Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Мониторинг вторжения раковых клеток и цитотоксичности Т-клеток в 3D-культуре

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

Представленный подход одновременно оценивает вторжение раковых клеток в 3D-сфероидные анализы и цитотоксичность Т-клеток. Сфероиды генерируются в эшафот-бесплатно агарозы мульти-микроуэлл литой. Со-культура и встраивание в коллагеновую матрицу типа I выполняются в одном устройстве, которое позволяет контролировать вторжение раковых клеток и цитотоксичность Т-клеток.

Abstract

Значительный прогресс был достигнут в лечении рака с помощью иммунотерапии, хотя большое количество раковых заболеваний остаются устойчивыми к лечению. Ограниченное количество анализов позволяет для прямого мониторинга и механистического понимания взаимодействия между опухолью и иммунными клетками, среди которых, Т-клетки играют значительную роль в выполнении цитотоксической реакции адаптивной иммунной системы на раковые клетки. Большинство анализов основаны на двумерной (2D) совместной культуре клеток из-за относительной простоты использования, но с ограниченным представлением фенотипа инвазивного роста, одной из отличительных черт раковых клеток. Современные трехмерные (3D) системы совместной культуры требуют либо специального оборудования, либо отдельного мониторинга для вторжения со-культурных раковых клеток и взаимодействующих Т-клеток.

Здесь мы описываем подход к одновременному мониторингу инвазивного поведения в 3D сфероидов раковых клеток и цитотоксии Т-клеток в со-культуре. Образование сфероидов обусловлено расширением клеточно-клеточных взаимодействий в микроуровновых отливах агарозы без агарозы с U-образными днами. Оба Т-клеток совместной культуры и раковых клеток вторжения в тип I коллагена матрицы выполняются в микроуэллах агарозы бросает без необходимости передачи клеток, тем самым сохраняя нетронутыми 3D совместной культуры системы на протяжении всего анализа. Коллагеновая матрица может быть отделена от агарозного отливки, что позволяет окрашивать иммунофторесценцию (ИФ) и конфокальные изображения клеток. Кроме того, клетки могут быть изолированы для дальнейшего роста или подвергнуты анализу, например, для экспрессии генов или флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Наконец, 3D-ко-культура может быть проанализирована иммуногистохимией (IHC) после встраивания и секционирования. Возможные модификации анализа включают измененные составы внеклеточной матрицы (ЭКМ), а также включение различных стромальных или иммунных клеток с раковыми клетками.

Introduction

Несмотря на значительные улучшения в иммунотерапии рака за последнее десятилетие, наше механистическое понимание чувствительности и устойчивости к лечению по-прежнему довольно бедны1. Хорошо известно, что опухоли проявляют существенную неоднородность, и что динамические взаимодействия опухолевых клеток с их микроокноронностью, а также с иммунными клетками, влияют на гибель опухолевых клеток, инвазивное поведение и реакциюна лечение, которые включают иммунотерапию 1,2,3. Как одна рука адаптивной иммунной системы, Т-клетки выполняют клеточной цитотоксичности. Анализ Т-клеточного распознавания и реакции на раковые клетки дает механистическое понимание устойчивости и чувствительности к иммунной модуляторной терапии.

В пробирке моделирования и мониторинга взаимодействия между раком и Т-клеток в соответствующей среде была сложной задачей и до сих пор, привело к ограниченной механистической идеи. Большинство анализов на основе клеток опираются на двухмерную (2D) среду, что не хватает ключевых функций, которые имеют решающее значение для recapitulating трехмерных (3D) в физиологии vivo4,5,6, а именно пространственных клеточно-клеточных взаимодействий, контакт с внеклеточной матрицы (ECM) 7 ,динамическийметаболический спрос, увеличение гипоксиииз-за массового роста 8, и последствия микроэквиронации опухоли (TME)9. С другой стороны, Есть еще ряд недостатков с в настоящее время используется трехмерных (3D) совместной культуры и вторжения систем анализа: (1) трудоемкий характер фероидной генерациии урожай 5,10, (2) отсутствие контроля над размером сфероидов, форма и плотностьклеток 11,12, (3) низкой пропускной способности типа анализы, (4) требование для специального оборудования13,,14, (5) необходимость передачи совместной культуры в различных средах для различныханализов 15,16,17. В частности, передача анализа совместной культуры часто приводит к нарушению сфероидов и утрате целостности со-культуры. Это особенно относится к "свободным" сфероидам с уменьшенной клеточной адгезией. Например, большинство 3D вторжения анализы требуют, чтобы сфероиды собирают после их первоначального формирования, а затем повторно в ECM14,15,16. Этот шаг повторного поиска приводит к потере контроля над расстоянием между сфероидами. Поскольку расстояние между сфероидами опухоли влияет на их инвазивное поведение, эта потеря контроля вводит высокую межассальную дисперсию и уменьшает воспроизводимость. Кроме того, применение анализов фракционирования клеток последовательными шагами центрифугации для оценки периферических и опухолевых сфероидов, проникающих в иммунные клетки, ограничивается популяциями опухолевых клеток, которые генерируют более стабильныесфероиды 17.

Концепция и подход

Наш подход устраняет вышеупомянутые недостатки с помощью модели «Все в одном» — 3D сфероидной ко-культуры, которая не требует передачи сфероидов для последующих анализов. Мы адаптировали устройство формирования сфероидов (см. Таблицу материалов)для создания анализа для одновременного мониторинга инвазивного поведения раковых клеток и цитотоксии со-культурных Т-клеток. Этот метод является удобным, недорогим и позволяет быстро и легко обрабатывать в относительно высокой пропускной способности 3D настройки. В зависимости от типа используемого устройства, до 81 большого одинаково размера сфероидов могут быть созданы в одном шаге трубопроводов с контролем над индивидуальным размером сфероида путем изменения количества клеток, посеянных. Образование сфероидов вызвано расширением клеточно-клеточных взаимодействий в эшафот-бесплатных агарозных многофункциональных слепков с U-образными дном. Мы адаптировали эту 3D-систему для динамических функциональных исследований на основе клеток, а также молекулярных и биохимических анализов конечных точек, которые включают флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), иммунофторесценцию (IF) или иммуногистохимию (IHC) окрашивание, а также анализ экспрессии генов нетронутой 3D-ко-культуры.

Для функциональных исследований,встраивание сфероидов в коллаген типа I в агарозе бросает приводит к вторжению раковых клеток из равноумных сфероидов и позволяет контролировать основные клеточные линии конкретных особенностей, таких как одноклеточная против коллективноймиграции клеток 18,19. Кроме того, коллагеновая матрица легко отделяется от литой агарозы, в результате чего патч толщиной 1'u20122 мм, содержащий несколько сфероидов, которые могут быть дополнительно обработаны для ИФ-окрашивания и визуализации с помощью конфокальная микроскопия. Это может выявить различные вторжения клеток и клеточной матрицы взаимодействия в высокой пропускной способности скрининга. Кроме того, клетки в коллагеновой матрице могут быть изолированы после пищеварения коллагена и разной диссоциации клеток для последующего культивирования клеток или анализа.

Для IHC-анализа сфероидовпосле фиксации и секционирования агарозного отливки обнаруживаются белки или другие молекулы, представляющие интерес, сохраняя при этом географическое положение сфероидов. В описанной здесь подходе сфероиды непосредственно встроены в гидроксиэтил агарозный гель для обработки агарозы, а гель служит «крышкой» для удержания сфероидов в нижней части микроуровн. После встраивания парафина агарозылитые 20, серийный горизонтальный раздел выполняется с нижней части литой выступающей в качестве отправной точки.

Этот подход контрастирует с обычным IHC секционирование сфероидов, что требует сбора клеток перед встраиванием в Гидроксиэтилагарозы обработки геля 21 и рискует нарушения сфероидов, таким образом, потеряв пространственное расположение клеток. Кроме того, фракционирование клеток центрифугой для оценки того, проникновения иммунных клеток или остается периферической дляопухолевых сфероидов 17, избегается путем прямого встраивания.

Кроме того, 3D-ко-культура может быть выполнена путем смешивания опухоли, стромальных или иммунных клеток, и, таким образом, изучение опухолевых клеток перекрестный разговор или recapitulating различных микроокнороний опухоли для анализа клеточно-клеточных взаимодействий, включая совместно культуры с эндотелиальнымиклетками 16.

Этот 3D сфероид со-культуры настройки могут быть использованы для выполнения совместной культуры различных типов клеток, присутствующих в микроэквиронации опухоли и для оценки последствий измененных элементов ECM. Кроме коллагена типа I, другие компоненты ECM (например, матригель, матригель/коллагеновые смеси, фибронектин), могут быть использованы, так как вторжение опухолевых клеток влияет на обилие различных субстратов22. Кроме того, микровеллы агарозного отлитого подходят для формирования сфероидов первичных клеточных линий и для клеток с низкоклеточной адгезией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Список и объяснение некоторых часто используемых слов на протяжении всего протокола можно найти в дополнительном файле 1.

1. Поколение сфероидов

  1. Подготовка и автоклав 2% агарозы в 1x PBS (например, 1 г агарозы в 50 мл 1x PBS) и автоклав 35- и 81-микроуэлл резиновые формы.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте использования низкоплавильной агарозы для генерации агарозных слепок для обработки IHC.
  2. Подготовка агарозы бросает
    ПРИМЕЧАНИЕ: 35-микроуэлл бросает используются для вторжения, иммунофторесценции (IF) и изоляции клеток анализы. 81-микроуэлл бросает используются для цитотоксичности, иммуногистохимии (IHC), клеточной изоляции и анализа экстракции РНК.
    1. После того, как агароза была autoclaved, пусть расплавленной агарозы остыть примерно до 60'u201270 КК. В капюшоне клеточной культуры используйте асептическую технику и пипетку 500 МКЛ расплавленной агарозы в 81-микроуэлл резиновой плесени на колодец или 330 МКЛ в 35-микроуэлл резиновой плесени на колодец.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте создания пузырьков при смешивании или трубчатой агарозы. Удалите пузырьки, аккуратно трубчатые.
    2. После того, как агароза затвердевет, тщательно сгибайте резиновую форму, чтобы удалить из нее агарозу. При этом, поместите руки выше соответствующих хорошо пластины и пусть агароза литые падение прямо в один колодец хорошо пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Flex резиновой формы в разных положениях, с тем чтобы избежать чрезмерного сгибания. Это может быть полезно, чтобы сгибать резиновую плесень и нажмите осторожно снизу в то же время.
    3. Чтобы уравночные отливки агарозы, добавьте клеточной культуры среды, состоящей из DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки (2,5 мл / хорошо для 12-хорошо пластины и 1 мл / хорошо для 24-хорошо пластины). Поместите хорошо пластину в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) и инкубировать в течение 1 ч.
  3. Между тем, подготовить клеточной культуры для посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий номер посева клеток на агароуз литые должен быть решен следователем. Для murine первичных линий раковых клеток поджелудочной железы, 35000 клеток / 35-микроуэлл литые и 81000 клеток / 81-микроуэлл литые (в среднем 1000 клеток / сфероидов) посеяны для всех следующих анализов. Средний диаметр сфероида составляет около 150–2012200 мкм после 48 ч.
  4. Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки сначала наклоняя хорошо пластины. Затем аккуратно удалите среду в посевной камере.
  5. Тщательно семян подготовленных опухолевых клеток подвески падение мудрым в камеру посева клеток. Аккуратно поместите хорошо пластину обратно в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага клетки будут оседать в микролагов агарозы литой.
  6. Добавьте дополнительную среду к внешней стороне отлитого агарозы (2,5 мл/хорошо для 12-хорошо пластины и 1 мл/хорошо для 24-хорошо пластины).
  7. Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) для 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает до нескольких часов для клеток, чтобы сформировать сфероиды в микроуэллах. В целом, твердые сфероиды опухолевых клеток образуются после 24 ч и стабильны после 48 ч. Тем не менее, это может варьироваться между различными линиями клеток. При необходимости измените среду клеточной культуры, тщательно наклонив хорошо пластину с агарозой бросает и удаления окружающей среды культуры клеток с P1000 пипетки. Затем аккуратно добавить свежие среды, трубя его вдоль стены хорошо. Обычно нет необходимости менять средства массовой информации в отлитиях из-за его небольшого объема и риска удаления сфероидов.

2. Со-культура с Т-ячейками

  1. Resuspend необходимое количество Т-клеток в 75 йл (35-микроуэлл литые) или в 190 йл (81-микроуэлл литые) соответствующих Т-клеток культуры среды (RPMI дополнен 10% плода крупного рогатого скота сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин).
  2. Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки во-первых, наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалить среду в литых мягко ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки, сохраняя при этом хорошо пластины наклонена с другой стороны.
  3. (Критический шаг 1) Поскольку существует риск удаления сфероидов, контроль за потерей сфероидов путем сравнения количества сфероидов в микроуэллах до и после удаления среды при просмотре под микроскопом при 10-х увеличении.
  4. Тщательно семян Т-клеточной подвески падение мудрым в посевной камере агарозы бросили, удерживая P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
  5. (Критический шаг 2) Существует риск промывки сфероидов при добавлении Т-клеток. Поэтому очень важно добавлять Т-клетки очень медленно и примерно на 0,5 см выше посевной камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из возможностей уменьшить количество промытых сфероидов, указывая пипетки на один угол посевной камеры при добавлении Т-клеток, таким образом, только рискуя сфероидов в этом углу, чтобы быть вымываются.
  6. Аккуратно поместите хорошо пластину обратно в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) в течение 15 минут.
  7. Возьмите хорошо пластины из инкубатора и добавить свежие среды культуры клеток (RPMI дополняется 10% плода бычьей сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин) вокруг агарозы бросили медленно трубопроводов его вдоль стены хорошо.
  8. Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток на 48 ч.

3. Встраивание 3D-ко-культуры в коллагеновую матрицу типа I

  1. Подготовка нейтрализованного коллагена типа I
    1. Разбавить бульон коллагена с сывороткой свободной среды базы (RPMI) до окончательной рабочей концентрации 3 мг/мл. На каждые 100 мкл разбавленного коллагена добавляйте 11 МКЛ 10х ПББ и 1,2 МЛ 1 М гидроксида натрия (NaOH).
    2. Держите на льду и инкубировать (нейтрализовать) в течение 1 ч.
  2. Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки во-первых, наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалите среду в гипсе, аккуратно нацелив один угол посевной камеры с помощью пипетки P200, сохраняя при этом хорошо наклоненный пластиной с другой стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, очень важно, чтобы полностью удалить клеточной культуры среды, окружающие агарозы литой.
  3. Тщательно пипетки нейтрализованного коллагена я смешиваю капли мудрый в посевной камере агарозы бросили, держа P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
  4. Положите хорошо пластины сразу в инкубатор культуры клеток в течение 4 мин (35-микроуэлл литые) или 5 мин (81-микроуэлл литой).
    ВНИМАНИЕ: (Критический шаг 3) Очень важно строго придерживаться данного времени инкубации. В противном случае, инвазивное поведение не может быть воспроизведено.
  5. Переверните хорошо пластину и оставьте ее в инкубаторе на 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слепки будут оставаться прикрепленными к нижней части хорошо пластины из-за поверхностного натяжения. В случае использования специальной клеточной культуры среды с высокой концентрацией сыворотки (например, RPMI, дополненная 20% сыворотки крупного рогатого скота плода), для увеличения поверхностного натяжения может потребоваться дополнительный шаг мытья с 1x PBS после удаления среды в хорошо.
  6. Возьмите хорошо пластины из инкубатора и инвертировать его обратно. Добавить свежие клетки культуры среды (RPMI дополняется 10% плода бычьей сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин) вокруг агарозы бросили медленно трубопроводов его вдоль стены хорошо.
  7. Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток на 48 ч.

4. Анализ цитотоксичности

  1. Подготовка 3 мл 1x PBS с 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота на агарозу литой.
  2. После совместной культуры для 4 d, удалите клеточной культуры среды, окружающие агарозы литые с P1000 пипетки, слегка наклоняя хорошо пластины с другой стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий период времени совместной культуры должен решаться следователем.
  3. Распределите 1 мл 1x PBS и 2% FBS с P1000 пипеткой в посевную камеру, чтобы выбить сфероиды из микроуровн.
  4. Повторите шаг 4.3 дважды с объемом в колодец и перенесите его в 15 мл трубки.
  5. Центрифуга трубки при температуре 300 х г при 10 с при комнатной температуре (RT).
  6. Аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки P1000.
  7. Вымойте клетки, добавив 1 мл 1x PBS с 2% FBS и центрифуги на 300 х г в течение 1 мин на RT.
  8. Повторите шаг стирки (шаг 4.7).
  9. Удалите супернатант и добавьте 1 мл раствора ферментов диссоциации клеток (см. таблицу материалов).
  10. Используйте P200 пипетки и пипетки вверх и вниз, чтобы сломать ячейки кластеров.
  11. Инкубировать клетки в течение 20 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  12. Повторите шаг 4.10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 фунтов стерлингов и семена на блюдо клеточной культуры, чтобы наблюдать (под микроскопом при 10x увеличении), насколько хорошо сфероиды рассеялись в одиночных клетках. При необходимости добавьте 5 минут дальнейшей инкубации.
  13. Добавьте 4 мл полной клеточной культуры среды (RPMI дополняется 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина) и перемешать путем инвертирования трубки 3'u20124 раз.
  14. Центрифуга при 400 x g в течение 4 мин на RT.
  15. Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в буфер FACS для окрашивания апоптотических клеток Annexin V.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсюда можно провести любое окрашивание FACS и анализ клеток.

5. Гидроксиэтил агароза обработки гель встраивания для раздела IHC

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь очень важно, чтобы избежать использования низкоплавильных агарозы для генерации агарозы бросает.

  1. В конце совместной культуры, удалить клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки сначала наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалить среду в литых мягко ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки, сохраняя при этом хорошо пластины наклонена с другой стороны.
  2. Медленно пипетка 10% формалин первый в посевной камере, осторожно ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки. Затем добавьте 10% формалин к внешней стороне агарозы литые до тех пор, пока она полностью покрыта. Исправить агарозы бросили в 10% формалин для 1 d.
  3. Удалите формалин на следующий день.
  4. Тщательно пипетка 210 йл (81-микроуэлл литые) или 100 йл (35-микроуэлл литые) предварительно разогретой и сжиженной гидроксиэтил агарозы обработки геля (см. Таблица материалов) дроп-мудрый в посевной камере агарозы бросили, удерживая P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
  5. Пусть гидроксиэтил агарозы обработки гель затвердеть в течение 10 мин на RT.
  6. Передача агарозы литые в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительного хранения, вставлять литые в 70% этанола для предотвращения загрязнения.
  7. Обезвоживаемые секции геля через серию этанола (1 ч каждый: 70% этанола, 80% этанола, 95% этанола, 100% этанола (3x изменения каждый). Затем очистите в клиринговом растворе 3x по 1 ч каждый (например, алифатические углеводороды (например, Клирит) или ксилены), и проникните с расплавленным парафином (3x по 1 ч каждый), либо вручную, либо в тканевой процессер. Встраивание литых в парафиновый воск для последующего сечения на 5 мкм на секцию.
  8. Удалите воск, поставив слайды в ксилены, 3x в течение 3 минут каждый, а затем регидратировать ткани разделов через градуированных серии алкоголя: 100% этанола в течение 2 мин, 95% этанола в течение 1 мин, 80% этанола для 30 с и 70% этанола в течение 30 с, а затем поместить в воду.
  9. Выполните тепловой индуцированный эпитоп поиска в овощном пароходе при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 20 минут, а затем 20 мин охлаждения в 10 мМ цитрат рН 6,0 раствора и блок эндогенных пероксид с H2O2.
  10. Блокируйте секции с нормальной сывороткой цели и подвергайте их антителам anti-CD8 (разбавлению 1/25) всю ночь.
  11. Применение анти-кролик-HRP спряженных вторичных антител (см. Таблица материалов) и развивать окрашивание с помощью 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) хромаген. Counterstain ядра с 11% Харрис гематоксилин решение (см. Таблицу материалов).

6. Мониторинг и анализ нашествия сфероидов в совместной культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Время точки изображения сфероидов вторжения в матрицу коллагена I должен быть решен следователем. Приобретайте изображения клеточной культуры с помощью перевернутого микроскопа с 10-х увеличением. Идеальная точка времени зависит от тесту линии ячейки, а также от компонента ECM. Более инвазивные клеточные линии начнут распространяться в коллаген в течение нескольких часов после добавления коллагена. Так как Т-клетки в совместной культуре может предотвратить полный вид на выход из сфероидов в очень ранние моменты времени, как правило, изображения принимаются на 0 ч (в качестве ссылки), 24 ч и 48 ч после добавления коллагена.

  1. Квантитатная инвазивность путем ручного подсчета количества "шипов", высовыхающихся из сфероида и/или с помощью программного обеспечения для анализа изображений, например, Изображения J.
    1. Анализируйте вторжение как количество «шипов» из сфероида, вручную подсчитывая количество «шипов» сфероида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть решено следователем, какие выступы из сфероидов рассматриваются как "шипы". Критерием принятия решения может быть длина "шипа", измеряемая от края сфероида.
    2. Проанализируйте вторжение как область вторжения относительно размера сфероида.
      1. Используйте инструмент Freehand Draw Tool (Изображение J) для отслеживания границы общей площади (вторжение и сфероидная область).
      2. Нажмите Проанализируйте верхнее меню, а затем нажмите Мера для отображения измерения области.
      3. Отслеживаем границу общей сфероидной области.
      4. Нажмите Проанализируйте верхнее меню, а затем нажмите Мера для отображения измерения области.
      5. Скопируйте измеренный список результатов в электронную таблицу и вычислите общее вторжение/сфероид с помощью формулы: полное вторжение - общая площадь/сфероидная область.

7. Иммунофлуоресценция окрашивания

  1. Подготовьтесь к следующему.
    1. Приготовьте 5,4% формалин (5 мл) с использованием 2,3 мл 1x PBS и 2,7 мл 10% формалина.
    2. Приготовьте 0,5% октосинола (50 мл) с использованием 50 мл 1x PBS и 2,5 мл 10% октосинола (магазин на RT).
    3. Подготовка IF Buffer (200 мл) с использованием 200 мл 1x PBS, 200 мг бычьего сыворотки альбумин (BSA), 4 мл 10% октосинола, 1 мл 10% полисорбата 20 (разогрева до RT перед использованием; фильтр и хранить при 4 градусов по Цельсию).
    4. Подготовь блокирующий раствор (5 мл) с помощью 5 мл IF Buffer и 500 МКЛ козьей сыворотки (разогревайте до RT перед использованием).
    5. Держите 8-хорошо камерные слайды, стеклянные крышки, и монтажные средства массовой информации готовы.
  2. День 0
    1. Исправить весь агарозный литые, в том числе сфероиды, на ночь в 5,4% формалин на RT в увлажненной камере.
  3. День 1
    1. Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки, наклоняя хорошо пластины.
    2. Передача коллагена патч в 8-хорошо камерный слайд, хватая угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы литые с гладким остроконечный кончик пинцета и очистить его от агарозы бросили в одном, уверенное движение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген патч должен быть легко отделен от агарозы литой. В противном случае, используйте P1000 пипетки, чтобы тщательно добавить культуру среды в области посевной камеры или инвертировать агарозы литые и осторожно встряхнуть хорошо пластины, чтобы выбить коллагеновой матрицы.
    3. Добавьте 250 йл 0,5% октосинола (см. таблицу материалов)за колодец. Инкубация в течение 1 ч на RT.
    4. Аспирировать октосинол и добавить 250 мкл блокирующего раствора на колодец. Блок на 1 ч на RT.
    5. Между тем, разбавить первичное антитело (разбавление для анти кератина 8: 1/500; Фаллоидин 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) в блокирующего растворе, расчет на 250 мкл на колодец.
    6. Добавьте первичное антитело в блокирующий раствор и поместите камеру слайда во увлажненной камере для ночной инкубации на RT.
  4. День 2
    1. Удалите первичное антитело в блокируя раствор, аспирируя.
    2. Вымойте 3 раза, добавив 300 йл IF Buffer и дайте ему сидеть в течение 5 минут на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Просто дайте ему сидеть, нет необходимости ставить его на шейкер.
    3. Разбавить вторичное антитело в блокирующий раствор (для анти кератина 8: анти-крыса, разбавление 1/500).
    4. Добавьте 250 МКЛ вторичного антитела в блокирующий раствор к каждой колодец и инкубировать в течение 1 ч на RT. С этого далее защитите образцы от света.
    5. Удалите вторичное антитело в блокируя раствор, аспирируя.
    6. Вымойте 3 раза с 300 йл IF Buffer, добавив, и пусть он сидит в течение 5 минут на RT.
    7. Промыть образцы с 1x PBS и аспирировать его.
    8. Аккуратно снимите стенки камерного слайда так, чтобы в нижней части осталось только стеклянное горку.
    9. Добавьте по крайней мере 200 МКЛ монтажных средств массовой информации в стеклянную крышку и медленно уронить крышку над образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте создания пузырьков, так как это повлияет на качество изображения. Пузыри можно предотвратить, аккуратно поместив крышку скольжения на длинный край слайда под углом 45 "или медленно опуская крышку скольжения на слайде.
    10. Положите установленные образцы в темное и сухое место и дайте ему посидеть на ночь. Изображение может быть выполнено на следующий день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Coverslip может первоначально сдвиг немного один раз размещены на коллагена патч. Пусть стеклянная горка сидеть на равномерной площади в течение нескольких минут. Обложка выровняет образец так, чтобы не было разрыва между стеклянным слайдом и крышкой с течением времени.

8. Изоляция клеток от коллагеновой матрицы

  1. Подготовьтесь к следующему.
    1. Подготовка 1 мг/мл коллагеназы 4 в сывороткесодержащей клеточной культуры среды (магазин aliquoted коллагеназы 4 разбавления при -20 градусов по Цельсию)
    2. Подготовка 2,5% BSA в 1x PBS и пальто все трубки и пипетки советы с ним (фильтр BSA решение перед использованием).
    3. Предварительное решение BSA и среда клеточной культуры перед использованием.
  2. Приготовьте 2 мл раствора коллагеназы 4 (1 мг/мл), чтобы переварить максимум три коллагеновых матрицы из 35-микроуэлловых отливок агарозы.
  3. Передача до трех матриц коллагена 75 МКЛ из 35-микроуэлл агарозы бросает в 2,5% BSA предварительно покрытием 15 мл трубки. Возьмитесь за угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы, отлитой гладким заостренным кончиком пинцета, и снимите его с агарозы, отлитой одним, уверенным движением.
  4. Bevel-вырезать кончик P1000 отзыв с ножницами. Предварительно пальто оставшийся кончик с 2,5% BSA и сломать коллагеновой матрицы как можно больше, трубя вверх и вниз. Инкубировать трубку в течение 15 мин при 37 градусов по Цельсию.
  5. (Критический шаг 4) Каждые 5 минут проверяйте, растворилась ли коллагеновая матрица. Pipette вверх и вниз снова, прежде чем принимать 10 йл образца и семян его на блюдо клеточной культуры для наблюдения под микроскопом в 10x увеличение. Добавьте еще 5 минут, если это необходимо.
  6. Заполните трубку 10 мл довоенной клеточной культуры среды (DMEM дополняется 10% сыворотки крупного рогатого скота плода). Аккуратно перемешайте трубку 3'u20124 раз.
  7. Центрифуга трубки на 400 х г в течение 4 мин на RT.
  8. Аккуратно снимите супернатант и оставьте 2 мл объема.
  9. (Критический шаг 5) Оставьте 2 мл после первого шага центрифугации, так как в нижней части трубки все еще может быть неразрешеный коллаген, несущий клетки вдоль них.
  10. Выполните два шага мытья, добавляя 10 мл сыворотки, содержащей клеточной культуры среды каждый раз. Центрифуга каждый раз на 400 х г в течение 4 мин на RT.
  11. После последнего шага стирки, удалить как можно больше среды, как это возможно, и оставить только ячейки гранулы.
  12. Повторное разрешение клеточной гранулы в 1 мл раствора ферментов диссоциации клеток (см. таблицу материалов).
  13. Используйте P200 пипетки и пипетки вверх и вниз, чтобы сломать ячейки кластеров.
  14. Инкубировать клетки в течение 20 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  15. Повторите шаг 8.13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 фунтов стерлингов и семян на блюдо клеточной культуры наблюдать под микроскопом в 10x увеличение, чтобы посмотреть, насколько хорошо сфероиды разобщены в одиночные клетки. При необходимости добавьте 5 минут дальнейшей инкубации.
  16. Добавьте 4 мл клеточной культуры среды (DMEM дополнено 10% сыворотки крупного рогатого скота плода) и перемешайте трубку 3'u20124 раз.
  17. Центрифуга при 400 x g в течение 4 мин на RT.
  18. Удалите супернатант. Отсюда и далее, FACS окрашивания или клеточной культуры могут быть выполнены.

9. Извлечение РНК из коллагеновой матрицы

  1. Подготовка гуанидиния тиоцианата с фенолом (см. Таблица материалов ),100% хлороформ, 70% RNase без этанола, РНК-экстракции комплект (см. Таблица материалов ),RNase-бесплатно 1,5 мл труб, RNase-бесплатно 15 мл труб и RNase-бесплатно ddH2O.
  2. Передача до двенадцати матриц коллагена 190 йл из 81-микроуэлла агарозы бросает в 15 мл трубки. Возьмитесь за угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы, отлитой гладким заостренным кончиком пинцета, и снимите его с агарозы, отлитой одним, уверенным движением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матрицы также могут быть заморожены при -80 градусов по Цельсию до готовности к экстракции РНК.
  3. Добавьте 1 мл гуанидиния тиоцианата с фенолом (см. Таблицуматериалов) в коллагеновые матрицы в 15 мл трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гуанидиний тиоцианат с фенолом должен полностью покрывать коллагеновые матрицы.
  4. Вихрь труб для 10'u201220 s.
  5. Гомогенизировать матрицы с 20 G иглы и 5 мл шприцев, пока они полностью не растворяются.
  6. Пусть матрицы сидят в течение 5 минут на RT.
  7. Добавьте 200 мкл чистого хлороформа в матрицы и встряхните трубку энергично в течение 15 с.
  8. Немедленно перенесите смесь на трубы 1,5 мл.
  9. Пусть смесь сидеть, по крайней мере 5 мин на RT, пока фазы разделены.
  10. Центрифуга 1,5 мл труб при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
  11. Заполните новую трубку 1,5 мл с 500 л 70% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема aqueous фазы после центрифугации (см. шаг 9.12. это не может быть 500 МЛ. Количество этанола 70% должно быть равно объему аквеозной фазы.
  12. Тщательно перенесите верхнюю aqueous фазу центрифугированных образцов к 70% этанол-заполненной пробке и перемешайте тщательно pipetting вверх и вниз.
  13. (Критический шаг 6) Будьте осторожны, чтобы не нарушить слои в нижней части гуанидиния тиоцианата с фенол разделения при удалении верхней фазы, так как это будет загрязнять РНК.
  14. Добавьте образец в столбец извлечения РНК (включен в комплект извлечения РНК, см. Таблицу материалов). С этого же далее следуйте протоколу производителя по очистке РНК от клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Модель 3D совместной культуры позволяет проводить различные анализы, показанные на рисунке 1A,которые могут быть объединены или изменены по мере необходимости. В нашей установленной экспериментальной установки, опухоли и Т-клетки совместно культуры в течение 2 дней с последующим началом вторжения анализ для выбора инвазивных и / или устойчивых опухолевых клеток (Рисунок 1B). На 4-й день проводится квантиция вторжения и "выжившие" клетки изолированы от коллагеновой матрицы или непосредственно обработаны для извлеченияРНК 23 или ДНК из матрицы(рисунок 1B). Встраивание 3D-культуры в коллаген типа I в микроуровн агарозного литого позволяет контролировать и анализ вторжения с помощью Изображения J сначала демаркировать общую площадь с помощью инструмента свободной руки программного обеспечения, а затем рассчитать соотношение над демаркации сфероидной области (рисунок 2A), и / или, подсчитав количество "шипов" оставляя сфероидов. Используя две первичные линии раковых клеток поджелудочной железы (клеточная линия 1 и клеточная линия 2), наблюдались и количественно наблюдались и количественно наблюдались различные сфероидные формы иинвазивное поведение (рисунок 2B). Клеточная линия 1 показывает более компактное образование сфероидов и "колючее" вторжение, сравнимое с вторжением одной клетки, в то время как клеточная линия 2 образует более свободные сфероиды и показывает коллективный шаблон вторжения(рисунок 2C). Со-культура была выполнена с двумя различными линиями клональных клеток опухоли, посеянными в то же время (рисунок 3A'u2012E), чтобы следить за их взаимодействиями во время последующих анализов, и с опухолевыми клетками и Т-клетками при образованииопухолевых сфероидов (рисунок 3F'u2012J).Figure 3 Для детальной оценки инвазивного поведения было выполнено иммунофлуоресцентное окрашивание(рисунок 4). После отделения коллагеновой матрицы от агарозного литого, ИФ окрашивания и переноса на стеклянную горку (рисунок4A'u2012B),конфокальные изображения выполнялись в высокой пропускной способности(рисунок 4C'u2012J). Размер и консистенция агарозного литого позволяют встраивать всю систему 3D культуры в парафин для серийного сечения и иммуногистохимии (IHC) окрашивания для количественной оценки пространственной связи между опухолью и Т-клетками(рисунок 5). Т-клетки, присутствующие в разделе, могут быть идентифицированы и далее характеризуются окрашиванием поверхностного маркера клетки, примером которого является CD8(рисунок 5D,E). Т-клетки, проникшие в сфероид опухоли, можно сосчитать по сравнению с теми, которые остались на периферии сфероида. Рисунок 5D,E показывает примеры различных инфильтрации Т-клеток в опухолевые сфероиды, выращенные из линии опухолевых клеток 1 (D) и клеточной линии 2 (E). В таблице 1 показаны типичные экспериментальные установки для анализов и выход репрезентативных и анализируемых образцов в конце эксперимента для каждого протокола.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс, анализ и хронология экспериментов. (A) 81-микроуэлл и 35-микроуэлл резиновой плесени заполнены 2% агарозы в 1x PBS для создания агарозы литые с несколькими микроуэллами. Диаметр резиновой формы составляет 3,5 см. Размер 35-микроуровного агарозного отлитого составляет 13 мм х 8 мм, а отлитого 81 микроуэлла - 13 мм х 13 мм. Сфероиды образуются при посеве клеток в камеры агарозы, отбрасываемые в один шаг. Со-культура с Т-клетками осуществляется в рамках одного и того же актерского состава. Показаны функциональный мониторинг и потенциальные анализы. (B)Хронология экспериментов. Опухолевые клетки совместно культуры с аутологичными Т-клеток в течение 2 дней, что позволяет максимальное взаимодействие между обоими типами клеток. Анализ вторжения инициируется через два дня. Анализ конечных точек проводится через два дня для мониторинга инвазивного и выживаемости фенотипа опухолевых клеток, а также пролиферации и выживания Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Количественная оценка вторжения. Вторжение можно количественно оценить с помощью анализа изображений, например, с помощью программного обеспечения Image J и подсчета количества "шипов" на сфероид. (A)Расчет общей площади вторжения как соотношения общей площади к сфероидной области. Шкала бар: 300 мкм. (B) Примеры двух различных первичных линий рака поджелудочной железы (клеточная линия 1 и 2) в образовании сфероидов при различных увеличений и вторжения в коллаген типа I. (C)Анализ вторжения выполняется путем подсчета количества шипов на сфероид (левая диаграмма; бары ошибок: 2,63 для клеточной линии 1, 1,47 для клеточной линии 2) и вычислить область вторжения, как описано (правая диаграмма; бары ошибок: 0,36 для клеточной линии 1, 1,28 для клеточной линии 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Со-культура с красителем помечены опухоли и Т-клеток. (A'u2012E) Смесь двух по-разному красителей помечены первичного мурина рака поджелудочной железы клональных клеточных линий (зеленый и красный) и увеличенный вид одного представителя микроуэлла (B'u2012E). (F'u2012J) Со-культура предварительно помеченных опухолей (зеленых) и Т-клеток (красный). (Гю2012J) Увеличенный вид одного репрезентативного микроуэлла показывает одну опухоль-Т-клеточную ко-культуру при образовании сфероидов опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Иммунофлуоресценция окрашивания. Иммунофторесценция (ИФ) окрашивания была выполнена после отделения коллагеновой матрицы от агарозы. (A'u2012B) После окрашивания, коллагеновые пятна переносятся на стеклянную горку и покрываются стеклянными крышками. (C'u2012F) Пример IF-окрашенных коллагена патч в том числе опухолевых сфероидов с (C) Hoechst, (D) кератин 8, (E) фаллоидин и (F) наложения. Панели(G'u2012J) Показать соответствующий увеличенный вид одного сфероида. Масштабная планка 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Секция иммуногистохимии. Агароза литые с 3D культуры погружен в гидроксиэтил агарозы обработки геля, был встроен в парафин, секционо и обработаны для иммуногистохимии (IHC) окрашивания. (A) Парафин блок, используемый для горизонтального сечения, который начинается от нижней части агарозы литые для получения серийных разделов нескольких опухолевых клеток / Т-клеток совместно культур в рамках одного литого; шкала бар No 5 мм. (B) Гематоксилин и эозин окрашенных раздел агарозы литой, содержащей 3D совместной культуры опухоли и Т-клеток. Шкала бар: 1мм.( C ) Увеличенный вид на H и E-окрашенных со-культуры в агарозы литой. CD8 окрашивание Т-клеток совместно с клеточной линией 1(D)и клеточной линией 2(E). Масштаб баров в C'u2012E и 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Протокол типичная настройка клетки, посеянные (в гипсе) типичная урожайность
анализ цитотоксичности 2x 81-микроуэлл бросает 81,000 100 000 ячеек
Анализ IHC 1x 81-микроуэлл литые 81,000 40 сфероидов
Анализ вторжения 2x 35-микроуэлл бросает 35,000 50 сфероидов
ЕСЛИ анализ 2x 35-микроуэлл бросает 35,000 50 сфероидов
Изоляция клеток от коллагена I 2x 35-микроуэлл бросает 35,000 50 000 ячеек
Извлечение РНК из коллагена I 12x 81-микроуэлл бросает 243,000 400-600 нг/хл

Таблица 1: Типичная экспериментальная настройка и выход для протоколов. В таблице показана типичная экспериментальная установка для каждого протокола и типичная урожайность анализируемых образцов (количество клеток, сфероидов или концентрация РНК) в конце эксперимента, соответственно. Иммуногистохимия IHC; Иммунофлюоресценция ИФЗ.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный здесь метод описывает 3D-генерацию сфероидов опухоли, которая позволяет совместно культурироваться с Т-клетками, функциональными и молекулярными анализами на основе клеток, а также различными возможностями мониторинга и анализа с помощью одного устройства. Основным преимуществом нашего подхода является то, что он не требует перевода 3D-культуры в отдельный анализ и поддерживает целостность 3D-культуры на протяжении всего анализа.

Представленный здесь рабочий процесс может быть изменен по мере необходимости. Время инкубации для формирования сфероидов, со-культуры Т-клеток или анализа цитотоксичности, возможно, потребуется изменить для различных экспериментальных условий или клеточных линий.

Есть несколько шагов на протяжении всего анализа, которые требуют тесного соблюдения протокола. Они в целом: удаление среды клеточной культуры перед добавлением второй клеточной линии для совместной культуры, а также встраивание 3D-культуры в ECM или гидроксиэтил агарозы обработки геля в агарозы бросает. Крайне важно медленно и осторожно удалить среду посевной камеры, наклонив хорошо пластину и нацелив один угол камеры с помощью микропипеда. Пока отливки агарозы содержат клетки, мы рекомендуем всегда удалять любую среду в колодец с помощью микропипеда, вместо того, чтобы использовать пипетку. Добавление второй клеточной линии и встраивание в ECM или гидроксиэтил агарозы обработки геля должна быть выполнена медленно и капли мудрым, с тем чтобы предотвратить промывку клеток в микроуэллах. Наиболее важным шагом анализа вторжения коллагена является инкубацио время, прежде чем инвертировать слепки в хорошо пластины с колодцами. Сокращение времени может привести к коллагена выпадают из литой, и превышение времени может привести к культуре быть прижаты к нижней части микроуэллов, в результате чего неравномерно распределены сфероидов вторжения. Инвертирование литых позволяет клеткам микроуровн полностью погрузиться в жидкий коллаген, прежде чем он полимеризируется и затвердевает. Поверхностное натяжение между агарозным литым и пластиковым дном хорошо пластины, генерирует "висящее падение"15,24 во время вторжения 3D сфероидов.

Важно отметить, что инкубацио время до инвертирования слепков была создана для встраивания в коллаген типа I. С другими компонентами ECM этот шаг должен быть соответствующим образом скорректирован. Следует отметить, что не следует протедать полное удаление остаточных средств массовой информации, с тем чтобы избежать непреднамеренной потери клеток, присутствующих в микроуровнах. Это остаточное мультимедиа приводит к небольшому разбавлению добавленного ECM. Это необходимо принимать во внимание при анализе и адаптации из других систем анализа.

Со-культура, описанная здесь, позволяет максимальное взаимодействие опухоли/Т-клеток до вторжения опухолевых клеток: Опухоли и Т-клетки совместно культурированы в течение 2 дней до встраивания в коллаген типа I, а затем выявления выживших и инвазивных опухолевых клеток в течение следующихдвух дней (рисунок 1B). Следует отметить, что, когда со-культура была начата в то время как Т-клетки были повторно использованы в коллагене I, Т-клетки не смогли показать влияние на вторжение опухолевых клеток и цитотоксичность. Этот эффект может быть связано с Т-клеток более распространяется в коллагене и, следовательно, менее сосредоточены вокруг сфероидов. Это говорит о том, что прямое взаимодействие между опухолью и Т-клеток в течение двух дней совместной культуры до вторжения анализ имеет решающее значение для оценки Т-клеток опосредованное воздействие на опухолевые клетки.

Тем не менее, некоторые преимущества этой 3D-модели имеют недостатки. Эта высокая пропускная способность позволяет легко и быстро посева клеток в агарозы бросили в один шаг трубопроводов, в результате чего генерация множества равномерно размера сфероидов в рамках одного литого. Однако, поскольку сфероиды расположены в пределах одного и того же литого, они также могут быть легко удалены, например, во время удаления среды культуры клеток в камере посева и при добавлении Т-клеток для совместной культуры. Таким образом, размер доходности для каждого протокола сильно зависит от технических навыков и опыта следователя, но и от типа анализа выполняется. Как следует из таблицы 1, необходимо учитывать возможную потерю сфероидов примерно на 50% в конце эксперимента. Кроме того, во время посева, клетки не могут в равной степени распределяться по площади посевной камеры, в результате чего более или менее репрезентативные сфероиды в агарозе литой. Из нашего опыта, этот эффект увеличивается с размером агарозы литой. Соответственно, при планировании эксперимента необходимо учитывать тиражи.

Spatiotemporal взаимодействия клеток в рамках 3D-системы могут быть оценены по промежуток времени изображения, который представляет собой еще один вариант мониторинга в этой модели. Кроме того, малый диаметр микроуровн и один шаг трубы к семенным клеткам, подходят для выполнения одноклеточного клонирования. Наконец, образцы пациента (например, из биопсии) могут быть проанализированы в анализе из-за небольшого количества клеток, необходимых для микроуэллов и высокой пропускной способности функции 3D-системы. Включение стимулирующих или блокирующих препаратов (например, анти-PD-1 или анти-PD-L1) для зондирования взаимодействия опухолевых клеток/Т-клеток является логическим продолжением анализа.

В заключение, 3D сфероидная модель совместной культуры, представленная здесь, обеспечивает гибкую основу для мониторинга вторжения раковых клеток и цитотоксичности со-культурных Т-клеток в биологически релевантных условиях. Полученный перекрестный разговор можно визуализировать, сохраняя целостность 3D-культуры и тем самым обеспечивая механистическое понимание опухолевых клеток – Т-клеточных взаимодействий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Виржини Ой, доктора философии, за полезные дискуссии и советы по подходу к 3D-модели совместной культуры. Мы также благодарим Элизабет Джонс за отличную техническую помощь в разделе IHC. Это исследование было поддержано грантами от DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) для YL (LI 2547/4-1) и Национальных институтов здравоохранения AW (R01 CA23 1291), ATR (R01 CA205632), GWP (R01 CA218670) и основной грант онкологического центра (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

Исследования рака Выпуск 160 культура 3D клеток раковые клетки ко-культура коллаген цитотоксичность вторжение иммунофлуоресценция иммуногистохимия т-клетки сфероид опухоли
Мониторинг вторжения раковых клеток и цитотоксичности Т-клеток в 3D-культуре
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter