Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

النهج المقدم في وقت واحد يقيم غزو الخلايا السرطانية في 3D مقايسات كروية وT-خلية السمية الخلوية. يتم إنشاء Spheroids في جبيرة agarose متعددة microwell خالية من السقالات. يتم تنفيذ ثقافة المشاركة والتضمين في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل نفس الجهاز الذي يسمح بمراقبة غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية بوساطة T-cell.

Abstract

وقد أحرز تقدم كبير في علاج السرطان بالعلاج المناعي، على الرغم من أن عددا كبيرا من أنواع السرطان لا يزال مقاوما للعلاج. وهناك عدد محدود من المقايسات تسمح للرصد المباشر والرؤى الميكانيكية في التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمناعة, من بينها, الخلايا التائية تلعب دورا هاما في تنفيذ استجابة السامة للخلايا من الجهاز المناعي التكيفي للخلايا السرطانية. وتستند معظم المقايسات على ثنائي الأبعاد (2D) ثقافة المشتركة للخلايا بسبب سهولة الاستخدام النسبي ولكن مع تمثيل محدود من النمط الظاهري النمو الغازية، واحدة من السمات المميزة للخلايا السرطانية. تتطلب أنظمة الثقافة المشتركة (ثلاثية الأبعاد) الحالية إما معدات خاصة أو مراقبة منفصلة لغزو الخلايا السرطانية المشتركة في الثقافة والخلايا التائية المتفاعلة.

هنا وصفنا نهجا لرصد السلوك في وقت واحد الغازية في 3D من الخلايا السرطانية spheroids وT-خلية السمية الخلوية في الثقافة المشتركة. يتم دفع تشكيل Spheroid من خلال تفاعلات الخلايا المعززة في يلقي agarose microwell خالية من السقالات مع قيعان على شكل حرف U. يتم تنفيذ كل من الخلايا التائية المشتركة في الثقافة وغزو الخلايا السرطانية في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل microwells من يلقي agarose دون الحاجة إلى نقل الخلايا ، وبالتالي الحفاظ على نظام الثقافة المشتركة 3D سليمة في جميع أنحاء الفحص. يمكن فصل مصفوفة الكولاجين عن يلقي agarose، مما يسمح للflufluorescence (IF) تلطيخ وللتصوير confocal من الخلايا. أيضا، يمكن عزل الخلايا لمزيد من النمو أو تخضع لتحليلات مثل التعبير الجيني أو الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS). وأخيرا، يمكن تحليل 3D المشتركة في الثقافة بواسطة الكيمياء المناعية (IHC) بعد تضمين والقطع. وتشمل التعديلات المحتملة للم مقايسة التراكيب المعدلة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وكذلك إدراج الخلايا القوية أو المناعية المختلفة مع الخلايا السرطانية.

Introduction

على الرغم من التحسينات الكبيرة في العلاج المناعي للسرطان على مدى العقد الماضي، فهمنا الميكانيكي للحساسية ومقاومة العلاجات لا تزال سيئة إلى حد ما1. ومن الثابت أن الأورام عرض عدم التجانس كبيرة, وأن التفاعلات الديناميكية للخلايا الورم مع البيئة الدقيقة وكذلك مع الخلايا المناعية, أثر الورم موت الخلايا, سلوك الغازية والاستجابة للعلاجات التي تشمل العلاج المناعي1,2,3. كذراع واحدة من الجهاز المناعي التكيفي، T-الخلايا تنفيذ السمية الخلوية الخاصة بالخلايا. تحليل التعرف على الخلايا التائية والاستجابة للخلايا السرطانية يوفر رؤى ميكانيكية في المقاومة والحساسية للعلاجات المتغيرة المناعية.

في المختبر النمذجة ورصد التفاعلات بين السرطان والخلايا التائية في بيئة مناسبة كانت صعبة وحتى الآن، أدى إلى رؤى ميكانيكية محدودة. تعتمد معظم المقايسات المستندة إلى الخلية على بيئة ثنائية الأبعاد، أن يفتقر إلى الميزات الرئيسية التي تعتبر حاسمة لتلخيص ثلاثي الأبعاد (3D) في علم وظائف الأعضاء الجسم الحي4,5,6, وهي التفاعلات الخلية المكانية, الاتصال مع مصفوفة خارج الخلية (ECM)7, الطلب الأيضي الديناميكي, زيادة نقص الأكسجة بسبب النمو الشامل8, وآثار الورم microenvironment (TME)9. من ناحية أخرى ، لا يزال هناك عدد من أوجه القصور مع استخدام حاليا ثلاثي الأبعاد (3D) نظم التحليل المشترك والغزو : (1) طبيعة تستغرق وقتا طويلا من الجيل spheroid والحصاد5،10، (2) عدم وجود سيطرة على حجم spheroid ، الشكل وكثافة الخلية11،12، (3) اختبار نوع منخفض الإنتاجية ، (4) متطلبات المعدات الخاصة13،14، (5) الحاجة إلى نقل الثقافة المشتركة إلى بيئات متميزة لمقاسات مختلفة15،16،17. على وجه الخصوص، نقل مقايسة الثقافة المشتركة غالبا ما يؤدي إلى تعطيل spheroids وفقدان النزاهة في الثقافة المشتركة. وهذا ينطبق خصوصا على spheroids "فضفاضة" مع انخفاض خلية الخلية التصاق. على سبيل المثال، تتطلب معظم عمليات فحص الغزو ثلاثي الأبعاد أن يتم حصاد الـ spheroids بعد تكوينها الأولي ثم إعادة الاعتماد عليها في ECM14،15،16. تؤدي خطوة إعادة التدهور هذه إلى فقدان التحكم في المسافة بين الـ spheroids. منذ المسافة بين الورم spheroids يؤثر على سلوكهم الغازية, هذا فقدان السيطرة يدخل التباين بين التشايس عالية ويقلل من إعادة إنتاج. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق مقايسات تجزئة الخلية من قبل خطوات الطرد المركزي المتتالية لتقييم الخلايا المناعية الطرفية والورمية المتسللة تقتصر على مجموعات الخلايا السرطانية التي تولد17spheroids أكثر استقرارا .

المفهوم والنهج

نهجنا يعالج أوجه القصور المذكورة أعلاه باستخدام "الكل في واحد" - 3D spheroid شارك ثقافة النموذج ، الذي لا يتطلب نقل spheroids لمقايسات لاحقة. نحن تكييفها جهاز تشكيل spheroid (انظر جدول المواد)لتوليد مقايسة لرصد في وقت واحد السلوك الغازية للخلايا السرطانية والسمية الخلوية من الخلايا التائية المشتركة في الثقافة. هذه الطريقة سهلة الاستخدام وغير مكلفة وتسمح بالتعامل السريع والسهل في إعداد ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية نسبيًا. تعتمد على نوع الجهاز المستخدم، يمكن إنشاء ما يصل إلى 81 من الـ 81 من الـ 777 1777 كبيرة الحجم بشكل موحد في خطوة واحدة من الأنابيب مع التحكم في حجم الزفير الفردي عن طريق تعديل عدد الخلايا المصنفة. يتم فرض تشكيل Spheroid من خلال تفاعلات الخلايا المعززة في أغروز متعددة الآبار الخالية من السقالات مع قيعان على شكل حرف U. نحن تكييف هذا النظام 3D لديناميكية الخلايا القائمة على الدراسات الوظيفية وكذلك نقطة النهاية الجزيئية والبيوكيميائية المقايسة التي تشمل الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS)، immunofluorescence (IF) أو مناعية الكيمياء (IHC) تلطيخ فضلا عن تحليل التعبير الجيني من سليمة 3D المشتركة الثقافة.

للدراسات وظيفية، والتضمين spheroids في نوع الكولاجين الأول داخل agarose يلقي النتائج في غزو الخلايا السرطانية من spheroids متساوية البعد وتصاريح رصد السمات الأساسية خط الخلية محددة ، مثل خلية واحدة مقابل الهجرة الجماعية خلية18،19. وعلاوة على ذلك، يتم فصل مصفوفة الكولاجين بسهولة من يلقي agarose، مما أدى إلى رقعة سميكة 1\u20122 مم تحتوي على spheroids متعددة، والتي يمكن معالجتها كذلك ل-تلطيخ IF والتصوير عن طريق المجهر confocal. وهذا يمكن أن تكشف عن اختراق الخلية وتفاعلات مصفوفة الخلية في فحص عالي الإنتاجية. أيضا، يمكن عزل الخلايا في مصفوفة الكولاجين بعد هضم الكولاجين وتفكك الخلايا المفردة لزراعة الخلايا أو التحليل اللاحق.

لتحليل IHC من spheroids، بعد التثبيت والقسم من أغاروز يلقي والبروتينات أو غيرها من الجزيئات ذات الاهتمام يمكن الكشف عنها مع الحفاظ على المواقع الجغرافية للpheroids. في النهج الموصوف هنا ، يتم تضمين spheroids مباشرة في هلام معالجة Hydroxyethyl agarose داخل يلقي agarose وهليل بمثابة "غطاء" للاحتفاظ spheroids في الجزء السفلي من microwells. بعد تضمين البارافين من أغاروز يلقي20, يتم تنفيذ المقطع الأفقي التسلسلي مع الجزء السفلي من المدلى بها بمثابة نقطة البداية.

هذا النهج يتناقض مع التشكيلات التقليدية IHC من spheroids التي تتطلب حصاد الخلايا قبل تضمينها في هيدروكسيثيل agarose معالجة هلام21 ، وخطر تعطيل spheroids وبالتالي فقدان الترتيب المكاني للخلايا. أيضا، يتم تجنب تجزئة الخلية عن طريق الطرد المركزي لتقييم ما إذا كانت الخلايا المناعية تسللت أو ظلت هامشية لpheroids الورم17 عن طريق تضمين مباشرة.

وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ 3D المشتركة الثقافة عن طريق دمج الورم، stromal أو الخلايا المناعية، وبالتالي دراسة الخلايا الورم عبر الحديث أو تلخيص مختلف الأورام microenvirments لتحليل التفاعلات الخلية الخلية بما في ذلك الثقافات المشتركة مع الخلايا البطانية16.

يمكن استخدام هذا الإعداد 3D شارك في الثقافة spheroid لتنفيذ ثقافة المشاركة من أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في البيئة الدقيقة الورم وتقييم آثار عناصر ECM المعدلة. بالإضافة إلى نوع الكولاجين الأول، مكونات ECM الأخرى (على سبيل المثال، matrigel، ماتريجل / الكولاجين الخلائط، فيبرومينكتين)، ويمكن استخدامها منذ غزو الخلايا الورم يتأثر وفرة ركائز مختلفة22. أيضا، microwells من الزهر agarose هي مناسبة لتشكيل spheroid من خطوط الخلايا الأولية وللخلايا مع انخفاض خلية الخلية التصاق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يمكن العثور على قائمة وشرح لبعض الكلمات المستخدمة بشكل متكرر في جميع أنحاء البروتوكول في الملف التكميلي 1.

1. جيل من الزى

  1. إعداد وautoclave 2٪ agarose في 1X PBS (على سبيل المثال، 1 ز agarose في 50 مل من 1X PBS) والأوتوكلاف 35- و 81 ميكروويل قوالب المطاط.
    تنبيه: تجنب استخدام agarose منخفض الذوبان لتوليد الكاستين agarose لمعالجة IHC.
  2. إعداد يلقي agarose
    ملاحظة: يتم استخدام 35-microwell يلقي للغزو، immunofluorescence (IF) وميكنزال الخلايا. وتستخدم 81-microwell يلقي للسمية الخلوية, الكيمياء المناعية (IHC), عزل الخلايا وMISICS استخراج الحمض النووي الريبي.
    1. بعد agarose وقد تم autoclaved، والسماح المصهور agarose بارد إلى حوالي 60\u201270 درجة مئوية. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، واستخدام تقنية معقمة والماصات 500 ميكرول من agarose المنصهر في قالب المطاط 81 ميكروويل في بئر أو 330 ميكرول في 35 ميكروويل العفن المطاط في بئر.
      تنبيه: تجنب إنشاء فقاعات أثناء خلط أو اغروز. إزالة أي فقاعات عن طريق الأنابيب بلطف.
    2. بعد أن يتم ترسيخ agarose، فليكس بعناية العفن المطاط لإزالة يلقي agarose منه. هنا، ضع اليدين فوق لوحة جيدة مناسبة والسماح للإغاروز المدلى بها تسقط الحق في بئر واحدة من لوحة جيدا.
      ملاحظة: فليكس قالب المطاط في مواقف مختلفة من أجل تجنب أكثر من ثني. قد يكون من المفيد ثني قالب المطاط ودفع بلطف من أسفل في نفس الوقت.
    3. لتكفّل يلقي agarose، إضافة خلية ثقافة المتوسطة، ويتألف من DMEM تكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (2.5 مل / جيدا ل12-جيدا لوحة و 1 مل / جيدا ل24-جيدا لوحة). وضع لوحة جيدا في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) واحتضان لمدة 1 ساعة.
  3. وفي الوقت نفسه، إعداد ثقافة الخلية للبذاءة.
    ملاحظة: مجموع عدد البذر الخلية لكل يلقي agarose هو أن تقرر من قبل المحقق. بالنسبة لخطوط خلايا سرطان البنكرياس الأولية، يتم زرع 35,000 خلية/35-ميكروويل مبوب و81,000 خلية/81-ميكروويل (في المتوسط 1000 خلية/spheroids) لجميع الأقوال التالية. يبلغ متوسط قطر الزفير حوالي 150\u2012200 ميكرومتر بعد 48 ساعة.
  4. إزالة خلية ثقافة المتوسطة المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة جيدا. ثم إزالة بعناية المتوسطة في غرفة البذر.
  5. بذور بعناية تعليق خلية الورم المعدة قطرة الحكمة في غرفة البذر الخلية. بعناية وضع لوحة جيدا مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: خلال هذه الخطوة سوف تستقر الخلايا في microwells من الزهر agarose.
  6. إضافة متوسطة إضافية إلى خارج يلقي agarose (2.5 مل / جيدا ل12-جيدا لوحة و 1 مل / جيدا ل24-جيدا لوحة).
  7. وضع لوحة جيدا مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: عادة ما يستغرق الأمر بضع ساعات للخلايا لتشكيل spheroids في microwells. بشكل عام، يتم تشكيل الخلايا السرطانية الصلبة spheroids بعد 24 ساعة ومستقرة بعد 48 ساعة. ومع ذلك، يمكن أن يختلف هذا بين خطوط الخلايا المختلفة. إذا لزم الأمر، قم بتغيير خلية الثقافة المتوسطة عن طريق إمالة بعناية لوحة جيدا مع يلقي agarose وإزالة المتوسطة المحيطة خلية ثقافة مع ماصة P1000. ثم تضاف بعناية المتوسطة الطازجة عن طريق pipetting على طول جدار البئر. عادة ليس من الضروري تغيير الوسائط داخل يلقي بسبب حجم صغير وخطر إزالة spheroids.

2. شارك في الثقافة مع الخلايا التائية

  1. Resuspend العدد المطلوب من الخلايا التائية في 75 ميكرول (35 ميكروويل المدلى بها) أو في 190 ميكرول (81-ميكروويل المدلى بها) من المناسبة تي خلية المتوسطة (RPMI تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين و 100 وحدة / مل بينسيلين / ستريبتوميسين).
  2. إزالة متوسط ثقافة الخلية المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة جيدا. ثم ببطء وبعناية إزالة المتوسطة داخل المدلى بها عن طريق استهداف بلطف زاوية واحدة من غرفة البذر مع ماصة P200 مع الحفاظ على لوحة جيدا مائلة مع اليد الأخرى.
  3. (الخطوة الحرجة 1) كما أن هناك خطرا من إزالة spheroids، والسيطرة على فقدان spheroids عن طريق مقارنة عدد من spheroids داخل microwells قبل وبعد إزالة المتوسطة عن طريق عرض تحت المجهر في التكبير 10x.
  4. بذور بعناية تعليق T-الخلية إسقاط الحكمة في غرفة البذر من يلقي agarose من خلال عقد ماصة P200 حوالي 0.5 سم فوق المدلى بها.
  5. (الخطوة الحرجة 2) هناك خطر من طرد من spheroids أثناء إضافة الخلايا التائية. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لإضافة الخلايا التائية ببطء شديد وحوالي 0.5 سم فوق غرفة البذر.
    ملاحظة: احتمال واحد لتقليل عدد من spheroids مسح من قبل مشيرا إلى ماصة إلى زاوية واحدة من غرفة البذر في حين إضافة T-الخلايا، وبالتالي المخاطرة فقط spheroids في هذه الزاوية إلى أن يتم مسح بها.
  6. بعناية وضع لوحة جيدا مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لمدة 15 دقيقة.
  7. اتخاذ لوحة جيدا من الحاضنة وإضافة ثقافة الخلايا الطازجة المتوسطة (RPMI تستكمل مع مصل الأبقار الجنين 10٪ و 100 وحدة / مل البنسلين / ستربتوميسين) حول أغاروز يلقي عن طريق الأنابيب ببطء على طول جدار البئر.
  8. ضع الصحن جيداً مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.

3. تضمين ثقافة 3D المشتركة في نوع مصفوفة الكولاجين الأول

  1. إعداد تحييد نوع الكولاجين الأول
    1. تخفيف الكولاجين المخزون مع مصل حر قاعدة المتوسطة (RPMI) إلى تركيز العمل النهائي من 3 ملغ / مل. لكل 100 ميكرولتر من الكولاجين المخفف، أضف 11 ميكرولتر من 10 مرات PBS و 1.2 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    2. الحفاظ على الجليد واحتضان (تحييد) لمدة 1 ساعة.
  2. إزالة متوسط ثقافة الخلية المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة جيدا. ثم، ببطء وبعناية إزالة المتوسطة داخل المدلى بها عن طريق استهداف بلطف زاوية واحدة من غرفة البذر مع ماصة P200 مع الحفاظ على لوحة جيدا مائلة مع اليد الأخرى.
    ملاحظة: هنا، من الضروري إزالة تماماً ثقافة الخلية المتوسطة المحيطة cast agarose.
  3. ماصة بعناية الكولاجين تحييد أنا مزيج قطرة الحكمة في غرفة البذر من يلقي agarose من خلال عقد ماصة P200 حوالي 0.5 سم فوق المدلى بها.
  4. وضع لوحة جيدا على الفور في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 4 دقائق (35-ميكروويل المدلى بها) أو 5 دقائق (81-ميكروويل المدلى بها).
    تنبيه: (الخطوة الحرجة 3) من الأهمية بمكان أن تحافظ بدقة على وقت الحضانة المحدد. وإلا، قد لا يكون السلوك الغازي قابلًا للتكرار.
  5. عكس لوحة البئر وتركها انقلبت في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: سيبقى الملاحظات ملتصقة بالجزء السفلي من اللوحة المُزَدَّة بسبب التوتر السطحي. في حالة استخدام متوسطة خاصة لثقافة الخلية مع تركيز مصل مرتفع (على سبيل المثال، RPMI تكملها مع مصل الأبقار الجنينية 20٪) ، قد تكون خطوة إضافية غسل مع 1x PBS بعد إزالة الوسط في البئر ضرورية لزيادة التوتر السطحي.
  6. أخرج اللوح الجيد من الحاضنة وعكسه مرة أخرى. إضافة خلية جديدة ثقافة المتوسطة (RPMI تكملها مع 10٪ مصل الأبقار الجنين و 100 وحدة / مل البنسلين / ستربتوميسين) حول agarose يلقي عن طريق الأنابيب ببطء على طول جدار البئر.
  7. وضع لوحة جيدا مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.

4. فحص السمية الخلوية

  1. إعداد 3 مل من 1X PBS مع 2٪ مصل الأبقار الجنين لكل يلقي agarose.
  2. بعد المشاركة في الثقافة لمدة 4 د، وإزالة متوسطة ثقافة الخلية المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 عن طريق إمالة قليلا لوحة جيدا مع اليد الأخرى.
    ملاحظة: يجب أن يقرر المحقق الفترة الزمنية الإجمالية للثقافة المشتركة.
  3. توزيع 1 مل من 1X PBS + 2٪ FBS مع ماصة P1000 في غرفة البذر لطرد الزفيرويدات من microwells.
  4. كرر الخطوة 4.3 مرتين مع وحدة التخزين في البئر ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
  5. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 10 ق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. إزالة بعناية فائقة مع ماصة P1000.
  7. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من 1x PBS مع 2٪ FBS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 1 دقيقة في RT.
  8. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 4.7).
  9. إزالة supernatant وإضافة 1 مل من الخلايا إنزيمات تفكك الحل (انظر جدول المواد).
  10. استخدام P200 ماصة وماصة صعودا وهبوطا لكسر مجموعات الخلايا.
  11. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  12. كرر الخطوة 4.10.
    ملاحظة: خذ ~ 10 ميكرولتر والبذور على طبق ثقافة الخلية لمراقبة (تحت المجهر في التكبير 10x) جيدا كيف تم فصل spheroids في خلايا واحدة. إذا لزم الأمر، أضف 5 دقائق من مزيد من الحضانة.
  13. إضافة 4 مل من خلية كاملة ثقافة المتوسطة (RPMI تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين و 100 وحدات / مل البنسلين / ستربتوميسين) ومزيج عن طريق عكس أنبوب 3\u20124 مرات.
  14. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 4 دقائق في RT.
  15. إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في FACS العازلة لتراكب الملحق الخامس من الخلايا المبرمج.
    ملاحظة: من هنا على أي بقع FACS ويمكن إجراء تحليل الخلية.

5. Hydroxyethyl agarose معالجة هلام تضمين لالقطع IHC

ملاحظة: هنا من المهم تجنب استخدام agarose منخفض الذوبان لتوليد يلقي agarose.

  1. في نهاية الثقافة المشتركة، وإزالة متوسطة ثقافة الخلية المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة جيدا. ثم ببطء وبعناية إزالة المتوسطة داخل المدلى بها عن طريق استهداف بلطف زاوية واحدة من غرفة البذر مع ماصة P200 مع الحفاظ على لوحة جيدا مائلة مع اليد الأخرى.
  2. ببطء ماص 10٪ formalin الأولى في غرفة البذر عن طريق استهداف بلطف زاوية واحدة من غرفة البذر مع ماص P200. ثم إضافة 10٪ formalin إلى خارج أغاروز المدلى بها حتى يتم تغطيتها تماما. إصلاح أغاروز المدلى بها في 10٪ formalin ل1 د.
  3. إزالة formalin في اليوم التالي.
  4. دقيق ماصة 210 ميكرول (81-ميكروويل المدلى بها) أو 100 ميكرول (35-ميكروويل المدلى بها) من قبل الدافئة والمسال hydroxyethyl أجروز معالجة هلام (انظر جدول المواد)قطرة الحكمة في غرفة البذر من أغاروز المدلى بها من خلال عقد ماصة P200 حوالي 0.5 سم فوق المدلى بها.
  5. السماح للهيدروكسيل agarose معالجة هلام ترسيخ لمدة 10 دقيقة في RT.
  6. نقل أغاروز المدلى بها إلى 1X PBS.
    ملاحظة: للتخزين لفترة أطول، قم بتضمين المدلى بها في 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث.
  7. يجفف أقسام الجل من خلال سلسلة الإيثانول (1 ح لكل من: 70٪ الإيثانول، 80٪ الإيثانول، 95٪ الإيثانول، 100٪ الإيثانول [3x التغييرات لكل من).). ثم واضحة في محلول المقاصة 3x ل 1 ساعة لكل منهما (على سبيل المثال، الهيدروكربونات الليفاتية [مثل، Clearite)، أو الزيلينات)، والتسلل مع البارافين المنصهر (3x مقابل 1 ساعة لكل منهما)، إما يدويا أو في معالجة الأنسجة. تضمين المدلى بها في الشمع البارافين لالقطع اللاحقة في 5 ميكرومتر لكل قسم.
  8. إزالة الشمع عن طريق وضع الشرائح في إكسيلين، 3x لمدة 3 دقائق لكل منهما، ثم إعادة هيدرات أقسام الأنسجة من خلال سلسلة الكحول متدرج: 100٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، 80٪ الإيثانول لمدة 30 ث و 70٪ الإيثانول لمدة 30 ث، ثم وضع في الماء.
  9. تنفيذ الحرارة الناجمة عن استرجاع epitope في باخرة نباتية في 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، تليها 20 دقيقة من التبريد في 10 mM الصوديوم citrate 6.0 حل وpoxidases كتلة الذاتية مع H2O2.
  10. منع المقاطع مع مصل الهدف العادي وتعريضهم للأجسام المضادة CD8 المضادة (تخفيف 1/25) بين عشية وضحاها.
  11. تطبيق المضادة للأرانب-HRP مترافق الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد)وتطوير تلطيخ باستخدام 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) chromagen. نوى Counterstain مع 11٪ هاريس حل الهماوكسيلين (انظر جدول المواد).

6. رصد وتحليل غزو spheroid في ثقافة المشاركة

ملاحظة: نقطة الزمن من التصوير غزو كروي في الكولاجين الأول مصفوفة هو أن تقرر من قبل المحقق. احصل على صور لثقافة الخلية باستخدام مجهر مقلوب مع تكبير 10x. تعتمد نقطة الوقت المثالية على خط الخلية الذي يتم اختباره، وكذلك مكون ECM. وسوف تبدأ خطوط الخلايا الغازية أكثر في الانتشار في الكولاجين في غضون ساعات قليلة بعد إضافة الكولاجين. منذ الخلايا التائية في الثقافة المشتركة قد تمنع رؤية كاملة على الخروج من spheroids في وقت مبكر جدا من النقاط، عموما يتم التقاط الصور في 0 ح (كمرجع)، 24 ح و 48 ساعة بعد إضافة الكولاجين.

  1. التهزّم من خلال عدّ عدد "المسامير" التي تخرج من الزفير و/أو باستخدام برنامج تحليل الصور، على سبيل المثال، صورة J.
    1. تحليل الغزو كـ عدد "المسامير" من الـ spheroid بواسطة حساب عدد "المسامير" لـ spheroid يدوياً.
      ملاحظة: هو أن يكون قررت من قبل المحقق الذي نتوءات من spheroids تعتبر "المسامير". يمكن أن يكون معيار القرار هو طول "الارتفاع" الذي يتم قياسه من حافة الـ spheroid.
    2. تحليل الغزو كمنطقة الغزو نسبة إلى حجم الزفير.
      1. استخدام أداة رسم حر (صورة J) لتتبع الحدود من المنطقة الإجمالية (غزو + منطقة spheroid).
      2. انقر على تحليل في القائمة العلوية، ثم انقر على قياس لعرض قياس المنطقة.
      3. تتبع حدود منطقة الزفيرة الإجمالية.
      4. انقر على تحليل في القائمة العلوية، ثم انقر على قياس لعرض قياس المنطقة.
      5. نسخ قائمة النتائج المقاسة في جدول بيانات وحساب إجمالي الغزو/ spheroid باستخدام الصيغة: الغزو الإجمالي = المساحة الإجمالية/منطقة spheroid.

7. تلطّخ الفلوروس المناعي

  1. إعداد ما يلي.
    1. إعداد 5.4% formalin (5 مل) باستخدام 2.3 مل من 1X PBS و 2.7 مل من 10% formalin.
    2. إعداد 0.5٪ أوكوكسيينول (50 مل) باستخدام 50 مل من 1X PBS و 2.5 مل من 10٪ أوكوكسيينول (مخزن في RT).
    3. إعداد IF العازلة (200 مل) باستخدام 200 مل من 1X PBS, 200 ملغ البوم الأبقار المصل (BSA), 4 مل من 10% Octoxynol, 1 مل من 10% بوليسوربات 20 (الاحماء لRT قبل الاستخدام; تصفية وتخزين في 4 درجات مئوية).
    4. إعداد حل حظر (5 مل) باستخدام 5 مل IF العازلة و 500 ميكرولتر من مصل الماعز (الاحماء لRT قبل الاستخدام).
    5. حافظ على شرائح الغرفة 8-well، وأغطية الزجاج، والوسائط المتصاعدة جاهزة.
  2. اليوم 0
    1. إصلاح يلقي agarose كله، بما في ذلك spheroids، بين عشية وضحاها في 5.4٪ formalin في RT في غرفة مرطبة.
  3. اليوم 1
    1. إزالة متوسط ثقافة الخلية المحيطة يلقي agarose مع ماصة P1000 عن طريق إمالة لوحة جيدا.
    2. نقل رقعة الكولاجين في شريحة غرفة 8-جيدا من خلال استيعاب زاوية من مصفوفة الكولاجين داخل غرفة البذر من يلقي agarose مع ملقط تلميح مدببة أنيق وقشر قبالة أغاروز المدلى بها في حركة واحدة، واثق.
      ملاحظة: يجب فصل رقعة الكولاجين بسهولة عن الزهرة agarose. خلاف ذلك، استخدم ماصة P1000 لإضافة بعناية المتوسطة الثقافة في منطقة غرفة البذر أو عكس يلقي agarose وتهز بلطف لوحة جيدا لإزاحة مصفوفة الكولاجين.
    3. أضف 250 ميكرولتر من 0.5% أوكوكسينول (انظر جدول المواد)في البئر. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
    4. التعرق أوكوكسي نول وإضافة 250 μL من حظر حل في البئر. كتلة لمدة 1 ساعة في RT.
    5. وفي الوقت نفسه، تمييع الأجسام المضادة الأولية (تخفيف لمضادات الكيراتين 8: 1/500. Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) في حل الحجب، وحساب ل 250 ميكرولتر في البئر.
    6. أضف الجسم المضاد الأساسي في محلول الحجب ووضع شريحة الغرفة في غرفة مرطبة للاحتضان الليلي في RT.
  4. اليوم الثاني
    1. إزالة الأجسام المضادة الأساسية في حظر الحل عن طريق التعرق.
    2. اغسل 3 مرات عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من IF Buffer واتركه لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة : فقط السماح لها الجلوس ، ليست هناك حاجة لوضعها على شاكر.
    3. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب (للكيراتين المضاد 8: مضاد للجرذ، تمييع 1/500).
    4. إضافة 250 μL من الأجسام المضادة الثانوية في حل منع لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة في RT. من الآن فصاعداً، احمي العينات من الضوء.
    5. إزالة الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر عن طريق التعرق.
    6. اغسل 3 مرات مع 300 ميكرولتر من IF Buffer عن طريق إضافة والسماح لها بالجلوس لمدة 5 دقائق في RT.
    7. شطف العينات مع 1X برنامج تلفزيوني وpirate it.
    8. إزالة بعناية جدران الشريحة الغرفة بحيث يبقى فقط الشريحة الزجاجية في الجزء السفلي.
    9. أضف ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من وسائط التركيب إلى غطاء زجاجي وأسقط الغطاء ببطء فوق العينة.
      ملاحظة: تجنب إنشاء فقاعات لأن هذا سيؤثر على جودة الصورة. يمكن منع الفقاعات عن طريق وضع زلة الغطاء بلطف على الحافة الطويلة للشريحة بزاوية 45 درجة أو خفض زلة الغطاء ببطء على الشريحة.
    10. وضع العينات التي شنت في مكان مظلم وجاف والسماح لها الجلوس بين عشية وضحاها. يمكن إجراء التصوير في اليوم التالي.
      ملاحظة: قد يتحول الغطاء في البداية قليلا مرة واحدة وضعت على التصحيح الكولاجين. دع الشريحة الزجاجية تجلس على منطقة زوجية لبضع دقائق. سوف تتسطح الغطاء خارج العينة بحيث لن يكون هناك فجوة اليسار بين الشريحة الزجاجية و coverlip مع مرور الوقت.

8. عزل الخلايا من مصفوفة الكولاجين

  1. إعداد ما يلي.
    1. إعداد 1 ملغم / مل collagenase 4 في مصل تحتوي على خلية ثقافة المتوسطة (مخزن ali ونقلت collagenase 4 المخففات في -20 درجة مئوية)
    2. إعداد 2.5٪ BSA في 1X برنامج تلفزيوني ومعطف جميع الأنابيب ونصائح ماصة معها (مرشح BSA الحل قبل الاستخدام).
    3. Prewarm حل BSA و الخلية ثقافة المتوسطة قبل الاستخدام.
  2. إعداد 2 مل من الكولاجيناز 4 محلول (1 ملغ / مل) لهضم كحد أقصى من ثلاث مصفوفات الكولاجين من 35 ميكروويل أغاروز يلقي.
  3. نقل ما يصل إلى ثلاث مصفوفات الكولاجين 75 ميكرول من 35 ميكروويل agarose يلقي في 2.5٪ BSA قبل المغلفة 15 مل أنبوب. فهم زاوية من مصفوفة الكولاجين داخل غرفة البذر من يلقي agarose مع ملقط تلميح مدبب أنيق وقشر قبالة يلقي agarose في حركة واحدة، واثق.
  4. قطع شطبة غيض من P1000 مع مقص. قبل معطف الطرف المتبقي مع 2.5٪ BSA وكسر مصفوفة الكولاجين قدر الإمكان عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. (الخطوة الحرجة 4) في كل 5 دقائق، تحقق ما إذا كانت مصفوفة الكولاجين قد حلت أم لا. الماصات صعودا وهبوطا مرة أخرى قبل اتخاذ 10 ميكرولتر من عينة من أصل والبذور على طبق ثقافة الخلية لمراقبة تحت المجهر في التكبير 10x. إضافة آخر 5 دقائق إذا لزم الأمر.
  6. ملء أنبوب مع 10 مل من خلية ما قبل الدفء ثقافة المتوسطة (DMEM تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين). مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب 3\u20124 مرات.
  7. الطرد المركزي الأنبوب في 400 × ز لمدة 4 دقائق في RT.
  8. إزالة بعناية فائقة وترك 2 مل من حجم.
  9. (الخطوة الهامة 5) اترك 2 مل بعد الخطوة الأولى للطرد المركزي حيث قد يكون هناك كولاجين غير مُحل في الجزء السفلي من الأنبوب يحمل خلايا على طولها.
  10. قم بإجراء خطوتين للغسيل عن طريق إضافة 10 مل من استزراع الخلايا التي تحتوي على المصل في كل مرة. جهاز طرد مركزي في كل مرة في 400 × ز لمدة 4 دقائق في RT.
  11. بعد آخر خطوة الغسيل، وإزالة متوسطة قدر ممكن وترك فقط بيليه الخلية.
  12. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من حل إنزيمات تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
  13. استخدام P200 ماصة وماصة صعودا وهبوطا لكسر مجموعات الخلايا.
  14. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  15. كرر الخطوة 8.13.
    ملاحظة: خذ ~ 10 ميكرولتر والبذور على طبق ثقافة الخلية لمراقبة تحت المجهر في التكبير 10x لعرض مدى انفصال spheroids في خلايا واحدة. إذا لزم الأمر، أضف 5 دقائق من مزيد من الحضانة.
  16. إضافة 4 مل من خلية ثقافة المتوسطة (DMEM تكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين) ومزيج عن طريق عكس أنبوب 3\u20124 مرات.
  17. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 4 دقائق في RT.
  18. إزالة المناط. من هنا فصاعدا، يمكن تنفيذ FACS تلطيخ أو ثقافة الخلية.

9. RNA استخراج من مصفوفة الكولاجين

  1. إعداد ثيوسيانات guanidinium مع الفينول (انظر جدول المواد)،100٪ الكلوروفورم، 70٪ RNase خالية من الإيثانول، RNA استخراج عدة (انظر جدول المواد)،RNase خالية 1.5 أنابيب مل، RNase خالية 15 mL أنابيب وRNase خالية ddH2O.
  2. نقل ما يصل إلى اثني عشر 190 ميكرول مصفوفات الكولاجين من 81 ميكروويل agarose يلقي في أنبوب 15 مل. فهم زاوية من مصفوفة الكولاجين داخل غرفة البذر من يلقي agarose مع ملقط تلميح مدبب أنيق وقشر قبالة يلقي agarose في حركة واحدة، واثق.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مصفوفات المجمدة في -80 درجة مئوية حتى جاهزة لاستخراج RNA.
  3. إضافة 1 مل guanidinium thiocyanate مع الفينول (انظر جدول المواد)إلى مصفوفات الكولاجين في أنبوب 15 مل.
    ملاحظة: يجب أن تغطي الـ guanidinium thiocyanate مع الفينول مصفوفات الكولاجين بالكامل.
  4. دوامة الأنابيب ل10\u201220 s.
  5. التجانس المصفوفات مع 20 G الإبر والمحاقن 5 مل حتى يتم حلها تماما.
  6. دع المصفوفات تجلس لمدة 5 دقائق في RT.
  7. إضافة 200 μL من الكلوروفورم النقي إلى المصفوفات ويهز الأنبوب بقوة لمدة 15 s.
  8. نقل على الفور المزيج إلى 1.5 مل أنابيب.
  9. دع المزيج يجلس لمدة 5 دقائق على الأقل في RT حتى يتم فصل المراحل.
  10. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 1.5 مل في 12،000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  11. تعبئة أنبوب جديد 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول.
    ملاحظة: تعتمد على حجم المرحلة مائي بعد الطرد المركزي (راجع الخطوة 9.12. قد لا يكون هذا 500 μL. وينبغي أن تكون كمية الإيثانول 70٪ مساوية لحجم المرحلة مائي.
  12. نقل بعناية المرحلة مائي العلوي من عينات الطرد المركزي إلى أنبوب مملوء بالإيثانول 70٪ ومزيج تماما عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
  13. (الخطوة الحرجة 6) يجب الحرص على عدم إزعاج الطبقات في الجزء السفلي من thiocyanate guanidinium مع فصل الفينول مع إزالة المرحلة العليا، لأن هذا سوف تلوث الجيش الملكي النيبالي.
  14. إضافة عينة إلى عمود استخراج RNA (المدرجة في عدة استخراج الحمض النووي الريبي، انظر جدول المواد). من الآن فصاعدا، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتنقية الحمض النووي الريبي من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح نموذج الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد بالأرقام المختلفة الموضحة في الشكل 1A، والتي يمكن دمجها أو تعديلها حسب الحاجة. في الإعداد التجريبية المنشأة لدينا، الورم والخلايا التائية هي شارك في الثقافة لمدة 2 أيام تليها بدء اختبار الغزو لاختيار الخلايا السرطانية الغازية و / أو مقاومة (الشكل 1B). في اليوم 4 يتم تنفيذ كمية الغزو ويتم عزل الخلايا "الناجية" من مصفوفة الكولاجين أو معالجتها مباشرة لرنا23 أو استخراج الحمض النووي من مصفوفة (الشكل 1B). تضمين ثقافة 3D في نوع الكولاجين الأول داخل microwells من أغاروز يلقي يسمح رصد وتحليل الغزو باستخدام الصورة J لأول مرة لتحديد المنطقة الكلية باستخدام أداة السحب اليدوي البرمجيات ومن ثم حساب نسبة على منطقة الزفيرة ترسيمها(الشكل 2A)، و / أو عن طريق عد عدد من "المسامير" ترك spheroid. باستخدام اثنين من خطوط سرطان البنكرياس الأساسية (خط الخلية 1 وخط الخلية 2)، لوحظ مختلف الأشكال الكروية والسلوك الغازي وكميا وفقا لذلك (الشكل 2B). خلية خط 1 يظهر تشكيل أكثر إحكاما وغزو "شائك" ، وقابلة للمقارنة لغزو خلية واحدة ، في حين أن خط الخلية 2 أشكال spheroids أكثر فضفاضة ويظهر نمط الغزو الجماعي(الشكل 2C). تم تنفيذ ثقافة المشاركة مع اثنين من مختلف خطوط الخلايا النيجرية الورم بذر في نفس الوقت (الشكل 3A\u2012E) لمتابعة تفاعلاتها أثناء عمليات الفحص اللاحقة ، ومع الخلايا السرطانية والخلايا التائية عند تكوين الورم (الشكل 3F\u2012J). للحصول على تقييم مفصل للسلوك الغازي ، تم تنفيذ تلطيخ الفلوروست المناعية (الشكل 4). بعد فصل مصفوفة الكولاجين من يلقي agarose، إذا تلطيخ، ونقلها إلى شريحة زجاجية (الشكل 4A\u2012B)، تم تنفيذ التصوير confocal بطريقة عالية الإنتاجية (الشكل 4C\u2012J). حجم واتساق من أغاروز المدلى بها تسمح تضمين كامل 3D نظام الثقافة في البارافين للقطع التسلسلي ومناعة الكيمياء (IHC) تلطيخ لتحديد العلاقة المكانية بين الورم والخلايا التائية (الشكل 5). يمكن تحديد الخلايا التائية الموجودة في القسم وتتميز كذلك بعلامة سطح الخلية تلطيخ مثال هنا لD8 (الشكل 5D, E). الخلايا التائية التي تسللت إلى الورم يمكن أن تحسب نسبة إلى تلك التي بقيت في محيط الزفير. الشكل 5D، E يبين أمثلة على تسلل متميزة من الخلايا التائية في spheroids الورم نمت من خط الخلايا الورم 1 (D)وخط الخلية 2 (E). ويبين الجدول 1 الاجهزة التجريبية النموذجية للم مقايسات، وغلة عينات تمثيلية وقابلة للتحليل في نهاية التجربة لكل بروتوكول.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل والتحليلات والجدول الزمني للتجارب. (أ)81-microwell و 35-ميكروويل العفن المطاط شغلها مع agarose 2٪ في 1X PBS لتوليد أغاروز المدلى بها مع microwells متعددة. قطر قالب مطاطي هو 3.5 سم. حجم يلقي agarose 35 ميكروويل هو 13 مم × 8 ملم، ويلقي من 81-ميكروويل هو 13 مم × 13 ملم. يتم تشكيل Spheroids على بذر الخلية في غرف أغاروز المدلى بها في خطوة واحدة الأنابيب. يتم تنفيذ ثقافة المشاركة مع الخلايا التائية داخل المدلى بها نفسه. يتم عرض الرصد الوظيفي والإمكانات المقايسة. (ب) الجدول الزمني للتجارب. الخلايا السرطانية هي المشتركة مع الخلايا التائية الذاتية لمدة 2 أيام مما يسمح لأقصى قدر من التفاعل بين كلا النوعين الخلية. يتم بدء عملية فحص الغزو بعد يومين. يتم إجراء تحليلات نقطة النهاية بعد يومين إثنين لرصد النمط الظاهري للخلايا السرطانية الغازية والبقاء على قيد الحياة بالإضافة إلى انتشار الخلايا التائية وبقائها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: القياس الكمي للغزو. يمكن قياس الغزو من خلال تحليل الصور ، على سبيل المثال ، باستخدام برنامج Image J وحساب عدد "المسامير" لكل spheroid. (أ)حساب إجمالي مساحة الغزو كنسبة من المساحة الإجمالية إلى منطقة الزفير. شريط مقياس: 300 μm. (ب) أمثلة من اثنين من مختلف الابتدائي خطوط سرطان البنكرياس مرين (خلية خط 1 و 2) في تشكيل spheroid في التكبير مختلفة وغزو في نوع الكولاجين الأول. (C)يتم إجراء تحليل الغزو عن طريق حساب عدد المسامير لكل سفئي (مخطط أيسر؛ قضبان الخطأ: 2.63 لخط الخلية 1، 1.47 لخط الخلية 2) وحساب منطقة الغزو كما هو موضح (الرسم البياني الأيمن؛ قضبان الخطأ: 0.36 لخط الخلية 1، 1.28 لخط الخلية 2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ثقافة المشاركة مع الورم المسمى بالصبغ والخلايا التائية. (A\u2012E) مزيج من اثنين من صبغة مختلفة المسمى الابتدائي مورين سرطان البنكرياس خطوط الخلايا التخفي (الأخضر والأحمر) ومكبر عرض من ميكروويل ممثل واحد (B\u2012E). (F\u2012J) شارك في ثقافة الورم المسمى مسبقا (الأخضر) والخلايا التائية (الأحمر). (G\u2012J) عرض مكبرة من ميكروويل ممثل واحد يظهر واحد الورم-T-خلية شارك في الثقافة على تكوين الورم spheroid. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تلطيخ الفلوروس المناعي. تم تنفيذ تلوين الفلور المناعي (IF) بعد فصل مصفوفة الكولاجين عن يلقي agarose. (A\u2012B) بعد تلطيخ IF ، يتم نقل بقع الكولاجين إلى شريحة زجاجية ومغطاة بأغطية زجاجية. (C\u2012F) مثال على تصحيح الكولاجين IF- الملون بما في ذلك spheroids الورم مع (C) Hoechst , (D) الكيراتين 8 , (E) phalloidin و (F) تراكب. لوحات (G\u2012J) إظهار عرض مكبرة من كل من واحد spheroid. شريط مقياس = 300 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قسم الكيمياء المناعية. أغاروز المدلى بها مع ثقافة 3D مغمورة في هلام معالجة الهيدروكسيل agarose، كانت جزءا لا يتجزأ في البارافين، مقطعة ومعالجتها لتلطيخ المناعة (IHC). (أ) كتلة البارافين المستخدمة للقطع الأفقي الذي يبدأ من الجزء السفلي من يلقي agarose للحصول على المقاطع التسلسلية من الخلايا الورمية متعددة / T-الخلية الثقافات المشتركة داخل يلقي واحد؛ شريط مقياس = 5 مم (ب) هيماوكسيلين واليوسين الملطخة مقطع من أغاروز يلقي تحتوي على 3D ثقافة المشاركة من ورم والخلايا التائية. شريط مقياس: 1 مم (C) عرض مكبرة من H & E-الملطخة المشتركة الثقافة داخل يلقي agarose. CD8 تلطيخ الخلايا التائية المشتركة مع خلية خط 1 (D) وخط الخلية 2 (E). أشرطة مقياس في C\u2012E = 200 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول الإعداد النموذجي الخلايا المصنفة (لكل يلقي) العائد النموذجي
فحص السمية الخلوية 2x 81-microwell يلقي 81,000 100,000 خلية
IHC فحص 1x 81-ميكروويل المدلى بها 81,000 40 من الـ 40 من الـ 40
فحص الغزو 2x 35-microwell يلقي 35,000 50 كروية
IF مقايسة 2x 35-microwell يلقي 35,000 50 كروية
عزل الخلايا عن الكولاجين الأول 2x 35-microwell يلقي 35,000 50,000 خلية
RNA استخراج من الكولاجين الأول 12x 81-microwell يلقي 243,000 400-600 نانوغرام/ميكرولتر

الجدول 1: الإعداد التجريبي النموذجي وغلة البروتوكولات. ويبين الجدول الإعداد التجريبي النموذجي لكل بروتوكول والعائد النموذجي للعينات القابلة للتحليل (عدد الخلايا أو الزفوئيدات أو تركيز الحمض النووي الريبي) في نهاية التجربة، على التوالي. IHC = الكيمياء المناعية; IF = الفلوروسين المناعي.

الملف التكميلي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا تصف التوليد ثلاثي الأبعاد للورم، والذي يسمح بزرع الخلايا التائية، والتحاليل الوظيفية والجزيئية القائمة على الخلايا، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من إمكانيات الرصد والتحليل باستخدام جهاز واحد. الميزة الرئيسية لنهجنا هو أنه لا يتطلب نقل ثقافة 3D إلى فحص منفصل ويحافظ على سلامة ثقافة 3D في جميع أنحاء المقايسات.

يمكن تعديل سير العمل المعروض هنا حسب الحاجة. قد تحتاج أوقات الحضانة لتشكيل الزفيرويد، خلية تي المشتركة في الثقافة أو اختبار السمية الخلوية، إلى أن تتغير لظروف تجريبية مختلفة أو خطوط الخلية.

هناك بضع خطوات في جميع أنحاء عمليات الفحص، والتي تتطلب الالتزام الوثيق للبروتوكول. هذه هي في عام : إزالة خلية ثقافة المتوسطة قبل إضافة خط الخلية الثانية للثقافة المشتركة ، فضلا عن تضمين ثقافة 3D في ECM أو هيدروكسي إيثيل agarose معالجة هلام داخل يلقي agarose. من الأهمية بمكان إزالة الوسط من غرفة البذر ببطء وبعناية عن طريق إمالة اللوحة بشكل جيد واستهداف زاوية واحدة من الغرفة باستخدام ميكروسيبيت. طالما أن يلقي agarose تحتوي على خلايا، نوصي دائما إزالة أي وسيلة في البئر مع ميكروبيبيت، بدلا من استخدام الأنابيب. إضافة خط الخلية الثانية وتضمين في ECM أو هيدروكسي إيثيل أجاروز معالجة هلام يحتاج إلى أن يؤديها ببطء وإسقاط الحكمة من أجل منع طرد الخلايا في microwells. الخطوة الأكثر أهمية من الكولاجين غزو التشايس هو وقت الحضانة قبل عكس يلقي في لوحة جيدا مع الآبار. قد يؤدي تقليل الوقت إلى تسرب الكولاجين من المدلى بها ، وتجاوز الوقت قد يؤدي إلى الضغط على الثقافة إلى أسفل microwells ، مما يؤدي إلى غزو الزفير غير الموزعة بشكل غير متساو. عكس المدلى بها تمكن الخلايا في microwells لغمر تماما في الكولاجين السائل قبل أن يلمر ويقوي. التوتر السطحي بين الزهر agarose والقاع البلاستيك من لوحة البئر، يولد "شنقا قطرة"15،24 خلال غزو 3D كروية.

من المهم أن نلاحظ أن وقت الحضانة قبل عكس قد أنشئت يلقي لتضمين في الكولاجين النوع الأول. مع مكونات ECM الأخرى، يجب أن يتم ضبط هذه الخطوة وفقاً لذلك. وتجدر الإشارة إلى أن الإزالة الكاملة للوسائط المتبقية لا ينبغي أن تحاول تجنب فقدان غير مقصود للخلايا الموجودة في الشبكات الصغيرة. هذه الوسائط المتبقية ينتج عن تخفيف طفيف من ECM المضافة. وينبغي أن يؤخذ ذلك في الاعتبار من أجل التحليل والتكيف من نظم أخرى للتشكي.

الثقافة المشتركة الموصوفة هنا يسمح لأقصى قدر من التفاعل الورم / الخلايا التائية قبل غزو الخلايا السرطانية هو مقايسة: الورم والخلايا التائية هي المشتركة في تربية لمدة 2 أيام قبل تضمين في الكولاجين من النوع الأول ومن ثم تحديد الخلايا السرطانية على قيد الحياة والغازية على مدى اليومين المقبلين (الشكل 1B). ملاحظة, عندما بدأت الثقافة المشتركة في حين تم resuspended الخلايا التائية في الكولاجين الأول, فشلت الخلايا التائية لإظهار تأثير على غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية. قد يكون هذا التأثير بسبب الخلايا التائية يجري أكثر توزيعا في الكولاجين، وبالتالي أقل تركيزا حول spheroids. وهذا يشير إلى أن التفاعل المباشر بين الورم والخلايا التائية خلال يومين من الثقافة المشتركة قبل إجراء فحص الغزو أمر بالغ الأهمية لتقييم الآثار التي تتوسط الخلايا التائية على الخلايا السرطانية.

ومع ذلك، بعض من مزايا هذا النموذج 3D تأتي مع عيوب. هذا الإعداد عالية الإنتاجية يسمح البذر سهلة وسريعة من الخلايا في يلقي agarose في خطوة واحدة الأنابيب، مما أدى إلى توليد العديد من spheroids موحد الحجم داخل المدلى بها واحد. ومع ذلك ، منذ تقع جميع spheroids داخل المدلى بها نفسه ، ويمكن أيضا إزالتها بسهولة ، على سبيل المثال ، أثناء إزالة خلية ثقافة المتوسطة داخل غرفة البذر ، ومع إضافة الخلايا التائية للثقافة المشتركة. ولذلك، فإن مقدار العائد لكل بروتوكول يعتمد اعتماداً كبيراً على المهارات التقنية والخبرة لدى المحقق، ولكن أيضاً على نوع الفحص الذي يجري تنفيذه. وكما يقترح الجدول 1، يجب أن يؤخذ في الاعتبار احتمال فقدان الـ spheroids بنسبة 50% في نهاية التجربة. وعلاوة على ذلك، خلال خطوة البذر، قد لا توزع الخلايا بالتساوي على مساحة غرفة البذر، مما يؤدي إلى أكثر أو أقل من الزفيرة التمثيلية داخل الزهر agarose. من تجربتنا، وهذا التأثير يزيد مع حجم يلقي agarose. وبناء على ذلك، يجب النظر في النسخ المتماثلة أثناء التخطيط للتجربة.

يمكن تقييم التفاعل الزماني للخلايا داخل النظام ثلاثي الأبعاد بواسطة التصوير الفاصل الزمني ، والذي يقدم خيارًا آخر للرصد في هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، فإن القطر الصغير للذرات الصغيرة وخطوة الأنابيب الواحدة للخلايا البذرة، مناسبان لإجراء استنساخ وحيد للخلايا. وأخيراً، يمكن تحليل عينات المريض (مثل الخزعات) في الفحص بسبب العدد الصغير من الخلايا اللازمة للميكرويات والسمة عالية الإنتاجية للنظام ثلاثي الأبعاد. إدراج الأدوية المحفزة أو المانعة (مثل المضادة PD-1 أو المضادة PD-L1) للتحقيق في تفاعل الخلايا الورمية / الخلايا T هو امتداد منطقي للمساسية.

في الختام، يوفر نموذج الثقافة المشتركة 3D spheroid المعروض هنا إطارًا مرنًا لرصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا التائية المشتركة في الثقافة في بيئة ذات صلة بيولوجياً. يمكن تصور التوك التفاعلي الناتج مع الحفاظ على سلامة الثقافة ثلاثية الأبعاد وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية في خلية الورم – تفاعلات الخلايا التى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر فيرجيني أوري، دكتوراه لمناقشات مفيدة والمشورة حول نهج نموذج الثقافة المشتركة 3D. كما نشكر إليزابيث جونز على المساعدة التقنية الممتازة في قسم IHC. وقد دعمت هذه الدراسة من خلال المنح المقدمة من DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) إلى YL (LI 2547/4-1) والمعاهد الوطنية للصحة إلى AW (R01 CA2 31291)، إلى ATR (R01 CA205632)، إلى GWP (R01 CA218670)، والمنح الأساسية لمركز السرطان (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 160، ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، الخلايا السرطانية، الثقافة المشتركة، الكولاجين، السمية الخلوية، الغزو، المناعةfluorescence، الكيمياء المناعية، الخلايا التائية، الورم الزفير
رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter