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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Abstract

Se han realizado progresos significativos en el tratamiento del cáncer con inmunoterapia, aunque un gran número de cánceres siguen siendo resistentes al tratamiento. Un número limitado de ensayos permiten un seguimiento directo y conocimientos mecánicos sobre las interacciones entre el tumor y las células inmunitarias, entre los cuales, las células T desempeñan un papel importante en la ejecución de la respuesta citotóxica del sistema inmunitario adaptativo a las células cancerosas. La mayoría de los ensayos se basan en el co-cultivo bidimensional (2D) de las células debido a la relativa facilidad de uso, pero con una representación limitada del fenotipo de crecimiento invasivo, una de las señas de identidad de las células cancerosas. Los sistemas actuales de co-cultivo tridimensional (3D) requieren equipo especial o monitoreo separado para la invasión de células cancerosas co-cultivadas y células T que interactúan.

Aquí describimos un enfoque para monitorear simultáneamente el comportamiento invasivo en 3D de los esferoides de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el co-cultivo. La formación de esferoides es impulsada por interacciones células celulares mejoradas en moldes de micropocillos de agarosa libres de andamios con fondos en forma de U. Tanto el co-cultivo de células T como la invasión de células cancerosas en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro de los micropocillos de los moldes de agarosa sin la necesidad de transferir las células, manteniendo así un sistema de cultivo conjunto 3D intacto a lo largo del ensayo. La matriz de colágeno se puede separar del molde de agarosa, lo que permite la tinción de inmunofluorescencia (IF) y la toma de imágenes confocales de las células. Además, las células pueden aislarse para un mayor crecimiento o someterse a análisis como la expresión génica o la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Por último, el co-cultivo 3D puede ser analizado por inmunohistoquímica (IHC) después de la incrustación y seccionamiento. Las posibles modificaciones del ensayo incluyen composiciones alteradas de la matriz extracelular (ECM), así como la inclusión de diferentes células estromales o inmunitarias con las células cancerosas.

Introduction

A pesar de las mejoras significativas en la inmunoterapia contra el cáncer en la última década, nuestra comprensión mecanicista de la sensibilidad y la resistencia a los tratamientos siguen siendo bastante pobres1. Está bien establecido que los tumores muestran una heterogeneidad sustancial, y que las interacciones dinámicas de las células tumorales con su microambiente, así como con las células inmunitarias, afectan la muerte celular tumoral, el comportamiento invasivo y la respuesta a tratamientos que incluyen inmunoterapia1,,2,,3. Como un brazo del sistema inmunitario adaptativo, las células T ejecutan la citotoxicidad específica de la célula. El análisis del reconocimiento de células T y la respuesta a las células cancerosas proporciona información mecanicista sobre la resistencia y la sensibilidad a los tratamientos modulatorios inmunes.

El modelado in vitro y el seguimiento de las interacciones entre el cáncer y las células T en un entorno adecuado ha sido un desafío y hasta ahora, ha dado lugar a conocimientos mecánicos limitados. La mayoría de los ensayos basados en células se basan en un entorno bidimensional (2D), que carece de características clave que son críticas para la recapitulación de la fisiología in vivo tridimensional (3D)4,5,6, a saber, interacciones células espaciales, contacto con la matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinámica, aumento de la hipoxia debido al crecimiento de masa8, y los efectos del microambiente tumoral (TME)9. Por otro lado, todavía hay una serie de deficiencias con los sistemas de co-cultivo tridimensional (3D) y ensayo de invasión actualmente utilizados: (1) la naturaleza que consume mucho tiempo de la generación de esferoides y la cosecha5,10, (2) la falta de control sobre el tamaño del esferoide, forma y densidad celular11,12, (3) los ensayos de tipo de bajo rendimiento, (4) el requisito de equipos especiales13,14, (5) la necesidad de transferir el co-cultivo a entornos distintos para diferentes ensayos15,16,17. En particular, la transferencia de un ensayo de co-cultivo a menudo conduce a la interrupción de los esferoides y la pérdida de la integridad de la co-cultura. Esto se aplica especialmente para los esferoides "flojos" con una adhesión reducida de células celulares. Por ejemplo, la mayoría de los ensayos de invasión 3D requieren que los esferoides se cosechan después de su formación inicial y luego se resuspend en ECM14,,15,,16. Este paso de resuspensión resulta en una pérdida de control sobre la distancia entre los esferoides. Dado que la distancia entre los esferoides tumorales afecta su comportamiento invasivo, esta pérdida de control introduce una alta varianza entre ensayos y reduce la reproducibilidad. Además, la aplicación de ensayos de fraccionamiento celular mediante pasos de centrifugación consecutivos para la evaluación de las células inmunitarias infiltrantes de esferoides periféricos y tumorales se limita a las poblaciones de células tumorales que generan esferoides más estables17.

Concepto y enfoque

Nuestro enfoque aborda las deficiencias antes mencionadas utilizando un modelo de co-cultivo de esferoides 3D, que no requiere la transferencia de esferoides para ensayos posteriores. Adaptamos un dispositivo de formación de esferoides (ver Tabla de Materiales)para generar un ensayo para monitorear simultáneamente el comportamiento invasivo de las células cancerosas y la citotoxicidad de las células T co-cultivadas. Este método es fácil de usar, económico y permite un manejo rápido y fácil en un entorno 3D relativamente alto. Dependiendo del tipo de dispositivo utilizado, se pueden generar hasta 81 esferoides grandes de tamaño uniforme en un solo paso de pipeteo con control sobre el tamaño individual del esferoide modificando el número de células sembradas. La formación de esferoides es forzada por interacciones células celulares mejoradas en moldes de varios pozos libres de andamios con fondos en forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudios funcionales dinámicos basados en células, así como ensayos moleculares y bioquímicos variables que incluyen clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), inmunofluorescencia (IF) o tinción de inmunohistoquímica (IHC), así como análisis de expresión génica del cocultivo 3D intacto.

Para estudios funcionales,la incrustación de esferoides en colágeno tipo I dentro de los moldes de agarosa da como resultado la invasión de células cancerosas de esferoides equidistantes y permite monitorear características esenciales específicas de la línea celular, tales como la migración de células únicas frente a células colectivas18,,19. Además, la matriz de colágeno se separa fácilmente del molde de agarosa, lo que resulta en un parche de 1-u20122 mm de espesor que contiene múltiples esferoides, que se pueden procesar más para la tinción de IF y la toma de imágenes por microscopía confocal. Esto puede revelar interacciones distintas de la invasión celular y de la matriz celular en un cribado de alto rendimiento. Además, las células de la matriz de colágeno se pueden aislar después de la digestión del colágeno y la disociación de una sola célula para el posterior cultivo o análisis celular.

Para el análisis IHC de esferoides,después de la fijación y seccionamiento del molde de agarosa, las proteínas u otras moléculas de interés son detectables manteniendo las posiciones geográficas de los esferoides. En el enfoque descrito aquí, los esferoides están directamente incrustados en el gel de procesamiento de agarosa hidroxietilo dentro del molde de agarosa y el gel sirve como una "tapa" para retener los esferoides en la parte inferior de los micropocillos. Después de la incrustación de parafina de la agarosa fundida20, el seccionamiento horizontal en serie se realiza con la parte inferior del yeso sirviendo como punto de partida.

Este enfoque contrasta con el seccionamiento convencional de IHC de esferoides que requiere la recolección de células antes de incrustar en hidroxietilo agarose gel de procesamiento21 y corre el riesgo de interrupción de los esferoides, perdiendo así la disposición espacial de las células. Además, el fraccionamiento celular por centrifugación para evaluar si las células inmunitarias infiltradas o permanecidas periféricas a los esferoides tumorales17 se evita mediante la inserción directa.

Además, el co-cultivo 3D se puede realizar mezclando células tumorales, estromales o inmunitarias, y estudiando así la conversación cruzada de células tumorales o recapitulando diferentes microambientes tumorales para analizar interacciones células celulares incluyendo co-cultivos con células endoteliales16.

Este entorno de co-cultivo esferoides 3D se puede utilizar para realizar el co-cultivo de diferentes tipos de células presentes en el microambiente tumoral y para evaluar los efectos de los elementos ECM alterados. Además del colágeno tipo I, otros componentes de ECM (por ejemplo, matrigel, mezclas de matrigel/colágeno, fibronectina), se pueden utilizar ya que la invasión de células tumorales se ve afectada por la abundancia de diferentes sustratos22. Además, los micropocillos del molde de agarosa son adecuados para la formación de esferoides de líneas celulares primarias y para células con baja adherencia celular.

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Protocol

Una lista y explicación de algunas palabras usadas con frecuencia en todo el protocolo se puede encontrar en el archivo suplementario 1.

1. Generación de esferoides

  1. Preparar y autoclave 2% de agarosa en 1x PBS (por ejemplo, 1 g de agarosa en 50 ml de 1x PBS) y autoclave 35 y 81 micropojes de caucho.
    ADVERTENCIA: Evite el uso de agarosa de baja fusión para generar los moldes de agarosa para el procesamiento de IHC.
  2. Preparar moldes de agarosa
    NOTA: Los moldes de 35 micropocillos se utilizan para ensayos de invasión, inmunofluorescencia (IF) y aislamiento celular. Los moldes de 81 micropocillos se utilizan para ensayos de citotoxicidad, inmunohistoquímica (IHC), aislamiento celular y extracción de ARN.
    1. Después de que la agarosa haya sido autoclavada, deje que la agarosa fundida se enfríe a unos 60oC. En una capucha de cultivo celular, utilice la técnica aséptica y la pipeta de 500 l de agarosa fundida en un molde de caucho de 81 micropocillos por pozo o 330 l en un molde de caucho de 35 micropocillos por pozo.
      ADVERTENCIA: Evite crear burbujas mientras mezcla o pipetea agarosa. Retire las burbujas pipeteando suavemente.
    2. Después de solidificar la agarosa, flexione cuidadosamente el molde de goma para eliminar la agarosa fundida de ella. Por la presente, coloque las manos por encima de la placa adecuada y deje que la agarosa caiga directamente en un pozo del pozo.
      NOTA: Flexione el molde de goma en diferentes posiciones para evitar la flexión excesiva. Podría ser útil flexionar el molde de goma y empujar suavemente desde la parte inferior al mismo tiempo.
    3. Para equilibrar los moldes de agarosa, añadir el medio de cultivo celular, que consiste en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (2,5 ml/pozo para placa de 12 pozos y 1 ml/pozo para placa de 24 pozos). Poner el bien-placa en una incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% CO2) e incubar durante 1 h.
  3. Mientras tanto, preparar el cultivo celular para la siembra.
    NOTE: The total cell seeding number per agarose cast is to be decided by the investigator. Para las líneas celulares de cáncer de páncreas primario murino, se siembran 35.000 células/35 micropocillos y 81.000 células/81-micropozo (en promedio 1000 células/esferoides) para todos los ensayos siguientes. El diámetro medio de un esferoide es de aproximadamente 150 u2012200 m después de 48 h.
  4. Retire primero el medio de cultivo celular que rodea la agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa de pozo. A continuación, retire cuidadosamente el medio en la cámara de siembra.
  5. Sembra cuidadosamente la suspensión de la célula tumoral preparada en la cámara de siembra celular. Vuelva a colocar cuidadosamente la placa de pozo en la incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% de CO2)durante 15 min.
    NOTA: Durante este paso, las células se asentarán en los micropocillos del molde de agarosa.
  6. Añadir un medio adicional al exterior del molde de agarosa (2,5 ml/pozo para placa de 12 pozos y 1 ml/pozo para placa de 24 pozos).
  7. Vuelva a colocar la placa de pozo en la incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% de CO2)durante 48 h.
    NOTA: Por lo general, las células tardan hasta unas horas en formar esferoides en los micropocillos. En general, los esferoides de células tumorales sólidas se forman después de 24 h y son estables después de 48 h. Sin embargo, esto puede variar entre diferentes líneas celulares. Si es necesario, cambie el medio de cultivo celular inclinando cuidadosamente la placa de pozo con los moldes de agarosa y retirando el medio de cultivo celular circundante con una pipeta P1000. A continuación, añadir cuidadosamente medio fresco pipeteándolo a lo largo de la pared del pozo. Por lo general, no es necesario cambiar los medios dentro de los moldes debido a su pequeño volumen y el riesgo de eliminar los esferoides.

2. Co-cultivo con células T

  1. Resuspender el número requerido de células T en 75 l (35-micropocillos fundidos) o en 190 l (81-micropocillos fundido) del medio de cultivo de células T apropiado (RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina).
  2. Retire primero el medio de cultivo celular que rodea la agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa de pozo. A continuación, retire lentamente y cuidadosamente el medio dentro del yeso apuntando suavemente a una esquina de la cámara de siembra con una pipeta P200 mientras mantiene la placa bien inclinada con la otra mano.
  3. (Paso crítico 1) Como existe el riesgo de eliminar los esferoides, controle la pérdida de esferoides comparando el número de esferoides dentro de los micropocillos antes y después de extraer el medio mediante la visualización bajo el microscopio a un aumento de 10x.
  4. Sembrar cuidadosamente la suspensión de la célula T en la cámara de siembra de la agarosa fundida sosteniendo la pipeta P200 aproximadamente 0,5 cm por encima del yeso.
  5. (Paso crítico 2) Existe el riesgo de eliminar los esferoides mientras se agregan las células T. Por lo tanto, es fundamental añadir las células T muy lentamente y unos 0,5 cm por encima de la cámara de siembra.
    NOTA: Una posibilidad de disminuir el número de esferoides enjuagados es apuntando la pipeta a una esquina de la cámara de siembra mientras se añaden las células T, por lo que sólo se arriesgan a los esferoides en esta esquina para ser expulsados.
  6. Coloque cuidadosamente la placa de identificación en la incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% de CO2)durante 15 min.
  7. Saque la placa de pozo de la incubadora y agregue un medio de cultivo celular fresco (RPMI suplementado con un suero bovino 10% fetal y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina) alrededor de la agarosa fundida por pipetearlo lentamente a lo largo de la pared del pozo.
  8. Vuelva a colocar la placa de identificación en la incubadora de cultivo celular durante 48 h.

3. Incorporación del co-cultivo 3D en la matriz de colágeno tipo I

  1. Preparar colágeno neutralizado tipo I
    1. Diluir el colágeno de stock con medio base libre de suero (RPMI) a una concentración de trabajo final de 3 mg/ml. Por cada 100 l de colágeno diluido, añada 11 l de 10 veces PBS y 1,2 l de hidróxido de sodio de 1 M (NaOH).
    2. Mantener sobre hielo e incubar (neutralizar) durante 1 h.
  2. Retire primero el medio de cultivo celular que rodea la agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa de pozo. A continuación, retire lentamente y cuidadosamente el medio dentro del yeso apuntando suavemente a una esquina de la cámara de siembra con una pipeta P200 mientras mantiene la placa bien inclinada con la otra mano.
    NOTA: Aquí, es fundamental eliminar por completo el medio de cultivo celular que rodea el molde de agarosa.
  3. Pipetear cuidadosamente el colágeno neutralizado mezclo gota en la cámara de siembra de la agarosa fundida sosteniendo la pipeta P200 aproximadamente 0,5 cm por encima del yeso.
  4. Poner la placa de pozo inmediatamente en la incubadora de cultivo celular durante 4 minutos (35 micropocillos fundidos) o 5 min (81-microwell fundido).
    ADVERTENCIA: (Paso crítico 3) Es fundamental mantener estrictamente el tiempo de incubación dado. De lo contrario, es posible que el comportamiento invasivo no sea reproducible.
  5. Invierta el pozo y déjelo volteado en la incubadora durante 1 h.
    NOTA: Los moldes permanecerán unidos a la parte inferior de la placa de pozo debido a la tensión superficial. En caso de que se utilice un medio de cultivo celular especial con alta concentración sérica (por ejemplo, RPMI suplementada con 20% de suero bovino fetal), podría ser necesario un paso de lavado adicional con 1x PBS después de retirar el medio en el pozo para aumentar la tensión superficial.
  6. Saque la placa de pozo de la incubadora e invierta de nuevo. Añadir medio de cultivo celular fresco (RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina) alrededor de la agarosa fundida por pipectándolo lentamente a lo largo de la pared del pozo.
  7. Vuelva a colocar la placa de identificación en la incubadora de cultivo celular durante 48 h.

4. Ensayo de citotoxicidad

  1. Preparar 3 ml de 1x PBS con 2% de suero bovino fetal por fundición de agarosa.
  2. Después del co-cultivo para 4 d, retire el medio de cultivo celular que rodea el molde de agarosa con una pipeta P1000 inclinando ligeramente la placa de pozo con la otra mano.
    NOTA: El investigador decidirá el período de tiempo total de la cocultura.
  3. Distribuya 1 ml de 1x PBS + 2% FBS con una pipeta P1000 en la cámara de siembra para desalojar los esferoides de los microposos.
  4. Repita el paso 4.3 dos veces con el volumen en el pozo y transfiéralo a un tubo de 15 ml.
  5. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 s a temperatura ambiente (RT).
  6. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta P1000.
  7. Lavar las células añadiendo 1 ml de 1x PBS con 2% de FBS y centrífuga a 300 x g durante 1 min en RT.
  8. Repita el paso de lavado (paso 4.7).
  9. Retire el sobrenadante y añada 1 ml de solución de enzimas de disociación celular (ver Tabla de materiales).
  10. Utilice una pipeta P200 y una pipeta arriba y abajo para descomponer los racimos de celdas.
  11. Incubar las células durante 20 min en la incubadora de cultivo celular (37oC, 5% CO2).
  12. Repita el paso 4.10.
    NOTA: Saque 10 oL y la semilla en un plato de cultivo celular para observar (bajo el microscopio a una ampliación de 10 veces) qué tan bien se han disociado los esferoides en células individuales. Si es necesario, añadir 5 min de incubación adicional.
  13. Añadir 4 ml de medio de cultivo celular completo (RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina) y mezclar invirtiendo el tubo 3-u20124 veces.
  14. Centrífuga a 400 x g durante 4 min en RT.
  15. Retire el sobrenadante y resusppend las células en el tampón FACS para la tinción De Las células apoptóticas De Annexin V.
    NOTA: A partir de aquí se puede realizar cualquier tinción FACS y análisis celular.

5. Inserción de gel de procesamiento de hidroxietilo agarose para seccionamiento de IHC

NOTA: Aquí es fundamental evitar el uso de agarosa de baja fusión para generar los moldes de agarosa.

  1. Al final del co-cultivo, retire primero el medio de cultivo celular que rodea el molde de agarosa con una pipeta P1000 inclinando la placa de pozo. A continuación, retire lentamente y cuidadosamente el medio dentro del yeso apuntando suavemente a una esquina de la cámara de siembra con una pipeta P200 mientras mantiene la placa bien inclinada con la otra mano.
  2. Pipeta lentamente 10% formalina primero en la cámara de siembra apuntando suavemente a una esquina de la cámara de siembra con una pipeta P200. A continuación, agregue un 10% de formalina al exterior del molde de agarosa hasta que esté completamente cubierto. Arreglar el lanzamiento de agarosa en 10% de formol para 1 d.
  3. Retire el formol al día siguiente.
  4. Pipetear cuidadosamente 210 l (81-microwell cast) o 100 l (35-microwell cast) de gel de procesamiento de agarosa de hidroxietilo precalentado y licuado (ver Tabla de materiales) gota en la cámara de siembra de la agarosa fundida sosteniendo la pipeta P200 aproximadamente 0.5 cm por encima del molde.
  5. Deje que el gel de procesamiento de hidroxietilo agarose se solidifique durante 10 minutos en RT.
  6. Transfiera el lanzamiento de agarosa a 1x PBS.
    NOTA: Para un almacenamiento más largo, incruste el molde en un 70% de etanol para evitar la contaminación.
  7. Deshidratar las secciones del gel a través de una serie de etanol (1 h cada una: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol [3x cambia cada uno]). A continuación, despejar en una solución de compensación 3x para 1 h cada una (por ejemplo, hidrocarburos alifáticos [por ejemplo, Clearite] o xilenos), e in infiltrarse con parafina fundida (3x para 1 h cada uno), ya sea manualmente o en un procesador de tejido. Incrustar el molde en cera de parafina para la sección posterior a 5 m por sección.
  8. Retire la cera poniendo diapositivas en xilenos, 3x durante 3 minutos cada una, luego rehidrate las secciones de tejido a través de una serie de alcohol calificado: 100% etanol durante 2 min, 95% etanol durante 1 min, 80% etanol para 30 s y 70% etanol para 30 s, luego colocar en agua.
  9. Realizar la recuperación de epítopos inducidos por calor en un vapor vegetal a 100 oC durante 20 min, seguido de 20 min de enfriamiento en una solución de pH de citrato de sodio de 10 mM 6,0 y bloquear peroxidas endógenas con H2O2.
  10. Bloquear las secciones con suero objetivo normal y exponerlas a anticuerpos anti-CD8 (dilución 1/25) durante la noche.
  11. Aplicar anticuerpos secundarios conjugados anti-conejo-HRP (ver Tabla de Materiales) y desarrollar la tinción utilizando cromógeno 3,3'-Diaminobenzidina (DAB). Contramante los núcleos con una solución de hematoxilina Harris del 11% (ver Tabla de Materiales).

6. Monitoreo y análisis de la invasión de esferoides en la cocultura

NOTA: El investigador decidirá el punto de tiempo de invasión de esferoides de imagen en la matriz de colágeno I. Adquiera imágenes de cultivo celular utilizando un microscopio invertido con aumento de 10x. El punto de tiempo ideal depende de la línea celular que se está probando, así como del componente ECM. Las líneas celulares más invasivas comenzarán a propagarse en el colágeno dentro de unas horas después de agregar el colágeno. Dado que las células T en el co-cultivo podrían impedir una visión completa sobre la salida de los esferoides en puntos de tiempo muy temprano, generalmente las imágenes se toman a 0 h (como referencia), 24 h y 48 h después de agregar el colágeno.

  1. Cuantificar la invasividad contando manualmente el número de "picos" que salen del esferoide y/o utilizando software de análisis de imágenes, por ejemplo, Imagen J.
    1. Analice la invasión como el número de "picos" del esferoide contando manualmente el número de "picos" de un esferoide.
      NOTA: El investigador debe decidir qué protuberancias de los esferoides se consideran "picos". Un criterio de decisión podría ser la longitud del "pico" medido desde el borde del esferoide.
    2. Analice la invasión como el área de invasión en relación con el tamaño del esferoide.
      1. Usa la Herramienta Dibujo a mano alzada (Imagen J) para trazar el borde del área total (invasión + área esferoide).
      2. Haga clic en Analizar en el menú superior y, a continuación, haga clic en Medir para mostrar la medida de área.
      3. Traza el borde del área esferoide total.
      4. Haga clic en Analizar en el menú superior y, a continuación, haga clic en Medir para mostrar la medida de área.
      5. Copie la lista de resultados medidos en una hoja de cálculo y calcule el total de invasión/esferoide utilizando la fórmula: invasión total - área total/ área esferoide.

7. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Prepare lo siguiente.
    1. Preparar 5,4% de formalina (5 ml) utilizando 2,3 ml de 1x PBS y 2,7 ml de 10% de formalina.
    2. Preparar 0,5% de octoxinol (50 ml) utilizando 50 ml de 1x PBS y 2,5 ml de 10% de octoxinol (almacenar en RT).
    3. Preparar IF Buffer (200 mL) utilizando 200 ml de 1x PBS, 200 mg de albúmina sérica bovina (BSA), 4 ml de 10% de octoxinol, 1 ml de polisorbato al 10% 20 (calentar hasta RT antes de su uso; filtrar y almacenar a 4 oC).
    4. Preparar la solución de bloqueo (5 ml) utilizando 5 ml de Tampón IF y 500 ml de suero de cabra (calentar hasta RT antes de su uso).
    5. Mantenga listos los portaobjetos de cámara de 8 biens, los cubreobjetos de vidrio y los medios de montaje.
  2. Día 0
    1. Arreglar todo el molde de agarosa, incluyendo los esferoides, durante la noche en 5.4% de formalina en RT en una cámara humidificada.
  3. Día 1
    1. Retire el medio de cultivo celular que rodea la agarosa fundida con una pipeta P1000 inclinando la placa de pozo.
    2. Transfiera el parche de colágeno en un tobogán de cámara de 8 pozos agarrando una esquina de la matriz de colágeno dentro de la cámara de siembra del fundido de agarosa con elegantes pinzas de punta puntiagudas y despegarla del molde de agarosa en un solo movimiento seguro.
      NOTA: El parche de colágeno debe separarse fácilmente del molde de agarosa. De lo contrario, utilice una pipeta P1000 para añadir cuidadosamente un medio de cultivo en el área de la cámara de siembra o invierta el fundido de agarosa y agite suavemente la placa para desalojar la matriz de colágeno.
    3. Añadir 250 l de 0,5% de octoxino (ver Tabla de materiales)por pocero. Incubar durante 1 h en RT.
    4. Aspirar el Octoxynol y añadir 250 l de solución de bloqueo por pozo. Bloquee para 1 h en RT.
    5. Mientras tanto, diluir el anticuerpo primario (dilución para la anti-queratina 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) en la solución de bloqueo, calculando para 250 l por pocól.
    6. Agregue el anticuerpo primario en la solución de bloqueo y coloque el portaobjetos de la cámara en una cámara humidificada para la incubación durante la noche en RT.
  4. Día 2
    1. Retire el anticuerpo primario en la solución de bloqueo aspirando.
    2. Lavar 3 veces añadiendo 300 s de IF Buffer y dejar reposar durante 5 minutos en RT.
      NOTA: Sólo déjalo reposar, no hay necesidad de ponerlo en una coctelera.
    3. Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo (para anti-queratina 8: anti-rata, dilución 1/500).
    4. Añadir 250 l de anticuerpo secundario en solución de bloqueo a cada pocóteo e incubar durante 1 h en RT. A partir de ahora, proteja las muestras de la luz.
    5. Retire el anticuerpo secundario en la solución de bloqueo aspirando.
    6. Lavar 3 veces con 300 l de IF Buffer añadiendo y dejar reposar durante 5 minutos en RT.
    7. Enjuague las muestras con 1x PBS y aspirarlos.
    8. Retire con cuidado las paredes del portaobjetos de la cámara para que sólo quede el tobogán de vidrio en la parte inferior.
    9. Agregue al menos 200 l de soporte de montaje a un cubreobjetos de vidrio y suelte lentamente el cubreobjeto sobre la muestra.
      NOTA: Evite crear burbujas, ya que esto afectará a la calidad de la imagen. Las burbujas se pueden prevenir colocando suavemente el resbalón de la cubierta en el borde largo de la diapositiva en un ángulo de 45o o bajando lentamente el resbalón de la cubierta en la diapositiva.
    10. Coloque las muestras montadas en un lugar oscuro y seco y déjelas reposar durante la noche. Las imágenes se pueden realizar al día siguiente.
      NOTA: El cubreobjetos podría cambiar inicialmente un poco una vez colocado sobre el parche de colágeno. Deje que el tobogán de vidrio se siente en un área uniforme durante unos minutos. El cubreobjetos aplanará la muestra para que no quede espacio entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos con el tiempo.

8. Aislamiento de células de la matriz de colágeno

  1. Prepare lo siguiente.
    1. Preparar 1 mg/ml de colagenasa 4 en un medio de cultivo celular que contenga suero (almacenar colagenasa alícuota 4 diluciones a -20 oC)
    2. Preparar 2.5% BSA en 1x PBS y recubrir todos los tubos y puntas de pipeta con él (filtrar solución BSA antes de su uso).
    3. Precalienta la solución BSA y el medio de cultivo celular antes de usarlo.
  2. Preparar 2 ml de solución de colagenasa 4 (1 mg/ml) para digerir un máximo de tres matrices de colágeno de moldes de agarosa de 35 micropocillos.
  3. Transfiera hasta tres matrices de colágeno de 75 l de moldes de agarosa de 35 micropocillos en un tubo de 15 ml pre-recubierto de BSA al 2,5%. Agarre una esquina de la matriz de colágeno dentro de la cámara de siembra del molde de agarosa con elegantes pinzas puntiagudas y despege la agarosa fundida en un solo movimiento seguro.
  4. Corte en bisel la punta de una punta P1000 con tijeras. Pre-recubrir la punta restante con 2.5% BSA y descomponer la matriz de colágeno tanto como sea posible pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar el tubo durante 15 min a 37oC.
  5. (Paso crítico 4) Cada 5 min, compruebe si la matriz de colágeno se ha disuelto. Pipetear de nuevo arriba y abajo antes de sacar 10 ml de la muestra y sembrar en una placa de cultivo celular para observarla bajo el microscopio a un aumento de 10 veces. Añadir otros 5 minutos si es necesario.
  6. Llene el tubo con 10 ml de medio de cultivo celular precalentado (DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal). Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 3o20124 veces.
  7. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 4 min en RT.
  8. Retire con cuidado el sobrenadante y deje 2 ml de volumen.
  9. (Paso crítico 5) Dejar 2 ml después del primer paso de centrifugación, ya que todavía podría haber colágeno sin disolver en la parte inferior del tubo que transporta las células a lo largo de ellas.
  10. Realice dos pasos de lavado añadiendo 10 ml de medio de cultivo celular que contiene suero cada vez. Centrifugar cada vez a 400 x g durante 4 min en RT.
  11. Después del último paso de lavado, retire tanto medio como sea posible y deje sólo el pellet celular.
  12. Resuspender el gránulo celular en 1 ml de solución de enzimas de disociación celular (ver Tabla de materiales).
  13. Utilice una pipeta P200 y una pipeta arriba y abajo para descomponer los racimos de celdas.
  14. Incubar las células durante 20 min en la incubadora de cultivo celular (37oC, 5% CO2).
  15. Repita el paso 8.13.
    NOTA: Saque 10 oL y se semilla en un plato de cultivo celular para observar bajo el microscopio un aumento de 10 veces para ver qué tan bien se han disociado los esferoides en células individuales. Si es necesario, añadir 5 min de incubación adicional.
  16. Añadir 4 ml de medio de cultivo celular (DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal) y mezclar invirtiendo el tubo 3-u20124 veces.
  17. Centrífuga a 400 x g durante 4 min en RT.
  18. Retire el sobrenadante. A partir de aquí, se puede realizar la tinción de FACS o el cultivo celular.

9. Extracción de ARN de la matriz de colágeno

  1. Preparar el tiocianato de guanidinio con fenol (ver Tabla de Materiales),100% cloroformo, etanol 70% libre de ARN, Kit de extracción de ARN (ver Tabla de Materiales),Tubos de 1,5 ml libres de RNase, Tubos de 15 ml libres de RNase y ddH2O sin RNase.
  2. Transfiera hasta doce matrices de colágeno de 190 l de moldes de agarosa de 81 micropocillos en un tubo de 15 ml. Agarre una esquina de la matriz de colágeno dentro de la cámara de siembra del molde de agarosa con elegantes pinzas puntiagudas y despege la agarosa fundida en un solo movimiento seguro.
    NOTA: Las matrices también se pueden congelar a -80 oC hasta que estén listas para la extracción de ARN.
  3. Añadir 1 ml de guanidinio tiocyananato con fenol (ver Tabla de materiales)a las matrices de colágeno en el tubo de 15 ml.
    NOTA: El tiocianato de guanidinio con fenol debe cubrir completamente las matrices de colágeno.
  4. Vórtice los tubos para 10-u201220 s.
  5. Homogeneizar las matrices con agujas de 20 G y jeringas de 5 ml hasta que se disuelvan por completo.
  6. Deje que las matrices se sienten durante 5 minutos en RT.
  7. Añadir 200 l de cloroformo puro a las matrices y agitar el tubo vigorosamente durante 15 s.
  8. Transfiera inmediatamente la mezcla a tubos de 1,5 ml.
  9. Deje reposar la mezcla durante al menos 5 minutos en RT hasta que las fases estén separadas.
  10. Centrifugar los tubos de 1,5 ml a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.
  11. Llene un nuevo tubo de 1,5 ml con 500 ml de etanol al 70%.
    NOTA: Dependiendo del volumen de la fase acuosa después de la centrifugación (ver paso 9.12. esto podría no ser 500 l. La cantidad de 70% de etanol debe ser igual al volumen de la fase acuosa.
  12. Transfiera cuidadosamente la fase acuosa superior de las muestras centrifugadas al tubo lleno de etanol al 70% y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  13. (Paso crítico 6) Tenga cuidado de no perturbar las capas en la parte inferior del tiocianato de guanidinio con separación de fenol mientras se elimina la fase superior, ya que esto contaminará el ARN.
  14. Agregue la muestra a una columna de extracción de ARN (incluida en el kit de extracción de ARN, consulte Tabla de materiales). A partir de ahora, siga el protocolo del fabricante para la purificación del ARN de las células.

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Representative Results

El modelo de co-cultivo 3D permite diferentes ensayos que se muestran en la Figura 1A,que se pueden combinar o modificar según sea necesario. En nuestra configuración experimental establecida, las células tumorales y T se co-cultivan durante 2 días seguidos de la iniciación del ensayo de invasión para la selección de células tumorales invasivas y/o resistentes (Figura 1B). El día 4 se realiza la cuantificación de la invasión y las células "supervivientes" se aíslan de la matriz de colágeno o se procesan directamente para el ARN23 o la extracción de ADN de la matriz (Figura 1B). La inserción del cultivo 3D en el colágeno de tipo I dentro de los micropocillos del molde de agarosa permite el monitoreo y análisis de la invasión mediante el uso de la Imagen J para demarcar primero el área total utilizando la herramienta de dibujo a mano alzada del software y luego calcular la relación sobre el área de esferoide demarcado (Figura 2A), y / o contando el número de "picos" que salen del esferoide. Utilizando dos líneas celulares de cáncer de páncreas murino primario (línea celular 1 y línea celular 2), se observaron y cuantificaron en consecuencia diferentes formas de esferoides y comportamiento invasivo (Figura 2B). La línea celular 1 muestra una formación de esferoides más compacta y una invasión "espigada", comparable a la invasión de una sola célula, mientras que la línea celular 2 forma más esferoides sueltos y muestra un patrón de invasión colectiva(Figura 2C). El cultivo en co-cultivo se llevó a cabo con dos líneas celulares clonales tumorales diferentes sembradas al mismo tiempo (Figura 3A-u2012E) para seguir sus interacciones durante los ensayos posteriores, y con las células tumorales y las células T sobre la formación de esferoides tumorales (Figura 3F-u2012J). Para una evaluación detallada del comportamiento invasivo, se realizó tinción inmunofluorescente(Figura 4). Después de la separación de la matriz de colágeno de la fundición de agarosa, la tinción IF, y la transferencia a un portaobjetos de vidrio (Figura 4A-u2012B), la imagen confocal se realizó de una manera de alto rendimiento (Figura 4C-u2012J). El tamaño y la consistencia del molde de agarosa permiten la inserción de todo el sistema de cultivo 3D en parafina para sección en serie y tinción de inmunohistoquímica (IHC) para cuantificar la relación espacial entre el tumor y las células T (Figura 5). Las células T presentes en la sección se pueden identificar y caracterizar aún más por la tinción del marcador de superficie celular ejemplificada aquí para CD8 (Figura 5D,E). Las células T que se han infiltrado en el esferoide tumoral se pueden contar en relación con las que permanecieron en la periferia del esferoide. La Figura 5D,E muestra ejemplos de infiltración distinta de células T en esferoides tumorales cultivados a partir de la línea celular tumoral 1 (D) y la línea celular 2 (E). La Tabla 1 muestra las configuraciones experimentales típicas para los ensayos, y el rendimiento de muestras representativas y analizables al final del experimento para cada protocolo.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo, análisis y cronología de los experimentos. (A) Un molde de caucho de 81 micropocillos y 35 micropocillos se llena con 2% de agarosa en 1x PBS para generar un molde de agaro con múltiples micropocillos. El diámetro de un molde de caucho es de 3,5 cm. El tamaño del molde de agarosa de 35 micropocillos es de 13 mm x 8 mm, y del molde de 81 micropocillos es de 13 mm x 13 mm. Los esferoides se forman al sembrar la célula en las cámaras de la agarosa fundida en un solo paso de pipeteo. El co-cultivo con células T se realiza dentro del mismo molde. Se muestran el monitoreo funcional y los posibles ensayos. (B) Cronología de los experimentos. Las células tumorales se co-cultivan con células T autólodas durante 2 días, lo que permite una interacción máxima entre ambos tipos de células. El ensayo de invasión se inicia después de dos días. Los análisis de punto final se realizan después de dos días más para monitorear el fenotipo invasivo y de supervivencia de las células tumorales, así como la proliferación y supervivencia de las células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cuantificación de la invasión. La invasión se puede cuantificar mediante el análisis de imágenes, por ejemplo, utilizando el software Image J y contando el número de "picos" por esferoide. (A) Cálculo del área de invasión total como proporción del área total con el área esferoides. Barra de escala: 300 m. (B) Ejemplos de dos líneas celulares de cáncer de páncreas murina primarias diferentes (línea celular 1 y 2) en formación de esferoides a diferentes aumentos e invasión en colágeno tipo I. (C) El análisis de la invasión se realiza contando el número de picos por esferoide (diagrama izquierdo; barras de error: 2.63 para la línea celular 1, 1.47 para la línea celular 2) y calcula el área de invasión como se describe (diagrama derecho; barras de error: 0.36 para la línea celular 1, 1.28 para la línea de celda 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Co-cultivo con tumor con etiqueta de tinte y células T. (A-u2012E) Mezcla de dos líneas celulares clonales de cáncer de páncreas murino etiquetadas con tinte diferente (verde y rojo) y una visión magnificada de un micropozo representativo (B-u2012E). (F-u2012J) Co-cultivo de tumor pre-etiquetado (verde) y células T (rojo). (G-u2012J) La visión magnificada de un micropozo representativo muestra un co-cultivo tumor-célula-células T sobre la formación de esferoides tumorales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tinción de inmunofluorescencia. La tinción de inmunofluorescencia (IF) se realizó después de separar la matriz de colágeno del molde de agarosa. (A-u2012B) Después de la tinción IF, los parches de colágeno se transfieren a un portaobjetos de vidrio y se cubren con cubreobjetos de vidrio. (C-u2012F) Ejemplo de un parche de colágeno manchado de IF, incluidos los esferoides tumorales con (C) Hoechst, (D) queratina 8, (E) faloideína y (F) superposición. Paneles (G-u2012J) Muestran la vista ampliada respectiva de un solo esferoide. Barra de escala de 300 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Seccionamiento de inmunohistoquímica. La agarosa fundida con el cultivo 3D inmerso en gel de procesamiento de hidroxietilo agarosa, fue incrustada en parafina, seccionada y procesada para la tinción de inmunohistoquímica (IHC). (A) Bloque de parafina utilizado para el seccionamiento horizontal que comienza desde la parte inferior de la fundición de agarosa para obtener secciones seriales de múltiples co-cultivos de células tumorales/células T dentro de un solo molde; barra de escala de 5 mm(B) Hematoxilina y eosina-s sección de un molde de agarosa que contiene co-cultivo 3D de tumor y células T. Barra de escala: 1 mm. (C) Vista ampliada de una cocultura manchada de H&E dentro del elenco de agarosa. Tinción CD8 de células T co-cultivadas con la línea celular 1 (D) y la línea celular 2 (E). Escalar barras en C-u2012E a 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo configuración típica células sembradas (por molde) rendimiento típico
ensayo de citotoxicidad 2 moldes de 81 micropocillos 81,000 100.000 células
Ensayo IHC 1x 81-microwell fundido 81,000 40 esferoides
Ensayo de invasión 2 moldes de 35 micropocillos 35,000 50 esferoides
If ensayo 2 moldes de 35 micropocillos 35,000 50 esferoides
Aislamiento celular del colágeno I 2 moldes de 35 micropocillos 35,000 50.000 células
Extracción de ARN del colágeno I 12x 81-microwell moldes 243,000 400-600 ng/l

Tabla 1: Configuración experimental típica y rendimiento para los protocolos. La tabla muestra la configuración experimental típica para cada protocolo y el rendimiento típico de muestras analizables (número de células, esferoides o concentración de ARN) al final del experimento, respectivamente. Inmunohistoquímica IHC; Inmunofluorescencia IF.

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Discussion

El método presentado aquí describe la generación de esferoides tumorales 3D, que permite el co-cultivo con células T, ensayos funcionales y moleculares basados en células, así como una variedad de posibilidades de monitoreo y análisis utilizando un solo dispositivo. La principal ventaja de nuestro enfoque es que no requiere la transferencia de la cultura 3D a un ensayo separado y mantiene la integridad de la cultura 3D a lo largo de los ensayos.

El flujo de trabajo que se presenta aquí se puede modificar según sea necesario. Los tiempos de incubación para la formación de esferoides, el co-cultivo de células T o el ensayo de citotoxicidad, pueden necesitar ser alterados para diferentes condiciones experimentales o líneas celulares.

Hay algunos pasos a lo largo de los ensayos, que requieren una estrecha adhesión al protocolo. Estos son en general: eliminar el medio de cultivo celular antes de agregar una segunda línea celular para el co-cultivo, así como la inserción del cultivo 3D en ECM o gel de procesamiento de agarosa hidroxietilo dentro de los moldes de agarosa. Es absolutamente crítico retirar lentamente y cuidadosamente el medio de la cámara de siembra inclinando la placa de pozo y apuntando a una esquina de la cámara con una micropipeta. Siempre y cuando los moldes de agarosa contengan células, recomendamos eliminar siempre cualquier medio del pozo con una micropipeta, en lugar de usar un pipeteador. La adición de una segunda línea celular y la incrustación en ECM o gel de procesamiento de agarosa hidroxietilo debe realizarse lentamente y en forma de gota para evitar que se expulsen las células en los micropocillos. El paso más crítico del ensayo de invasión de colágeno es el tiempo de incubación antes de invertir los moldes en el pozo con los pozos. Reducir el tiempo puede hacer que el colágeno salga del yeso, y exceder el tiempo podría hacer que el cultivo se presione hasta el fondo de los micropocillos, lo que resulta en una invasión esferoide distribuida de manera desigual. Invertir el yeso permite que las células de los micropocillos se sumerjan completamente en el colágeno líquido antes de polimerizar y solidificar. La tensión superficial entre el moldeado de agarosa y el fondo de plástico de la placa de pozo, genera una "gota colgante"15,,24 durante la invasión esferoide 3D.

Es importante tener en cuenta que el tiempo de incubación antes de invertir los moldes se ha establecido para incrustar en colágeno tipo I. Con otros componentes ECM, este paso debe ajustarse en consecuencia. Cabe destacar que no se debe intentar la eliminación completa de medios residuales para evitar una pérdida involuntaria de células presentes en los micropocillos. Este medio residual da lugar a una ligera dilución del ECM añadido. Esto debe tenerse en cuenta para el análisis y la adaptación de otros sistemas de ensayo.

El co-cultivo descrito aquí permite una interacción máxima tumoral/células T antes de que se ensayo la invasión de las células tumorales: El tumor y las células T se co-cultivan durante 2 días antes de incrustar en colágeno tipo I y luego identificar las células tumorales supervivientes e invasivas durante los próximos dos días (Figura 1B). Cabe destacar que cuando el co-cultivo se inició mientras que las células T se resuspendieron en colágeno I, las células T no mostraron un impacto en la invasión de células tumorales y la citotoxicidad. Este efecto podría deberse a que las células T están más distribuidas en colágeno y por lo tanto menos concentradas alrededor de los esferoides. Esto sugiere que la interacción directa entre el tumor y las células T durante los dos días de co-cultivo antes del ensayo de invasión es fundamental para la evaluación de los efectos mediados de las células T en las células tumorales.

Sin embargo, algunas de las ventajas de este modelo 3D vienen con desventajas. Este ajuste de alto rendimiento permite la siembra fácil y rápida de células en la agarosa fundida en un paso de pipeteo, lo que resulta en la generación de una multitud de esferoides de tamaño uniforme dentro de un molde. Sin embargo, dado que todos los esferoides se encuentran dentro del mismo molde, también se pueden quitar fácilmente, por ejemplo, durante la eliminación del medio de cultivo celular dentro de la cámara de siembra y al tiempo que se agregan células T para el co-cultivo. Por lo tanto, la cantidad de rendimiento para cada protocolo depende en gran medida de las habilidades técnicas y la experiencia del investigador, pero también del tipo de ensayo que se está realizando. Como sugiere la Tabla 1, se debe tener en cuenta una posible pérdida de esferoides de aproximadamente el 50% al final de un experimento. Además, durante el paso de siembra, las células podrían no distribuirse por igual sobre el área de la cámara de siembra, lo que resulta en esferoides más o menos representativos dentro de la fundición de agarosa. Se experiencia, este efecto aumenta con el tamaño del elenco de agarosa. En consecuencia, las réplicas deben tenerse en cuenta al planificar el experimento.

La interacción espaciotemporal de las células dentro del sistema 3D se puede evaluar mediante imágenes de lapso de tiempo, que presenta otra opción de monitoreo en este modelo. Además, el pequeño diámetro de los micropocillos y el paso de pipeteo único a las células de semillas, son adecuados para realizar clonación de una sola célula. Por último, las muestras del paciente (por ejemplo, de biopsias) se pueden analizar en el ensayo debido al pequeño número de células necesarias para los micropocillos y a la característica de alto rendimiento del sistema 3D. La inclusión de fármacos estimulantes o bloqueados (por ejemplo, anti-PD-1 o anti-PD-L1) para sondear la interacción de células tumorales/células T es una extensión lógica del ensayo.

En conclusión, el modelo de co-cultivo esferoides 3D presentado aquí proporciona un marco flexible para monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T co-cultivadas en un entorno biológicamente relevante. La conversación cruzada resultante se puede visualizar manteniendo la integridad del cultivo 3D y así proporcionar información mecanicista sobre las interacciones de células tumorales – células T.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Acknowledgments

Agradecemos a Virginie Ory, PhD por útiles debates y consejos sobre el enfoque del modelo de co-cultura 3D. También agradecemos a Elizabeth Jones por su excelente asistencia técnica con la sección IHC. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) a YL (LI 2547/4-1) y los Institutos Nacionales de Salud a AW (R01 CA231291), a ATR (R01 CA205632), a GWP (R01 CA218670) y a la subvención básica del Centro Oncológico (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

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References

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