Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Abstract

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de behandeling van kanker met immunotherapie, hoewel een groot aantal kankers resistent blijft tegen behandeling. Een beperkt aantal tests zorgen voor directe monitoring en mechanistische inzichten in de interacties tussen tumor- en immuuncellen, waaronder T-cellen een belangrijke rol spelen bij het uitvoeren van de cytotoxische reactie van het adaptieve immuunsysteem op kankercellen. De meeste tests zijn gebaseerd op tweedimensionale (2D) co-cultuur van cellen als gevolg van het relatieve gebruiksgemak, maar met beperkte vertegenwoordiging van de invasieve groei fenotype, een van de kenmerken van kankercellen. Huidige driedimensionale (3D) co-cultuur systemen vereisen ofwel speciale apparatuur of aparte monitoring voor invasie van co-gekweekte kankercellen en interactie T-cellen.

Hier beschrijven we een aanpak om tegelijkertijd het invasieve gedrag in 3D van kankercelsferoïden en T-celcytotoxiciteit in co-cultuur te monitoren. Sferoïde vorming wordt aangedreven door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose microwell-afgietselt met U-vormige bodems. Zowel T-cel co-cultuur en kanker cel invasie in type I collageen matrix worden uitgevoerd binnen de microwells van de agarose werpt zonder de noodzaak om de cellen over te dragen, waardoor een intacte 3D co-cultuur systeem in de hele test. De collageenmatrix kan worden gescheiden van de agarose gegoten, waardoor immunofluorescentie (IF) kleuring en voor confocale beeldvorming van cellen. Ook kunnen cellen worden geïsoleerd voor verdere groei of worden onderworpen aan analyses zoals voor genexpressie of fluorescentie geactiveerde celsordening (FACS). Ten slotte kan de 3D co-cultuur worden geanalyseerd door immunohistochemie (IHC) na inbedding en sectie. Mogelijke wijzigingen van de test omvatten veranderde samenstellingen van de extracellulaire matrix (ECM) en de opname van verschillende stromale of immuuncellen met de kankercellen.

Introduction

Ondanks aanzienlijke verbeteringen in kanker immunotherapie in het afgelopen decennium, onze mechanistische begrip van gevoeligheid en weerstand tegen behandelingen zijn nog steeds vrij slecht1. Het is algemeen vastgesteld dat tumoren een aanzienlijke heterogeniteit vertonen, en dat de dynamische interacties van de tumorcellen met hun micro-omgeving en met de immuuncellen, impact tumorceldood, invasief gedrag en reactie op behandelingen die immunotherapieomvatten 1,2,3. Als een arm van het adaptieve immuunsysteem, T-cellen uit te voeren cel-specifieke cytotoxiciteit. De analyse van T-celherkenning en respons op kankercellen biedt mechanistische inzichten in resistentie en gevoeligheid voor immuunmodulatorische behandelingen.

In vitro modellering en monitoring interacties tussen kanker en T-cellen in een geschikte omgeving is uitdagend en tot nu toe resulteerde in beperkte mechanistische inzichten. De meeste celgebaseerde tests zijn gebaseerd op een tweedimensionale (2D) omgeving, dat ontbreekt aan belangrijke kenmerken die van cruciaal belang zijn voor het samenvatten van de driedimensionale (3D) in vivo fysiologie4,5,6, namelijk ruimtelijke celcelinteracties, contact met de extracellulaire matrix (ECM)7, dynamische metabole vraag, verhoogde hypoxie als gevolg van massagroei8, en effecten van de tumormicro-omgeving (TME)9. Aan de andere kant zijn er nog een aantal tekortkomingen met de momenteel gebruikte driedimensionale (3D) co-cultuur en invasie testsystemen: (1) de tijdrovende aard van sferoïde generatie en oogst5,10, (2) het gebrek aan controle over de sferoïde grootte, vorm en celdichtheid11,12, (3) de test van het lage doorvoertype, (4) de eis voor speciale apparatuur13,14, (5) de noodzaak om de cocultuur voor verschillende testen 15 ,16,16,17in verschillende omgevingen over te brengen . Met name de overdracht van een co-cultuurtest leidt vaak tot verstoring van sferoïden en verlies van de integriteit van de co-cultuur. Dit geldt vooral voor "losse" sferoïden met verminderde cel-celhechting. De meeste 3D-invasietesten vereisen bijvoorbeeld dat sferoïden na hun eerste formatie worden geoogst en vervolgens opnieuw worden opgetrokken in ECM14,15,16. Deze resuspensiestap resulteert in een verlies van controle over de afstand tussen sferoïden. Aangezien de afstand tussen tumorsferoïden hun invasief gedrag beïnvloedt, introduceert dit verlies van controle hoge inter-assay variantie en vermindert de reproduceerbaarheid. Bovendien is de toepassing van celfrasectiontesten door opeenvolgende centrifugatiestappen voor de beoordeling van de perifere en tumorsferoïde infiltrerende immuuncellen beperkt tot tumorcelpopulaties die stabielere sferoïden genereren17.

Concept en aanpak

Onze aanpak richt zich op de bovengenoemde tekortkomingen met behulp van een "All-in-One"-3D sferoïde co-cultuur model, die niet vereist dat de overdracht van sferoïden voor latere tests. We hebben een sferoïde vormingsapparaat (zie Tabel van Materialen)aangepast om een test te genereren voor gelijktijdig monitorend invasief gedrag van kankercellen en cytotoxiciteit van co-gekweekte T-cellen. Deze methode is gebruiksvriendelijk, goedkoop en zorgt voor een snelle en eenvoudige bediening in een relatief hoge doorvoer 3D-instelling. Afhankelijk van het gebruikte type apparaat kunnen tot 81 grote sferoïden van uniforme grootte worden gegenereerd in één pipettingstap met controle over de individuele sferoïde grootte door het aantal ingezaaide cellen te wijzigen. Sferoïde vorming wordt gedwongen door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose multi-well afgietsten met U-vormige bodems. We hebben dit 3D-systeem aangepast voor dynamische celgebaseerde functionele studies en endpoint moleculaire en biochemische tests die fluorescentie geactiveerde celsorden (FACS), immunofluorescentie (IF) of immunohistochemie (IHC) kleuring omvatten, evenals genexpressieanalyse van de intacte 3D co-cultuur.

Voor functionele studies, inbedden sferoïden in type I collageen binnen de agarose werpt resulteert in invasie van kankercellen van equidistant sferoïden en maakt het mogelijk monitoring van essentiële cellijn-specifieke kenmerken, zoals eencellige vs collectieve cel migratie18,19. Bovendien is de collageenmatrix gemakkelijk gescheiden van de agarose-cast, wat resulteert in een 1\u20122 mm dikke patch met meerdere sferoïden, die verder kan worden verwerkt voor IF-vlekken en beeldvorming door confocale microscopie. Dit kan onthullen verschillende celinvasie en cel-matrix interacties in een high-throughput screening. Ook kunnen cellen in de collageenmatrix worden geïsoleerd na de vertering van collageen en eencellige dissociatie voor latere celkweek of -analyse.

Voor IHC-analyse van sferoïdenzijn na fixatie en sectie van de agarose gegoten eiwitten of andere moleculen van belang detecteerbaar met behoud van de geografische posities van de sferoïden. In de hier beschreven aanpak, sferoïden zijn direct ingebed in Hydroxyethyl agarose processing gel binnen de agarose gegoten en de gel dient als een "deksel" om de sferoïden te behouden aan de onderkant van de microwells. Na paraffine inbedding van de agarose gegoten20, seriële horizontale sectie wordt uitgevoerd met de onderkant van de cast die als uitgangspunt.

Deze aanpak contrasteert met conventionele IHC-sectie van sferoïden die het oogsten van cellen vereist voordat ze inhydroenen worden genomen in Hydroxyethyl agarose processing gel21 en riskeert verstoring van sferoïden waardoor de ruimtelijke ordening van cellen verloren gaat. Ook celfractionering door centrifugatie voor het beoordelen of immuuncellen geïnfiltreerd of perifeer bleven tot tumorsferoïden17 wordt vermeden door directe inbedding.

Bovendien, 3D co-cultuur kan worden uitgevoerd door het mengen van tumor, stromale of immuuncellen, en dus het bestuderen van tumorcel crosstalk of het opnieuw vatten van verschillende tumor micro-omgevingen voor het analyseren van cel-cel interacties met inbegrip van co-culturen met endotheelcellen16.

Deze 3D sferoïde co-cultuur instelling kan worden gebruikt om co-cultuur van verschillende celtypes aanwezig in de tumor micro-omgeving uit te voeren en om de effecten van veranderde ECM-elementen te beoordelen. Naast type I collageen kunnen andere ECM-componenten (bijvoorbeeld matrigel, matrigel/collageenmengsels, fibronectine) worden gebruikt omdat tumorcelinvasie wordt beïnvloed door de overvloed aan verschillende substraten22. Ook zijn de microwells van de agarose gegoten geschikt voor sferoïde vorming van primaire cellijnen en voor cellen met een lage celcelhechting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Een lijst en uitleg van enkele veelgebruikte woorden in het hele protocol is te vinden in aanvullend dossier 1.

1. Generatie van sferoïden

  1. Bereid en autoclave 2% agarose in 1x PBS (bijvoorbeeld, 1 g agarose in 50 mL van 1x PBS) en autoclave 35- en 81-microwell rubbermallen.
    LET OP: Vermijd het gebruik van laag smeltende agarose voor het genereren van de agarose-afgietsjes voor IHC-verwerking.
  2. Bereid agarose afgietsert
    OPMERKING: 35 microwell gieters worden gebruikt voor invasie, immunofluorescentie (IF) en celisolatie testen. 81 microwell afgietselt worden gebruikt voor cytotoxiciteit, immunohistochemie (IHC), celisolatie en RNA extractie testen.
    1. Nadat de agarose is autoclaved, laat gesmolten agarose afkoelen tot ongeveer 60\u201270 °C. In een cel cultuur kap, gebruik aseptische techniek en pipet 500 μL gesmolten agarose in een 81-microwell rubberen mal per put of 330 μL in een 35-microwell rubberen mal per put.
      LET OP: Vermijd het creëren van bellen tijdens het mengen of pipetten agarose. Verwijder eventuele bubbels door zachtjes pipetten.
    2. Nadat de agarose is gestold, voorzichtig buig de rubberen mal om de agarose gegoten uit te verwijderen. Plaats hierbij de handen boven de juiste goedplaat en laat de agarose gegoten drop recht in een put van de put-plaat.
      LET OP: Buig de rubberen mal op verschillende posities om te voorkomen dat over buigen. Het kan nuttig zijn om de rubberen mal flex en duw zachtjes van de bodem op hetzelfde moment.
    3. Om de agarose afgietselen te equiliberen, voeg celkweekmedium toe, bestaande uit DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (2,5 mL/put voor 12-putplaat en 1 mL/put voor 24-well plate). Zet de putplaat in een celkweek incubator (37 °C, 5% CO2)en broed gedurende 1 uur.
  3. Bereid ondertussen de celkweek voor op zaaien.
    OPMERKING: Het totale celzaainummer per agarose cast moet worden bepaald door de onderzoeker. Voor murine primaire alvleesklierkanker cellijnen, 35.000 cellen/35-microwell gegoten en 81.000 cellen/81-microwell gegoten (in gemiddelde 1000 cellen/sferoïden) worden gezaaid voor alle volgende testen. De gemiddelde diameter van een sferoïde is ongeveer 150\u2012200 μm na 48 uur.
  4. Verwijder celcultuurmedium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet eerst door het kantelen van de put-plaat. Verwijder vervolgens voorzichtig het medium in de zaaikamer.
  5. Zaad zorgvuldig de voorbereide tumorcel suspensie drop-wise in de cel zaaien kamer. Zet de putplaat voorzichtig terug in de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 15 minuten.
    LET OP: Tijdens deze stap zullen de cellen zich vestigen in de microwells van de agarose gegoten.
  6. Voeg extra medium toe aan de buitenkant van de agarose gegoten (2,5 mL/put voor 12-well plaat en 1 mL/put voor 24-well plaat).
  7. Zet de putplaat terug in de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2) voor 48 uur.
    OPMERKING: Meestal duurt het tot een paar uur voor de cellen te vormen sferoïden in de microwells. Over het algemeen worden vaste tumorcelferoïden gevormd na 24 uur en zijn stabiel na 48 uur. Dit kan echter variëren tussen verschillende cellijnen. Verander indien nodig het celcultuurmedium door de putplaat voorzichtig te kantelen met de agarose afgietselt en het omringende celkweekmedium met een P1000 pipet te verwijderen. Voeg vervolgens voorzichtig vers medium toe door het langs de muur van de put te pipetten. Meestal is het niet nodig om de media binnen de afgietselt te veranderen vanwege het kleine volume en het risico van het verwijderen van de sferoïden.

2. Co-cultuur met T-cellen

  1. Het vereiste aantal T-cellen in 75 μL (35-microwell cast) of in 190 μL (81-microwell cast) van het juiste T-celkweekmedium (RPMI aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine) opnieuw op te stellen.
  2. Verwijder eerst het celcultuurmedium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet door de putplaat te kantelen. Verwijder vervolgens langzaam en voorzichtig het medium in de cast door voorzichtig een hoek van de zaaikamer te targeten met een P200 pipet terwijl de putplaat met de andere hand gekanteld blijft.
  3. (Kritieke stap 1) Aangezien er een risico van het verwijderen van sferoïden, controle voor het verlies van sferoïden door het vergelijken van het aantal sferoïden binnen de microwells voor en na het verwijderen van het medium door te bekijken onder de microscoop op 10x vergroting.
  4. Zaad de T-cel suspensie voorzichtig in de zaaikamer van de agarose gegoten door de P200 pipet ongeveer 0,5 cm boven de cast te houden.
  5. (Kritieke stap 2) Er is een risico van het spoelen van de sferoïden tijdens het toevoegen van de T-cellen. Daarom is het van cruciaal belang om de T-cellen zeer langzaam en ongeveer 0,5 cm boven de zaaikamer toe te voegen.
    OPMERKING: Een mogelijkheid om het aantal doorgespoelde sferoïden te verminderen is door de pipet naar een hoek van de zaaikamer te richten terwijl de T-cellen worden toegevoegd, waardoor alleen het risico bestaat dat de sferoïden in deze hoek worden weggespoeld.
  6. Plaats de putplaat voorzichtig terug in de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 15 minuten.
  7. Neem de put-plaat uit de couveuse en voeg verse celkweekmedium (RPMI aangevuld met 10% foetale runderserum en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine) rond de agarose gegoten door het langzaam pipetting het langs de muur van de put.
  8. Zet de putplaat terug in de celcultuur incubator voor 48 uur.

3. Inbedding van 3D co-cultuur in type I collageen matrix

  1. Geneutraliseerd collageen type I voorbereiden
    1. Verdun het bouen collageen met serumvrij basismedium (RPMI) tot een uiteindelijke werkconcentratie van 3 mg/mL. Voeg voor elke 100 μL verdund collageen 11 μL 10x PBS en 1,2 μL 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe.
    2. Houd op ijs en incubeer (neutraliseren) voor 1 uur.
  2. Verwijder eerst het celcultuurmedium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet door de putplaat te kantelen. Verwijder vervolgens langzaam en voorzichtig het medium in de cast door voorzichtig een hoek van de zaaikamer aan te pakken met een P200 pipet terwijl de putplaat met de andere hand wordt gekanteld.
    OPMERKING: Hier is het van cruciaal belang om het celcultuurmedium rond de agarose-cast volledig te verwijderen.
  3. Voorzichtig pipette de geneutraliseerde collageen Meng ik drop-wise in de zaaikamer van de agarose gegoten door het houden van de P200 pipet ongeveer 0,5 cm boven de cast.
  4. Zet de putplaat onmiddellijk in de celkweek incubator voor 4 min (35-microwell gegoten) of 5 min (81-microwell gegoten).
    LET OP: (Kritieke stap 3) Het is essentieel om strikt aan de gegeven incubatietijd te houden. Anders is het invasieve gedrag mogelijk niet reproduceerbaar.
  5. Keer de putplaat om en laat deze 1 uur omdraaien in de couveuse.
    LET OP: De afgietsten blijven aan de onderkant van de putplaat bevestigd als gevolg van oppervlaktespanning. In het geval dat speciale celkweekmedium met hoge serumconcentratie (bijvoorbeeld RPMI aangevuld met 20% foetaal runderserum) wordt gebruikt, kan een extra wasstap met 1x PBS na het verwijderen van het medium in de put nodig zijn om de oppervlaktespanning te verhogen.
  6. Haal de putplaat uit de couveuse en keer hem terug. Voeg vers celkweekmedium (RPMI aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine) toe rond de agarose die wordt gegoten door het langzaam langs de wand van de put te pipetten.
  7. Zet de putplaat 48 uur terug in de couveuse van de celkweek.

4. Cytotoxiciteitstest

  1. Bereid 3 mL 1x PBS voor met 2% foetaal runderserum per agarose gegoten.
  2. Na co-cultuur voor 4 d, verwijder de cel cultuur medium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet door iets kantelen van de put-plaat met de andere hand.
    OPMERKING: De totale periode van co-cultuur moet worden bepaald door de onderzoeker.
  3. Verdeel 1 mL 1x PBS + 2% FBS met een P1000 pipet in de zaaikamer om de sferoïden los te maken van de microwells.
  4. Herhaal stap 4.3 twee keer met het volume in de put en breng het over in een 15 mL buis.
  5. Centrifugeren de buis op 300 x g voor 10 s bij kamertemperatuur (RT).
  6. Verwijder de supernatant voorzichtig met een P1000 pipet.
  7. Was de cellen door 1 mL 1x PBS toe te voegen met 2% FBS en centrifuge op 300 x g gedurende 1 min bij RT.
  8. Herhaal de wasstap (stap 4.7).
  9. Verwijder de supernatant en voeg 1 mL celdissociatie enzymen oplossing (zie Tabel van materialen).
  10. Gebruik een P200 pipet en pipet op en neer om de celclusters te breken.
  11. De cellen gedurende 20 minuten in de celkweek incubator inbroeden (37 °C, 5% CO2).
  12. Herhaal stap 4.10.
    OPMERKING: Neem ~10 μL eruit en zaad op een celkweekschotel om te observeren (onder de microscoop bij 10x vergroting) hoe goed de sferoïden zijn gescheiden in enkele cellen. Voeg indien nodig 5 min extra incubatie toe.
  13. Voeg 4 mL volledige celkweekmedium (RPMI aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine) toe en meng door de buis 3\u20124 keer om te keren.
  14. Centrifuge op 400 x g gedurende 4 minuten op RT.
  15. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in FACS buffer voor Annexin V kleuring van apoptotische cellen.
    OPMERKING: Vanaf hier kan elke FACS-kleuring en celanalyse worden uitgevoerd.

5. Hydroxyethyl agarose processing gel inbedding voor IHC sectioning

OPMERKING: Hier is het van cruciaal belang om te voorkomen dat het gebruik van laag smeltende agarose voor het genereren van de agarose werpt.

  1. Verwijder aan het einde van de co-cultuur eerst het celcultuurmedium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet door de putplaat te kantelen. Verwijder vervolgens langzaam en voorzichtig het medium in de cast door voorzichtig een hoek van de zaaikamer te targeten met een P200 pipet terwijl de putplaat met de andere hand gekanteld blijft.
  2. Langzaam pipette 10% formalin eerst in de zaaikamer door voorzichtig gericht op een hoek van de zaaikamer met een P200 pipet. Voeg vervolgens 10% formaline toe aan de buitenkant van de agarose cast totdat deze volledig bedekt is. Fix de agarose gegoten in 10% formaline voor 1 d.
  3. Verwijder de formaline op de volgende dag.
  4. Voorzichtig pipette 210 μL (81-microwell gegoten) of 100 μL (35-microwell gegoten) van voorverwarmde en vloeibaar hydroxyethyl agarose processing gel (zie Tabel van materialen) drop-wise in de zaaikamer van de agarose gegoten door het houden van de P200 pipet ongeveer 0,5 cm boven de cast.
  5. Laat de hydroxyethyl agarose processing gel stollen gedurende 10 min op RT.
  6. Breng de agarose gegoten naar 1x PBS.
    OPMERKING: Voor langere opslag, insluiten van de cast in 70% ethanol om besmetting te voorkomen.
  7. Dehydrateer de gelsecties via een ethanolserie (elk 1 uur: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol [3x verandert elk]). Dan duidelijk in een clearing oplossing 3x voor 1 h elk (bijvoorbeeld aliphatische koolwaterstoffen [bijvoorbeeld Clearite], of xylenen), en infiltreren met gesmolten paraffine (3x voor 1 h elk), handmatig of in een weefsel processor. Sluit de cast in paraffinewas in voor latere secties bij 5 μm per sectie.
  8. Verwijder was door het aanbrengen van glijbanen in xylenen, 3x voor 3 min per stuk, dan rehydrateren weefsel secties door middel van een gesorteerde alcohol serie: 100% ethanol voor 2 min, 95% ethanol voor 1 min, 80% ethanol voor 30 s en 70% ethanol voor 30 s, plaats dan in water.
  9. Voer warmte geïnduceerde epitoop retrieval uit in een plantaardige stoomboot bij 100 °C gedurende 20 minuten, gevolgd door 20 min koeling in een 10 mM natriumcitraat pH 6.0-oplossing en blokkeerhyogene peroxidases met H2O2.
  10. Blokkeer de secties met normaal doelserum en stel ze 's nachts bloot aan anti-CD8-antilichaam (verdunning 1/25).
  11. Breng anti-konijn-HRP geconjugeerde secundaire antilichamen (zie Tabel van Materialen)en de ontwikkeling van de kleuring met behulp van 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) chromageen. Tegenstrepen kernen met een 11% Harris hematoxylin oplossing (zie Tabel van materialen).

6. Monitoring en analyse van sferoïde invasie in co-cultuur

OPMERKING: Het tijdspunt van beeldvorming sferoïde invasie in het collageen I matrix moet worden besloten door de onderzoeker. Verwerven cel cultuur beelden met behulp van een omgekeerde microscoop met 10x vergroting. Het ideale tijdpunt is afhankelijk van de geteste cellijn en de ECM-component. Meer invasieve cellijnen zal beginnen te verspreiden in het collageen binnen een paar uur na het toevoegen van het collageen. Aangezien de T-cellen in de co-cultuur een volledige mening op de uitgang van de sferoïden bij zeer vroege tijd-punten zouden kunnen verhinderen, worden over het algemeen de beelden genomen bij 0 h (als verwijzing), 24 h en 48 h na het toevoegen van het collageen.

  1. Quantitate invasief door handmatig het aantal "spikes" te tellen dat uit de sferoïde komt en/of met behulp van beeldanalysesoftware, bijvoorbeeld Afbeelding J.
    1. Analyseer invasie als het aantal "spikes" van de sferoïde door handmatig het aantal "spikes" van een sferoïde te tellen.
      OPMERKING: Het moet door de onderzoeker worden besloten welke uitsteeksels van de sferoïden als "spikes" worden beschouwd. Een beslissingscriterium zou de lengte van de "spike" kunnen zijn die vanaf de rand van de sferoïde wordt gemeten.
    2. Analyseer invasie als het invasiegebied ten opzichte van de grootte van de sferoïde.
      1. Gebruik het freehand draw tool (afbeelding J) om de rand van het totale gebied te traceren (invasie + sferoïde gebied).
      2. Klik op Analyseren in het bovenste menu en klik vervolgens op Meten om de gebiedsmeting weer te geven.
      3. Traceer de rand van het totale sferoïde gebied.
      4. Klik op Analyseren in het bovenste menu en klik vervolgens op Meten om de gebiedsmeting weer te geven.
      5. Kopieer de lijst met gemeten resultaten in een spreadsheet en bereken de totale invasie/sferoïde met behulp van de formule: totale invasie = totale oppervlakte/sferoïde gebied.

7. Kleuring van immunofluorescentie

  1. Bereid het volgende voor.
    1. Bereid 5,4% formaline (5 mL) voor met 2,3 mL van 1x PBS en 2,7 mL van 10% formaline.
    2. Bereid 0,5% Octoxynol (50 mL) voor met 50 mL van 1x PBS en 2,5 mL van 10% Octoxynol (store bij RT).
    3. Bereid IF Buffer (200 mL) voor met 200 mL 1x PBS, 200 mg runderserumalbumine (BSA), 4 mL van 10% Octoxynol, 1 mL van 10% polysorbate 20 (opwarmen tot RT voor gebruik; filteren en opslaan bij 4 °C).
    4. Bereid de blokkeringsoplossing (5 mL) voor met 5 mL IF Buffer en 500 μL geitenserum (warm op tot RT voor gebruik).
    5. Houd 8-well kamerdia's, glazen coverslips en montagemedia gereed.
  2. Dag 0
    1. Fix de hele agarose gegoten, met inbegrip van de sferoïden, 's nachts in 5,4% formaline bij RT in een bevochtigde kamer.
  3. Dag 1
    1. Verwijder het celcultuurmedium rond de agarose gegoten met een P1000 pipet door het kantelen van de put-plaat.
    2. Breng de collageen patch in een 8-well kamer dia door het grijpen van een hoek van de collageen matrix in de zaaikamer van de agarose gegoten met slanke punt pincet en schil het uit de agarose gegoten in een enkele, zelfverzekerde beweging.
      OPMERKING: De collageen patch moet gemakkelijk worden gescheiden van de agarose gegoten. Anders, gebruik maken van een P1000 pipet om zorgvuldig toe te voegen cultuur medium in het gebied van de zaaikamer of omkeren van de agarose gegoten en zachtjes schudden de put-plaat om de collageen matrix los te maken.
    3. Voeg 250 μL van 0,5% Octoxynol (zie tabel van materialen)per put. Incubeer voor 1 uur bij RT.
    4. Aspirate de Octoxynol en voeg 250 μL blokkeringsoplossing per put toe. Blok voor 1 uur op RT.
    5. Verdun ondertussen het primaire antilichaam (verdunning voor anti-keratine 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) in de blokkeringsoplossing, berekenend voor 250 μL per put.
    6. Voeg het primaire antilichaam toe aan de blokkeringsoplossing en plaats de kamerdia in een bevochtigde kamer voor nachtelijke incubatie bij RT.
  4. Dag 2
    1. Verwijder het primaire antilichaam in het blokkeren van oplossing door aspirating.
    2. Was 3 keer door 300 μL IF Buffer toe te voegen en laat het 5 minuten zitten bij RT.
      LET OP: Laat het zitten, er is geen noodzaak om het op een shaker.
    3. Verdun het secundaire antilichaam in blokkeeroplossing (voor anti-keratine 8: anti-rat, verdunning 1/500).
    4. Voeg 250 μL secundair antilichaam toe in de blokkeringsoplossing aan elke put en incubbate voor 1 h bij RT. Bescherm vanaf nu de monsters tegen licht.
    5. Verwijder het secundaire antilichaam in het blokkeren van oplossing door aspirating.
    6. Was 3 keer met 300 μL IF Buffer door toe te voegen en laat het zitten voor 5 min op RT.
    7. Spoel de monsters af met 1x PBS en spoel deze aan.
    8. Verwijder voorzichtig de wanden van de schuif, zodat alleen de glazen schuif aan de onderkant overblijft.
    9. Voeg ten minste 200 μL montagemedia toe aan een glazen afdekkenlip en laat de coverslip langzaam over het monster vallen.
      OPMERKING: Vermijd het maken van bellen, omdat dit van invloed is op de beeldkwaliteit. Bellen kunnen worden voorkomen door de afdeksel voorzichtig op de lange rand van de glijbaan onder een hoek van 45° te plaatsen of de afdekslip op de glijbaan langzaam te laten zakken.
    10. Zet de gemonteerde monsters op een donkere en droge plaats en laat het zitten 's nachts. Imaging kan worden uitgevoerd op de volgende dag.
      LET OP: De coverslip kan in eerste instantie verschuiven een beetje eenmaal geplaatst over de collageen patch. Laat het glas een paar minuten op een gelijkmatige ruimte zitten. De coverslip zal plat uit het monster, zodat er geen kloof links tussen de glazen schuif en coverslip na verloop van tijd.

8. Isolatie van cellen uit de collageenmatrix

  1. Bereid het volgende voor.
    1. Bereid 1 mg/mL collagenase 4 in serumhoudend celkweekmedium (op te slaan aliquoted collagenase 4 verdunningen bij -20 °C)
    2. Bereid 2,5% BSA in 1x PBS en coat alle buizen en pipettips mee (filter BSA-oplossing voor gebruik).
    3. Verwarm de BSA-oplossing en het celkweekmedium voor gebruik voor.
  2. Bereid 2 mL collagenase 4 oplossing (1 mg/mL) om maximaal drie collageen matrices verteren van 35-microwell agarose werpt.
  3. Breng tot drie 75 μL collageen matrices van 35-microwell agarose werpt in een 2,5% BSA voorgecoate 15 mL buis. Pak een hoek van de collageenmatrix in de zaaikamer van de agarose gegoten met slanke punt pincet en schil het uit de agarose gegoten in een enkele, zelfverzekerde beweging.
  4. Snijd de punt van een P1000-tip met een schaar. Pre-coat de resterende tip met 2,5% BSA en breek de collageenmatrix zoveel mogelijk af door op en neer te pipetten. Broed de buis 15 min bij 37 °C.
  5. (Kritieke stap 4) Controleer bij elke 5 minuten of de collageenmatrix is opgelost. Pipet op en neer opnieuw alvorens 10 μL van het monster uit te nemen en het op een schotel van de celkweek voor het waarnemen onder de microscoop bij 10x vergroting zaad. Voeg indien nodig nog eens 5 minuten toe.
  6. Vul de buis met 10 mL voorverwarmd celkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum). Meng voorzichtig door de buis 3\u20124 keer om te keren.
  7. Centrifuge de buis op 400 x g gedurende 4 minuten op RT.
  8. Verwijder voorzichtig de supernatant en laat 2 mL volume achter.
  9. (Kritieke stap 5) Laat 2 mL na de eerste centrifugatiestap als er misschien nog onopgelost collageen aan de onderkant van de buis die cellen langs hen.
  10. Voer twee wasstappen uit door telkens 10 mL serumhoudend celkweekmedium toe te voegen. Centrifuge elke keer op 400 x g gedurende 4 min op RT.
  11. Na de laatste wasstap, verwijder zoveel mogelijk medium en laat alleen de cel pellet.
  12. Resuspend de celpellet in 1 mL van celdissociatie enzymen oplossing (zie Tabel van Materialen).
  13. Gebruik een P200 pipet en pipet op en neer om de celclusters te breken.
  14. De cellen gedurende 20 minuten in de celkweek incubator inbroeden (37 °C, 5% CO2).
  15. Herhaal stap 8.13.
    OPMERKING: Neem ~10 μL eruit en zaad op een celkweekschotel om onder de microscoop te observeren bij 10x vergroting om te zien hoe goed de sferoïden zijn gescheiden in enkele cellen. Voeg indien nodig 5 min extra incubatie toe.
  16. Voeg 4 mL celkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum) toe en meng door de buis 3\u20124 keer om te keren.
  17. Centrifuge op 400 x g gedurende 4 minuten op RT.
  18. Verwijder de supernatant. Vanaf hier kan facs-kleuring of celkweek worden uitgevoerd.

9. RNA-extractie uit de collageenmatrix

  1. Bereid guanidiniumthiocyanaat met fenol (zie Tabel van materialen),100% chloroform, 70% RNase-vrije ethanol, RNA-extractiekit (zie tabel van materialen),RNase-vrije 1,5 mL-buizen, RNase-vrije 15 mL-buizen en RNase-vrije ddH2O.
  2. Breng tot twaalf 190 μL collageen matrices van 81-microwell agarose werpt in een 15 mL buis. Pak een hoek van de collageenmatrix in de zaaikamer van de agarose gegoten met slanke punt pincet en schil het uit de agarose gegoten in een enkele, zelfverzekerde beweging.
    LET OP: De matrices kunnen ook worden ingevroren bij -80 °C tot ze klaar zijn voor RNA-extractie.
  3. Voeg 1 mL guanidinium thiocyanaat met fenol (zie Tabel van materialen)toe aan de collageenmatrices in de 15 mL buis.
    OPMERKING: Het guanidiniumthiocylaat met fenol moet de collageenmatrices volledig bedekken.
  4. Vortex de buizen voor 10\u201220 s.
  5. Homogeniseer de matrices met 20 G naalden en 5 mL spuiten totdat ze volledig zijn opgelost.
  6. Laat de matrices zitten voor 5 minuten op RT.
  7. Voeg 200 μL zuiverchloroform toe aan de matrices en schud de buis krachtig gedurende 15 s.
  8. Breng de mix onmiddellijk over op buizen van 1,5 mL.
  9. Laat de mix zitten voor ten minste 5 minuten op RT totdat de fasen zijn gescheiden.
  10. Centrifugeer de 1,5 mL buizen op 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  11. Vul een nieuwe 1,5 mL buis met 500 μL ethanol.
    OPMERKING: Afhankelijk van het volume van de waterige fase na centrifugatie (zie stap 9.12. dit is mogelijk geen 500 μL. De hoeveelheid ethanol van 70% moet gelijk zijn aan het volume van de waterige fase.
  12. Breng de bovenste waterige fase van de gecentrifugeerde monsters voorzichtig over naar de met 70% ethanol gevulde buis en meng grondig door op en neer te pipetten.
  13. (Kritieke stap 6) Wees voorzichtig om de lagen aan de onderkant van het guanidinium thiocyanaat niet te verstoren met fenolscheiding terwijl u de bovenste fase verwijdert, omdat dit het RNA zal besmetten.
  14. Voeg het monster toe aan een RNA-extractiekolom (opgenomen in de RNA-extractiekit, zie Tabel met materialen). Volg vanaf nu het protocol van de fabrikant voor RNA-zuivering uit cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het 3D co-cultuurmodel maakt verschillende tests mogelijk die in figuur 1Aworden weergegeven, die naar behoefte kunnen worden gecombineerd of gewijzigd. In onze gevestigde experimentele setup worden tumor- en T-cellen gedurende 2 dagen co-gekweekt, gevolgd door het initiëren van de invasietest voor selectie van invasieve en/of resistente tumorcellen(figuur 1B). Op dag 4 wordt de kwantificering van invasie uitgevoerd en worden "overlevende" cellen geïsoleerd van de collageenmatrix of direct verwerkt voor RNA23 of DNA-extractie uit matrix (figuur 1B). Het inbedden van de 3D-cultuur in type I collageen in de microwells van de agarose gegoten maakt monitoring en analyse van invasie met behulp van Image J om eerst af tebaken van het totale gebied met behulp van de software freehand draw tool en vervolgens berekenen van de verhouding over de afgebakende sferoïde gebied (Figuur 2A), en / of door het tellen van het aantal "spikes" het verlaten van de sferoïde. Met behulp van twee primaire murine alvleesklierkanker cellijnen (cellijn 1 en cellijn 2), verschillende sferoïde vormen en invasief gedrag werden waargenomen en gekwantificeerd dienovereenkomstig (Figuur 2B). Cellijn 1 toont een meer compacte sferoïde vorming en "stekelige" invasie, vergelijkbaar met eencellige invasie, terwijl cellijn 2 meer losse sferoïden vormt en een collectief invasiepatroon vertoont(figuur 2C). Co-cultuur werd uitgevoerd met twee verschillende tumor kloon cellijnen ingezaaid op hetzelfde moment (Figuur 3A\u2012E) om hun interacties te volgen tijdens de daaropvolgende tests, en met tumorcellen en T-cellen bij tumor sferoïde vorming (Figuur 3F\u2012J). Voor een gedetailleerde beoordeling van het invasieve gedrag werd immunofluorescente kleuring uitgevoerd(figuur 4). Na scheiding van de collageenmatrix van de agarose gegoten, ALS kleuring, en overdracht naar een glazen glijbaan (Figuur 4A\u2012B), confocale beeldvorming werd uitgevoerd in een high-throughput manier (Figuur 4C\u2012J). De grootte en consistentie van de agarose cast maken het mogelijk om het hele 3D-kweeksysteem in paraffine in te bedden voor seriële secties en immunohistochemie (IHC) kleuring voor het kwantificeren van de ruimtelijke relatie tussen tumor en T-cellen(figuur 5). T-cellen aanwezig in de sectie kan worden geïdentificeerd en verder gekenmerkt door celoppervlak marker kleuring hier geïllustreerd voor CD8 (Figuur 5D, E). T-cellen die de tumor sferoïde hebben geïnfiltreerd kan worden geteld ten opzichte van degenen die bleven in de periferie van de sferoïde. Figuur 5D,E toont voorbeelden van duidelijke infiltratie van T-cellen in tumorsferoïden gekweekt uit tumorcellijn 1(D)en cellijn 2 (E). Tabel 1 toont typische experimentele opstellingen voor de tests en de opbrengst van representatieve en analyseerbare monsters aan het einde van het experiment voor elk protocol.

Figure 1
Figuur 1: Workflow, analyses en tijdlijn van experimenten. (A) Een 81-microwell en 35-microwell rubberen mal zijn gevuld met 2% agarose in 1x PBS om een agarose gegoten met meerdere microwells te genereren. De diameter van een rubberen mal is 3,5 cm. De grootte van de 35-microwell agarose gegoten is 13 mm x 8 mm, en van de 81-microwell gegoten is 13 mm x 13 mm. Sferoïden worden gevormd bij celzaaien in de kamers van de agarose gegoten in een enkele pipetting stap. Co-cultuur met T-cellen wordt uitgevoerd binnen dezelfde cast. Functionele monitoring en potentiële testen worden getoond. (B) Tijdlijn van experimenten. Tumorcellen worden samen gekweekt met autologe T-cellen gedurende 2 dagen, waardoor een maximale interactie tussen beide celtypen mogelijk is. De invasie test wordt gestart na twee dagen. Eindpuntanalyses worden uitgevoerd na nog eens twee dagen om het invasieve en overlevingsfenotype van tumorcellen te monitoren, evenals de proliferatie en overleving van T-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kwantificering van invasie. Invasie kan worden gekwantificeerd door beeldanalyse, bijvoorbeeld met behulp van Image J-software en het tellen van het aantal "spikes" per sferoïde. (A) Berekening van het totale invasiegebied als een verhouding tussen het totale areaal en het sferoïde gebied. Schaalbalk: 300 μm. (B) Voorbeelden van twee verschillende primaire murine alvleesklierkanker cellijnen (cellijn 1 en 2) in sferoïde vorming bij verschillende vergrotingen en invasie in collageen type I. (C) De analyse van de invasie wordt uitgevoerd door het aantal pieken per sferoïde te tellen (linkerdiagram; foutbalken: 2,63 voor cellijn 1, 1,47 voor cellijn 2) en het invasiegebied te berekenen zoals beschreven (rechterdiagram; foutbalken: 0,36 voor cellijn 1, 1,28 voor cellijn 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Co-cultuur met kleurstof-gelabelde tumor en T-cellen. (A\u2012E) Mix van twee verschillend kleurstof-gelabelde primaire murine alvleesklierkanker klooncellijnen (groen en rood) en vergroot beeld van een representatieve microwell (B\u2012E). (F\u2012J) Co-cultuur van vooraf gelabelde tumor (groen) en T-cellen (rood). (G\u2012J) Vergroot beeld van een representatieve microwell toont een tumor-T-cel co-cultuur bij tumor sferoïde vorming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Immunofluorescentie kleuring. Immunofluorescentie (IF) kleuring werd uitgevoerd na het scheiden van de collageen matrix van de agarose gegoten. (A\u2012B) Na IF-kleuring worden de collageenvlekken overgebracht naar een glazen schuif en bedekt met glazen covers. (C\u2012F) Voorbeeld van een IF-bevlekte collageenpatch met tumorsferoïden met (C) Hoechst, (D) keratine 8, (E) phalloïdine en (F)overlay. Panelen (G\u2012J) Tonen de respectievelijke vergrote weergave van een enkele sferoïde. Schaalbalk = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Immunohistochemie sectioning. De agarose gegoten met de 3D-cultuur ondergedompeld in hydroxyethyl agarose processing gel, werd ingebed in paraffine, gesectied en verwerkt voor immunohistochemie (IHC) kleuring. (A) Paraffine blok dat wordt gebruikt voor horizontale secties die begint vanaf de onderkant van de agarose gegoten om seriële delen van meerdere tumor cel / T-cel co-culturen te verkrijgen binnen een enkele cast; schaalbalk = 5 mm. (B) Hematoxylin & eosine-gekleurde sectie van een agarose cast met 3D co-cultuur van tumor en T-cellen. Schaalbalk: 1 mm. (C) Vergroot beeld van een H&E-bevlekte co-cultuur binnen de agarose cast. CD8 kleuring van T-cellen co-gekweekt met cellijn 1(D)en cellijn 2(E). Schaalbalken in C\u2012E = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol typische setup ingezaaide cellen (per cast) typische opbrengst
cytotoxiciteitstest 2x 81-microwell gietvorm 81,000 100.000 cellen
IHC-test 1x 81-microwell gegoten 81,000 40 sferoïden
Invasie assay 2x 35-microwell gietvorm 35,000 50 sferoïden
ALS-test 2x 35-microwell gietvorm 35,000 50 sferoïden
Celisolatie van collageen I 2x 35-microwell gietvorm 35,000 50.000 cellen
RNA extractie van collageen I 12x 81-microwell gietvorm 243,000 400-600 ng/μl

Tabel 1: Typische experimentele opstelling en opbrengst voor de protocollen. De tabel toont de typische experimentele opstelling voor elk protocol en de typische opbrengst van analyseerbare monsters (aantal cellen, sferoïden of RNA-concentratie) aan het einde van het experiment, respectievelijk. IHC= immunohistochemie; IF= immunofluorescentie.

Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier gepresenteerde methode beschrijft 3D tumor sferoïde generatie, die co-cultuur met T-cellen, cel-gebaseerde functionele en moleculaire testen, evenals een verscheidenheid aan monitoring en analyse mogelijkheden met behulp van een enkel apparaat. Het grote voordeel van onze aanpak is dat het niet vereist overdracht van de 3D-cultuur naar een aparte test en handhaaft de integriteit van de 3D-cultuur in de hele test.

De hier gepresenteerde workflow kan naar behoefte worden gewijzigd. De incubatietijden voor sferoïde vorming, T-cel co-cultuur of cytotoxiciteit test, kan nodig zijn om te worden gewijzigd voor verschillende experimentele omstandigheden of cellijnen.

Er zijn een paar stappen in de tests, die nauwe naleving van het protocol vereisen. Deze zijn in het algemeen: het verwijderen van de celkweek medium voor het toevoegen van een tweede cel lijn voor co-cultuur, evenals het inbedden van de 3D-cultuur in ECM of hydroxyethyl agarose processing gel binnen de agarose werpt. Het is absoluut cruciaal om het medium van de zaaikamer langzaam en zorgvuldig te verwijderen door de putplaat te kantelen en een hoek van de kamer te targeten met een micropipet. Zolang de agarose afgietselt cellen bevatten, raden we aan om altijd elk medium in de put te verwijderen met een micropipet, in plaats van een pipet. Het toevoegen van een tweede cel lijn en inbedding in ECM of hydroxyethyl agarose processing gel moet langzaam en drop-wise worden uitgevoerd om te voorkomen dat spoelen uit de cellen in de microwells. De meest kritische stap van de collageen invasie test is de incubatietijd voor het omkeren van de afgietsten in de put-plaat met de putten. Het verminderen van de tijd kan ertoe leiden dat het collageen uit te vallen van de cast, en het overschrijden van de tijd kan leiden tot de cultuur te worden gedrukt naar de bodem van de microwells, wat resulteert in ongelijk verdeeld sferoïde invasie. Het omkeren van de cast stelt cellen in de microwells in staat om volledig onder te dompelen in het vloeibare collageen voordat het polymeriseert en stolt. De oppervlaktespanning tussen de agarose gegoten en de plastic bodem van de put-plaat, genereert een "hanging-drop"15,24 tijdens de 3D sferoïde invasie.

Het is belangrijk op te merken dat de incubatietijd voor het omkeren van de afgietsten is vastgesteld voor het inbedden in type I collageen. Bij andere ECM-componenten moet deze stap dienovereenkomstig worden aangepast. Van belang, volledige verwijdering van restmedia mag niet worden geprobeerd om een onbedoeld verlies van cellen aanwezig in de microwells te voorkomen. Dit restmediamiddel resulteert in een lichte verdunning van de toegevoegde ECM. Hiermee moet rekening worden gehouden bij de analyse en aanpassing van andere testsystemen.

De co-cultuur hier beschreven zorgt voor een maximale tumor / T-cel interactie voordat de invasie van tumorcellen wordt onderzocht: Tumor en T-cellen zijn co-gekweekt voor 2 dagen voor het inbedden in type I collageen en vervolgens het identificeren van overlevende en invasieve tumorcellen in de komende twee dagen(Figuur 1B). Van nota, toen de co-cultuur werd geïnitieerd terwijl T-cellen werden opnieuw opgetrokken in collageen I, T-cellen niet aan te tonen een impact op tumorcel invasie en cytotoxiciteit. Dit effect kan te wijten zijn aan de T-cellen worden meer verdeeld in collageen en dus minder geconcentreerd rond de sferoïden. Dit suggereert dat de directe interactie tussen tumor en T-cellen tijdens de twee dagen van co-cultuur voorafgaand aan de invasie test is van cruciaal belang voor de beoordeling van T-cel gemedieerde effecten op de tumorcellen.

Toch hebben enkele van de voordelen van dit 3D-model nadelen. Deze hoge doorvoer instelling maakt het gemakkelijk en snel zaaien van cellen in de agarose gegoten in een pipetting stap, wat resulteert in de generatie van een veelheid van uniform formaat sferoïden binnen een cast. Aangezien de sferoïden zich echter allemaal in dezelfde cast bevinden, kunnen ze ook gemakkelijk worden verwijderd, bijvoorbeeld tijdens het verwijderen van het celkweekmedium in de zaaikamer en tijdens het toevoegen van T-cellen voor co-cultuur. Daarom is de opbrengst voor elk protocol sterk afhankelijk van de technische vaardigheden en ervaring van de onderzoeker, maar ook van het type test dat wordt uitgevoerd. Zoals in tabel 1 wordt gesuggereerd, moet rekening worden gehouden met een mogelijk verlies van sferoïden van ongeveer 50%. Bovendien kunnen cellen tijdens de zaaistap niet gelijkmatig over het gebied van de zaaikamer worden verdeeld, wat resulteert in min of meer representatieve sferoïden binnen de agarose-cast. Vanuit onze ervaring neemt dit effect toe met de grootte van de agarose cast. Daarom moeten replica's worden overwogen tijdens het plannen van het experiment.

De spatiotemporale interactie van cellen binnen het 3D-systeem kan worden beoordeeld aan de hand van time lapse imaging, wat een andere bewakingsoptie in dit model presenteert. Bovendien zijn de kleine diameter van de microwells en de enkele pipettingstap naar zaadcellen geschikt voor het uitvoeren van eencellig klonen. Ten slotte kunnen de monsters van de patiënt (bijvoorbeeld uit biopten) in de test worden geanalyseerd vanwege het kleine aantal cellen dat nodig is voor de microwells en het hoge doorvoerkend kenmerk van het 3D-systeem. Het opnemen van stimulerende of blokkerende geneesmiddelen (bijvoorbeeld anti-PD-1 of anti-PD-L1) om de tumorcel/T-cel interactie te onderzoeken is een logische uitbreiding van de test.

Tot slot biedt het hier gepresenteerde 3D-sferoïde co-cultuurmodel een flexibel kader voor het monitoren van kankercelinvasie en cytotoxiciteit van co-gekweekte T-cellen in een biologisch relevante omgeving. De resulterende crosstalk kan worden gevisualiseerd met behoud van de integriteit van de 3D-cultuur en dus bieden mechanistische inzichten in tumorcel - T-cel interacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Virginie Ory, PhD voor nuttige discussies en advies over de aanpak van de 3D co-cultuur model. We danken Elizabeth Jones ook voor uitstekende technische bijstand bij de IHC-sectie. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) aan YL (LI 2547/4-1) en de National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), naar ATR (R01 CA205632), naar GWP (R01 CA218670) en de Core Grant van het Cancer Center (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

Kankeronderzoek 3D-celcultuur kankercellen co-cultuur collageen cytotoxiciteit invasie immunofluorescentie immunohistochemie t-cellen tumorsferoïde
Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter