本文所述方案重点介绍了诱导多能干细胞分化为类脑内皮细胞的主要步骤、用于感染的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的制备，以及用于其他分子分析的样本采集。
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摘要
摘要
流行性脑脊髓膜炎是一种危及生命的感染性疾病，当脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，简称Nm）穿透高度特化的脑内皮细胞（BECs）进入中枢神经系统（CNS）时即可发生。由于Nm是仅感染人类的病原体，缺乏可靠的体内模型系统，使得研究Nm与BEC之间的宿主-病原体相互作用具有挑战性，因而迫切需要建立一种能够模拟天然BEC的人源模型。与外周内皮细胞相比，BEC具有更强的屏障特性，表现为复杂的紧密连接结构以及较高的跨内皮电阻（TEER）。然而，许多体外模型（如原代BEC和永生化BEC）在脱离天然神经微环境后，要么缺乏屏障特性，要么会迅速丧失这些特性。近年来人类干细胞技术的进步已开发出从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化获得类脑内皮细胞的方法，相较于其他体外人源模型，该方法能更准确地模拟BEC的表型。利用iPSC来源的BEC（iPSC-BECs）来建模Nm与BEC的相互作用，其优势在于使用了具有BEC屏障特性的真正人类细胞，可用于研究屏障破坏、先天免疫激活以及细菌与细胞的相互作用。本文将展示如何从iPSCs分化获得iPSC-BECs，并介绍细菌制备、感染过程及样本采集分析的方法。
引言
血脑屏障（BBB）和脑膜血液-脑脊液屏障（mBCSFB）是极为紧密的细胞屏障，可将循环系统与中枢神经系统（CNS）分隔开来，主要由高度特化的脑内皮细胞（BECs）构成1,2。BECs共同通过调控营养物质和代谢废物进出大脑来维持大脑正常的稳态，同时阻止多种毒素、药物和病原体进入1,2。当血源性细菌能够与BECs构成的屏障相互作用并穿透该屏障引发炎症时，就会发生细菌性脑膜炎。Neisseria meningitidis（Nm，脑膜炎奈瑟菌）是一种革兰氏阴性菌，可在10‒40%健康个体的鼻咽部定植，但在某些情况下可引起严重的全身性疾病3。在感染者体内，Nm可进入血流，导致暴发性紫癜，并可穿透BECs进入中枢神经系统，引发脑膜炎3。Nm是全球细菌性脑膜炎的主要致病菌之一，尽管已有疫苗投入使用，它仍是脑膜炎的主要病因之一4。现代医学干预手段（如抗生素治疗）已使这些疾病具备可治愈性，但罹患脑膜炎的患者往往遗留永久性神经功能损伤5,6。<....
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方案
注意：所有培养基/试剂的配制、干细胞的维持以及分化步骤均改编自 Stebbins 等人22。
1. 准备iPSC培养和BEC分化所需的材料。
- 用于 IMR90-4 诱导多能干细胞培养的组织培养（TC）塑料表面基质包被
- 将基底膜基质凝胶（例如 Matrigel）分装为每份 2.5 mg，于 -20 °C 保存。
注意：处理基质凝胶时需迅速操作，并在冰上进行分装，因其在高于 4 °C 时会形成凝胶，一旦凝固则无法分装。 - 进行 TC 塑料包被时，迅速将一份基质凝胶加入含有 30 mL DMEM/F12 培养基的 50 mL 锥形管中。向冷冻的基质凝胶中加入 1 mL 培养基，反复吹打直至完全解冻，立即转移至含其余培养基的 50 mL 锥形管中。
- 每孔 6 孔板使用 1 mL 基质凝胶包被液，每瓶 T75 培养瓶使用 12 mL。
注意：基质凝胶包被的 TC 塑料可在使用前两周内制备。但必须避免包被液干燥，必要时可定期向孔中补充 DMEM/F12 培养基。
- 将基底膜基质凝胶（例如 Matrigel）分装为每份 2.5 mg，于 -20 °C 保存。
- 在生物安全柜的无菌环境中，将 50 mL 的 50x 添加剂加入 450 mL 干细胞维持基础培养基中，配制干细胞维持培养基。
注意：其他干细胞维持培养基（如 mTeSR 和 E8）已在其他研究中使用....
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结果
本文所述方案改编自 Stebbins 等人的研究，重点介绍将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为具有血脑屏障（BBB）特性的类脑内皮细胞的方法，以及如何利用 iPSC-BECs 模型开展脑膜炎奈瑟菌（Nm）感染研究19,22。iPSC-BECs 在正确分化后，可形成紧密的屏障结构，其跨内皮电阻（TEER）通常高于 2000 Ω·cm2，并表达内皮细胞标志物，如 VE-钙黏蛋白和 CD31（PECAM）（图 1A‒C）。此外，它们还表达并定位紧密连接蛋白标志物 Claudin-5、Occludin 和 ZO-1（图 1D‒F），以及 Glut-1 等转运蛋白（图 1G）。在感染 Nm 后，iPSC-BECs 会通过上调中性粒细胞趋化性促炎细胞因子作出反应，q.......
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讨论
建立BECs和BBB模型一直面临挑战，因为原代和永生化的人BECs， 体外，往往缺乏强健的屏障表型。人类的出现 干细胞技术已经 允许生成 由iPSC衍生的类BEC细胞 保留预期的标志性特征 血脑屏障表型，例如 内皮标志物，紧密 连接表达，屏障 性质，对其他因素的响应 中枢神经系统细胞类型及功能 外排转运蛋白12,13,14,15, 22, 24, 25这使得研究人员能够利用BECs 体外 高度模拟 体内 脑微血管内皮细胞（BE.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
L.M.E. 受 A. S-U. 负责的德国研究基金会（DFG）研究培训项目 GRK2157“用于研究人类病原体微生物感染的三维组织模型”的资助。B.J.K. 受亚历山大·冯·洪堡基金会博士后奖学金资助。此外，我们感谢 Lena Wolter 在培养 iPSC-BECs 过程中提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | 酶解细胞解离试剂 |
| 乙酸 | Sigma | A6283 | |
| 全反式维甲酸（RA） | Sigma | R2625 | |
| 抗CD31（PECAM-1） | 赛默飞世尔科技（Labvision） | RB-10333 | |
| 抗紧密连接蛋白-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| 抗Glut-1 | 赛默飞世尔科技（Labvision） | SPM498（MA5-11315） | |
| 抗闭合蛋白 | Invitrogen | 33-1500 | |
| 抗VE-钙黏蛋白 | Santa Cruz | sc-52751 | |
| 抗ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto蛋白胨 | BD | 211684 | |
| β-巯基乙醇 | 默克（Sigma-Aldrich） | 805740 | |
| 细胞培养板和培养瓶 | Sarstedt | ||
| 离心机（Heraeus Megafuge 1.0R） | 赛默飞世尔科技 | ||
| II级生物安全柜 | Nuaire | NU-437-400E | |
| CO2 培养箱（DHD Autoflow CO2 气套式培养箱） | Nuaire | ||
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533 | |
| 哥伦比亚琼脂 + 5% 羊血 | 生物梅里埃 | 43049 | |
| Costar Transwell 聚酯膜小室（12 孔或 24 孔） | 康宁 | 3460, 3470 | |
| D(+)-葡萄糖 | 默克（Sigma-Aldrich） | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 21600-069 | |
| 上皮细胞伏特-欧姆计（Millipore ERS-2）配STX电极 | 默克（密理博） | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| 纤连蛋白 | Sigma | F1141 | |
| 荧光显微镜（Eclipse Ti） | 尼康 | ||
| 血细胞计数板（Neubauer） | A. Hartenstein | ZK06 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | PeproTech | 100-18B | |
| 人内皮细胞无血清培养基（hESFM） | Gibco | 11111-044 | |
| 倒置显微镜（Wilovert） | 洪德（Will Wetzlar） | ||
| iPS(IMR90)-4 细胞 | WiCell | ||
| Kellogg's 补充剂 | 要配制 110 ml Kellogg 补充剂，需准备 100 ml 含 4 g/ml 葡萄糖、0.1 g/ml 谷氨酰胺和 0.2 mg/ml 硫胺素焦磷酸的溶液，以及 10 ml 5 mg/ml Fe(NO₃)₃ 溶液。3)3 混合溶液，过滤除菌，分装后于 -20 保存 °C. | ||
| 敲除血清替代物（KOSR） | Gibco | 10828-028 | |
| L-谷氨酰胺（GlutaMAX） | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix 试剂盒 | NEB | E3010L | cDNA合成试剂盒 |
| 基质胶基质 | 康宁 | 354230 | |
| 甲醇 | ROTH | 4627.5 | |
| MgCl₂2 | ROTH | KK36.1 | |
| 微量移液器（Research Plus） | Eppendorf | ||
| NaHCO₃3 | ROTH | 6329 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Gibco | 11140-035 | |
| NucleoSpin RNA 提取试剂盒 | Machery-Nagel | 740955 | RNA提取试剂盒 |
| 移液器助吸器（Accu-Jet Pro） | 品牌 | ||
| 牛血小板贫乏血浆来源血清（PDS） | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | 应用生物系统公司 | A25742 | qPCR预混液 |
| qPCR薄膜（MicroAmp光学粘性薄膜） | 应用生物系统公司 | 4211971 | |
| qPCR板（MicroAmp Fast 96孔板） | 应用生物系统公司 | 4346907 | |
| ROCK抑制剂，Y27632二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR扩增仪（StepOnePlus） | 应用生物系统公司 | 4376600 | |
| 血清移液管 | Sarstedt | ||
| StemFlex 基础培养基 + 50 倍 StemFlex 添加剂 | Gibco | A3349401 | 干细胞维持培养基 |
| 水平转子（Heraeus #2704） | 赛默飞世尔科技 | ||
| 焦磷酸硫胺素 | Sigma | C8754-5G | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | 非酶解细胞解离试剂（EDTA） |
参考文献
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
