Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Overvågning af kræftcelleinvasion og T-cellecytotoksicitet i 3D-kultur

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

Den præsenterede tilgang evaluerer samtidig kræftcelleinvasion i 3D-sfæriske analyser og T-celle cytotoksicitet. Sfæroider genereres i et stillads-fri agarose multi-microwell stemmer. Co-kultur og indlejring i type I kollagen matrix udføres inden for samme enhed, som gør det muligt at overvåge kræft celle invasion og T-celle medieret cytotoksicitet.

Abstract

Der er gjort betydelige fremskridt i behandling af kræft med immunterapi, selv om et stort antal kræftformer fortsat er resistente over for behandling. Et begrænset antal analyser giver mulighed for direkte overvågning og mekanistisk indsigt i samspillet mellem tumor og immunceller, blandt hvilke, T-celler spiller en væsentlig rolle i udførelsen af cytotoksiske reaktion adaptive immunsystem til kræftceller. De fleste analyser er baseret på to-dimensionelle (2D) co-kultur af celler på grund af den relative brugervenlighed, men med begrænset repræsentation af den invasive vækst fænotype, en af kendetegnene for kræftceller. Nuværende tre-dimensionelle (3D) co-kultur systemer kræver enten særligt udstyr eller separat overvågning for invasion af co-dyrkede kræftceller og interagerende T-celler.

Her beskriver vi en tilgang til samtidig at overvåge den invasive adfærd i 3D af kræftcelle sfæroider og T-celle cytotoksicitet i co-kultur. Spheroid dannelse er drevet af forbedrede celle-celle interaktioner i stillads-fri agarose microwell kaster med U-formede bunde. Både T-celle co-kultur og kræft celle invasion i type I kollagen matrix udføres inden for mikroopgange af agarose kaster uden behov for at overføre cellerne, og dermed opretholde en intakt 3D co-kultur system i hele analysen. Kollagen matrix kan adskilles fra agarose stemmer, giver mulighed for immunfluorescens (IF) farvning og for konfokale billeddannelse af celler. Celler kan også isoleres for yderligere vækst eller underkastes analyser som for genekspression eller fluorescensaktiv cellesortering (FACS). Endelig kan 3D-samkulturen analyseres ved immunohistochemistry (IHC) efter indlejring og trækning. Mulige ændringer af analysen omfatter ændrede sammensætninger af den ekstracellulære matrix (ECM) samt inddragelse af forskellige stromale eller immunceller med kræftcellerne.

Introduction

På trods af betydelige forbedringer i kræft immunterapi i løbet af det seneste årti, vores mekanistiske forståelse af følsomhed og resistens over for behandlinger er stadig temmelig dårlig1. Det er veletableret, at tumorer udviser betydelig heterogenitet, og at de dynamiske interaktioner af tumorceller med deres mikromiljø samt med immuncellerne, indvirkning tumorcelledød, invasiv adfærd og reaktion på behandlinger, der omfatter immunterapi1,,2,3. Som den ene arm af det adaptive immunsystem udfører T-celler cellespecifik cytotoksicitet. Analysen af T-celle anerkendelse og respons på kræftceller giver mekanistisk indsigt i resistens og følsomhed over for immun modulerende behandlinger.

In vitro modellering og overvågning interaktioner mellem kræft og T-celler i et passende miljø har været udfordrende og hidtil resulterede i begrænset mekanistisk indsigt. De fleste cellebaserede analyser er afhængige af et todimensionelt (2D) miljø, der manglernøglefunktioner,der er afgørende for rekapitulering af den tredimensionelle (3D) in vivo fysiologi4,,5,6, nemlig rumlige celle-celle interaktioner, kontakt med den ekstracellulære matrix (ECM)7, dynamisk metabolisk efterspørgsel, øget hypoxi på grund af massevækst8, og virkningerne af tumor mikromiljø (TME)9. På den anden side er der stadig en række mangler med den i øjeblikket anvendte tre-dimensionelle (3D) co-kultur og invasion assay systemer: (1) den tidskrævende karakter af sfæroide generation og høst5,10, (2) den manglende kontrol over sfæroid størrelse, form og celletæthed11,12, (3) lav-throughput type analyser, (4) kravet om specialudstyr13,14, (5) behovet for at overføre co-kultur i forskellige miljøer for forskellige analyser15,16,17. Især overførsel af en co-kultur assay ofte fører til afbrydelse af sfæroider og tab af co-kultur integritet. Dette gælder især for "løse" sfæroider med reduceret cellecellevedhæftning. For eksempel kræver de fleste 3D-invasionsanalyser, at sfæroider høstes efter deres første dannelse og derefter resuspended i ECM14,15,16. Dette resuspension trin resulterer i et tab af kontrol over afstanden mellem sfæroider. Da afstanden mellem tumor sfæroider påvirker deres invasive adfærd, dette tab af kontrol introducerer høj inter-assay varians og reducerer reproducerbarhed. Endvidere, anvendelsen af celle fraktionering assays af på hinanden følgende centrifugering trin til vurdering af de perifere og tumor sfæroid infiltrerende immunceller er begrænset til tumorcellepopulationer, der genererer mere stabile sfæroider17.

Koncept og tilgang

Vores tilgang omhandler ovennævnte mangler ved hjælp af en "All-in-One"-3D spheroid co-kultur model, som ikke kræver overførsel af sfæroider til efterfølgende analyser. Vi tilpassede en sfæroide dannelsesanordning (se Materialetabel)for at generere en analyse til samtidig overvågning af invasiv adfærd af kræftceller og cytotoksicitet af co-dyrkede T-celler. Denne metode er brugervenlig, billig og giver mulighed for hurtig og nem håndtering i en relativt høj-throughput 3D-indstilling. Afhængig af den anvendte type enhed, kan op til 81 store ensartet størrelse sfæroider genereres i en enkelt pipettering trin med kontrol over den enkelte sfæroid størrelse ved at ændre antallet af celler seedet. Spheroid formation er tvunget af forbedrede celle-celle interaktioner i stillads-fri agarose multi-godt kaster med U-formede bunde. Vi har tilpasset dette 3D-system til dynamiske cellebaserede funktionelle undersøgelser samt endpointmolekylær- og biokemiske analyser, der omfatter fluorescensaktiv cellesortering (FACS), immunfluorescens (IF) eller immunhisistokemi (IHC) farvning samt genekspressionsanalyse af den intakte 3D-co-kultur.

For funktionelle undersøgelser, indlejring sfæroider i type I kollagen i agarose kaster resulterer i invasion af kræftceller fra lige langt fradet spheroids og tillader overvågning væsentlige celle linje-specifikke funktioner, såsom enkelt celle vs kollektiv celle migration18,19. Desuden er kollagenmatrixen let adskilt fra agarosestøbt, hvilket resulterer i en 1\u20122 mm tyk plet, der indeholder flere sfæroider, som kan behandles yderligere til IF-farvning og billeddannelse ved konfokal mikroskopi. Dette kan afsløre forskellige celle invasion og celle-matrix interaktioner i en høj-throughput screening. Også, celler i kollagen matrix kan isoleres efter kollagen fordøjelse og enkelt celle dissociation til efterfølgende celle dyrkning eller analyse.

Til IHC-analyse af sfæroiderkan proteiner eller andre interessemolekyler efter fiksering og trækning af agarosestøbt påvises, samtidig med at spheroids geografiske positioner bevares. I den fremgangsmåde, der er beskrevet her, er sfæroider direkte indlejret i Hydroxyethyl agarose behandling gel i agarose støbt og gelen fungerer som et "låg" for at bevare sfæroider i bunden af mikrobrønde. Efter paraffin indlejring af agarose støbt20, seriel vandret sektion udføres med bunden af stemmer tjener som udgangspunkt.

Denne fremgangsmåde står i kontrast til konventionel IHC-trækning af sfæroider, der kræver høst af celler, før de indlejres i Hydroxyethyl agarosebehandlinggel21 og risikerer afbrydelse af sfæroider og dermed mister den rumlige placering af celler. Også, celle fraktionering ved centrifugering til vurdering af, om immunceller infiltreret eller forblev perifere til tumor sfæroider17 undgås ved direkte indlejring.

Endvidere, 3D co-kultur kan udføres ved at blande tumor, stromale eller immunceller, og dermed studere tumor celle krydstale eller rekapitulere forskellige tumor mikromiljøer til analyse af celle-celle interaktioner, herunder co-kulturer med endotelceller16.

Denne 3D spheroid co-kultur indstilling kan bruges til at udføre co-kultur af forskellige celletyper til stede i tumormikromiljø og til at vurdere virkningerne af ændrede ECM-elementer. Udover type I kollagen, andre ECM komponenter (f.eks matrigel, matrigel / kollagen blandinger, fibronectin), kan anvendes, da tumor celle invasion er påvirket af den overflod af forskellige substrater22. Også mikrobrønde af agarose stemmer er egnet til sfæroide dannelse af primære cellelinjer og for celler med lav celle-celle vedhæftning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En liste og forklaring af nogle ofte anvendte ord i hele protokollen kan findes i supplerende fil 1.

1. Generering af sfæroider

  1. Forbered og autoklave 2% agarose i 1x PBS (f.eks 1 g agarose i 50 ml 1x PBS) og autoklave 35- og 81-microwell gummi forme.
    FORSIGTIG: Undgå at bruge lavt smeltende agarose til generering af agarosestøbt til IHC-behandling.
  2. Forbered agarose kaster
    BEMÆRK: 35-mikrobrønde bruges til invasion, immunfluorescens (IF) og celleisolationsanalyser. 81-microwell kaster anvendes til cytotoksicitet, immunohistochemistry (IHC), celleisolering og RNA ekstraktion assays.
    1. Efter agarose er blevet autoklaveret, lad smeltet agarose afkøle til omkring 60\u201270 °C. I en cellekulturhætte skal du bruge aseptisk teknik og pipette 500 μL smeltet agarose i en 81-mikrooprjævningsform pr. brønd eller 330 μL i en 35-mikrowell gummiform pr. brønd.
      FORSIGTIG: Undgå at skabe bobler, mens du blander eller pipetteres agarose. Fjern eventuelle bobler ved forsigtigt at pipettere.
    2. Efter agarose er størknet, forsigtigt flex gummiform til at fjerne agarose støbt fra det. Herved, placere hænderne over den relevante godt plade og lad agarose støbt falde lige ind i en brønd af godt plade.
      BEMÆRK: Bøj gummiformen på forskellige positioner for at undgå over bøjning. Det kan være nyttigt at flex gummiform og skubbe forsigtigt fra bunden på samme tid.
    3. For at ekvilibrere agarosestøbterne tilsættes cellekulturmedium, der består af DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (2,5 ml/brønd til 12-brøndplade og 1 ml/brønd til 24-brøndplade). Sæt brøndpladen i en cellekulturinkubator (37 °C, 5% CO2) og inkuber i 1 time.
  3. I mellemtiden forberede celle kultur for såning.
    BEMÆRK: Det samlede cellesåningsnummer pr. agarosestøbt besluttes af investigator. For murine primære kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, 35,000 celler/35-microwell støbt og 81,000 celler/81-microwell stemmer (i gennemsnit 1000 celler/sfæroider) er seedet til alle følgende analyser. Den gennemsnitlige diameter af en sfæroid er omkring 150\u2012200 μm efter 48 timer.
  4. Fjern cellekulturmedie omkring agarose støbt med en P1000 pipette først ved at vippe brøndpladen. Fjern derefter forsigtigt mediet i såningskammeret.
  5. Omhyggeligt frø den forberedte tumor celle suspension drop-wise ind i cellen såning kammer. Sæt forsigtigt brøndpladen tilbage i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2) i 15 min.
    BEMÆRK: I dette trin vil cellerne sætte sig ned i mikrobrøndene af agarosestøbt.
  6. Tilsæt yderligere medium til ydersiden af agarose støbt (2,5 ml / godt for 12-brønd plade og 1 ml / godt for 24-brønd plade).
  7. Sæt brøndpladen tilbage i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2) i 48 timer.
    BEMÆRK: Normalt tager det op til et par timer for cellerne at danne sfæroider i mikrowells. Generelt dannes solide tumorcelle sfæroider efter 24 timer og er stabile efter 48 timer. Dette kan dog variere mellem forskellige cellelinjer. Hvis det er nødvendigt, ændre cellekultur medium ved omhyggeligt at vippe godt plade med agarose kaster og fjerne den omgivende celle kultur medium med en P1000 pipette. Derefter forsigtigt tilføje frisk medium ved pipetting det langs væggen af brønden. Normalt er det ikke nødvendigt at ændre medierne i afstøbninger på grund af sin lille volumen og risikoen for at fjerne sfæroider.

2. Co-kultur med T-celler

  1. Det krævede antal T-celler i 75 μL (35 mikrooptøbte) eller i 190 μL (81 mikrooptøbte) af det relevante T-cellekulturmedium (RPMI suppleret med 10% føtalt kvægserum og 100 enheder/ml penicillin/streptomycin).
  2. Fjern først cellekulturmediet omkring agarosestøbt med en P1000-pipette ved at vippe brøndpladen. Fjern derefter langsomt og forsigtigt mediet i støbeskeen ved forsigtigt at målrette det ene hjørne af såningskammeret med en P200-pipette, mens du holder godt pladen vippet med den anden hånd.
  3. (Kritisk trin 1) Da der er risiko for at fjerne sfæroider, kontrol for tab af sfæroider ved at sammenligne antallet af sfæroider i mikrobrønde før og efter fjernelse af mediet ved visning under mikroskopet ved 10x forstørrelse.
  4. Frø forsigtigt T-celle suspension drop-wise ind i såning kammer af agarose støbt ved at holde P200 pipette omkring 0,5 cm over stemmer.
  5. (Kritisk trin 2) Der er en risiko for at skylle spheroids ud, mens du tilføjer T-cellerne. Derfor er det vigtigt at tilsætte T-cellerne meget langsomt og ca. 0,5 cm over såningskammeret.
    BEMÆRK: En mulighed for at reducere antallet af skyllede ud sfæroider er ved at pege pipetten til det ene hjørne af såningskammeret, samtidig med at T-cellerne tilføjes, hvilket kun risikerer, at sfæroiderne i dette hjørne skal skylles ud.
  6. Læg forsigtigt brøndpladen tilbage i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2) i 15 min.
  7. Tag brøndpladen ud fra inkubatoren og tilsæt frisk cellekulturmedium (RPMI suppleret med 10% føtalt kvægserum og 100 enheder/ml penicillin/streptomycin) omkring agarose støbt ved langsomt pipettering det langs væggen af brønden.
  8. Sæt brøndpladen tilbage i cellekulturskuvøsen i 48 timer.

3. Indlejring af 3D co-kultur i type I kollagen matrix

  1. Forbered neutraliseret type I kollagen
    1. Lagerkollagen fortyndes med serumfri basismedium (RPMI) til en endelig arbejdskoncentration på 3 mg/ml. For hver 100 μL fortyndet kollagen tilsættes 11 μL 10x PBS og 1,2 μL 1 M natriumhydroxid (NaOH).
    2. Hold på is og inkuber (neutralisere) i 1 time.
  2. Fjern først cellekulturmediet omkring agarosestøbt med en P1000-pipette ved at vippe brøndpladen. Fjern derefter langsomt og forsigtigt mediet i støbeskeen ved forsigtigt at målrette det ene hjørne af såningskammeret med en P200-pipette, mens du holder godt pladen vippet med den anden hånd.
    BEMÆRK: Her er det afgørende helt at fjerne cellekulturmediet omkring agarosestøbt.
  3. Forsigtigt pipette den neutraliserede kollagen jeg blande drop-wise i såning kammer af agarose støbt ved at holde P200 pipette omkring 0,5 cm over stemmer.
  4. Sæt brøndpladen straks ind i cellekulturinkubatoren i 4 min (35-mikrobrønds stemmer) eller 5 min (81-mikrooptøbninger).
    FORSIGTIG: (Kritisk trin 3) Det er afgørende nøje at holde sig til den givne inkubationstid. Ellers er den invasive adfærd muligvis ikke reproducerbar.
  5. Inverter brøndpladen og lad den vendes i inkubatoren i 1 time.
    BEMÆRK: Støberne forbliver fastgjort til bunden af brøndpladen på grund af overfladespænding. Hvis der anvendes et særligt celledyrtkulturmedium med høj serumkoncentration (f.eks. RPMI suppleret med 20 % føtalt kvægserum), kan et ekstra vasketrin med 1x PBS efter fjernelse af mediet i brønden være nødvendigt for at øge overfladespændingen.
  6. Tag godt ud fra inkubatoren og inverter den tilbage. Tilføj frisk celle kultur medium (RPMI suppleret med 10% føtal kvæg serum og 100 enheder/ml penicillin / streptomycin) omkring agarose støbt ved langsomt pipettering det langs væggen af brønden.
  7. Sæt brøndpladen tilbage i cellekulturskuvøsen i 48 timer.

4. Cytotoksicitetsanalyse

  1. Der tilberedes 3 ml 1x PBS med 2% føtalt kvægserum pr. agarosestøbt.
  2. Efter co-kultur i 4 d fjernes cellekulturmediet omkring agarosestøbt med en P1000-pipette ved at vippe brøndpladen lidt med den anden hånd.
    BEMÆRK: Den samlede tidsperiode for samkultur skal besluttes af investigator.
  3. Fordel 1 ml 1x PBS + 2% FBS med en P1000 pipette ind i såningskammeret for at løsne sfærerne fra mikrobrøndene.
  4. Trin 4.3 gentages to gange med volumen i brønden, og det overføres til et 15 ml rør.
  5. Centrifuge røret ved 300 x g i 10 s ved stuetemperatur (RT).
  6. Fjern forsigtigt supernatanten med en P1000 pipette.
  7. Cellerne vaskes ved at tilsætte 1 ml 1x PBS med 2% FBS og centrifuge ved 300 x g i 1 min. ved RT.
  8. Gentag vasketrinnet (trin 4.7).
  9. Fjern supernatanten, og tilsæt 1 ml celleafskævningsenzymeropløsning (se Materialetabel).
  10. Brug en P200-pipette og pipette op og ned til at bryde celleklyngerne.
  11. Cellerne inkuberes i 20 minutter i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2).
  12. Gentag trin 4.10.
    BEMÆRK: Tag ~ 10 μL ud og frø på en celle kultur parabol til at observere (under mikroskopet ved 10x forstørrelse), hvor godt sfæroider har dissocieret i enkelte celler. Hvis det er nødvendigt, tilsættes 5 min yderligere inkubation.
  13. Der tilsættes 4 ml fuldcellekulturmedium (RPMI suppleret med 10% føtalt kvægserum og 100 enheder/ml penicillin/streptomycin) og blandes ved at vende røret 3\u20124 gange.
  14. Centrifuge ved 400 x g i 4 min. ved RT.
  15. Supernatanten fjernes, og cellerne i FACS-bufferen i FACS-bufferen fjernes for at farve apoptotiske celler i bilag V.
    BEMÆRK: Herfra kan enhver FACS farvning og celleanalyse udføres.

5. Hydroxyethyl agarose behandling gel ingrering til IHC sektionsbesnit

BEMÆRK: Her er det vigtigt at undgå at bruge lavsmeltende agarose til generering af agarosestøbninger.

  1. I slutningen af samkulturen skal du fjerne cellekulturmediet omkring agarosestøbt med en P1000-pipette først ved at vippe brøndpladen. Fjern derefter langsomt og forsigtigt mediet i støbeskeen ved forsigtigt at målrette det ene hjørne af såningskammeret med en P200-pipette, mens du holder godt pladen vippet med den anden hånd.
  2. Langsomt pipette 10% formalin først i såning kammer ved forsigtigt at målrette et hjørne af såning kammer med en P200 pipette. Derefter tilføjes 10% formalin til ydersiden af agarose stemmer, indtil det er helt dækket. Fix agarose støbt i 10% formalin for 1 d.
  3. Fjern formalin på den næste dag.
  4. Pipettes forsigtigt 210 μL (81-mikrooptøbninger) eller 100 μL (35-mikrooptøbninger) af forvarmt og flydende hydroxyethylalgaroseforarbejdningsgel (se materialetabel)drop-wise ind i såingskammeret i agarose støbt ved at holde P200-pipetten ca. 0,5 cm over støbene.
  5. Lad hydroxyethyl agarose behandling gel størkne i 10 min på RT.
  6. Overfør agarose støbt til 1x PBS.
    BEMÆRK: Ved længere opbevaring skal de støbte i 70% ethanol integreres for at undgå kontaminering.
  7. Dehydrer gel sektioner gennem en ethanol serie (1 time hver: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol [3x ændringer hver]). Derefter klar i en clearingopløsning 3x i 1 time hver (f.eks. alifatiske kulbrinter [f.eks. Clearite] eller xylener), og infiltrere med smeltet paraffin (3x i 1 time hver), enten manuelt eller i en vævssystem. Støbte stemmer i paraffin til efterfølgende trækning ved 5 μm pr. sektion.
  8. Fjern voks ved at sætte dias i xylenes, 3x i 3 min hver, derefter rehydrere væv sektioner gennem en gradueret alkohol serie: 100% ethanol i 2 min, 95% ethanol i 1 min, 80% ethanol til 30 s og 70% ethanol til 30 s, derefter sted i vand.
  9. Udfør varmeinduceret epitopudtagning i en grøntsagsdamper ved 100 °C i 20 min. efterfulgt af 20 minutters afkøling i en 10 mM natriumcitrat pH 6,0 opløsning og blok endogene peroxidationer med H2O2.
  10. Bloker sektionerne med normalt målserum og udsæt dem for anti-CD8 antistof (fortynding 1/25) natten over.
  11. Påfør anti-kanin-HRP konjugerede sekundære antistoffer (se Tabel over materialer)og udvikle farvning ved hjælp af 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) kroagen. Counterstain kerner med en 11% Harris hæmatoxylin løsning (se Tabel over materialer).

6. Overvågning og analyse af spheroid invasion i co-kultur

BEMÆRK: Tidspunktet for billeddannelse spheroid invasion i kollagen I matrix skal afgøres af investigator. Ansk af cellekulturbilleder ved hjælp af et omvendt mikroskop med 10x forstørrelse. Det ideelle tidspunkt afhænger af den cellelinje, der testes, samt ECM-komponenten. Mere invasive cellelinjer vil begynde at sprede sig i kollagen inden for et par timer efter tilsætning af kollagen. Da T-cellerne i co-kultur kan forhindre en fuld visning af udgang fra sfæroider på meget tidlige tidspunkter, generelt billeder er taget på 0 h (som reference), 24 h og 48 h efter tilsætning af kollagen.

  1. Mængdeat invasiv ved manuelt at tælle antallet af "pigge", der kommer ud fra sfæroide og / eller ved hjælp af billedanalyse software, f.eks Billede J.
    1. Analysér invasion som antallet af "pigge" fra sfæroiden ved manuelt at tælle antallet af "pigge" af en sfæroid.
      BEMÆRK: Det skal besluttes af investigator, som fremspring fra sfæroider betragtes som "pigge". En beslutning kriterium kunne være længden af "spike" målt fra kanten af sfæroid.
    2. Analysér invasion som invasionsområdet i forhold til størrelsen af sfæroiden.
      1. Brug frihånds tegneværktøjet (Billede J) til at spore kanten af det samlede areal (invasion + sfæroide område).
      2. Klik på Analysér i den øverste menu, og klik derefter på Målér for at få vist områdemålingen.
      3. Spor grænsen for det samlede sfæroide område.
      4. Klik på Analysér i den øverste menu, og klik derefter på Målér for at få vist områdemålingen.
      5. Kopier listen over målte resultater i et regneark, og beregn den samlede invasion/sfæroide ved hjælp af formlen: total invasion = totalareal/sfæroid område.

7. Immunfluorescens farvning

  1. Forbered følgende.
    1. Forbered 5,4% formalin (5 ml) ved hjælp af 2,3 ml 1x PBS og 2,7 ml 10% formalin.
    2. Forbered 0,5% Octoxynol (50 ml) ved hjælp af 50 ml 1x PBS og 2,5 ml 10% Octoxynol (opbevares på RT).
    3. Forbered IF Buffer (200 ml) ved hjælp af 200 ml 1x PBS, 200 mg kvæg serumalbumin (BSA), 4 ml Octoxynol, 1 ml 10% polysorbat 20 (varm op til RT før brug; filter og opbevares ved 4 °C).
    4. Der klargør blokeringsopløsningen (5 ml) med 5 ml IF-buffer og 500 μL gedeserum (varm op til RT før brug).
    5. Hold 8-brønd kammerdias, glasdæksler og monteringsmedier klar.
  2. Dag 0
    1. Fix hele agarose stemmer, herunder sfæroider, natten over i 5,4% formalin på RT i et befugtet kammer.
  3. Dag 1
    1. Fjern cellekulturmediet omkring agarosestøbt med en P1000-pipette ved at vippe brøndpladen.
    2. Overfør kollagen patch i en 8-brønd kammer dias ved at gribe et hjørne af kollagen matrix i såning kammer af agarose støbt med slanke spids pincet og skræl det ud agarose støbt i en enkelt, sikker bevægelse.
      BEMÆRK: Kollagenplasteren skal let adskilles fra agarosestøbt. Ellers skal du bruge en P1000 pipette til omhyggeligt at tilføje kultur medium i området af såning kammer eller vende agarose støbt og forsigtigt ryste godt plade til at løsne kollagen matrix.
    3. Der tilsættes 250 μL 0,5 % Octoxynol (se Materialetabel)pr. brønd. Inkubere i 1 time på RT.
    4. Aspirere Octoxynol og tilsæt 250 μL blokerende opløsning pr. brønd. Blok i 1 time på RT.
    5. I mellemtiden fortyndes det primære antistof (fortynding for anti-keratin 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) i blokeringsopløsningen, der beregnes for 250 μL pr. brønd.
    6. Tilsæt det primære antistof i blokerende opløsning og læg kammeret dias i et befugtet kammer til natten inkubation på RT.
  4. Dag 2
    1. Fjern det primære antistof ved blokerende opløsning ved at aspirere.
    2. Vask 3 gange ved at tilsætte 300 μL IF Buffer og lad det sidde i 5 min på RT.
      BEMÆRK: Bare lad det sidde, er der ingen grund til at sætte det på en shaker.
    3. Det sekundære antistof fortyndes ved blokerende opløsning (for anti-keratin 8: anti-rotte, fortynding 1/500).
    4. Der tilsættes 250 μL sekundært antistof i blokereopløsningen til hver brønd og inkuberes i 1 time ved RT. Fra nu af skal du beskytte prøverne mod lys.
    5. Fjern det sekundære antistof ved blokerende opløsning ved at aspirere.
    6. Vask 3 gange med 300 μL IF Buffer ved at tilføje og lad det sidde i 5 min på RT.
    7. Skyl prøverne med 1x PBS og aspirere den.
    8. Fjern forsigtigt væggene i kammerets dias, så kun glasset glider i bunden tilbage.
    9. Der tilsættes mindst 200 μL monteringsmedier til en glasdækslæb, og dækslæbetdd langsomt slippes over prøven.
      BEMÆRK: Undgå at oprette bobler, da dette vil påvirke billedkvaliteten. Bobler kan undgås ved forsigtigt at placere dækslet på den lange kant af diaset i en vinkel på 45° eller langsomt sænke dækslet på sliden.
    10. Sæt de monterede prøver i et mørkt og tørt sted og lad det sidde natten over. Billeddannelse kan udføres den følgende dag.
      BEMÆRK: Dækslæbet kan i første omgang skifte en smule, når den er placeret over kollagenplasteren. Lad glasset glide sidde på et jævnt område i et par minutter. Dækslet vil flade ud prøven, så der ikke vil være nogen afstand tilbage mellem glas dias og coverslip over tid.

8. Isolering af celler fra kollagenmatrixen

  1. Forbered følgende.
    1. Der tilberedes 1 mg/ml kollagenase 4 i serumholdigt cellekulturmedium (opbevar aliquoterede kollagen 4 fortyndinger ved -20 °C)
    2. Forbered 2,5% BSA i 1x PBS og pels alle rør og pipette spidser med det (filter BSA løsning før brug).
    3. Forvarm BSA-opløsningen og cellekulturmediet før brug.
  2. Forbered 2 ml kollagen 4 opløsning (1 mg/ml) til at fordøje et maksimum på tre kollagen matricer fra 35-microwell agarose kaster.
  3. Overfør op til tre 75 μL kollagenmamakker fra 35-mikrowell agarosestøbt i et 2,5% BSA forbelagt 15 ml rør. Tag fat i et hjørne af kollagenmatrixen i agaroses såningskammer med slanke spidståceser og skræl det af agarose støbt i en enkelt, selvsikker bevægelse.
  4. Facet-cut spidsen af en P1000 spids med en saks. Forfrakke den resterende spids med 2,5% BSA og nedbryde kollagen matrix så meget som muligt ved pipettering op og ned. Rør i 15 min. inkuberes ved 37 °C.
  5. (Kritisk trin 4) Ved hver 5 min, kontrollere, om kollagen matrix er opløst. Pipette op og ned igen, før du tager 10 μL af prøven ud og frø den på en cellekulturskål til observation under mikroskopet ved 10x forstørrelse. Tilføj yderligere 5 min hvis det er nødvendigt.
  6. Fyld røret med 10 ml præwarmed cellekultur medium (DMEM suppleret med 10% føtal kvæg serum). Bland forsigtigt ved at vende røret 3\u20124 gange.
  7. Centrifuge røret ved 400 x g i 4 min.
  8. Fjern forsigtigt supernatanten og lad 2 ml volumen.
  9. (Kritisk trin 5) Efterlad 2 ml efter det første centrifugeringstrin, da der stadig kan være uopløst kollagen i bunden af røret, der indeholder celler langs dem.
  10. Udfør to vasketrin ved at tilføje 10 ml serumholdigt cellekulturmedium hver gang. Centrifuge hver gang ved 400 x g i 4 min.
  11. Efter det sidste vasketrin skal du fjerne så meget medium som muligt og kun lade cellepilpellet være.
  12. Opslæmning af cellepillen i 1 ml celle dissociationsenzymeropløsning (se Materialetabel).
  13. Brug en P200-pipette og pipette op og ned til at bryde celleklyngerne.
  14. Cellerne inkuberes i 20 minutter i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2).
  15. Gentag trin 8.13.
    BEMÆRK: Tag ~ 10 μL ud og frø på en celle kultur parabol til at observere under mikroskopet ved 10x forstørrelse for at se, hvor godt sfæroider har dissocieret i enkelte celler. Hvis det er nødvendigt, tilsættes 5 min yderligere inkubation.
  16. Tilsæt 4 ml cellekulturmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum) og blandes ved at vende røret 3\u20124 gange.
  17. Centrifuge ved 400 x g i 4 min. ved RT.
  18. Fjern supernatanten. Herfra og fremefter kan FACS farvning eller cellekultur udføres.

9. RNA-ekstraktion fra kollagenmatrixen

  1. Forbered guanidinium thiocyanat med phenol (se Tabel over materialer),100% chloroform, 70% RNase-fri ethanol, RNA ekstraktionssæt (se Tabel over materialer),RNase-fri 1,5 ml rør, RNase-fri 15 mL rør og RNase-fri ddH2O.
  2. Overfør op til tolv 190 μL kollagenmamacer fra 81-microwell agarose kaster i et 15 ml rør. Tag fat i et hjørne af kollagenmatrixen i agaroses såningskammer med slanke spidståceser og skræl det af agarose støbt i en enkelt, selvsikker bevægelse.
    BEMÆRK: Matriklerne kan også fryses ved -80 °C, indtil de er klar til RNA-ekstraktion.
  3. Der tilsættes 1 ml guanidinium thiocyanat med phenol (se Materialetabel)til kollagenmaskerne i 15 ml-røret.
    BEMÆRK: Guanidinium thiocyanate med phenol skal helt dække kollagen matricer.
  4. Vortex rørene for 10\u201220 s.
  5. Homogeniser matricerne med 20 G nåle og 5 ml sprøjter, indtil de er helt opløst.
  6. Lad matricer sidde i 5 min på RT.
  7. Der tilsættes 200 μL ren chloroform til matricer og rystes kraftigt i 15 s.
  8. Blandingen overføres straks til 1,5 ml rør.
  9. Lad blandingen sidde i mindst 5 min ved RT, indtil faserne er adskilt.
  10. Centrifuge de 1,5 ml rør ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C.
  11. Fyld et nyt 1,5 ml rør med 500 μL 70% ethanol.
    BEMÆRK: Afhængig af volumenet af den vandige fase efter centrifugering (se trin 9.12. dette er muligvis ikke 500 μL. Mængden af 70% ethanol skal være lig med mængden af den vandige fase.
  12. Overfør forsigtigt den øvre vandige fase af centrifugerede prøver til det 70% ethanolfyldte rør og bland grundigt ved at pipettere op og ned.
  13. (Kritisk trin 6) Pas på ikke at forstyrre lagene i bunden af guanidinium thiocyanate med phenol adskillelse, mens du fjerner den øvre fase, da dette vil forurene RNA.
  14. Tilføj prøven til en RNA-ekstraktionssøjle (inkluderet i RNA-ekstraktionssættet, se Materialetabel). Fra nu af skal du følge producentens protokol for RNA-rensning fra celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D-samkulturmodellen giver mulighed for forskellige analyser, der er vist i figur 1A, og som kan kombineres eller ændres efter behov. I vores etablerede eksperimentelle setup, tumor og T-celler er co-kulturperlede i 2 dage efterfulgt af indledningen af invasionen assay for udvælgelse af invasive og / eller resistente tumorceller (Figur 1B). På dag 4 udføres indskrækningen af invasionen, og "overlevende" celler isoleres fra kollagenmatrixen eller behandles direkte til RNA23 eller DNA-ekstraktion fra matrix (Figur 1B). Indlejring af 3D-kulturen i type I kollagen i mikrobrøndene af agarose stemmer giver overvågning og analyse af invasion ved hjælp af Billede J til først at afgrænse det samlede areal ved hjælp af softwarens frihånds tegneværktøj og derefter beregne forholdet over de afgrænsede sfæroide område (Figur 2A), og / eller ved at tælle antallet af "pigge" forlader sfæroid. Ved hjælp af to primære murine pancreas cancer cellelinjer (celle linje 1 og celle linje 2), forskellige sfæroide former og invasiv adfærd blev observeret og kvantificeret i overensstemmelse hermed (Figur 2B). Celle linje 1 viser en mere kompakt sfæroide dannelse og "strittende" invasion, der kan sammenlignes med en enkelt celle invasion, mens celle linje 2 danner mere løse sfæroider og viser en kollektiv invasion mønster (Figur 2C). Co-kultur blev udført med to forskellige tumor kloniske cellelinjer seedet på samme tid (Figur 3A\u2012E) til at følge deres interaktioner under efterfølgende analyser, og med tumorceller og T-celler på tumor sfæroide dannelse (Figur 3F \u2012J). Til detaljeret vurdering af den invasive adfærd blev der udført immunfluorescerende farvning (Figur 4). Efter adskillelse af kollagen matrix fra agarose støbt, HVIS farvning, og overførsel til et glas dias (Figur 4A\u2012B), konfokal billeddannelse blev udført i en høj-gennemløb måde (Figur 4C \ u2012J). Størrelsen og konsistensen af agarose støbt tillade indlejring af hele 3D-kultursystemet i paraffin til seriel sektion og immunohistochemistry (IHC) farvning for kvantificering af den rumlige forhold mellem tumor og T-celler (Figur 5). T-celler til stede i afsnittet kan identificeres og yderligere karakteriseret ved celleoverflade markør farvning eksemplificeret her for CD8 (Figur 5D, E). T-celler, der har infiltreret tumor sfæroide kan tælles i forhold til dem, der forblev i periferien af sfæroide. Figur 5D,E viser eksempler på tydelig infiltration af T-celler i tumor sfæroider dyrket fra tumorcellelinje 1 (D) og cellelinje 2 (E). Tabel 1 viser typiske eksperimentelle opsætninger for analyserne og udbyttet af repræsentative og analyserbare prøver ved forsøgets afslutning for hver protokol.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang, analyser og tidsplan for eksperimenter. (A)En 81-microwell og 35-microwell gummi skimmel er fyldt med 2% agarose i 1x PBS til at generere en agarose støbt med flere mikroboser. Diameteren af en gummiform er 3,5 cm. Størrelsen af 35-microwell agarose støbt er 13 mm x 8 mm, og af 81-microwell støbt er 13 mm x 13 mm. Sfæroider dannes ved cellesebing ind i kamrene i agarose støbt i et enkelt pipetteringstrin. Co-kultur med T-celler udføres inden for samme stemmer. Funktionel overvågning og potentielle analyser er vist. BB) Tidsplan for eksperimenter. Tumorceller er co-kulturperlede med autologe T-celler i 2 dage giver mulighed for en maksimal interaktion mellem begge celletyper. Invasionen assay indledes efter to dage. Endepunktsanalyser udføres efter yderligere to dage for at overvåge tumorcellernes invasive og overlevelsesfenotype samt spredning og overlevelse af T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kvantificering af invasionen. Invasion kan kvantificeres ved billedanalyse, fx ved hjælp af Image J software og tælle antallet af "pigge" per spheroid. A) Beregning af det samlede invasionsområde som forholdet mellem det samlede areal og sfæroide område. Skala bar: 300 μm. (B) Eksempler på to forskellige primære murine kræft i bugspytkirtlen cellelinjer (celle linje 1 og 2) i sfæroide dannelse ved forskellige forstørrelser og invasion i type I kollagen. (C) Analyse af invasionen udføres ved at tælle antallet af pigge pr. spheroid (venstre diagram; fejllinjer: 2,63 for cellelinje 1, 1,47 for cellelinje 2) og beregne invasionsområdet som beskrevet (højre diagram; fejllinjer: 0,36 for cellelinje 1, 1,28 for cellelinje 2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Co-kultur med farvestof-mærket tumor og T-celler. (A\u2012E) Blanding af to forskelligt farvestof-mærket primær murine kræft i bugspytkirtlen kloncellelinjer (grøn og rød) og forstørret opfattelse af en repræsentativ microwell (B\u2012E). (F\u2012J) Co-kultur af præ-mærket tumor (grøn) og T-celler (rød). (G\u2012J) Forstørret opfattelse af en repræsentativ microwell viser en tumor-T-celle co-kultur på tumor sfæroide dannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Immunofluorescensfarvning. Immunofluorescens (IF) farvning blev udført efter adskillelse af kollagen matrix fra agarose stemmer. (A\u2012B) Efter HVIS farvning, kollagen patches overføres til et glas dias og dækket med glas coverslips. (C\u2012F) Eksempel på en IF-plettet kollagen patch herunder tumor sfæroider med (C) Hoechst,(D) keratin 8,(E)fallosid og(F)overlay. Paneler (G\u2012J) Vis den respektive forstørrede visning af en enkelt sfæroid. Skalalinje = 300 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Trækning af immunhisistokemi. Den agarose støbt med 3D-kultur nedsænket i hydroxyethyl agarose forarbejdning gel, blev indlejret i paraffin, sektionsopdemet og forarbejdet til immunohistochemistry (IHC) farvning. (A)Paraffin blok, der anvendes til vandret trækning, der starter fra bunden af agarose støbt for at opnå serielle dele af flere tumor celle / T-celle co-kulturer inden for en enkelt støbt; skala bar = 5 mm. (B) Hematoxylin & eosin-farvede del af en agarose støbt indeholder 3D co-kultur af tumor og T-celler. Skalabar: 1 mm.(C)Forstørret visning af en H&E-farvet co-kultur i agarose-castet. CD8 farvning af T-celler co-kulturperpert med cellelinje 1 (D) og cellelinje 2 (E). Skalabarer i C\u2012E = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protokollen typisk opsætning celler seedet (pr. støbt) typisk udbytte
cytotoksicitetsanalyse 2x 81-microwell kaster 81,000 100.000 celler
IHC-analyse 1x 81-microwell stemmer 81,000 40 sfæroider
Invasion assay 2x 35-microwell kaster 35,000 50 sfæroider
IF-analyse 2x 35-microwell kaster 35,000 50 sfæroider
Celleisolering fra kollagen I 2x 35-microwell kaster 35,000 50.000 celler
RNA-ekstraktion fra kollagen I 12x 81-microwell kaster 243,000 400-600 ng/μl

Tabel 1: Typisk eksperimentel opsætning og udbytte for protokollerne. Tabellen viser den typiske eksperimentelle opsætning for hver protokol og det typiske udbytte af analyserbare prøver (antal celler, sfæroider eller RNA-koncentration) ved afslutningen af eksperimentet. IHC= immunohistokemi; IF= immunfluorescens.

Supplerende sag 1. Klik her for at downloade denne fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden præsenteres her beskriver 3D tumor sfæroid generation, som giver mulighed for co-kultur med T-celler, celle-baserede funktionelle og molekylære assays, samt en række overvågning og analyse muligheder ved hjælp af en enkelt enhed. Den største fordel ved vores tilgang er, at det ikke kræver overførsel af 3D-kulturen til en separat analyse og fastholder integriteten af 3D-kulturen i hele analyserne.

Den arbejdsproces, der præsenteres her, kan ændres efter behov. Inkubationstiderne for sfæroiddannelse, T-celle co-kultur eller cytotoksicitetsanalyse kan være nødvendigt at ændre for forskellige forsøgsbetingelser eller cellelinjer.

Der er et par skridt i hele analyserne, som kræver tæt overholdelse af protokollen. Disse er generelt: fjernelse af cellekulturmediet, før der tilføjes en anden cellelinje til samkultur, samt indlejring af 3D-kulturen i ECM eller hydroxyethyl agarose behandlingsgel i agaroseafstøbt. Det er helt afgørende at langsomt og forsigtigt fjerne mediet af såning kammer ved at vippe godt plade og målrette det ene hjørne af kammeret med en mikropipette. Så længe agaroseafstøbt indeholder celler, anbefaler vi altid at fjerne ethvert medium i brønden med en mikropipette i stedet for at bruge en pipettor. Tilføjelse af en anden cellelinje og indlejring i ECM eller hydroxyethyl agarose behandling gel skal udføres langsomt og drop-wise for at forhindre rødmen ud cellerne i mikrobrønde. Det mest kritiske skridt i kollagen invasion assay er inkubationstiden før invertere kaster i godt plade med brøndene. Reduktion af tiden kan forårsage kollagen til at falde ud fra stemmer, og overstiger den tid, kan forårsage kulturen, der skal trykkes ned til bunden af mikrobrønde, hvilket resulterer i ujævnt fordelt sfæroid invasion. Invertering af stemmer gør det muligt for celler i mikrobrønde til helt nedsænkning i den flydende kollagen, før det polymeriserer og størkner. Overfladen spænding mellem agarose støbt og plast bunden af godt plade, genererer en "hængende-drop"15,24 under 3D sfærisk invasion.

Det er vigtigt at bemærke, at inkubationstiden før invertering af afstøbninger er blevet etableret for indlejring i type I kollagen. Med andre ECM-komponenter skal dette trin justeres i overensstemmelse hermed. Bemærk, at fuldstændig fjernelse af resterende medier ikke bør forsøges at undgå et utilsigtet tab af celler i mikrowells. Dette resterende medie resulterer i en let fortynding af den ekstra ECM. Dette skal tages i betragtning ved analyse og tilpasning fra andre analysesystemer.

Den co-kultur, der er beskrevet her giver mulighed for en maksimal tumor / T-celle interaktion før invasionen af tumorceller er analyseret: Tumor og T-celler er co-kulturperlede i 2 dage før indlejring i type I kollagen og derefter identificere overlevende og invasive tumorceller i løbet af de næste to dage (Figur 1B). Af note, når co-kultur blev indledt, mens T-celler blev resuspended i kollagen I, T-celler undladt at vise en indvirkning på tumor celle invasion og cytotoksicitet. Denne effekt kan skyldes, at T-cellerne er mere fordelt i kollagen og dermed mindre koncentreret omkring sfæroider. Dette tyder på, at den direkte interaktion mellem tumor og T-celler i løbet af de to dage af co-kultur forud for invasionen analysen er afgørende for vurdering af T-celle medieret effekter på tumorceller.

Ikke desto mindre, nogle af fordelene ved denne 3D-model kommer med ulemper. Denne høj-throughput indstilling giver nem og hurtig såning af celler i agarose støbt i en pipettering trin, hvilket resulterer i oprettelsen af et væld af ensartet størrelse sfæroider inden for en støbt. Men da sfæroiderne alle er placeret inden for samme støbte, kan de også let fjernes, f.eks. Derfor er mængden af udbytte for hver protokol stærkt afhængig af investigators tekniske færdigheder og erfaring, men også af den type analyse, der udføres. Som det foreslås i tabel 1, skal der tages hensyn til et muligt tab af sfæroider på ca. 50 % ved afslutningen af et eksperiment. Desuden kan cellerne under såningstrinnet ikke fordele sig ligeligt over såingskammerets område, hvilket resulterer i mere eller mindre repræsentative sfæroider i agarosestøbt. Fra vores erfaring, denne effekt stiger med størrelsen af agarose stemmer. Derfor skal replikerer tages i betragtning under planlægningen af eksperimentet.

Den spatiotemporale interaktion af celler i 3D-systemet kan vurderes ved tid bortfalder billeddannelse, som præsenterer en anden overvågningsmulighed i denne model. Desuden er mikrobrøndenes lille diameter og enkeltrørtrinnet til frøceller egnede til udførelse af enkeltcellekloning. Endelig kan patientens prøver (f.eks. fra biopsier) analyseres i analysen på grund af det lille antal celler, der kræves til mikrobrøndene, og 3D-systemets højoverførselsfunktion. Inddragelsen af stimulerende eller blokerende lægemidler (f.eks. anti-PD-1 eller anti-PD-L1) til sonde tumorcellen/T-celle interaktionen er en logisk forlængelse af analysen.

Afslutningsvis, 3D spheroid co-kultur model præsenteret her giver en fleksibel ramme for overvågning af kræft celle invasion og cytotoksicitet af co-dyrkede T-celler i en biologisk relevant indstilling. Den resulterende krydstale kan visualiseres og samtidig bevare integriteten af 3D-kulturen og dermed give mekanistisk indsigt i tumorcelle – T-celle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Virginie Ory, ph.d. for nyttige diskussioner og råd om tilgangen af 3D-samkulturmodellen. Vi takker også Elizabeth Jones for fremragende teknisk bistand med IHC sektionsafsnit. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) til YL (LI 2547/4-1) og National Institutes of Health til AW (R01 CA231291), til ATR (R01 CA205632), til GWP (R01 CA218670), og Core Grant af Cancer Center (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

Kræftforskning 3D celle kultur kræftceller co-kultur kollagen cytotoksicitet invasion immunfluorescens immunohistochemistry t-celler tumor sfæroide
Overvågning af kræftcelleinvasion og T-cellecytotoksicitet i 3D-kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter