Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

Abstract

התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול בסרטן עם אימונותרפיה, למרות מספר רב של סוגי סרטן להישאר עמידים לטיפול. מספר מוגבל של אסות מאפשרות ניטור ישיר ותובנות מכניות על האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי מערכת החיסון, ביניהם, T-תאים לשחק תפקיד משמעותי בביצוע התגובה cytotoxic של המערכת החיסונית אדפטיבית לתאים סרטניים. רוב ההתאסות מבוססות על דו מימדי (2D) שיתוף תרבות של תאים בשל קלות השימוש היחסית, אבל עם ייצוג מוגבל של פנוטיפ צמיחה פולשנית, אחד סימני ההיכר של תאים סרטניים. מערכות שיתוף תרבויות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נוכחיות דורשות ציוד מיוחד או ניטור נפרד לפלישה לתאים סרטניים בעלי תרבות שיתופית ולאינטראקציה עם תאי T.

כאן אנו מתארים גישה כדי לפקח בו זמנית על התנהגות פולשנית ב3D של כדורי תאים סרטניים וcytotoxicity T-cell בתרבות השותפות. היווצרות ספרואיד מונעת על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בדגומים ללא אגרוז microwell יצוקות עם תחתיות בצורת U. הן T-cell שיתוף-תרבות ופלישה לתאים סרטניים לסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך microwells של יציקות agarose ללא צורך להעביר את התאים, ובכך שמירה על מערכת 3D שלם שיתוף תרבות לאורך כל ההסכם. ניתן להפריד את מטריצת הקולגן מהיצוק של אגרוז, המאפשר הכתמת אימונו-לוד (IF) והדמיה קונפוקולית של תאים. כמו כן, תאים יכולים להיות מבודדים לצמיחה נוספת או נתון לניתוחים כגון עבור ביטוי גנים או פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS). לבסוף, ניתן לנתח את התרבות ההפוכה תלת-מיוד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר הטבעה וקוריה. שינויים אפשריים של ההסדה כוללים קומפוזיציות שונות של מטריצה חוץ תאית (ECM) כמו גם הכללה של תאים סטרומה או חיסוניים שונים עם התאים הסרטניים.

Introduction

למרות שיפורים משמעותיים אימונותרפיה סרטן בעשור האחרון, ההבנה המכנית שלנו של רגישות והתנגדות לטיפולים הם עדיין עניים למדי1. זה מבוסס היטב כי גידולים להציג הטרוגניות משמעותית, כי האינטראקציות הדינמיות של התאים הסרטניים עם microenvironment שלהם, כמו גם עם התאים החיסוניים, השפעה על מוות תאי הגידול, התנהגות פולשנית ותגובה לטיפולים הכוללים אימונותרפיה1,,2,,3. כזרוע אחת של המערכת החיסונית הסתגלנית, תאי T מבצעים ציטוקסיות ספציפית לתא. הניתוח של זיהוי T-תא ותגובה לתאים סרטניים מספק תובנות מכניות להתנגדות ורגישות לטיפולים אפנון חיסוני.

במבחנה מידול וניטור אינטראקציות בין סרטן ותאי T בסביבה המתאימה היה מאתגר ועד כה, הביא תובנות מכניות מוגבלות. רוב ההתאסות המבוססות על תאים מסתמכות על סביבה דו-ממדית (דו-ממדית), כי חסר תכונות מפתח כי הם קריטיים עבור סיכום תלת מימדי (3D) בפיזיולוגיה vivo4,5,6,כל כךאינטראקציות תא מרחבי, מגע עם מטריצה חוץ תאית (ECM)7, ביקושחילוף חומרים דינמי, היפוקסיהמוגברת בשל צמיחה המונית 8, והשפעות של microenvironment הגידול (TME)9. מצד שני, יש עדיין מספר חסרונות עם כיום בשימוש תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות ומערכות אסה פלישה: (1) את הזמן גוזל אופי של דורספרואידים וקציר 5,10, (2) חוסר שליטה על גודל spheroid,צפיפות צורה ותא 11,12, (3) סוג תפוקה נמוכה תפוקה אומר, (4) הדרישה עבורציוד מיוחד 13,14, (5) הצורך להעביר את התרבות ההתוכית לסביבותנפרדות עבור 15, 16,16,17. בפרט, העברת תרבות שיתוף סד לעתים קרובות מוביל לשיבוש של spheroids ואובדן שלמות התרבות ההתופת. זה חל במיוחד על ספרואידים "רופפים" עם הדבקה מופחתת תא. לדוגמה, רוב המקרים של פלישה תלת-מית'ר דורשים שספרואידים נקצרים לאחר היווצרותם הראשונית ולאחר מכן יתפרסו מחדש ב- ECM14,15,16. שלב זה של התחדשות פעולה כתוצאה מאובדן שליטה על המרחק בין spheroids. מאז המרחק בין spheroids הגידול משפיע על ההתנהגות הפולשנית שלהם, אובדן זה של שליטה מציג סטייה בין-אסראי גבוהה ומפחית את הרבייה. יתר על כן, היישום של שברים תאים אומר על ידי צעדי צנטריפוגציה עוקבים להערכת היקפית וגודול spheroid חדירה תאים חיסוניים מוגבלת לאוכלוסיות תאים סרטניים המייצרים spheroidsיציב יותר 17.

קונספט וגישה

הגישה שלנו מטפלת בליקויים הנ"ל באמצעות מודל "All-in-One" – מודל תרבות שיתופית של ספרואיד תלת-מימד, שאינו דורש העברת ספרואידים עבור האמורות הבאות. התאמנו מכשיר היווצרות spheroid (ראה טבלת חומרים)כדי ליצור תס"א לניטור בו זמנית התנהגות פולשנית של תאים סרטניים וcytotoxicity של תאי T תרבויות. שיטה זו ידידותית למשתמש, זולה ומאפשרת טיפול מהיר וקל בהגדרה תלת-מית-מית-מית-תפוקה גבוהה יחסית. בהתאם לסוג ההתקן המשמש, ניתן ליצור עד 81 כדורי spheroid גדולים בגודל אחיד בשלב pipetting יחיד עם שליטה על גודל spheroid בודד על ידי שינוי מספר התאים שנזרעו. היווצרות ספרואיד נכפתה על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בפיגומים ללא agarose יצוק מרובה היטב עם תחתיות בצורת U. התאמנו את מערכת תלת-מיD זו עבור מחקרים פונקציונליים דינמיים מבוססי תאים, כמו גם נקודות קצה מולקולרי וביוכימי ים הכוללים פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS), immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC) הכתמה, כמו גם ניתוח ביטוי גנים של התרבות השותפות 3D שלם.

עבור מחקריםפונקציונליים , הטבעת spheroids בסוג אני קולגן בתוך agarose מטיל תוצאות פלישה של תאים סרטניים מspheroids equidistant ומאפשר ניטור תכונות חיוניות קו תאים ספציפיים, כגון תא יחיד לעומת הגירה תא קולקטיבי18,,19. יתר על כן, מטריצת קולגן מופרדת בקלות מן יצוק agarose, וכתוצאה מכך תיקון עבה 1\u20122 מ"מ המכיל spheroids מרובים, אשר ניתן לעבד עוד יותר עבור IF-כתמים והדמיה על ידי מיקרוסקופית confocal. זה יכול לחשוף פלישה תאים ברורים ואינטראקציות מטריצת תא בהקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן, תאים במטריצת הקולגן ניתן לבודד לאחר עיכול קולגן ותנתק תא יחיד עבור טיפוח תאים הבאים או ניתוח.

לניתוח IHC של spheroids, לאחר קיבעון וקטוס של יצוק agarose, חלבונים או מולקולות אחרות של עניין ניתנים לזיהוי תוך שמירה על העמדות הגיאוגרפיות של spheroids. בגישה המתוארת כאן, spheroids מוטבעים ישירות Hydroxyethyl agarose עיבוד ג'ל בתוך יצוק agarose ואת הג'ל משמש "מכסה" כדי לשמור על spheroids בתחתית microwells. לאחר הטמימת הפרפין של יציקת agarose20, קטע אופקי סדרתי מבוצע עם החלק התחתון של הגבס משמש כנקודת ההתחלה.

גישה זו מנוגדת לניתוח IHC קונבנציונלי של spheroids הדורש קצירת תאים לפני הטבעה בג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose21 וסיכונים הפרעה של spheroids ובכך לאבד את הסידור המרחבי של תאים. כמו כן, שברת תאים על ידי צנטריפוגציה להערכה אם תאים חיסוניים חדרו או נשארו היקפיים לספרואידיםגידול 17 נמנע על ידי הטבעה ישירה.

יתר על כן, 3D שיתוף תרבות יכול להתבצע על ידי גידול admixing, סטרומה או תאים חיסוניים, ובכך ללמוד crosstalk תא סרטני או סיכום microenvironments גידול שונים לניתוח אינטראקציות תא-תאים כולל תרבויות מצטלבות עם תאים אנדותל16.

הגדרה זו 3D spheroid שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לבצע שיתוף תרבות של סוגי תאים שונים הנוכחי microenvironment הגידול כדי להעריך את ההשפעות של אלמנטים ECM שונה. מלבד סוג אני קולגן, רכיבים אחרים ECM (למשל, מטריג'ל, תערובת מטריג'ל / קולגן, פיברונקטין), ניתן להשתמש מאז פלישת תאים סרטניים מושפעת השפע של מצעיםשונים 22. כמו כן, microwells של יצוק agarose מתאימים להיווצרות spheroid של קווי תא ראשיים עבור תאים עם הדבקה תא נמוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רשימה והסבר של כמה מילים הנמצאות בשימוש תכוף לאורך הפרוטוקול ניתן למצוא בקובץ משלים 1.

1. דור של כדוריות

  1. הכנה ו autoclave 2% agarose ב 1x PBS (למשל, 1 גרם agarose ב 50 מ"ל של 1x PBS) ו autoclave 35- ו 81 מיקרווול גומי תבניות.
    התראה: הימנע משימוש באגהרוז עם התכה נמוכה ליצירת יצוק agarose לעיבוד IHC.
  2. הכן גבס אגרוז
    הערה: 35 יציקות מיקרווול משמשות לפלישה, אימונו-לודיזם (IF) ובידוד תאים. 81-microwell יצוק משמשים cytotoxicity, אימונוהיסטוכימיה (IHC), בידוד תאים ואסמים מיצוי RNA.
    1. לאחר agarose כבר autoclaved, לתת agarose מותך מגניב על 60\u201270 °C. בשכונה תרבות תא, להשתמש בטכניקה aseptic פיפטה 500 μL של agarose מותך לתוך תבנית גומי 81 מיקרווול לכל באר או 330 μL לתוך תבנית גומי 35 מיקרווול לכל באר.
      התראה: הימנע מיצירת בועות תוך ערבוב או צנרת agarose. הסר את כל הבועות על ידי התפתות בעדינות.
    2. לאחר התגבשות ההתגבשות, התכווץ בזהירות את תבנית הגומי כדי להסיר ממנה את הגבסה. בזאת, מניחים את הידיים מעל צלחת הבאר המתאימה ותנו ליצוק היגרוז ליפול ישר לתוך באר אחת של הצלחת.
      הערה: כופף את תבנית הגומי בתנוחות שונות כדי להימנע מגמישות יתר. זה יכול להיות מועיל כדי להגמיש את תבנית גומי ולדחוף בעדינות מלמטה באותו הזמן.
    3. כדי לצייד את יצוק agarose, להוסיף מדיום תרבות התא, המורכב DMEM בתוספת 10% סרום של 10% קנקן עוברי (2.5 מ"ל / גם עבור צלחת 12-באר ו 1 מ"ל / גם עבור צלחת 24-well). מכניסים את הצלחת היטב לדגירה של תא (37°C, 5% CO2)ותדגירה למשך שעה אחת.
  3. בינתיים, להכין את תרבות התא לזרעה.
    הערה: מספר זריעת התא הכולל לכל יצוק agarose הוא להיקבע על ידי החוקר. עבור קווי תאים סרטניים בלבלב הראשי murine, 35,000 תאים/35-microwell יצוק ו 81,000 תאים / 81-microwell יצוק (בממוצע 1000 תאים / spheroids) הם זרעים עבור כל האמורות הבאות. הקוטר הממוצע של ספרואיד הוא כ 150\u2012200 μm לאחר 48 שעות.
  4. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן הסירו בזהירות את המדיום בתא ההזרעה.
  5. בזהירות זרע את המתלה תא הגידול מוכן טיפה-חכם לתוך תא זריעה תא. בזהירות לשים את הצלחת היטב בחזרה לתוך אינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2)במשך 15 דקות.
    הערה: במהלך שלב זה התאים יתמקמו לתוך microwells של יצוק agarose.
  6. הוסף מדיום נוסף אל החלק החיצוני של יצוק agarose (2.5 מ"ל / גם עבור צלחת 12-באר ו 1 מ"ל / גם עבור צלחת 24-באר).
  7. להחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תרבית התאים (37°C, 5% CO2)למשך 48 שעות.
    הערה: בדרך כלל זה לוקח עד כמה שעות עבור התאים ליצור spheroids במיקרווול. באופן כללי, spheroids תא סרטני מוצק נוצרים לאחר 24 שעות והם יציבים לאחר 48 שעות. עם זאת, הדבר עשוי להשתנות בין קווי תא שונים. במידת הצורך, לשנות את רמת תא בינוני על ידי הטיה בזהירות את הצלחת היטב עם יצוק agarose והסרת מדיום תרבות התא שמסביב עם P1000 pipette. לאחר מכן להוסיף בזהירות מדיום טרי על ידי pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר. בדרך כלל אין צורך לשנות את המדיה בתוך השחקנים בשל נפח קטן שלה ואת הסיכון של הסרת spheroids.

2. שיתוף תרבות עם תאי T

  1. תפנס מחדש את המספר הנדרש של תאי T ב 75 μL (35-microwell יצוק) או ב 190 μL (81-microwell יצוק) של אמצעי תרבות T-cell המתאים (RPMI בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין).
  2. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות, הסר את המדיום בתוך הגבס על-ידי מיקוד עדין של פינה אחת של תא ההזרעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
  3. (שלב קריטי 1) כפי שיש סיכון של הסרת spheroids, שליטה על אובדן של spheroids על ידי השוואת מספר spheroids בתוך microwells לפני ואחרי הסרת המדיום על ידי צפייה תחת המיקרוסקופ ב 10x הגדלה.
  4. בזהירות זרעו את המתלים T-תא טיפה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת פיפטה P200 על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  5. (שלב קריטי 2) נכון גם לשטוף את כדורי המידע תוך הוספת תאי ה-T. לכן, זה קריטי להוסיף את תאי T לאט מאוד על 0.5 ס"מ מעל תא הזרעה.
    הערה: אפשרות אחת כדי להקטין את מספר spheroids החוצה שטף היא על ידי הצבעת פיפטה לפינה אחת של תא זריעה תוך הוספת תאי T, ובכך רק לסכן את spheroids בפינה זו כדי להיות שטוף החוצה.
  6. בזהירות למקם את צלחת היטב בחזרה לתוך אינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2)במשך 15 דקות.
  7. להוציא את צלחת היטב מן האינקובטור ולהוסיף מדיום תרבות תא טרי (RPMI בתוספת עם 10% סרום בשר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) סביב agarose יצוק על ידי לאט pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר.
  8. תחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תא למשך 48 שעות.

3. הטבעת תרבות תלת-מית-ית-ת-ית-עורית למטריצת קולגן מסוג I

  1. הכן קולגן מסוג I מנוטרל
    1. לדלל את קולגן המניות עם סרום חינם בסיס בינוני (RPMI) לריכוז עבודה סופי של 3 מ"ג/ מ"ל. עבור כל 100 μL של קולגן מדולל, להוסיף 11 μL של PBS 10x ו 1.2 μL 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. לשמור על קרח דגירה (לנטרל) במשך 1 שעה.
  2. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות להסיר את המדיום בתוך הגבס על ידי מיקוד בעדינות פינה אחת של תא זריעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
    הערה: כאן, זה קריטי להסיר לחלוטין את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose.
  3. בזהירות פיפטה הקולגן מנוטרל אני מערבב טיפה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת פיפטת P200 על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  4. מכניסים את הצלחת היטב מיד לתוך אינקובטור תרבות התא במשך 4 דקות (35 מיקרווול יצוק) או 5 דקות (81 מיקרווול יצוק).
    התראה: (שלב קריטי 3) חשוב לשמור בקפדנות על זמן הדגירה הנתון. אחרת, ייתכן שההתנהגות הפולשנית לא תהיה ניתן לשחזור.
  5. להפוך את צלחת הבאר ולהשאיר אותו התהפך באינקובטור במשך 1 שעה.
    הערה: הגבס יישאר מחובר לתחתית לוחית הבאר בשל מתח פני השטח. במקרה של תרבות תאים מיוחדת בינונית עם ריכוז סרום גבוה (למשל, RPMI בתוספת 20% סרום שורי עובר) משמש, צעד כביסה נוסף עם PBS 1x לאחר הסרת המדיום בבאר עשוי להיות נחוץ כדי להגביר את מתח פני השטח.
  6. תוציא את הצלחת מהאינקובטור ותהפוך אותה בחזרה. להוסיף מדיום תרבות תא טרי (RPMI בתוספת עם 10% סרום בשר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) סביב agarose יצוק על ידי לאט pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר.
  7. תחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תא במשך 48 שעות.

4. סיטוקסיסיטי

  1. הכן 3 מ"ל של PBS 1x עם 2% סרום של 2% קנקן קנקן agarose.
  2. לאחר שיתוף תרבות עבור 4 d, להסיר את מדיום תרבות התא סביב יצוק agarose עם פיפטה P1000 על ידי הטיה קלה את צלחת היטב עם היד השנייה.
    הערה: תקופת הזמן הכוללת של שיתוף התרבות היא להיקבע על ידי החוקר.
  3. להפיץ 1 מ"ל של 1x PBS + 2% FBS עם P1000 pipette לתוך תא זריעה כדי לנתק את spheroids מן microwells.
  4. חזור על שלב 4.3 פעמיים עם עוצמת הקול בבאר ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר (RT).
  6. הסר בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה P1000.
  7. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS 1x עם 2% FBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 1 דקות ב RT.
  8. חזור על שלב הכביסה (שלב 4.7).
  9. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון אנזימי דיסוציאציה תא (ראה טבלת חומרים).
  10. השתמש בפיפטה P200 ופיפטה למעלה ו למטה כדי לשבור את אשכולות התאים.
  11. דגירה התאים במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2).
  12. חזור על שלב 4.10.
    הערה: קח ~ 10 μL החוצה זרע על צלחת תרבות תא להתבונן (תחת המיקרוסקופ בהגדלה 10x) כמה טוב spheroids יש ניתוק בתאים בודדים. במידת הצורך, להוסיף 5 דקות של דגירה נוספת.
  13. להוסיף 4 מ"ל של תא מלא תרבות בינונית (RPMI בתוספת עם 10% סרום נקניק עוברי 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) ולערבב על ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  14. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  15. הסר את supernatant וssuspent את התאים במאגר FACS עבור התכתמות Annexin V של תאים אפופטוטיים.
    הערה: מכאן ניתן לבצע כל כתמים וניתוח תאים של FACS.

5. הידרוקסיאתיל agarose עיבוד ג'ל הטבעה עבור IHC מקטע

הערה: כאן זה קריטי כדי להימנע משימוש agarose נמס נמוך ליצירת יצוק agarose.

  1. בסוף התרבות ההגמרית, הסר את מדיום תרבות התא המקיף את היצוק agarose עם P1000 פיפטה הראשונה על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות, הסר את המדיום בתוך הגבס על-ידי מיקוד עדין של פינה אחת של תא ההזרעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
  2. לאט פיפט 10% פורמלין הראשון בתא הזרעה על ידי מיקוד בעדינות פינה אחת של תא הזרעה עם פיפטה P200. לאחר מכן להוסיף 10% פורמלין אל החלק החיצוני של הגבס agarose עד שהוא מכוסה לחלוטין. לתקן את הגבס agarose ב 10% פורמלין עבור 1 d.
  3. הסר את הפורמלין ביום שלמחרת.
  4. בזהירות פיפטה 210 μL (81-microwell יצוק) או 100 μL (35-microwell יצוק) של ג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose חימום מראש (ראהטבלת חומרים) ירידה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת P200 פיפטה על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  5. תן ג'ל עיבוד agarose הידרוקסיאתיל לגבש במשך 10 דקות ב RT.
  6. העבר את גבס agarose ל- PBS 1x.
    הערה: לאחסון ארוך יותר, הטבע את הגבס ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום.
  7. מייבשים את מקטעי הג'ל באמצעות סדרת אתנול (שעה אחת כל אחד: 70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול [3x משתנה כל אחד]). לאחר מכן ברור בתמיסת סליקה 3x עבור 1 שעה כל אחד (למשל, פחמימנים aliphatic [למשל, Clearite], או קסילן), ולחדור עם פרפין מותך (3x עבור 1 שעה כל אחד), או באופן ידני או בעיבוד רקמות. הטבע את הגבס בשעוות פרפין למקטעים הבאים ב 5 μm לכל קטע.
  8. להסיר שעווה על ידי לשים שקופיות xylenes, 3x עבור 3 דקות כל אחד, לאחר מכן rehydrate רקמות קטעים באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת: 100% אתנול עבור 2 דקות, 95% אתנול עבור 1 דקות, 80% אתנול עבור 30 s ו 70% אתנול עבור 30 s, ואז מקום במים.
  9. לבצע אחזור אפיטופ המושרה חום באפיטור ירקות ב 100 ° C במשך 20 דקות, ואחריו 20 דקות של קירור ב10 mM נתרן ציטראט pH 6.0 פתרון ולחסום peroxidases אנדוגני עם H2O2.
  10. חסמו את המקטעים עם סרום מטרה רגיל ולחשוף אותם נוגדן נגד CD8 (דילול 1/25) בן לילה.
  11. החל נוגדנים משניים נגד ארנב-HRP (ראה טבלת חומרים)ולפתח את הכתמים באמצעות כרומגן 3,3'-Diaminobenzidine (DAB). גרעין נגדי עם תמיסת המטוקסילין של האריס ב-11% (ראה טבלת חומרים).

6. ניטור וניתוח של פלישת ספרואידים בתרבות ההשתתפת

הערה: נקודת הזמן של פלישת כדורי הדמיה לתוך מטריצת הקולגן אני הוא להיקבע על ידי החוקר. לרכוש תמונות תרבות התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה 10x. נקודת הזמן האידיאלית תלויה בקו התא שנבחן, כמו גם ברכיב ECM. קווי תאים פולשניים יותר יתחילו להתפשט לתוך הקולגן בתוך כמה שעות לאחר הוספת הקולגן. מאז T-תאים בתרבות ההפעולה עשוי למנוע תצוגה מלאה על הנסיגה מן spheroids בנקודות זמן מוקדמות מאוד, בדרך כלל תמונות נלקחות ב 0 h (כפי סימוכין), 24 שעות ו 48 שעות לאחר הוספת הקולגן.

  1. פולשניות כמותית על ידי ספירה ידנית של מספר "קוצים" יוצא spheroid ו / או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, למשל, תמונה J.
    1. נתח את הפלישה כמספר "קוצים" מהספרואיד על-ידי ספירה ידנית של מספר "הקוצים" של ספרואיד.
      הערה: זה יוחלט על ידי החוקר אילו בלטים מן spheroids נחשבים "קוצים". קריטריון החלטה יכול להיות אורך ה"ספייק" הנמדד מקצה הספירואיד.
    2. לנתח את הפלישה כאזור הפלישה יחסית לגודל של spheroid.
      1. השתמש בכלי ציור יד חופשית (תמונה J) כדי לעקוב אחר הגבול של האזור הכולל (פלישה + אזור spheroid).
      2. לחץ על נתח בתפריט העליון ולאחר מכן לחץ על מדידה כדי להציג את מדידת האזור.
      3. עקוב אחר הגבול של אזור הספירואיד הכולל.
      4. לחץ על נתח בתפריט העליון ולאחר מכן לחץ על מדידה כדי להציג את מדידת האזור.
      5. העתק את רשימת התוצאות שנמדדו לתוך גיליון אלקטרוני וחשב את הפלישה/spheroid הכולל באמצעות הנוסחה: הפלישה הכוללת = שטח/ספרואיד סה"כ.

7. מכתמי חיסון

  1. הכן את הפעולות הבאות.
    1. הכן 5.4% פורמלין (5 מ"ל) באמצעות 2.3 מ"ל של PBS 1x ו 2.7 מ"ל של 10% פורמלין.
    2. להכין 0.5% Octoxynol (50 מ"ל) באמצעות 50 מ"ל של 1x PBS ו 2.5 מ"ל של 10% אוקטוקסינול (חנות ב RT).
    3. להכין אם Buffer (200 מ"ל) באמצעות 200 מ"ל של 1x PBS, 200 מ"ג סרום סרום של צות (BSA), 4 מ"ל של 10% Octoxynol, 1 מ"ל של 10% polysorbate 20 (להתחמם RT לפני השימוש; לסנן ולאחסן ב 4 ° C).
    4. להכין פתרון חסימה (5 מ"ל) באמצעות 5 מ"ל IF Buffer ו 500 μL של סרום עז (להתחמם RT לפני השימוש).
    5. שמור שקופיות תאיות עם 8 בארות, כיסויי זכוכית והמדיה להרכבה מוכנים.
  2. היום ה-0
    1. לתקן את כל גבס agarose, כולל spheroids, לילה ב 5.4% פורמלין ב RT בתא לח.
  3. היום הראשון
    1. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את היצוק agarose עם פיפטה P1000 על ידי הטיית צלחת היטב.
    2. מעבירים את תיקון הקולגן לשקופית של 8 בארות על-ידי תפיסת פינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של גבס היגרוז עם פינצטה מלוטשת ומחודדת ומקלף אותה מהיציק של ה"א-רוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
      הערה: יש להפריד בקלות את מדבקת הקולגן מהיצק של agarose. אחרת, השתמש בפיפטה P1000 כדי להוסיף בזהירות את מדיום התרבות באזור תא הזרעה או להפוך את יציקת agarose ולנער בעדינות את צלחת היטב כדי לנתק את מטריצת הקולגן.
    3. להוסיף 250 μL של 0.5% אוקטוקסינול (ראה טבלת חומרים)לכל באר. דגירה לשעה אחת בRT.
    4. לשאוף את Octoxynol ולהוסיף 250 μL של חסימת פתרון לכל באר. בלוק לשעה אחת בRT.
    5. בינתיים, לדלל את הנוגדן העיקרי (דילול אנטי קרטין 8: 1/500; פאלודין 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) בפתרון חסימה, חישוב עבור 250 μL לכל באר.
    6. הוסף את הנוגדן העיקרי בחסימת פתרון והניח את שקופית התא בתא לח לצורך דגירה לילית ב-RT.
  4. היום השני
    1. הסר את הנוגדן הראשי בחסימת פתרון על-ידי שאף.
    2. לשטוף 3 פעמים על ידי הוספת 300 μL של IF Buffer ולתת לו לשבת במשך 5 דקות ב RT.
      הערה: פשוט תן לו לשבת, אין צורך לשים אותו על שייקר.
    3. לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת חסימה (עבור אנטי קרטין 8: נגד חולדה, דילול 1/500).
    4. להוסיף 250 μL של נוגדן משני בחסימת פתרון לכל באר דגירה במשך 1 שעה ב RT. ממכאן מכאן, להגן על הדגימות מפני אור.
    5. הסר את הנוגדן המשני בחסימת פתרון על-ידי שאף.
    6. לשטוף 3 פעמים עם 300 μL של אם מאגר על ידי הוספה ולתת לו לשבת במשך 5 דקות ב RT.
    7. לשטוף את הדגימות עם PBS 1x ולאסוף אותו.
    8. הסר בזהירות את קירות מגלשת התא כך שרק החלקת הזכוכית בתחתית נשארה.
    9. הוסף לפחות 200 μL של מדיה הרכבה לכיסוי זכוכית ושחרר לאט את כיסוי מעל המדגם.
      הערה: הימנע מיצירת בועות מכיוון שזה ישפיע על איכות התמונה. ניתן למנוע בועות על-ידי הצבת פתק הכיסוי בעדינות בקצה הארוך של השקופית בזווית של 45° או הורדה איטית של החלקת הכיסוי בשקופית.
    10. מניחים את הדגימות הרכובות במקום חשוך ויבש ותנו להן לשבת למשך הלילה. ניתן לבצע הדמיה ביום שלמחרת.
      הערה: כיסוי עשוי בתחילה להזיז קצת פעם אחת הניח מעל תיקון קולגן. תנו לשקופית הזכוכית לשבת על אזור שווה לכמה דקות. כיסוי יהיה לשטח את הדגימה כך שלא יהיה רווח עזב בין מגלשת הזכוכית וכיסוי לאורך זמן.

8. בידוד תאים מטריצת הקולגן

  1. הכן את הפעולות הבאות.
    1. להכין 1 מ"ג/ מ"ל קולגנאז 4 במדיום תרבות תא המכיל סרום (לאחסן aliquoted קולגנאז 4 דילול ב -20 °C)
    2. להכין 2.5% BSA ב 1x PBS ולציפוי כל הצינורות וטיפים פיפטה עם זה (פתרון BSA מסנן לפני השימוש).
    3. לפני חום פתרון BSA ותרבות התא בינוני לפני השימוש.
  2. להכין 2 מ"ל של קולגנאז 4 פתרון (1 מ"ג / מ"ל) לעכל מקסימום של שלוש מטריצות קולגן מ 35-microwell agarose יצוק.
  3. להעביר עד שלושה מטריצות קולגן 75 μL מ 35-microwell agarose מטיל לתוך 2.5% BSA מראש מצופה צינור 15 מ"ל. אחז בפינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של היגרוז עם פינצטה מלוטשת מחודדת וקלף אותה מהיצק של ה"אגרוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
  4. לחתוך את הקצה של קצה P1000 עם מספריים. לפני מעיל הקצה הנותר עם 2.5% BSA ולשבור את מטריצת הקולגן ככל האפשר על ידי pipetting למעלה למטה. דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  5. (שלב קריטי 4) בכל 5 דקות, בדוק אם מטריצת הקולגן התמוססה. פיפטה למעלה ומטה שוב לפני לוקח 10 μL של הדגימה החוצה ולזרע אותו על צלחת תרבות תא להתבוננות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה 10x. להוסיף עוד 5 דקות במידת הצורך.
  6. מלא את הצינור עם 10 מ"ל של חום מראש תא תרבות בינוני (DMEM בתוספת עם 10% סרום שוור עוברי). מערבבים בעדינות על-ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  7. צנטריפוגה הצינור ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  8. בזהירות להסיר את supernatant ולהשאיר 2 מ"ל של נפח.
  9. (שלב קריטי 5) השאר 2 מ"ל לאחר צעד הצנטריפוגה הראשון כפי שעדיין יכול להיות קולגן לא פתור בתחתית הצינור נושא תאים לאורך אותם.
  10. בצע שני שלבי כביסה על-ידי הוספת 10 מ"ל של תא המכיל סרום בינוני בכל פעם. צנטריפוגה בכל פעם ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  11. לאחר שלב הכביסה האחרון, הסר בינוני ככל האפשר ולהשאיר רק את גלולת התא.
  12. תולה מחדש את גלולת התא ב- 1 מ"ל של תמיסת אנזימי דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים).
  13. השתמש בפיפטה P200 ופיפטה למעלה ו למטה כדי לשבור את אשכולות התאים.
  14. דגירה התאים במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2).
  15. חזור על שלב 8.13.
    הערה: לקחת ~ 10 μL החוצה זרע על צלחת תרבות תא להתבונן תחת המיקרוסקופ בהגדלה 10x כדי לראות כמה טוב spheroids יש ניתוק לתאים בודדים. במידת הצורך, להוסיף 5 דקות של דגירה נוספת.
  16. להוסיף 4 מ"ל של תא תרבות בינונית (DMEM בתוספת עם 10% סרום שור עוברי) ולערבב על ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  17. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  18. הסר את הסופרנטנט. מכאן ואילך, ניתן לבצע כתמימת FACS או תרבות תאים.

9. חילוץ RNA מטריצת הקולגן

  1. להכין guanidinium thiocyanate עם פנול (ראה טבלת חומרים),100% כלורופורם, 70% אתנול ללא RNase, ערכת מיצוי RNA (ראהטבלת חומרים), RNase חינם 1.5 מ"ל צינורות, RNase חינם 15 mL צינורות RNase ו RNase חינם ddH2O.
  2. להעביר עד 12 190 מטריצות קולגן μL מ 81-microwell agarose יצוק לתוך צינור 15 מ"ל. אחז בפינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של היגרוז עם פינצטה מלוטשת מחודדת וקלף אותה מהיצק של ה"אגרוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
    הערה: ניתן גם להקפיא את המטריס ב-80°C עד להכנות לחילוץ RNA.
  3. להוסיף 1 מ"ל guanidinium thiocyanate עם פנול (ראה טבלת חומרים)למטריצות קולגן בצינור 15 מ"ל.
    הערה: הגואנידיניום טיוציאניאט עם פנול חייב לכסות לחלוטין את מטריצות הקולגן.
  4. מערבולת הצינורות עבור 10\u201220 s.
  5. המגן את מטריצות עם מחטי 20 G ו 5 מזרקים מ"ל עד שהם מומסים לחלוטין.
  6. תנו למטריות לשבת 5 דקות ב-RT.
  7. להוסיף 200 μL של כלורופורם טהור מטריצות לנער את הצינור במרץ במשך 15 s.
  8. מעבירים מיד את התערובת לצינורות של 1.5 מ"ל.
  9. תן לתערובת לשבת לפחות 5 דקות ב-RT עד שהשלבים מופרדים.
  10. צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° C.
  11. מלא שפופרת חדשה של 1.5 מ"ל עם 500 μL של 70% אתנול.
    הערה: תלוי בנפח של השלב המים לאחר צנטריפוגה (ראה שלב 9.12. זה לא יכול להיות 500 μL. הכמות של 70% אתנול צריך להיות שווה לנפח של שלב המים.
  12. העבר בזהירות את השלב המים העליון של הדגימות הצנטריפוגיות לצינור מלא אתנול 70% ולערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה למטה.
  13. (שלב קריטי 6) היזהרו לא להפריע לשכבות בתחתית הגואנידיניום תיוציאניאט עם הפרדת פנול תוך הסרת השלב העליון, כמו זה יהיה לזהם את RNA.
  14. הוסף את הדגימה לעמודת חילוץ RNA (כלולה בערכת החילוץ RNA, ראה טבלת חומרים). מכאן מכאן, בצע את פרוטוקול היצרן לטיהור RNA מתאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל התרבות התת-ת-ית-ית-ית-ית-ית-יתור מאפשר תסה שונה המוצגת באות 1A, שניתן לשלב או לשנותה במידת הצורך. בהגדרה ניסיונית הוקמה שלנו, גידול ותאי T הם שיתוף תרבות במשך 2 ימים ואחריו חניכה של אסא הפלישה לבחירה של תאים סרטניים פולשניים ו / או עמידים(איור 1B). ביום 4 מבוצעת כמות הפלישה ותאי "הישרדות" מבודדים מטריצת הקולגן או מעובדים ישירות עבור RNA23 או הפקת דנ"אממטריקס (איור 1B). הטבעת תרבות 3D בסוג אני קולגן בתוך microwells של צוות agarose מאפשר ניטור וניתוח של הפלישה באמצעות תמונה J תחילה כדי לשרטט את האזור הכולל באמצעות כלי ציור יד חופשית של התוכנה ולאחר מכן לחשב את היחס על אזור ספרואיד מסומן (איור 2A), ו / או על ידי ספירת מספר "קוצים" עוזב את הפרא. באמצעות שני קווי תאים סרטניים בלבלב murine העיקרי (קו תא 1 וקו תא 2), צורות spheroid שונות והתנהגות פולשנית נצפו וכמתובהתאם (איור 2B). קו תא 1 מראה היווצרות ספירואיד קומפקטית יותר ופלישה "קוצנית", דומה לפלישה לתא יחיד, בעוד קו תא 2 צורות ספירואידים רופפים יותר ומראה דפוס פלישה קולקטיבית(איור 2C). שיתוף תרבות בוצעה עם שני קווי תא clonal הגידול שונים זרעו באותו זמן(איור 3A\u2012E)כדי לעקוב אחר האינטראקציות שלהם במהלך ההתאסות הבאות, עם תאים סרטניים ותאי T על היווצרות סרטני(איור 3F\u2012J). להערכה מפורטת של ההתנהגות הפולשנית, בוצעה כתמים חיסוניים(איור 4). לאחר הפרדת מטריצת הקולגן מהיצק agarose, IF כתמים, ולהעביר מגלשת זכוכית(איור 4A\u2012B),הדמיה confocal בוצע באופן בתפוקה גבוהה(איור 4C\u2012J). הגודל והעקביות של יציקת agarose לאפשר הטבעה של כל מערכת תרבות 3D בפרפין עבור מקטע סדרתי וכתמים חיסוניים (IHC) לכמת את הקשר המרחבי בין גידול ותאי T(איור 5). T-תאים הנוכחיים בסעיף ניתן לזהות ומאופיין עוד יותר על ידי כתמי סמן משטח תא המופת כאן עבור CD8(איור 5D,E). T-תאים שחדרו spheroid הגידול ניתן לספור יחסית לאלה שנשארו בפריפריה של spheroid. איור 5D,E מציג דוגמאות של חדירת T ברורה של תאי T לתוך spheroids הגידול גדל קו תא סרטני 1 (D) וקו תא 2 (E). טבלה 1 מציגה הגדרות ניסיוניות אופייניות עבור ההסתה, ואת התשואה של דגימות מייצגות וניתנות לניתוח בסוף הניסוי עבור כל פרוטוקול.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה, ניתוחים וציר זמן של ניסויים. (A)תבנית גומי 81-microwell ו 35 מיקרווול מלאים 2% agarose ב 1x PBS כדי ליצור יצוק agarose עם microwells מרובים. קוטרו של תבנית גומי הוא 3.5 ס"מ. גודלה של יציקת אגרוז 35 מיקרווול הוא 13 מ"מ x 8 מ"מ, ומתוך יציקת 81 מיקרווול היא 13 מ"מ x 13 מ"מ. ספרואידים נוצרים על תאי זריעה לתוך התאים של agarose יצוק בשלב pipetting אחד. תרבות פעולה עם תאי T מבוצעת בתוך אותו צוות השחקנים. ניטור פונקציונלי ואסרים פוטנציאליים מוצגים. צירהזמןשל הניסויים. תאים סרטניים הם שיתוף תרבות עם תאי T אוטולוגיים במשך 2 ימים המאפשר אינטראקציה מקסימלית בין שני סוגי התאים. הפלישה מתחילה לאחר יומיים. ניתוחי נקודת קצה מבוצעים לאחר יומיים נוספים כדי לפקח על פנוטיפ פולשני והישרדות של תאים סרטניים, כמו גם את ההתפשטות וההישרדות של תאי T. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: כימות הפלישה. ניתן לכמת את הפלישה על ידי ניתוח תמונה, למשל, באמצעות תוכנת Image J וספירת מספר "קוצים" לכל ספרואיד. (א)חישוב אזור הפלישה הכולל כייחס של שטח כולל לאזור הספירואיד. סרגל קנה מידה: 300 μm. (ב)דוגמאות של שני קווי תאים סרטניים מורין ראשי שונים (קו תא 1 ו 2) במבנה ספרואידי בהגדלות שונות ופלישה לסוג אני קולגן. (C) ניתוח הפלישה מתבצע על-ידי ספירת מספר הקוצים לכל ספרואיד (דיאגרמה שמאלית; קווי שגיאה: 2.63 עבור קו תא 1, 1.47 עבור קו תא 2) ומחשב את אזור הפלישה כמתואר (דיאגרמה ימנית; קווי שגיאה: 0.36 עבור קו תא 1, 1.28 עבור קו תא 2). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תרבות שיתופית עם גידול עם תווית צבע ותאי T. אנילא יודע אם אני יכול לעשות את זה. לערבב של שני צבע שונה מתויג ראשי מורין הלבלב הלבלב clonal קווי תא (ירוק ואדום) ותצוגה מוגדלת של מיקרווול נציג אחד (B \u2012E). אני לא יודעאם אני יכול לעשות את זה. תרבות שותף של גידול מסומן מראש (ירוק) ותאי T (אדום). אני לא יודע אם אנייכול לעשות את זה. תצוגה מוגדלת של מיקרווול נציג אחד מראה אחד גידול-T-תא שיתוף תרבות על היווצרות סרטני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כתמי חיסון. כתמי חיסון (IF) בוצעו לאחר הפרדת מטריצת הקולגן מהיצק של א-גרוז. אני לא יודעאם אני יכול לעשות את זה. לאחר כתמים IF, מדבקות קולגן מועברים לשקופית זכוכית ומכסים כיסויי זכוכית. אני לא יודעאם אני יכול לעשות את זה. דוגמה של תיקון קולגן מוכתם IF כולל spheroids גידול עם(C)Hoechst, (D) קרטין 8, (E) פאלואידין ו - (F) כיסוי. לוחות (G\u2012J) הצג את התצוגה מוגדלת בהתאמה של spheroid יחיד. סרגל קנה מידה = 300 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 5
איור 5: ניתוח אימונוהיסטוכימיה. צוות אגרוז עם תרבות 3D שקוע ג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose, היה מוטבע בפרפין, נותח ומעובד עבור כתמים אימונוהיסטוכימיה (IHC). (א)בלוק פרפין המשמש למקטע אופקי שמתחיל מתחתית הגבס agarose כדי להשיג קטעים טוריים של תאים סרטניים מרובים / T-תא תרבויות בתוך גבס אחד; סרגל קנה מידה = 5מ"מ. (ב)Hematoxylin & אאוסין קטע מוכתם של גבס agarose המכיל 3D שיתוף תרבות של גידול ותאי T. סרגל קנה מידה: 1מ"מ( ג) תצוגה מוגדלת של H & E מוכתם שיתוף תרבות בתוך גבס agarose. כתמי CD8 של תאי T בהתרבות עם קו תא 1 (D) וקו תא 2 (E). קנה מידה של פסים ב C\u2012E = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול התקנה אופיינית תאים שנזרעו (לכל גבס) תשואה אופיינית
סיטוקסיסיטי תסיסה 2 יציקות מיקרווול 2x 81 81,000 100,000 תאים
תס"א IHC 1 יציקת מיקרווול אחת 81,000 40 כדוריות
הפלישה לתסה 2 יציקות מיקרווול 2x 35 35,000 50 כדורי פרואידים
אם תסתה 2 יציקות מיקרווול 2x 35 35,000 50 כדורי פרואידים
בידוד תאים קולגן I 2 יציקות מיקרווול 2x 35 35,000 50,000 תאים
חילוץ RNA קולגן I 12x 81 יציקות מיקרווול 243,000 400-600 ng/μl

טבלה 1: התקנה ניסיונית אופיינית ותפוקה עבור הפרוטוקולים. הטבלה מציגה את ההתקנה הניסיונית האופיינית עבור כל פרוטוקול ואת התפוקה האופיינית של דגימות הניתנות לניתוח (מספר התאים, spheroids או ריכוז RNA) בסוף הניסוי, בהתאמה. IHC = אימונוהיסטוכימיה; IF= אימונולוסלוס.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מתארת דור ספרואידי גידול 3D, המאפשר שיתוף תרבות עם תאי T, תאים מבוססי פונקציונליות ומולקולריים, כמו גם מגוון רחב של אפשרויות ניטור וניתוח באמצעות מכשיר יחיד. היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא אינה מחייבת העברת תרבות תלת-מימד לתסה נפרדת ושומרת על שלמות תרבות ה-3D לאורך כל הדרך.

ניתן לשנות את זרימת העבודה המוצגת כאן במידת הצורך. זמני הדגירה עבור היווצרות spheroid, T-תא שיתוף תרבות או cytotoxicity סיסא, ייתכן שיהיה צורך לשנות עבור תנאים ניסיוניים שונים או קווי תא.

ישנם כמה צעדים לאורך כל ההתמרמרות, אשר דורשים דבקות קרובה בפרוטוקול. אלה הם באופן כללי: הסרת מדיום תרבות התא לפני הוספת קו תא שני עבור תרבות שיתופית, כמו גם הטבעת תרבות 3D ב ECM או ג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose בתוך יציקות agarose. זה קריטי לחלוטין כדי להסיר לאט ובזהירות את המדיום של תא הזרעה על ידי הטיית צלחת היטב ומיקוד פינה אחת של התא עם micropipette. כל עוד יצוק agarose מכילים תאים, אנו ממליצים תמיד להסיר כל מדיום בבאר עם micropipette, במקום להשתמש pipettor. הוספת קו תא שני הטבעה ECM או הידרוקסיאתיל agarose עיבוד ג'ל צריך להתבצע לאט וירידה חכם על מנת למנוע שטיפה את התאים במיקרווול. הצעד הקריטי ביותר של הפלישה קולגן הוא זמן הדגירה לפני היפוך הגבס בצלחת היטב עם הבארים. צמצום הזמן עלול לגרום קולגן לנשור מן הגבס, וחרג הזמן עלול לגרום לתרבות להיות לחוץ למטה של microwells, וכתוצאה מכך פלישה ספרואידית מופץ באופן לא אחיד. היפוך הגבס מאפשר לתאים במיקרו-באר לשקוע לחלוטין בקולגן הנוזלי לפני שהוא מתגבש ומתגבש. מתח פני השטח בין יצוק agarose ותחתית הפלסטיק של צלחת הבאר, יוצר "תלייה-טיפה"15,24 במהלך הפלישה 3D spheroid.

חשוב לציין כי זמן הדגירה לפני היפוך הגבס הוקם להטביעה קולגן מסוג I. עם רכיבי ECM אחרים, יש להתאים שלב זה בהתאם. הערה, הסרה מלאה של מדיה שיורית לא צריך להיות ניסה כדי למנוע אובדן בשוגג של תאים הנוכחי microwells. מדיה שיורית זו גורמת לדלול קל של ECM שנוסף. יש לקחת בחשבון את הניתוח וההסתגלות ממערכות אחרות.

התרבות ההפעולה המתוארת כאן מאפשרת אינטראקציה מקסימלית גידול / T-תא לפני הפלישה של תאים סרטניים הוא אמר: גידול ותאי T הם שיתוף תרבות במשך 2 ימים לפני הטבעה בסוג אני קולגן ולאחר מכן זיהוי תאים סרטניים ששרדו פולשנית במהלך יומיים הקרובים(איור 1B). שימו לב, כאשר התרבות השותפות החלה בזמן שתאי T נותחו מחדש קולגן 1, תאי T לא הצליחו להראות השפעה על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity. אפקט זה עשוי להיות בשל תאי T להיות מופץ יותר קולגן ולכן פחות מרוכז סביב spheroids. זה מצביע על כך שהאינטראקציה הישירה בין גידול ותאי T במהלך יומיים של תרבות חברתית לפני הפלישה assay הוא קריטי להערכת השפעות בתיווך T-cell על התאים הסרטניים.

אף על פי כן, חלק מהיתרונות של מודל 3D זה מגיעים עם חסרונות. הגדרה זו בתפוקה גבוהה מאפשרת זריעה קלה ומהירה של תאים לתוך היצוק agarose בשלב pipetting אחד, וכתוצאה מכך הדור של מספר רב של spheroids בגודל אחיד בתוך גבס אחד. עם זאת, מאז spheroids ממוקמים כל בתוך אותו יצוק, הם יכולים גם להיות מוסרים בקלות, למשל, במהלך הסרת מדיום תרבות התא בתוך תא זריעה ותוך הוספת תאי T עבור שיתוף תרבות. לכן, כמות התשואה עבור כל פרוטוקול תלויה מאוד בכישורים הטכניים ובניסיון של החוקר, אך גם בסוג ההסתה המבוצעת. כפי שטבלה 1 מרמזת, יש לקחת בחשבון אובדן אפשרי של כדוריות של כ-50% בסוף הניסוי. יתר על כן, במהלך שלב זריעה, תאים לא יכול להפיץ באופן שווה על פני האזור של תא זריעה, וכתוצאה מכך פחות או יותר spheroids נציג בתוך יצוק agarose. מהניסיון שלנו, אפקט זה גדל עם הגודל של גבס agarose. בהתאם לכך, יש לשקול את השכפולים בעת תכנון הניסוי.

ניתן להעריך את האינטראקציה spatiotemporal של תאים בתוך מערכת 3D על ידי הדמיית זמן לשגות, אשר מציג אפשרות ניטור אחרת במודל זה. יתר על כן, הקוטר הקטן של microwells ואת צעד pipetting יחיד לתאי זרע, מתאימים לביצוע שיבוט תא יחיד. לבסוף, דגימות של המטופל (למשל מביופסיות) ניתן לנתח בsay בשל מספר קטן של תאים הנדרשים microwells ואת תכונת תפוקה גבוהה של מערכת 3D. הכללה של תרופות מגרה או חסימה (למשל אנטי PD-1 או אנטי PD-L1) כדי לחקור את התא הגידול / T-תא אינטראקציה היא הרחבה לוגית של ההסחה.

לסיכום, מודל 3D spheroid שיתוף תרבות המוצג כאן מספק מסגרת גמישה לניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity של תאי T תרבותיים בהגדרה רלוונטית ביולוגית. את ההצלבה שנוצרת ניתן לדמיין תוך שמירה על שלמות התרבות 3D ובכך לספק תובנות מכניות לתא הגידול – אינטראקציות T-cell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לוירג'יני אורי, PhD על דיונים מועילים וייעוץ על הגישה של מודל 3D שיתוף תרבות. אנו מודים גם לאליזבת ג'ונס על סיוע טכני מצוין עם המחלקה IHC. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מDFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft) כדי YL (LI 2547/4-1) ואת המכונים הלאומיים לבריאות AW (R01 CA23 1291), ל-ATR (R01 CA205632), ל-GWP (R01 CA218670) ולמענק הליבה של המרכז לסרטן (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

חקר הסרטן גיליון 160 תרבות תאים תלת-מיוד תאים סרטניים תרבות שותף קולגן ציטוקסיות פלישה אימונו-לודיזם אימונוהיסטוכימיה תאי T סרטני
ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter