vielen solchen Filterfütterern zu finden sind, erleichtern die effiziente Filtration von Lebensmittelpartikeln wie Phytoplankton, die einige Mikrometer groß sind.
Die Motivation, die Rheologie des GR-Schleims zu untersuchen, rührt von unserem Wunsch her, seine Rolle bei der Unterstützung des Filterfütterungsprozesses im Silberkarpfen zu verstehen. Die schleimreiche Flüssigkeit in einem "dicken und klebrigen" Zustand kann die Haftung von Lebensmittelpartikeln erleichtern. Die Permeation und der Transport durch die GR-Membran werden durch die Einwirkung externer Scherkräfte erleichtert, die unterschiedliche Scherdehnungsraten induzieren. Daher kann die Schleimrheologie einen wichtigen Hinweis auf die enorme Überkonformität des Silberkarpfens im Pool der filterfütternden Fische liefern. Auf dieser Grundlage wurde postuliert, dass GR-Schleim eine Klebefunktion für Lebensmittelpartikel bieten und als Transportmittel zur Unterstützung des Filterfütterungsprozesses fungieren kann.
Das Hauptziel des Protokolls ist es, die Streckgrenze des Schleims zu bestimmen, die auf die minimale Scherspannung zurückzuführen ist, die erforderlich ist, um eine Strömung zu initiieren, bei der eine irreversible plastische Verformung zuerst über ein strukturiertes viskoelastisches Material beobachtet wird. Dementsprechend wurden die rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims, d.h. Viskositäts-, Speicher- und Verlustmodule, mit einem Rotationsrheometer auf seine nicht-newtonsche, scherverdünnende Natur untersucht.
Ein hier vorgestelltes Protokoll wird verwendet, um die rheologischen Eigenschaften von Schleim zu analysieren, der aus den Kiemenrechen eines Silberkarpfens gewonnen wird, der am Hart Creek-Standort des Missouri River gefischt wird. Das Protokoll zielt darauf ab, eine effektive Strategie für rheologische Tests und Materialcharakterisierung von Schleim zu entwickeln, von dem angenommen wird, dass er ein strukturiertes viskoelastisches Material ist.
Introduction
Der Silberkarpfen( Hypophthalmichthys molitrix) ist ein planktivorer Filterfresser und eine invasive Art, die mehrere natürliche Wasserstraßen in den Vereinigten Staaten infiltriert hat. Diese Art wurde ursprünglich im oberen Mississippi River Becken eingeführt, um Algenblüten1,2,3zu kontrollieren. Der Silberkarpfen ist ein äußerst effizienter Feeder. Typischerweise reichen die Partikelgrößen der Verbrauchsmaterialien von 4 bis 20 μm bis zu größerem Zooplankton, das etwa 80 μm3,4,5beträgt. Diese Art hat andere einheimische Fische ihnen abverdlichtet und kann durch die Begrenzung der verfügbaren Ressourcen enorme Schäden an einheimischen Wasserstraßen verursachen1,2,6. So stellen filterfütterende Fische wie der Silberkarpfen und der Großkopfkarpfen eine große Bedrohung für die Großen Seendar 1,2,6,7,8.
Filterfütternde Fische besitzen spezielle Organe, die als Kiemenrechen (GRs) bezeichnet werden, wobei sich eine dünne Schleimschicht auf ihrer Oberfläche befindet. Diese Organe verbessern die Effizienz der Filtration und Aggregation kleiner Partikel aus der ankommenden Flüssigkeit. Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, die nicht-newtonsche, scherverdünnende Materialeigenschaft und streckgrenze des GR-Schleims zu charakterisieren, der von der innenfläche der Kiemenrechen im Silberkarpfen gewonnen wird. Der mit einem Rotationsrheometer ermittelte Wert der Streckgrenze des GR-Schleims ist in dieser Studie von Interesse. Die gemessene Streckgrenze, auch "scheinbare Streckgrenze" genannt, hängt von den Prüfverfahren wie Steady Shear Rate- oder Dynamic Oscillatory Strain-Typ9,10ab. Die scherverdünnende " Streckgrenzerflüssigkeit" durchläuft einen Übergang von festem zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten bei einer kritischen angelegten Spannung9,11. Die scheinbare Streckgrenze ist die minimale Scherspannung, die erforderlich ist, um eine Strömung einzuleiten, oder die, bei der eine irreversible plastische Verformung zuerst beobachtet wird, wenn der Schleim von einem gelartigen Material zu einem flüssigkeitsähnlichen Material übergeht. Dieses Verhalten kann in strukturierten viskoelastischen Materialien beobachtet werden. Der Übergang vom gelartigen zum flüssigkeitsähnlichen Verhalten des GR-Schleims beinhaltet zwei Funktionen, d.h. eine Kleberolle zum Sammeln von Lebensmittelpartikeln und eine Transportfahrzeugrolle zur Unterstützung des Partikelabgabe- und Filtrationsprozesses. Die erweiterte Funktion des Schleims umfasst die Schaffung von Diffusionsbarrieren bei krankheitsresistenz und Atmung, die kontrollierte Freisetzung von Ernährungsfaktoren, toxischen Komponenten und Ausscheidungen, die Schaffung von Stoffwechselwegen für die Fütterung und Verschachtelung, die Unterstützung beim Schutz von Raubtieren und die Erzeugung von Grenzschichtmodifikationen, die die Fortbewegung und die Antriebseffizienz verbessern12,13,14.
Im Gegensatz zu einfachen Flüssigkeiten besitzen komplexe Flüssigkeiten wie der Schleim Eigenschaften, die mit den Strömungsbedingungen variieren und zusätzliche Messparameter erfordern, um ihr physikalisches Verhalten im Großmaßstab zu definieren. Zur Überwachung der Viskosität und Streckgrenze von GR-Schleim werden rheologische Messungen mit einem Rotationsrheometer durchgeführt. Das Rotationsrheometer wendet eine stetige oder oszillierende Scherspannung oder -dehnung mittels einer rotierenden Scheibe in Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe an und misst deren Reaktion. Der Grund für die Verwendung dieses Instruments und dieser Technik ist, dass das Rheometer eine Reihe von Messungen liefern kann, um die Materialeigenschaften des GR-Schleims des Silberkarpfens zu beschreiben, die nicht allein durch viskose definiert werden können.
Der Schleim ist ein viskoelastisches Material und seine mechanische Reaktion auf eine auferlegte Verformung liegt zwischen der eines reinen Feststoffs (geregelt durch das Hookesche Elastizitätsgesetz) und der einer reinen Flüssigkeit (geregelt durch das Newtonsche Viskositätsgesetz)15,16. Das komplexe makromolekulare Netzwerk, das im Schleim enthalten ist, kann sich als Reaktion auf äußere Kräfte oder Verformungen dehnen und neu ausrichten. Ein Rotationsrheometer besteht aus einer Kegelgeometrie und einer Peltierplatte, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt (siehe Tabelle 1 für Die Spezifikationen der Instrumentierung). Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll zur Bestimmung der rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims zu entwickeln. Ein Vorteil des Rotationsrheometers gegenüber einem Viskosimeter ist seine Fähigkeit, dynamische Messungen mit kleinen Probenvolumina durchzuführen. Das GR-Schleimprobenvolumen in dieser Studie betrug etwa 1,4 ml. Das Viskosimeter hingegen ist auf konstante Scherraten beschränkt und erfordert große Probenvolumina.
Es wird erwartet, dass die rheologischen Eigenschaften des Schleims innerhalb der Anatomie des Silberkarpfens stark variieren. Zum Beispiel können sich die Eigenschaften des Schleims, der sich auf den GR-Oberflächen befindet, vom Epibranchialorgan unterscheiden. Um die potenzielle Variabilität der Schleimeigenschaften in verschiedenen Regionen der Fische zu berücksichtigen, wurde die erworbene GR-Schleimprobe verdünnt und Lösungen mit drei Konzentrationen wurden mit dem Rotationsrheometer erstellt und getestet. Die nach Der Durchführung des Protokolls gemeldeten Daten und Ergebnisse zur Schleimrheologie zeigten die Wirksamkeit der Messtechnik. Die in diesem Artikel vorgestellten illustrativen Daten sind nicht dazu gedacht, über die gesamte Silberkarpfenpopulation verallgemeinert zu werden. Das hier vorgestellte Protokoll kann erweitert werden, um die Schleimrheologie über größere Stichprobensätze hinweg zu untersuchen, um andere Hypothesen zu testen.
Ziel dieser Studie ist es, die Variation der rheologischen Eigenschaften der GR-Schleimrheologie mit drei verschiedenen Schleimkonzentrationen (400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml) nachzuweisen. Die Konzentration von 400 mg/ml stellt die rohe Schleimprobe dar, die aus den Fisch-GRs gewonnen wurde. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um die rohe Schleimprobe in Konzentrationen von 200 mg/ml und 100 mg/ml zu verdünnen. Die Verdünnung der Schleimproben ermöglichte die Beurteilung des Scherausdünnungsgrades und der scheinbaren Streckgrenze in Abhängigkeit von der Konzentration und die Bestimmung der Konzentration, bei der der GR-Schleim in ein nicht-newtonsches Verhalten übergeht. Ein Shaker wurde verwendet, um große Schleimklumpen in den Proben abzubauen, um Fehler in den rheologischen Daten aufgrund von Inhomogenität zu mildern.
Bei den meisten Wirbeltieren, einschließlich Fischen, sind die vorherrschenden schleimbildenden Makromoleküle Glykoproteine (Muzinine), die dazu neigen, durch Verwicklungen oder chemische Vernetzung im Wasser aufzuquellen und ein gelartiges Material zu erzeugen12,13,17,18,19,20. Die hochmolekularen, gelbildenden Makromoleküle und der hohe Wassergehalt spiegeln die Rutschigkeit im Schleimwider 13. Ein hohes Maß an intermakromolekularen Wechselwirkungen führt zur Gelbildung, während geringere intermakromolekulare Wechselwirkungen oder gebrochene Bindungen zu hochviskosen Flüssigkeiten führen21.
Die Prozesse der Lebensmittelpartikelfiltration in filterfütternden Fischen werden durch GR-schleimbezogene Eigenschaften wie Kohäsion und Viskosität unterstützt, die ihr Adhäsionspotenzial und ihre Haftung bestimmen22. Die Stärke der schleimbasierten Adhäsion hängt von spezifischen intermolekularen, elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen ab23. Sanderson et al.24 führten eine Suspensionsfütterungsstudie an Schwarzfischen durch, in der sie die Beweise für schleimbasierte Adhäsion fanden. Sie stellten fest, dass auf die Adhäsion von schwebenden Lebensmittelpartikeln mit einer Schleimhautoberfläche der Transport von aggregierten Partikelklumpen folgt, die durch gerichteten Wasserfluss, der darauf einwirkt, mit Schleim verbunden sind24. Der Schleim, der Scherdehnungsraten ausgesetzt ist, die durch den Wasserfluss erzeugt werden, erleichtert die Abgabe von Nahrungspartikeln an die Verdauungsorgane. Endoskopische Techniken wurden verwendet, um gefilterte Partikel zu beobachten24.
Literatur über den Bereich der Scherraten und praktischen Grenzen bei der rheologischen Untersuchung von GR-Schleim ist knapp. Daher wurde eine Orientierung aus rheologischen Studien zu Magen-, Nasen-, Zervix- und Lungenschleim, Lachshautschleim, Hagfish-Schleim und Knochengelenk-Oberflächenschmiermittel gesucht, wobei die rheologische Charakterisierung und nicht-newtonsche Attribute untersucht wurden11,12,25,26,27,28,29,30,31. In jüngerer Zeit wurde die Wirkung von Fischhautschleim auf die Fortbewegung und die Antriebseffizienz mittels Viskosimetrie mit konstanter Scherrate untersucht. Untersuchungen zur Hautschleimrheologie (ohne Verdünnung oder Homogenisierung) in Bezug auf Brasse, Wolfsbarsch und magere Zeigten nicht-newtonsches Verhalten bei typischerweise niedrigen Scherraten14. In einer anderen verwandten Studie wurde festgestellt, dass die rohen Hautschleimproben von dorsalen und ventralen Seiten der senegalesischen Seezunge ein nicht-newtonsches Verhalten zeigen, was auf eine höhere Viskosität des ventralen Schleims bei allen Scherraten hinweist, die als32betrachtet werden. Andere rheologische Protokolle zur Hydrogelgerüstentwicklung und für hochkonzentrierte Suspensionen unter Verwendung eines Viskosimeters mit konstanter Scherrate wurden ebenfalls in der Literatur33,34berichtet.
In dieser Studie wurden die GR-Schleimeigenschaften mit einem dehnungskontrollierten Rotationsrheometer untersucht, das in rheologischen Experimenten an komplexen biologischen Flüssigkeiten weit verbreitet ist25. Bei Newtonschen Flüssigkeiten bleibt die scheinbare Viskosität konstant, ist scherratenunabhängig und die Scherspannungen variieren linear mit den Scherdehnungsraten (Abbildung 3A, B). Für nicht-newtonsche Flüssigkeiten (z. B. Scherverdünnungsflüssigkeiten) ist die Viskosität scherratenabhängig oder verformungsverlaufsabhängig (Abbildung 3A, B). Der Verlustmodul (G") stellt das Ausmaß dar, in dem das Material der Strömungsneigung widersteht und ist repräsentativ für die Flüssigkeitsviskosität (Abbildung 4). Der Speichermodul (G') stellt die Tendenz des Materials dar, nach spannungsinduzierter Verformung seine ursprüngliche Form wiederzuerlangen und entspricht der Elastizität (Abbildung 4). Der Phasenwinkel (δ) oder Verlusttangentenwert wird aus der inversen Tangente von G"/G' berechnet. Es stellt das Gleichgewicht zwischen Energieverlust und -speicherung dar und ist auch ein gebräuchlicher Parameter zur Charakterisierung viskoelastischer Materialien (δ = 0° für einen Hookean-Feststoff; δ = 90° für eine viskose Flüssigkeit; δ < 45° für einen viskoelastischen Feststoff und δ > 45° für eine viskoelastische Flüssigkeit) (Abbildung 4)25. Die scheinbare Streckgrenze (σy)in strukturierten Fluiden stellt eine Zustandsänderung dar, die in rheologischen Daten aus stationären Sweeps und dynamischen Spannungs-Dehnungs-Sweeps10beobachtet werden kann. Wenn die extern angelegte Spannung geringer ist als die scheinbare Streckgrenze, verformt sich das Material elastisch. Wenn die Spannung die scheinbare Streckgrenze übersteigt (in Abbildung 3Bals "mittlere Spannung" gekennzeichnet), wechselt das Material von elastischer zu plastischer Verformung und beginnt in seinem flüssigen Zustand zu fließen35. Die Messung des Speichermoduls (G') und des Verlustmoduls (G") in der Schleimprobe unter oszillierenden Spannungsbedingungen (oder Dehnungsbedingungen) quantifiziert die Änderung des Materialzustands von gelartigem zu viskoelastischem flüssigkeitsähnlichem Verhalten.
Die Arten von Rheometertests, die zur Überwachung von Daten in Bezug auf Speichermodul (G'), Verlustmodul (G") und scheinbare Viskosität (η) durchgeführt werden, werden hier beschrieben. Die dynamischen Schwingungstests (Dehnungs-Sweeps und Frequenz-Sweeps) überwachten G' und G' unter kontrollierter Schwingung der Kegelgeometrie. Die dynamischen Dehnungsfegentests bestimmten den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims durch Überwachung der intrinsischen Materialreaktion (Abbildung 4). Dehnungsfegen wurden verwendet, um das Nachgiebverhalten bei konstanter Schwingungsfrequenz und Temperatur zu bestimmen. Die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests überwachten die Materialreaktion auf steigende Frequenz (Verformungsrate) bei konstanter Amplitude (Dehnung oder Spannung) und Temperatur. Für die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests wurde die Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) aufrechterhalten. Die stationären Scherratentests überwachten die scheinbare Viskosität (η) unter stetiger Rotation der Kegelgeometrie. Der GR-Schleim wurde inkrementellen Belastungsschritten ausgesetzt und die scheinbare Viskosität (η, Pa.s) auf unterschiedliche Scherrate (ý, 1/s) überwacht.
Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll behandelt den GR-Schleim als ein komplex strukturiertes Material unbekannter Viskoelastizität mit einem bestimmten linearen viskoelastischen Reaktionsbereich. Der Fischschleim wurde aus den GRs des Silberkarpfens während eines Angelexpeditions am Hart Creek im Missouri River von Professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) 1,2,36extrahiert. Eine Anordnung von GRs im Mund eines Silberkarpfens ist in Abbildung 5A und eine schematische Zeichnung in Abbildung 5Bdargestellt. Ein ausgeschnittener GR ist in Abbildung 5Cdargestellt. Die Extraktion von Schleim aus GRs des Silberkarpfens wird als Beispiel in den schematischen Zeichnungen dargestellt, Abbildung 5D, E. Alle Rheometertests wurden unter einer konstanten, kontrollierten Temperatur von 22 ± 0,002 °C durchgeführt, die temperatur aufgezeichnet am Fangort1,2,36. Jede Schleimprobe wurde dreimal mit dem Rheometer getestet, und die gemittelten Ergebnisse werden zusammen mit den statistischen Fehlerbalken dargestellt.
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Protocol
1. Herstellung der Schleimlösungen verschiedener Konzentrationen
HINWEIS: Für dieses Experiment werden drei Konzentrationen der Schleimlösung (400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml mit ungefähren Volumina, 1 ml, 1 ml bzw. 2 ml) vorbereitet.
- Um die Masse des Schleims zu berechnen, messen Sie die durchschnittliche Masse der Fläschchen mit (Mmit Schleim ; mg) und ohne Schleim (MFläschchen ; mg). Dann subtrahieren Sie die Masse der Fläschchen mit Schleim mit der masse ohne schleim (Mschleim = M mitschleim - Mfläschchen ; mg).
- Verdünnen Sie den Schleim in drei Konzentrationen (400, 200, 100, mg/ ml) mit deionisiertem (DI) Wasser.
- Bereiten Sie die erste Konzentration der Schleimlösung, 400 mg / ml, vor, indem Sie dem Schleim 0,6 ml DI-Wasser mit einer Mikropipette hinzufügen.
HINWEIS: Da das ungefähre Volumen des extrahierten Schleims 1,4 ml betrug, hat die 400 mg / ml Lösung ein Gesamtvolumen von ~ 2 ml. - Legen Sie die Durchstechflasche mit 400 mg / ml Schleimlösung auf einen Shaker, um sicherzustellen, dass die Schleimlösung ausreichend homogenisiert ist und jede Schleimpartikelagglomeration gemildert wird.
- Bereiten Sie die zweite Konzentration der Schleimlösung, 200 mg / ml, vor, indem Sie die Hälfte des Volumens der Schleimlösung der ersten Konzentration mit einer Mikropipette in eine neue Durchstechflasche ziehen und 1 ml DI-Wasser in die neue Durchstechflasche geben.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 für die erste und zweite Durchstechflasche mit Schleimlösungen.
- Bereiten Sie die dritte Konzentration der Schleimlösung, 100 mg / ml, vor, indem Sie die Hälfte des Volumens (1 ml) der 200 mg / ml-Lösung mit einer Mikropipette in eine neue Durchstechflasche ziehen und DI-Wasser in die neue Durchstechflasche geben.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 für alle drei Konzentrationen von Schleimlösungen in ihren jeweiligen Durchstechflaschen (siehe Ergänzende Abbildung 1).
- Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit der Schleimlösung in einem Kühlschrank auf, bis die Kalibrierung und Prüfung des Rheometers durchgeführt ist.
- Bereiten Sie die erste Konzentration der Schleimlösung, 400 mg / ml, vor, indem Sie dem Schleim 0,6 ml DI-Wasser mit einer Mikropipette hinzufügen.
2. Messungen und Datenerfassung mit einem Rheometer
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Software zur Gerätesteuerung und Datenerfassung mit Rheometer ist in der Materialtabelle vermerkt. Diese Software wird als "Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware" bezeichnet.
- Richten Sie das Rheometer ein und kalibrieren Sie es.
- Schalten Sie die Druckluftversorgung des Rheometers ein und stellen Sie sicher, dass der pneumatische Tisch und das Rheometer mit einem Blasenmessgerät nivelliert sind. Drehen Sie die Schutzkappe am Rheometerschaft ab und halten Sie die Welle beim Abschrauben still.
- Schalten Sie die Rheometer-Hauptschalter ein, um die Magnetlager am Rheometer zu aktivieren.
- Schalten Sie den Rheometersteuerungscomputer mit der darin installierten Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware ein und starten Sie die Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware (siehe Ergänzende Abbildung 2).
- Führen Sie die Gerätekalibrierung durch, indem Sie die Registerkarten "Kalibrierung | Instrument' aus dem Softwarefenster. Wählen Sie die Option' Instrument'. Klicken Sie unter 'Trägheit' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert der Instrumententrägheit in μN.m.s2 und wiederholen Sie die Kalibrierung mindestens 3x, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10 % voneinander liegen (siehe Ergänzende Abbildung 3).
- Installieren Sie die Rheometergeometrie auf dem Schaft des Rheometers.
- Klicken Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware auf die Registerkarte" Geometrien".
- Reinigen Sie den Kegel mit der gewünschten Geometrie (40 mm Durchmesser, 1◦ 0' 11'' Kegel) und Peltierplatte mit Isopropanol (siehe Tabelle 1, Materialtabelle, Abbildung 1und Abbildung 2).
HINWEIS: Die Peltier plate wird auf dem Rheometer installiert; Es kann mit Isopropanol gereinigt werden, während es direkt am Rheometer befestigt ist. - Stellen Sie sicher, dass die Peltier-Plattenhalterung frei von sichtbarem Staub ist und reinigen Sie sie gegebenenfalls mit Isopropanol. Installieren Sie die Peltierplatte, wenn sie nicht im Rheometer vorinstalliert ist, und schließen Sie die Kühlkörperanschlüsse an.
- Drücken Sie die 'Lock-Taste' am Rheometer an der Verriegelungswelle, die mit der Kegelgeometrie verbunden ist. Dies blockiert die Position der Welle, kann sich aber an der Position frei drehen.
- Klicken Sie auf 'Smart Swap | Aktiviert' in der Registerkarte Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um eine automatische Erkennung der Geometrie zu ermöglichen (siehe Ergänzende Abbildung 4).
- Drehen Sie die Welle auf dem Rheometer, um die Geometrie zu verschrauben. Die Software erkennt in diesem Stadium die Kegelwinkelgeometrie von 40 mm Durchmesser, 1◦ 0' 11'' (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.5 bis 2.2.6, um sicherzustellen, dass die Geometrie erkannt wird.
- Wählen Sie 'Spalt' unter dem 'Control Panel' der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, klicken Sie auf 'Optionen' Symbol und wählen Sie 'Axial force' Option . Stellen Sie die axiale Kraft auf '1 Newton'; Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Kegelgeometrie die Peltierplatte für die Nullspaltinitialisierung berührt (siehe Ergänzende Abbildung 5).
- Führen Sie die Kalibrierung der Rheometergeometrie durch.
- Wählen Sie im Softwarefenster die Registerkarte' Geometrie'. Klicken Sie unter 'Trägheit' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert für die Geometrieträgheit in μN.m.s2 und wiederholen Sie diesen 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10% voneinander liegen.
- Klicken Sie im Softwarefenster unter 'Reibung' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert für die Geometriereibung in μN.m/(rad/s) und wiederholen Sie diesen 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10% voneinander liegen (siehe Ergänzende Abbildung 6).
- Ausführen der Null-Lücken-Initialisierung
HINWEIS: Da die Geometrie nicht genau über die Peltierplatte angehoben werden kann, um Messungen ohne eine Referenzposition "Null" durchzuführen, wird eine Null-Spalt-Initialisierung durchgeführt. Für die Messzwecke hat die Geometrie einen eingebauten Geometriespalt von 24 μm und einen Trimmspalt von 28 μm. Der Trimmspalt ist so eingestellt, dass die überschüssige Flüssigkeit, die außerhalb der Oberfläche der Geometrie auslaufen kann, effektiv gereinigt wird. Diese Lücken sind unerlässlich, um die Daten mit der Probe und dem Rheometer genau zu messen. Der Schritt 2.4.1 ist unbedingt erforderlich, um sicherzustellen, dass die Geometrie auf Nullspalt eingestellt ist, um die Geometrie- und Trimmlücken von 24 μm bzw. 28 μm zu erreichen.- Klicken Sie auf das Symbol 'Zero gap' unter 'Gap' Tab in der 'Systemsteuerung' im Softwarefenster. Die Initialisierung ist abgeschlossen, wenn die axiale Kraft, die von der Geometrie erfahren wird, größer oder gleich 1 N ist, da sie die Peltierplatte berührt. Stellen Sie sicher, dass der Rheometerspalt auf Null gesetzt ist, damit seine Referenzposition korrekt ist (siehe Ergänzende Abbildung 7 und Ergänzende Abbildung 8).
- Drücken Sie die Tasten "pfeil nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder die Symbole " Geometrieanheben und senken" unter der Registerkarte "Lücke" in der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe zu heben. Der Kontrollbildschirm des Rheometerinstruments und das Bedienfeld der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments zeigen die (gleiche) Spalthöhe an.
- Richten Sie das experimentelle Verfahren in der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments ein. Führen Sie die Charakterisierung rheologischer Eigenschaften durch, indem Sie eine Kegel-auf-Peltier-Plattengeometrie bei 22 °C verwenden.
HINWEIS: Die Website des US Geological Survey wurde verwendet, um die Wassertemperatur des Flusses am 20. September 2018 zu bestimmen, als die für die GR-Schleimexperimente verwendeten Silberkarpfen am Hart Creek-Standort36gefischt wurden. Die Temperatur des Schleims kann die rheologischen Eigenschaften beeinflussen. Die Bedeutung der Anpassung der Werte an die Flusstemperatur besteht darin, ungefähr der Temperatur zu entsprechen, unter der die Schleimeigenschaften realistisch geschätzt werden können.- Wählen Sie die Registerkarte "Experimente" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware und geben Sie die relevanten Informationen wie "Name", "Bediener", "Projekt" usw. ein. (siehe Ergänzende Abbildung 9)
- Wählen Sie die Registerkarte 'Geometrie' und stellen Sie sicher, dass die Informationen mit den Schritten 2.2.5 übereinstimmen. - 2.2.7. (siehe Ergänzende Abbildung 10).
- Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, die '1: Oszillationsamplitude' einrichten. (siehe Ergänzende Abbildung 11).
- Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 120 s' und aktivieren Sie das Kontrollkästchen 'Auf Temperatur warten' (siehe Ergänzende Abbildung 11).
- Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Frequenz = 1 Hz'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Drehmoment = 10 bis 10000 μN.m"; "Punkte pro Jahrzehnt = 5" (siehe Ergänzende Abbildung 11).
- Richten Sie das Experiment ein, um den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims bekannter Konzentration (100 mg / ml) zu bestimmen
- Mit einer geeigneten Mikropipette und Pipettenspitze ca. 0,3 ml Fischschleimlösung der Konzentration 100 mg/ml ziehen (siehe Schritt 1.2, Materialtabelle).
- Die Schleimlösung wird mit der Mikropipette auf die Peltierplatte einträuft (siehe Abbildung 2).
- Drücken Sie die Taste 'Trim Gap' am Rheometer, um die Geometrie auf die Peltierplatte zu senken. Alternativ können Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware unter der Registerkarte "Spalt" in der Option "Systemsteuerung" auf das Symbol " Spalttrimmen" klicken (siehe Ergänzende Abbildung 12).
- Verwenden Sie die Mikropipette mit der Pipettenspitze, um überschüssige Schleimlösung zu entfernen und sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit unter der Geometrie befindet, ohne dass sie in der Nähe der Peripherie der Geometrie verschüttet wird.
HINWEIS: Eine unsachgemäße Beladung der Flüssigkeit führt zu Fehlern bei den Messungen. Untergefüllte Probe verringert die Drehmomentverteilung und übergefüllte Probe führt zu fehlerhaften Spannungsverteilungen aufgrund von Verschütten entlang der Kanten. - Wählen Sie abwechselnd die Registerkarten "Motor' und 'Geschwindigkeit' auf 5 rad/s und 0 rad/s, bis die Probe unterhalb der Geometrie nur minimale Trägheit und Geschwindigkeit aufweist. Der Kontrollbildschirm des Rheometerinstruments und das Bedienfeld der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments zeigen die Geschwindigkeit an (siehe Ergänzende Abbildung 13).
- Drücken Sie die Taste 'Geometry Gap' auf dem Rheometer, um die Geometrie auf den voreingestellten geeigneten Spalt für die spezifische Geometrie zu senken. Alternativ können Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware unter der Registerkarte "Spalt" in der Option "Systemsteuerung" auf das Symbol "Geometrielücke" klicken (siehe Ergänzende Abbildung 14).
- Führen Sie das Experiment durch, um den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims der bekannten Konzentration (100 mg / ml) zu bestimmen.
- Klicken Sie in der Steuerungssoftware des Rheometers auf das Symbol" Start" (siehe Ergänzende Abbildung 15).
HINWEIS: Das Rheometer führt automatische Messungen durch; Sobald die Taste "Start" gedrückt wird, dauert es ca. 20 Minuten, bis das Rheometer den Test abgeschlossen hat. Die Einstellung "Punkte pro Jahrzehnt" in Schritt 2.5.5 bestimmt, wie viel Zeit das Rheometer benötigt, um Messungen abzuschließen. - Führen Sie das Experiment aus, indem Sie im angezeigten Popup-Fenster auf "Ja" klicken und vorschlagen, dass der Geometrieabstand auf den richtigen Abstand abgesenkt wird, um das Experiment zu starten, falls nicht bereits abgesenkt.
- Beobachten Sie das Echtzeitdiagramm, das vom Rheometer generiert wird und die Speicher- (G') und Verlustmodule (G'') meldet.
HINWEIS: Das G' und G" sind die Speicher- bzw. Verlustmodule. Der Speichermodul stellt die Tendenz des Materials dar, nach spannungsinduzierter Verformung seine ursprüngliche Form wiederzuerlangen und entspricht der Elastizität. Der Verlustmodul stellt das Ausmaß dar, in dem das Material der Strömungsneigung widersteht und ist repräsentativ für die Flüssigkeitsviskosität (siehe Abbildung 4). - Setzen Sie die X-Achse des Diagramms auf 'Oszillationsdehnungsprozentsatz'. Klicken Sie dazu mit der rechten Maustaste auf das angezeigte Diagramm und wählen Sie die Registerkarte "Graphvariablen " (siehe Ergänzende Abbildung 16).
- Zeichnen Sie den prozentualen Schwingungsdehnungsbereich aus dem Diagramm auf, bevor das Material in den nichtlinearen viskoelastischen Bereich eintritt, sobald der Test abgeschlossen ist.
- Drücken Sie die Tasten "nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder " Geometrie erhöhen undsenken" Symbole unter der Registerkarte "Lücke" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe über der Peltierplatte zu heben.
- Speichern Sie die Datei, die sowohl das experimentelle Verfahren als auch die Ergebnisse enthält, im nativen Dateiformat der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die lineare viskoelastische Region (LVR) der Schleimprobe zu ermitteln.
HINWEIS: Dies kann durch Einstellen der X-Achse des Diagramms auf Dehnungsamplitude (%) und/oder
Schwingungsspannung erfolgen, bevor die Daten in den nichtlinearen viskoelastischen Bereich (NLVR) gelangen (siehe Ergänzende Abbildung 16).
- Klicken Sie in der Steuerungssoftware des Rheometers auf das Symbol" Start" (siehe Ergänzende Abbildung 15).
- Führen Sie die dynamischen Sweeps und Steady-State-Scherraten-Flow-Tests im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) für den Schleim der bekannten Konzentration 100, mg / ml durch, um Ergebnisse aus drei unabhängigen Schleimproben von 100 mg / ml zu generieren. Führen Sie diese Schritte an den verfügbaren Schleimkonzentrationsproben einzeln durch.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1 – 2.5.4.
- Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Frequenz = 1 Hz'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Stamm % = 100 bis 10000 %; "Punkte pro Jahrzehnt = 10".
- Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, die die Prozedur '2: Schwingungsfrequenz' einrichten.
- Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 0,0 s'.
- Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Dehnung % = 1 %'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Frequenz = 20 bis 1 Hz"; "Punkte pro Jahrzehnt = 10".
- Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, um die Prozedur '3: Flow Sweep' einzurichten.
- Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 0,0 s'.
- Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Scherrate = 1 bis 10000 1/s'; "Punkte pro Jahrzehnt = 10"; Kontrollkästchen 'Steady State Sensing'.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7.1 – 2.7.2 und warten Sie, bis das Experiment abgeschlossen ist, etwa 45 Minuten.
- Drücken Sie die Bedienelemente "nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder die Symbole "Geometrie erhöhen und senken" unter der Registerkarte "Spalt" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe zu heben.
- Verwenden Sie Einwegtücher und Handschuhe, um den Schleim auf der Peltierplatte mit Isopropanollösung zu entfernen und zu reinigen (siehe Materialtabelle).
- Speichern Sie die Datei, die sowohl das experimentelle Verfahren als auch die Ergebnisse enthält, im nativen Dateiformat der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware.
3. Wiederholen Sie das Protokoll für andere Konzentrationen von Schleimlösungen von 200 mg/ ml und 400 mg / ml.
- Führen Sie die Schritte 2.5 – 2.8 einschließlich aller darin aufgeführten Unterschritte für die verbleibenden zwei Konzentrationen von Schleimlösungen, 200 mg/ml und 400 mg/ml, durch.
4. Grafische Darstellung und Datenanalyse
HINWEIS: Der in der zusätzlichen Codedatei bereitgestellte Code führt eine Datenmittelung durch und generiert Wiederholbarkeitsfehler, überlagert die Daten aus allen Experimenten. Die Standardabweichungsberechnungsfunktionen sind in der Software zur Steuerung des Rheometerinstruments nicht verfügbar. Der Code ist in einer Programmiersprache für Datenanalyse, Nachbearbeitung und grafische Darstellung geschrieben (siehe Materialtabelle für Details).
- Exportieren Sie die aus Schritt 2.8 generierten Daten über die Schleimkonzentration von 100 mg/ml GR und Schritt 3.1 über die Schleimkonzentrationen von 200 mg/ml und 400 mg/ml GR in tabellenformat, indem Sie auf die Registerkarte 'Datei | | exportieren Excel' in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware (siehe Ergänzende Abbildung 17).
- Führen Sie zusätzliche Codes aus, um Diagramme der scheinbaren Viskosität (η) für variierende Scherdehnungsraten (
) und Verlustmodul (G), Speichermodul (G') und Phasenwinkel (δ) für variierende Schwingungsspannungen ( ) zu generieren und repräsentative Ergebnisse zu generieren.
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Representative Results
In diesem Abschnitt stellen wir die Ergebnisse der Experimente an GR-Schleim mit einem Rotationsrheometer mit Kegelgeometrie (40 mm Durchmesser, 1° 0' 11'') und einer Peltierplatte vor. Die Experimente halfen bei der Charakterisierung des nicht-newtonschen, scherverdünnenden Verhaltens des GR-Schleims und der scheinbaren Streckgrenze, die den Schleimübergang von einem gelartigen Material zu einem flüssigkeitsähnlichen Material darstellt. Die repräsentativen Ergebnisse beinhalten quantitative Beschreibungen von Drehmomentgrenzen und Sekundärströmungseffekten der Rotationsrheometer-Instrumentierung. Die Instrumentierungsgrenzen und stationären und dynamischen Dehnungsratenmessungen halfen bei der genauen Bestimmung der viskoelastischen Verhaltenstrends und der scheinbaren Streckgrenze von GR-Schleim. Die messungen der sichtbaren Streckgrenze boten die Möglichkeit, die für eine irreversible plastische Verformung des GR-Schleims erforderliche Mindestspannung zu beobachten und die Strömung einzuleiten. Die Strömungsinitiierungstendenz des GR-Schleims konnte auf die Feinstaubadhäsions- und Transportfunktionen zurückgeführt werden. Die Adhäsions- und Transportfunktionen von GR-Schleim waren makroskopische Materialattribute, die durch die rheologischen Messungen in den Protokollexperimenten beeinflusst wurden. Daher wurde mit diesem Protokoll eine makrorheologische Charakterisierung des GR-Schleims durchgeführt.
Der im Experiment verwendete Schleim wurde aus mehreren Kiemenrechen von bis zu drei Silberkarpfen gewonnen und hatte keine sichtbaren Blutspuren1,2. Die entnommene Probe wurde in zwei weitere Proben verdünnt, wie im Protokoll beschrieben. Alle Messungen wurden bei der kontrollierten Temperatur von 22 ± 0,002 °C36durchgeführt. Diese Temperatur wurde auf der Peltierplatte des Rheometers gehalten. Die Kegelgeometrie wurde aufgrund ihrer Vielseitigkeit bei der Messung eines breiten Viskositätsbereichs in biologischen Materialien wie dem GR-Schleim ausgewählt. Das minimale Drehmoment unter stationären Scherbedingungen (10 x 10-9 Nm),das minimale Drehmoment unter Schwingungsbedingungen (2 x 10-9 Nm) zusammen mit dem Kegelwinkel (1° 0' 11") und die Zusammenfassung der Rheometerspezifikationen, die für die Beurteilung von Niedrigen Drehmoment- und Sekundärströmungsregimen erforderlich sind, sind in Tabelle 1dargestellt. Wir berichten Replikate der letzten drei Proben zur Charakterisierung und zum Vergleich des nicht-newtonschen und Scherverdünnungsverhaltens.
Breite Rückschlüsse nach erfolgreicher Ausführung des Protokolls
Die erfolgreiche Durchführung des Protokolls und der Analyse führte zur Charakterisierung der (makro-)rheologischen Eigenschaften, die ein nicht-newtonsches Scherverdünnungsverhalten von Schleim mit sich bringen, der aus den Kiemenrechen des Silberkarpfens Hypophthalmichthys molitrix extrahiert wurde. Insbesondere wurde das Ertragsphänomen aufgelöst und eine scheinbare Streckgrenze des Schleims (400 mg/ml Konzentration, die der tatsächlichen extrahierten Schleimkonsistenz am nächsten kommt) festgestellt (σy = 0,2736 Pa). Das Protokoll eignete sich gut für Messungen mit sehr kleinem Probenvolumen (ca. 1,4 ml) Schleim. Aufgrund des Mangels an Literatur zur GR-Schleimcharakterisierung werden diese Daten bei der analytischen Modellierung und erweiterten rheometrischen Studien helfen.
Ergebnisse dynamischer Sweep-Experimente
Die Ergebnisse der dynamischen Frequenz- und Amplitudensweep-Experimente werden in diesem Abschnitt vorgestellt. Dies sind die Ergebnisse der in den Schritten 2.8.2 - 2.8.5 erstellten Verfahren. Die Grenzwerte für das niedrige Drehmoment für den Schwingungsfrequenz- und Amplitudenfeep des GR-Schleims mit einer Konzentration von 400 mg/ml sind in Abbildung 6A,B markiert.
Die Frequenz-Sweep-Daten (Abbildung 6A) wurden für einen Winkelfrequenzbereich von 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 rad s-1 bei einer konstanten oszillierenden Dehnungsamplitude von 0,01 erfasst. Der Winkelfrequenzwert von 6,28 rad/s (1 Hz) wurde als ungefähre Bewegungsfrequenz der Gaumenfalten in den Zwischentischen der Kiemenrechen gewählt und in Abbildung 6Amarkiert. Die Wahl des Dehnungsamplitudenwertes wurde aus dem linearen viskoelastischen Bereich abgeleitet, der im Protokollschritt 2.7 ermittelt wurde. In Abbildung 6Awurden zwei potenzielle Untergrenzen des niedrigen Drehmomentregimes unter Verwendung von Dehnungsamplituden von 0,01 und 0,001 (γ0)und minimalen Drehmomenten von 2x10-9 Nm bzw. 10 x10 -9 Nm (Tmin,siehe Tabelle 1) berechnet. Die in Abbildung 6A dargestellten Daten beginnen bei der ungefähren Frequenz der Gaumenfaltenbewegung (1 Hz oder 6,28 rad/s) und erhöhen sich auf höhere Winkelfrequenzen, die außerhalb des Rahmens für die physikalische Interpretation in dieser Studie liegen. Daher wurden diese Daten nicht weiter analysiert, da sie eine detailliertere parametrische Untersuchung der Dehnungsamplitude und der Gaumenfaltenbewegungsfrequenz erfordern.
Die Amplituden-Sweep-Daten (Abbildung 6B) wurden mit einer festen Winkelfrequenz (ω) von 6,28 rad/s (1 Hz) erfasst. Es ist zu beachten, dass die Amplituden-Sweep-Daten nicht durch das niedrige Drehmomentregime der Instrumentierung beeinflusst wurden (Abbildung 6B). Daher wurden diese Daten für alle drei Schleimkonzentrationen (100 mg/ ml, 200 mg / ml und 400 mg / ml) weiter analysiert, um das Ausmaß der Viskoelastizität und das Ertragsverhalten zu bestimmen.
Die grafische Darstellung in Abbildung 4 wurde als Richtschnur für die erweiterte Analyse der Amplitudensfege-Experimente verwendet. Die Ergebnisse von drei Schleimlösungen mit Konzentrationen von 100 mg/ml, 200 mg/ml und 400 mg/ml werden im Folgenden erläutert.
Das Ergebnis für 100 mg/ml Schleimkonzentration (Abbildung 7A) zeigt, dass sich bei geringen Schwingungsspannungen (0,01 ≤ 
≤ 0,1 Pa)die Speicher- und Verlustmodule (G' und G") signifikant überlappen. Bei Schwingungsspannungen größer als 0,1 Pa nimmt der Speichermodul ab, was auf eine geringere Elastizität hinweist. Der für die Viskosität repräsentative Verlustmodul bleibt im gesamten Schwingungsspannungsbereich konstant (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Dieses Phänomen kann auf ein newtonsches flüssigkeitsähnliches Verhalten zurückgeführt werden und stimmt mit der konstanten scheinbaren Viskosität der 100 mg/ml Schleimkonzentration überein (Abbildung 7A und Abbildung 8A,B). Die entsprechenden Phasenwinkeldaten (δ) zeigen, dass bei moderaten und hohen Schwingungsspannungen (0,05 ≤ ≤ 0,3 Pa)die Werte zwischen 55° und 70° schwanken (Abbildung 7D). Daraus lässt sich schließen, dass die 100 mg/ml Schleimlösung ein flüssigkeitsähnliches Verhalten mit vernachlässigbarer scheinbarer Streckgrenze aufzeigt.
Wie in Abbildung 7Bbeobachtet, nimmt der Speichermodul (G') bei niedrigen Schwingungsspannungen (0,02 ≤ ≤ 0,04 Pa)mit einer Konzentration von 200 mg/ml ab, bleibt aber immer noch größer als der Verlustmodul (G"). Innerhalb des Schwingungsspannungsbereichs (0,04 ≤ ≤ 0,07 Pa)gab es einen "Crossover"-Bereich, in dem die Werte G' und G' ungefähr gleich bleiben. Dieser Bereich ist in Abbildung 7B mit gestrichelten Linien markiert und entsprechende Schwingungsspannungswerte wurden festgestellt (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Jenseits dieser Region erreichte G" einen höheren Wert als G', was auf einen Übergang zu einem fluidähnlichen Verhalten hindeutet. G" (für die Viskosität) blieb jedoch im vollen Bereich der Schwingungsspannung konstant (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Die in Abbildung 7E dargestellten Phasenwinkeldaten zeigen einen höheren Varianzgrad, insbesondere im Schwingungsspannungsbereich (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Aus den Abbildungen 7B,E kann abgeleitet werden, dass es ein Übergangsverhalten der Flüssigkeit von linearer viskoelastischer zu nichtlinearer viskoelastischer Region gab. Darüber hinaus repräsentierte die 200 mg/ml Schleimkonzentration nicht-newtonsche Eigenschaften und die Neigung zur Nachgiebigkeit im Oszillationsspannungsbereich (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Das nicht-newtonsche, scherverdünnende flüssigkeitsähnliche Verhalten stimmte mit den in Abbildung 8A dargestellten scheinbaren Viskositätsdaten und den entsprechenden Spannungsvariationen in Abbildung 8Büberein.
Die Daten zur Schleimkonzentration von 400 mg/ml sind in Abbildung 7C,Fdargestellt. Die G' und G' Trends in Abbildung 7C zeigen deutlich ein Ertragsphänomen mit einem Übergangspunkt zwischen G' und G'. Der wert der scheinbaren Streckgrenze (σy)wurde mit 0,2736 Pa aufgezeichnet, was auf eine deutliche Veränderung des Zustands des Schleims von einem gelartigen zu einem nicht-newtonschen flüssigkeitsähnlichen Zustand hinweist. Die in Abbildung 7F dargestellten Phasenwinkeldaten zeigen einen starken Anstieg der scheinbaren Streckgrenze (σy = 0,2736 Pa)von ca. 20° auf 65°. Eine so starke Erhöhung des Phasenwinkels kann auftreten, wenn das Material nachgibt und wie eine Flüssigkeit zu fließen beginnt. Das nicht-newtonsche flüssigkeitsähnliche Verhalten kann mit den Ergebnissen stationärer Schertests, die in Abbildung 8 A,8Bberichtetwerden,weiter unterstützt werden. Die in stationären Scherversuchen berichtete scheinbare Streckgrenze betrug 0,2272 Pa (Abbildung 8B).
Ergebnisse von Stationären Scherratenexperimenten
Die Ergebnisse der stationären Scherratenexperimente werden für drei Schleimlösungen mit Konzentrationen von 100 mg/ml, 200 mg/ml und 400 mg/ml in diesem Abschnitt anhand grafischer Darstellungen als Richtschnur dargestellt (Abbildungen 3A,B). Diese Ergebnisse entsprechen dem in den Protokollschritten 2.8.6-2.8.8 initialisierten Verfahren.
In Abbildung 8A für die 100 mg/ml Schleimkonzentration sind die scheinbaren Viskositätsdaten mit hoher Varianz bei niedrigen Scherraten (1 ≤ 
≤ 4 s-1)zusammen mit der Steigung -1,4 dargestellt. Die Lage des niedrigen Drehmomentregimes ist ebenfalls markiert. Die hohe Varianz von 100 mg/ml Daten innerhalb dieses Bereichs (1 ≤ ≤ 4 s-1) wird als Effekt des (schattierten) Low-Torque-Regimes angenommen. In Abbildung 8Bzeigte die entsprechende Spannungsvariation mit Scherratendaten einen kleinen Bereich von Scherraten, bei dem die Stichprobe ein "Spannungsplateau" (oder den flachen Bereich) erreichte. Dieser Bereich wird bei der Streckgrenzerschätzung vernachlässigt, da die entsprechenden Viskositätsdaten drehmomentarmen Effekten unterliegen. Innerhalb des Bereichs mit hoher Scherrate (2500 ≤ ≤ 10000 s-1) wurden die scheinbaren Viskositätsdaten durch das sekundäre Strömungsregime beeinflusst. Die 100 mg/ml Schleimlösung verhält sich daher wie eine newtonsche Flüssigkeit, die unabhängig von der Scherrate außerhalb der niedrigen Drehmoment- und Sekundärströmungsregime ist und eine konstante scheinbare Viskosität von 0,00088 Pa s (±1,656 x10-5 Pa s) aufgibt.
Wie in Abbildung 8Abeobachtet, blieb die Schleimkonzentration von 200 mg/ml von Grenzwerten mit niedrigem Drehmoment unberührt und zeigte einen scherverdünnenden Effekt im Scherratenbereich, 1 ≤ ≤ 15s-1. Die Null-Scher-Dehnungsrate Viskosität (ηo) wurde mit 0,032 Pa s (±0,024 Pa s)und die unendliche Scherdehnungsrate Viskosität (η∞)bei Scherrate ( ), 1995 s-1, als 0,00085 Pa s (±2,495 x 10-5Pas)notiert. Die Scherverdünnungswirkung der Flüssigkeit wurde mit einer Steigung von -1,8 innerhalb des Scherratenbereichs, 1 ≤ ≤ 4 s-1nachgewiesen. Die entsprechende Spannungsvariation in Abbildung 8Bzeigt ein "Spannungsplateau", das ein Ertragsphänomen mit einer durchschnittlichen Streckgrenze von 0,1446 Pa (±0,0037 Pa)darstellt.
Die Schleimkonzentration von 400 mg/ml ist die am wenigsten verdünnte und folglich in der Materialkonsistenz dem tatsächlich extrahierten GR-Schleim am nächsten. Beachten Sie in Abbildung 8A,dass die Scherverdünnungscharakteristik für die Schleimkonzentration von 400 mg/ml im Vergleich zur Schleimkonzentration von 200 mg/ml gut definiert ist. Die Viskositäten der Nullscherung (ηo) und der unendlichen Scherdehnungsrate (η∞) bei Scherrate ( ), 1995 s-1, betrugen 0,137 Pa s (±0,032 Pa s)bzw. 0,00099 Pa s (±9,323 x 10-5Pa s). Zusätzlich wurde die Steigung des Scherdurchforstungsbereichs mit -0,91 im Scherratenbereich, 1 ≤ ≤ 32 s-1festgelegt. Das entsprechende "Spannungsplateau" aus den in Abbildung 8Bbeobachteten Spannungsvariationen mit Scherrate stellt eine scheinbare Streckgrenze von 0,2272 Pa (±0,0948 Pa)dar.
| Bestandteil | Modell/Teilenummer/Version | Parameterbeschreibung | Leistungsbeschreibung |
| Rheometer | DHR-2 | Frequenzbereich | 1 x 10−7 - 100 Hz |
| Maximale Winkelgeschwindigkeit | 300 rad/s | ||
| Minimales Drehmoment bei gleichmäßiger Scherung | 10 nN.m | ||
| Minimales Drehmoment unter Oszillation | 2 nN.m | ||
| Maximales Drehmoment | 200 μN *m | ||
| Drehmomentauflösung | 0,1 nN.m | ||
| Scherratenbereich | 5,73 x 10−6 bis 1,72 x 104 [1/s] | ||
| Maximale Normalkraft | 50 N | ||
| Normale Kraftauflösung | 0,5 mN | ||
| Geometrie | 513404.905 | Dimensionen | 40 mm Durchmesser |
| 1° 0' 11" Kegelwinkel | |||
| Peltier Teller | 533210.901 | Temperaturbereich | -40°C bis 200°C ± 0,1°C |
Tabelle 1: Spezifikationen des Rheometers
Abbildung 1: CAD-Rendering von Rheometerkomponenten. (A) 40 mm 1° Kegelgeometrie, (B) Peltierplattenbefestigung. Die Kegelgeometrie sollte an der Welle des Rheometers befestigt werden, und die Peltierplatte sollte mit der Basis des Rotationsrheometers verbunden sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Platzierung der Flüssigkeit auf der Peltierplatte. Die Flüssigkeitsprobe sollte in der Mitte der Peltierplatte platziert werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Flüssigkeit auf der Platte zu gewährleisten, wenn die Geometrie abgesenkt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Grafische Darstellung stetiger rheologischer Eigenschaften. Variation der (A) scheinbaren Viskosität (η) und (B) Scherspannung ( ) mit Scherdehnungsrate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Grafische Darstellung dynamischer rheologischer Eigenschaften. Variation der Speicher- (G') und Verlustmodule (G") und des Phasenwinkels (δ) mit Schwingungsspannung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder und schematische Zeichnungen von Kiemenrechen (GR). (A) Ansicht des Kiemenrechenarrays und der Gaumenfalten (B) Schematische Zeichnung des Kiemenrechenarrays und der Gaumenfalten (C) Ausgeschnittener Kiemenrechen (D) Schematische Zeichnung des Kiemenrechens mit hervorstechenden Merkmalen (E) Lage der Schleimextraktion im Kiemenrechen. Die Bilder 5A und 5C wurden während einer Dissektion aufgenommen, die von Professor L. Patricia Hernandez vom Department of Biological Sciences der George Washington University durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Effekte mit geringem Drehmoment. Speicher- und Verlustmodulvariation für 400 mg/ml, Schleimkonzentration mit (A) Frequenzfegen bei Dehnungsamplitude = 0,01 und (B) Amplitudenfegen bei Schwingungsfrequenz = 1 Hz (oder 6,28 rad/s). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Amplituden-Sweeps für drei Konzentrationen silberkarpfenschleim. Die Tests wurden bei f = 1 Hz oder ω = 6,28 rad/s (A) Speicher- und Verlustmodulvariation für die Schleimkonzentration, 100 mg/ ml (B) Speicher- und Verlustmodulvariation für die Schleimkonzentration, 200 mg / ml (C) Speicher- und Verlustmodulvariation für GR-Schleimkonzentration, 400 mg / ml (D) Phasenwinkelvariation für GR-Schleimkonzentration abgeschlossen, 100 mg/ml (E) Phasenwinkelvariation für schleimige Konzentration, 200 mg/ml (F) Phasenwinkelvariation für Schleimkonzentration, 400 mg / ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Variation der scheinbaren Viskosität (η) und der Spannung (σ) mit Der Scherrate ( ) für alle drei Konzentrationen von Fischschleim. (A) Scheinbare Viskositätsvariation mit Scherrate für Schleimkonzentrationen, 400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml zusammen mit Regimen von Drehmomentarmeffekten und sekundären Strömungseffekten (B) Spannungsvariation mit Scherrate für GR-Schleimkonzentrationen, 400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml, die die "Stressplateaus" (oder flache Region) mit gestrichelten Linien markieren. Gestrichelte Linien stellen die durchschnittlichen scheinbaren Streckgrenzer für die drei GR-Schleimkonzentrationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Drei Konzentrationen von Silberkarpfen GR Schleim. Von links nach rechts: 400 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml. Die Anfangskonzentration von 400 mg/ ml wurde nach dem Kriterium gewählt, dass die Probe nach der Verdünnung eine angemessene Menge fischschleim enthalten und gleichzeitig ein ausreichend großes Volumen für mehrere Tests liefern würde. Die beiden nachfolgenden Konzentrationen wurden mit 50 Volumenprozent DI-Wasser verdünnt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Einführung der Software zur Steuerung von Rheometerinstrumenten. Diese Software darf erst gestartet werden, nachdem das Gerät eingeschaltet wurde. Andernfalls ist das Gerät möglicherweise nicht korrekt kalibriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Kalibrierung des Geräts. Die Trägheitskalibrierung ist die einzige Kalibrierung, die für das Gerät erforderlich ist. Nach der Installation der Geometrie werden weitere Kalibrierungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Intelligenter Swap-Schalter. Mit dieser Option können Sie Smart Swap aktivieren oder deaktivieren. Smart Swap ist eine Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, die automatisch eine Geometrie erkennt, sobald sie auf der Rheometerwelle installiert ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Messspaltoptionen Die Registerkartenoptionen "Gap"wurden aufgerufen, um die Bedingungen für den Null-Spalt-Modus und die Verfahrgeschwindigkeit des Messkopfes festzulegen. Eine axiale Kontaktkraft zwischen der Geometrie und der Peltierplatte wurde auf 1 N eingestellt, um die Nullspaltreferenz, d.h. den Kontakt zwischen Kegelgeometrie und der Oberfläche der Peltierplatte, zu gewährleisten. Der Messkopf wurde dann so hergestellt, dass er genau den Messspalt von 24 μm zwischen der 40 mm 1° Kegelgeometrie und der Peltierplatte durchquert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 6: Kalibrierung der Geometriebefestigung. Bei der Installation der 40 mm 1° Kegelgeometrie und ihrer Detektion durch die Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware wurde die Geometrie auf die gleiche Weise kalibriert wie die Gerätekalibrierung, um genaue Messungen während eines Experiments zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 7: Zero Gap-Symbol. Die Null-Lücken-Initialisierung wird mit diesem Symbol durchgeführt. Sobald die Null-Spalt-Initialisierung abgeschlossen ist, kann das Rheometer die Position der Welle mit der daran befestigten Geometrie genau referenzieren, wenn sie angehoben oder abgesenkt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 8: CAD-Rendering der Kegelgeometrie und der Peltierplatte nach Null-Spalt-Referenz. Die Geometrie ist so eingestellt, dass der Nullspalt entsteht, wenn eine axiale Kontaktkraft von 1 N erzeugtwird, wenn sie mit der Peltierplatte in Kontakt kommt.
Ergänzende Abbildung 9: Schritt 2.5.1 des Protokolls. Die Abbildung stellt die Art und Weise dar, wie die Beispielbenennung sowie die Datei- und Datenausgabe festgelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 10: Schritt 2.5.2 des Protokolls. Die Abbildung zeigt, wie Geometrieeinstellungen wie Beispielvolumen, Geometrieabstand und Trimmabstand festgelegt werden können. Für einige Geometrien, nämlich den in diesem Experiment verwendeten Kegel, sind diese Einstellungen unveränderlich und basierend auf der Geometrie definiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 11: Schritt 2.5.3 des Protokolls. Die Abbildung stellt dar, wie testeinstellung und konditionierung in diesem Verfahrensschritt eingestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 12: Symbol für Schnittlücken. Der Trimmspalt wurde so eingestellt, dass die Geometrie so weit abgesenkt werden konnte, dass überschüssige Flüssigkeit, die aus dem Bereich zwischen der Peltierplatte und der Kegelgeometrie austritt, abgesenkt werden kann. Der Spalt ist abhängig von der verwendeten Geometrie. Für die im Protokoll verwendete 40mm, 1° Kegelgeometrie betrug der Trimmspalt 28 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 13: Symbol für die Motorgeschwindigkeit. Die Motoreinstellungen wurden verwendet, um die Rotationsgeschwindigkeit der Welle einzustellen und die Geometrieträgheit zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 14: Symbol für Geometrielücken. Der Geometriespalt senkt die Geometrie auf einen bestimmten Abstand über der Peltierplatte, wie in der Kegelplattengeometrie angegeben. Für die im Protokoll verwendete 40 mm, 1° Kegelgeometrie beträgt der Geometriespalt 24 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 15: Startsymbol. Die Schaltfläche Start initiiert die gesamte Sequenz der zuvor eingerichteten Prozeduren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 16: Ändern der Graphvariablen. Die Abbildung stellt die Variablen dar, die für die Datenpräsentation beim Ausführen der Prozeduren definiert werden können. Insbesondere Oszillationsdehnung und Oszillationsspannung sind bei den dynamischen Sweep-Experimenten im Protokoll von Bedeutung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 17: Exportieren von Dateien der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware in eine Tabellenkalkulationssoftware. Nachdem die Dateien als Tabellenkalkulation exportiert wurden, wurde die Datenanalyse mit anderer Programmiersoftware durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codedatei: Nachbearbeitung von Datendateien mittels Datenanalyseprogramm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Eines der Hauptziele bei der Entwicklung dieses Protokolls ist es, festzustellen, dass es sich gut für die rheologische Charakterisierung von GR-Schleim eignet, wenn sehr kleine Probenvolumina verfügbar sind. Wir erkennen an, dass mehr Proben aus einer Schule von Silberkarpfen benötigt werden, um die rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims vollständig zu charakterisieren, und die hier vorgestellten Daten stellen keine Verallgemeinerung über die gesamte Silberkarpfenpopulation dar. Unsere Technik ist wegen ihrer Wirksamkeit bei der rheologischen Charakterisierung kleiner Probenvolumina und bei erweiterten Untersuchungen mit größeren Ensembles von Schleimproben gerechtfertigt.
Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind die Herstellung von Schleimlösungen verschiedener Konzentrationen, Messungen und Datenerfassung mit einem Rotationsrheometer sowie die grafische Darstellung und Datenanalyse für physikalische Erkenntnisse.
Physikalische Einblicke in GR-Schleimdaten werden aus grafischen Darstellungen in Abbildung 3 und Abbildung 4gezogen, die mit Attributen des erwarteten Materialverhaltens versehen sind. Null-Scher-Dehnungsrate Viskositätswerte (ηo) können bei niedrigen Scherdehnungsraten beobachtet werden, wobei die Mobilität der Materialmoleküle dominiert (Abbildung 3A und Abbildung 8A). Die Werte für die unendliche Scherdehnungsviskosität (η∞)in nicht-newtonschen Flüssigkeiten sind um Größenordnungen niedriger als die Viskosität der Null-Scher-Dehnungsrate. Diese Daten können bei hohen Scherraten bemerkt werden, bei denen wenig oder keine Abhängigkeit von intermolekularen Wechselwirkungen besteht (Abbildung 3A und Abbildung 8A). Bei nicht-newtonschen Flüssigkeiten nehmen die scheinbaren Viskositäten mit zunehmender Scherrate allmählich ab und erreichen einen konstant niedrigen Wert (Abbildung 3A und Abbildung 8A). Das Nachgiebverhalten im GR-Schleim unter stationären Messungen kann mit Steigung dargestellt werden, wie in Abbildung 3A gezeigt und in Gleichung 1 dargestellt, wobei ηa die scheinbare Viskosität darstellt, σy die (konstante) Streckgrenze und die Scherdehnungsrate ist.
Abbildung 3A und Abbildung 8B sind auf einer Log-Log-Skala dargestellt, und daher erreicht Gleichung 1 die folgende Form:
wobei k – die scheinbare Streckgrenze darstellt. Auf einer Log-Log-Skala nimmt die scheinbare Viskosität mit einer Steigung von '-1' ab, was die Materialausbeute wie in Abbildung 3A10dargestellt anzeigt. Die Schleimkonzentrationen von 200 mg/ml und 400 mg/ml besaßen Steigungen von -1,8 bzw. -0,91 und zeigen das Nachgiebverhalten (Abbildung 8A). Bei dynamischen Schwingungsmessungen sind die viskoelastischen Eigenschaften unabhängig von der Dehnungsamplitude im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) (Abbildung 4). Das Nachgiebverhalten im GR-Schleim unter dynamischen Schwingungsmessungen kann beobachtet werden, wenn das viskoelastische Material (GR-Schleim) in den nichtlinearen viskoelastischen Bereich (NLVR) eintritt, wenn der Speichermodul (G') abnimmt (Abbildung 4). Im NLVR-Regime zeigt das viskoelastische Material ein festgelähnliches Verhalten, wenn der Speichermodul größer als der Verlustmodul (G' > G") ist. Wenn der Verlustmodul den Speichermodul (G' < G) überschreitet, tritt eine "Kreuzung" zwischen G' und G' Daten auf. Wie in Abbildung 7B,Cgezeigt, zeigten die Schleimkonzentrationen von 200 mg/ml und 400 mg/ml GR ein flüssigkeitsähnliches Verhalten, das durch die "Kreuzung" zwischen G' und G'-Daten gekennzeichnet ist. Die scheinbare Streckgrenze unter stationären Messungen wird als Mittelwert der Spannung bis zum Erreichen eines Wendepunkts dargestellt (Abbildung 3B). Danach beginnt die Spannung mit einem Anstieg der Scherdehnungsrate, wie in Abbildung 3B und Abbildung 8B gezeigt, stark zu steigen. Die GR-Schleimdaten (Konzentrationen von 200 mg/ml und 400 mg/ml) zeigten ein Scherverdünnungsflüssigkeitsverhalten, bis das Material nachgibt (Abbildung 8A,B). Die scheinbare Streckgrenze wurde bei 200 mg/ml und 400 mg/ml Schleimkonzentrationen aufgrund ihrer nicht-newtonschen Eigenschaften deutlich beobachtet (Abbildung 8B). Die scheinbare Streckgrenze bei dynamischen Schwingungsmessungen ist in Abbildung 4 und Abbildung 7B, C als "Crossover"-Bereich zwischen G' und G"-Daten dargestellt, gefolgt von G"-Werten, die G' überschreiten. Die 400 mg/ml GR Schleimdaten zeigten scherverdünnendes, nicht-newtonsches Verhalten. Der Anfangspunkt der Materialausbeute wurde mit einer scheinbaren Streckgrenze von etwa 0,2736 Pa beobachtet (Abbildung 7C). Der hydrogel-zu-fluidartige Übergang mit Phasenwinkeländerungen (δ = tan-1 (G"/G')) ist in den Abbildungen 4 und 7D-F dargestellt. Die Extrema im Phasenwinkel ist mit einem Hookean-Feststoff bei 0° und viskoser Flüssigkeit bei 90° assoziiert, wie in Abbildung 4 gezeigt. Die Phasenwinkelwerte um 45° wurden auf den Übergang des gelartigen Verhaltens des Materials zu einem flüssigkeitsähnlichen Verhalten zurückgeführt. Die 400 mg/ml Schleimkonzentration zeigte deutlich eine Veränderung der Materialcharakteristik von Hydrogel zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten durch den Prozess der Nachgiebigkeit mit einer scheinbaren Streckgrenze von ~ 0,2736 Pa(Abbildung 7F).
Das Verständnis der Messbeschränkungen und die Vermeidung von Daten, die für die physikalische Interpretation ungeeignet sind, ist eine Herausforderung bei komplexen und weichen biologischen Flüssigkeiten, insbesondere bei Studien mit kleinen Probenvolumina11. Die unter Drehmoment- und Sekundärströmungseffekten erzeugten Daten sind für die physikalische Interpretation ungeeignet und hängen von der im Rheometer verwendeten Geometrie ab (z. B. Kegel und Platte in dieser Studie). Diese Regime wurden identifiziert, um jede falsche Darstellung experimenteller Daten zu vermeiden, die aufgrund von Impulsdiffusion unter Instrumentenauflösung und Messartefakten leiden. Grenzwerte für niedriges Drehmoment (Abbildung 6A und Abbildung 8A) sind Funktionen der Geometrie und des vom Gerät erzeugten Mindestdrehmoments (Tabelle 1). Unter stationären Schermessbedingungen wurde das Kriterium für die Ablehnung von Daten, die von der niedrigen Drehmomentgrenze beeinflusst werden, für eine Kegelplattengeometrie mit Radius (R) mit minimalem Drehmoment (Tmin = 10 x10 -9 Nm, Tabelle 1) von Ewoldt et al. diskutiert und im Folgenden11dargestellt:
wobei die Scherdehnungsrate ist. Im Gegensatz zu den 100 mg/ml GR Schleimkonzentrationen zeigen die 200 mg/ml und 400 mg/ml GR Schleimkonzentrationen, die von Effekten mit niedrigem Drehmoment nicht beeinflusst wurden, deutlich ein nicht-newtonsches Scherverdünnungsverhalten mit hohen Viskositäten der Nullscherdehnungsrate bei niedrigen Scherdehnungsraten. Das Kriterium für minimal messbare viskoelastische Module unter dynamischen Schwingungsmessungen wurde von Ewoldt et al. diskutiert und im Folgenden vorgestellt (Gleichung 4)11. In Gleichung 4 gilt für eine Kegelplattengeometrie des Radius (R) das minimale Drehmoment unter Oszillationsscherung (Tmin = 2 x 10-9 Nm, Tabelle 1).
wobei Gmin der Speichermodul (G') oder Verlustmodul (G") und die Scherdehnungsrate ist. Die Durch Die Durchwirkung von Effekten mit niedrigem Drehmoment geregelten Begrenzungsschemata sind in den Abbildungen 6A und 6Bdargestellt. Das sekundäre Strömungsregime bei stationären Messungen wird durch eine nach innen gerichtete Impulsdiffusion des Fluids mittels eines Wirbels gesteuert, der sich innerhalb des Rotationskegels und der Plattengeometriebefindet 11. Das sekundäre Strömungsmuster erhöht das Drehmoment falsch, wodurch die Flüssigkeit als scherverdickend erscheint (Abbildung 8A). Die von Ewoldt et al. in Abbildung 8A vorgeschlagene sekundäre Durchflussgrenze wurde unter Verwendung der folgenden Beziehung11 gezeichnet:
wobei L = βR, β der Kegelwinkel ist, R der Kegelradius, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 und die Scherrate ist. Dieses Regime half bei der Abschätzung der Viskositätswerte für unendliche Scherdehnung (η∞)in GR-Schleimproben.
Eine Änderung des Protokolls kann durch Verwendung einer Flachplattengeometrie anstelle der Kegelplattengeometrie, wie im hier vorgestellten Protokoll gezeigt, vorgenommen werden. Die Flachplattenprüfungen sollten mit einer parametrischen Variation des Messspalts im Rotationsrheometer durchgeführt werden, um die Abhängigkeit der scheinbaren Streckgrenze von der Messlücke und -geometrie aufzudecken. Die in diesem Dokument vorgestellten Verbesserungsvorschläge des Protokolls werden im Folgenden beschrieben. Es sollte eine parametrische Variation der Dehnungsamplitude im linearen viskoelastischen Regime (LVR) und der Schwingungsfrequenz durchgeführt werden. "Tack and Peel"-Rheologietests sollten durchgeführt werden, um ein vollständiges Verständnis der Adhäsivität des GR-Schleims zu entwickeln. Rheologische Eigenschaften von GR-Schleim sollten an Ensembles mit größerem Probenvolumen zusammen mit Studien zur Messung von Spuren von Blutzellen durchgeführt werden, um seine Wirkung auf die rheologischen Gesamteigenschaften von GR zu berücksichtigen.
Die Einschränkungen des Protokolls werden im Folgenden beschrieben. Die Feinheiten der GR-Schleimextraktionsverfahren und das Vorhandensein von Blutzellen oder Gewebefragmenten in den Schleimproben können die Rheologie des Schleims beeinflussen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass der im Protokoll verwendete Schleim keine sichtbaren Blutspuren aufblieb. Die GR-Schleimprobe ist ein heterogenes Material und kann aufgrund der Varianz in der Lage und den Bedingungen nach der Extraktion unterschiedliche rheologische Eigenschaften besitzen. Diese Einschränkung wurde durch eine ausreichende Homogenisierung des GR-Schleims mit einem Shaker behoben, um große Schleimklumpen und Gewebe zu zerkleinern. Eine weitere wichtige Einschränkung sind die sehr kleinen GR-Schleimprobenvolumina (ca. 1,4 ml), die für Analysen geerntet werden, die eine Verallgemeinerung der GR-Schleimeigenschaften einschränken.
Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es eine genaue rheologische Charakterisierung von nicht-newtonschen, biologischen Flüssigkeiten wie dem Schleim ermöglicht. Das hier vorgestellte Protokoll ebnet den Weg für die Untersuchung anderer ähnlicher biologischer Flüssigkeiten, die mit menschlichen, tierischen und pflanzlichen Sekreten in Verbindung gebracht werden. Darüber hinaus können synthetische Flüssigkeiten oder polymerbasierte Lösungen, die Analoga biologischer Flüssigkeiten sind, mit diesem Protokoll getestet werden, um Materialeigenschaften unter unterschiedlichen Spannungen, Schwingungsfrequenzen und Temperaturen zu verstehen. Das Protokoll eignet sich gut zur rheologischen Charakterisierung biologischer Flüssigkeiten, wenn sehr kleine Probenvolumina zur Verfügung gestelltwerden.
Das erweiterte Ergebnis des Protokolls ist, dass die scheinbare Viskosität und die scheinbare Streckgrenze des GR-Schleims die Erstellung analytischer Modelle erleichtern werden, um Ergebnisse aus grundlegenden hydrodynamischen Untersuchungen der Filterzuführung und fortschrittlichen Technologien, die Eine Crossflow- und Membranfiltration erfordern und beinhalten, zu interpretieren.
Die makrorheologische Studie postuliert, dass sich der Schleim in Kontakt mit Lebensmittelpartikeln zunächst in einem gelartigen Zustand befindet, der als Klebstoff dient. Bei Einleitung von Strömungs- und Scherkräften erreicht der Schleim eine scheinbare Streckgrenze und erfährt eine plastische Verformung. Die Protokollausführung mit einem Rotationsrheometer half bei der Charakterisierung des Übergangs von Schleim von gelartigem zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten. Dieser Übergang wurde experimentell beobachtet, und die scheinbare Streckgrenze wurde bei 0,2736 Pa in Rotationsrheometerexperimenten aufgezeichnet. Wenn die äußeren Belastungen des Schleims geringer sind als die scheinbare Streckgrenze, zeigt der Schleim ein gelähnliches Verhalten, um die Haftung von Lebensmittelpartikeln zu erleichtern. Wenn die äußeren Spannungen die scheinbare Streckgrenze überschreiten, zeigt Schleim ein scherverdünnendes Verhalten, das den Transport von agglomerierten Nahrungspartikeln zu den Verdauungsorganen im Silberkarpfen erleichtert.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Unterstützung und Finanzierung durch das GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Wir danken Professor L. Patricia Hernandez vom Department of Biological Sciences der George Washington University für die Inspiration der Untersuchung und die laufende Zusammenarbeit, die Bereitstellung biologischer Expertise zur Physiologie des Silberkarpfens und die Bereitstellung der Schleimproben. Wir danken den Studenten, Herrn David Palumbo, Frau Carly Cohen, Herrn Isaac Finberg, Herrn Dominick Petrosino, Herrn Alexis Renderos, Frau Priscilla Varghese, Herrn Carter Tegen und Herrn Raghav Pajjur für die Hilfe im Labor und Herrn Thomas Evans und Herrn James Thomas von TA Instruments, New Castle, DE für die Unterstützung bei der Ausbildung und Wartung des Rheometers. Die Bilder für die Abbildungen 5A,C wurden während einer Sezierung aufgenommen, die von Professor L. Patricia Hernandez vom Department of Biological Sciences der George Washington University durchgeführt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
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