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Summary
这里描述的方案强调了分化诱导多能干细胞衍生的脑样内皮细胞、用于感染的 脑膜炎奈瑟菌 的制备以及用于其他分子分析的样本收集的主要步骤。
Abstract
脑膜炎球菌性脑膜炎是一种危及生命的感染,当脑膜炎 奈瑟菌(脑膜炎球菌 ,Nm)可以通过穿透高度特化的脑内皮细胞 (BEC) 进入中枢神经系统 (CNS) 时发生。由于 Nm 是一种人类特异性病原体,由于缺乏强大的 体内 模型系统,因此对 Nm 和 BEC 之间的宿主-病原体相互作用的研究具有挑战性,并需要一种模拟天然 BEC 的基于人类的模型。与外周内皮细胞相比,BEC 具有更紧密的屏障特性,其特征是复杂的紧密连接和升高的跨内皮电阻 (TEER)。然而,许多 体外 模型,如原发性BEC和永生化BECs,在从天然神经微环境中移除后,要么缺乏或迅速失去其屏障特性。人类干细胞技术的最新进展已经开发出从诱导多能干细胞 (iPSC) 中提取类脑内皮细胞的方法,与其他体 外 人类模型相比,该方法具有更好的表型 BEC。使用 iPSC 衍生的 BEC (iPSC-BEC) 对 Nm-BEC 相互作用进行建模具有使用具有 BEC 屏障特性的人类细胞的好处,可用于检查屏障破坏、先天免疫激活和细菌相互作用。在这里,我们演示了除了细菌制备、感染和样本采集分析外,还如何从 iPSC 中衍生 iPSC-BEC。
Introduction
血脑屏障 (BBB) 和脑膜血脑脊液屏障 (mBCSFB) 是将循环与中枢神经系统 (CNS) 分开的极其紧密的细胞屏障,主要由高度特化的脑内皮细胞 (BEC) 组成1,2。BECs通过调节大脑内外的营养物质和废物来维持适当的大脑稳态,同时排除许多毒素、药物和病原体1,2。当血源性细菌能够与BECs相互作用并穿透BECs形成的屏障并引起炎症时,就会发生细菌性脑膜炎。脑膜炎奈瑟菌(Nm,脑膜炎球菌)是一种革兰氏阴性细菌,定植于10-40%健康个体的鼻咽部,但在某些情况下可引起严重的全身性疾病3。在受影响的个体中,Nm 可以进入血流,在那里它可以引起暴发性紫癜,并穿透 BEC 进入中枢神经系统,从而引起脑膜炎3。Nm 是全球细菌性脑膜炎的主要原因,尽管接种了疫苗,但仍是脑膜炎的主要原因 4.现代医疗干预,如抗生素治疗,使这些疾病得以生存,但那些患有脑膜炎的人往往会留下永久性的神经损伤5,6。
先前的研究已经确定了有助于 Nm-BEC 相互作用的细菌因子和宿主信号转导 7,8,9,10,11。已鉴定的粘附蛋白和侵入蛋白,如混浊蛋白Opc和IV型菌毛,以及受体如CD147,已经在体外对各种BEC模型进行了研究,但这些模型缺乏许多定义的BBB特性7,9,11,12。对 Nm-BEC 相互作用的完全理解仍然难以捉摸,部分原因是无法利用体内模型、不完全的疫苗接种保护以及体外缺乏强大的人类 BEC 模型。
由于 BEC 的独特特性,在体外模拟 hBEC 一直具有挑战性。与外周内皮细胞相比,BEC 具有许多增强其屏障特性的表型,例如由于复杂的紧密连接而导致的高跨内皮电阻 (TEER)12。一旦从大脑微环境中移除,BECs就会迅速失去其屏障特性,从而限制了仅形成弱屏障的原代或永生化体外模型的有用性12,13。Nm 感染的人类特异性、缺乏稳健的体内模型以及体外模拟人类 BEC 的挑战相结合,需要更好的模型来理解 Nm 和 BEC 之间复杂的宿主-病原体相互作用。最近,使用模型人诱导多能干细胞 (iPSC) 技术,BEC 样细胞来源于 iPSC,可在体内更好地模拟 BEC 12、13、14、15。iPSC-BECs是人类来源的,易于扩展,并且与原代或永生化对应物相比具有预期的BEC表型12,13,14,15。此外,我们和其他人已经证明 iPSC-BEC 可用于模拟中枢神经系统的各种疾病,例如宿主-病原体相互作用、亨廷顿舞蹈症和导致 Allan-Hurndon-Dudley 综合征的 MCT8 缺乏症 16,17,18,19,20,21.在这里,我们展示了如何从可再生的 iPSC 来源获得 iPSC-BEC,以及用 Nm 感染 iPSC-BEC 导致先天免疫反应的激活。我们认为,该模型可用于研究宿主-病原体相互作用,这在其他体外模型中无法概括,并且在检查与人类特定病原体(如Nm)的相互作用时特别有用。
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Protocol
注:所有培养基/试剂制备、干细胞维护和分化步骤均改编自 Stebbins 等人 22。
1.制备iPSC培养和BEC分化所需的材料。
- 用于 IMR90-4 iPSC 培养的组织培养 (TC) 塑料基质包被
- 将基底膜基质凝胶(例如基质胶)等分成2.5mg等分试样,并储存在-20°C。
注意:在冰上处理基质凝胶和等分试样时,请快速工作,因为它在4°C以上形成凝胶,一旦凝固就不能分装。 - 对于涂覆 TC 塑料,在 50 mL 锥形管中快速将一等分的基质凝胶加入 30 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)/F12 培养基中。将 1 mL 培养基加入冷冻基质凝胶上,上下移液直至解冻,然后立即将剩余培养基转移到 50 mL 锥形管中。
- 在 6 孔板的每孔中使用 1 mL 的基质凝胶包被溶液,每个 T75 培养瓶使用 12 mL。
注意:基质凝胶涂层的 TC 塑料可在使用前两周制备。然而,避免基质凝胶溶液变干至关重要,这可能需要偶尔在孔顶部添加更多的 DMEM/F12。
- 将基底膜基质凝胶(例如基质胶)等分成2.5mg等分试样,并储存在-20°C。
- 在生物安全柜的无菌环境中,将 50 mL 50x 补充剂加入 450 mL 干细胞维持基础培养基中,制备干细胞维持培养基。
注:其他干细胞维持培养基(mTeSR 和 E8)已用于其他研究 13,14,15,22,23,24,25。 - 要制备 500 mL 未调节培养基 (UM),将 392.5 mL DMEM/F12 与 100 mL 敲除血清替代物 (KOSR)、5 mL 非必需氨基酸、终浓度为 1 mM 的 L-谷氨酰胺和 3.5 μL β-巯基乙醇混合。过滤灭菌并在4°C下储存长达2周。
- 要制备 200 mL 内皮细胞 (EC) 培养基加视黄酸 (RA) 加 bFGF,请混合 198 mL 人内皮血清游离培养基 (hESFM)、2 mL 过滤灭菌的贫血小板衍生血清 (PDS) 和 20 ng/mL bFGF。过滤灭菌并在4°C下储存长达2周。 在添加到细胞之前,向 EC 培养基中加入 10 μM RA。
注意:由于PDS已停产,因此可能受到限制,因此该协议已使用B27代替PDS 15,23,26成功进行。 - 要制备不含 RA 或 bFGF 的 200 mL EC 培养基,请合并 198 mL hESFM 和 2 mL 过滤灭菌的 PDS 并过滤灭菌。在4°C下储存长达4周。
2. 维持IMR90-4细胞培养
注:这里我们以IMR90-4细胞系为例,但其他诱导多能干细胞系如CC3、CD10、CD12、DF19-9-11T、83iCTR、00iCTR和CS03iCTRn2已成功用于分化为BECs13,14,15,16,17,23,27,28。
- 在37°C的5%CO2 中培养iPSC,通常以不同的密度在6孔板上维持,每孔2mL干细胞维持培养基。
- 为了维持 iPSC 培养物,选择一个不汇合且菌落之间有开放空间的通道。
- 吸出培养基,加入1mL非酶促细胞解离试剂,并在37°C下孵育7分钟。在孵育过程中,用每孔 2 mL 新鲜干细胞维持培养基替换新的 6 孔板上的基质凝胶溶液。
- 小心地吸出非酶促细胞解离试剂,注意不要吸出仍附着在平板上的细胞。
- 加入 6 mL 干细胞维持培养基,冲洗孔底几次,直至所有细胞完全分离。然后,接种具有不同密度的新 6 孔板,通常为 1:6 或 1:12 以进行正常维护。
注意:使用上述比例,细胞大约每周分裂两次。 - 将板移至培养箱中,通过来回和从左到右摇动板,在交替摇动之间暂停直到培养基沉淀,将接种的细胞均匀地分布在孔中。
3. 脑内皮细胞与人iPSC的分化
- 用于分化的 iPSC 铺板(分化方案的第 -3 天 )
- 每个IMR90-4维持培养孔用于分化,吸出培养基,每孔加入1mL酶促细胞解离试剂,并在37°C下孵育7分钟。
- 通过将 1 mL 解离的细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中,每 1 mL 细胞至少含有 2 mL 新鲜干细胞维持培养基,使酶促细胞解离试剂失活。将细胞悬液以1,500× g 旋转5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于每孔使用的 IMR90-4 细胞的 1 mL 干细胞维持培养基中,并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
注意:在计数时,用 0.4% 台盼蓝以 1:1 稀释以区分活细胞和死细胞可能会有所帮助。根据 iPSC 的密度,6 孔板的一个孔通常产生 1-10 个6 个细胞。 - 为了在 T75 烧瓶中分化,将 7.5 x 105 个细胞加入 12 mL 干细胞维持培养基和 ROCK 抑制剂(Y27632 二盐酸盐)中,终浓度为 10 μM。 从 T75 烧瓶中吸出基质凝胶包被溶液并将细胞悬浮液转移到烧瓶中。通过来回和从左到右摇动烧瓶(参见步骤2.2.4)均匀分布细胞,并在37°C和5%CO2下孵育。
注意:在此步骤中添加ROCK抑制剂以增强解离的单个干细胞的存活率至关重要25,29。细胞应均匀分布在烧瓶中,并且由于 ROCK 抑制剂处理而表现出扩散的间充质样形态的单体中22。
- 在第 -2 天 和第 -1 天,将培养基更换为新鲜的干细胞维持培养基;每 T75 12 mL。
- 在第 0 天,通过将培养基更改为 UM 开始分化;每 T75 12 mL。
- 每天更改 UM(第 1 天 - 第 5 天)。
注意:细胞通常在 UM 中 2 至 3 天后达到汇合,可以用肉眼或通过倒置明场显微镜观察。随着分化的进展,巢蛋白+“神经束”变得可见,中间有PECAM-1+细胞,如前所述13,14。 - 通过切换到含有 20 ng/mL bFGF 和 10 μM 视黄酸 (RA)(第 6 天)的 EC 培养基并孵育两天,选择性地扩增内皮细胞群。含 bFGF 的 EC 培养基可在两周前制备。RA在使用当天从冷冻原液中添加(例如,每1mL EC + bFGF加入1μL 10 mM RA原液)。
注意:在第 6 天和第 8 天无需补充 RA 也可以实现成功分化。然而,省略 RA 将产生 TEER降低 12、13、14 的 BEC。 - 用胶原 IV 和纤连蛋白(第 7 天)包被细胞培养板和膜插入物(例如 Transwell),用于纯化 BEC 和后续实验。
- 对于膜插入物的包被,将 4 份 IV 型胶原蛋白(1 mg/mL 溶于 0.5 mg/mL 乙酸中)、1 份纤连蛋白 (1 mg/mL) 和 5 份无菌组织级水混合。ECM 溶液可以按 1:5 的比例稀释用于包被细胞培养板(即 4 份 IV 份胶原蛋白、1 份纤连蛋白、45 份水)。与包衣溶液在37°C孵育过夜。
注:在纯化步骤的同一天,在传代培养之前,也可以在传代培养前包被板和膜插入物至少4小时。
- 对于膜插入物的包被,将 4 份 IV 型胶原蛋白(1 mg/mL 溶于 0.5 mg/mL 乙酸中)、1 份纤连蛋白 (1 mg/mL) 和 5 份无菌组织级水混合。ECM 溶液可以按 1:5 的比例稀释用于包被细胞培养板(即 4 份 IV 份胶原蛋白、1 份纤连蛋白、45 份水)。与包衣溶液在37°C孵育过夜。
- 通过在胶原 IV 和纤连蛋白包被的平板或膜插入物上传代培养分化的细胞来纯化 BEC(第 8 天)。
- 吸出 EC 培养基并加入酶促细胞解离试剂(每 T75 12 mL)。在37°C孵育,直到90%的细胞从烧瓶中分离出来。
注意:细胞解离可能需要长达1小时。 - 在孵育期间,从先前制备的板/插入物中取出胶原蛋白IV /纤连蛋白涂层溶液,并在无菌罩中干燥。插入物干燥大约需要 20 分钟。
- 细胞分离后,使用 10 mL 移液管将它们从烧瓶中洗掉。上下移液器以实现单细胞悬浮液。
注:单细胞悬浮液对于可靠的细胞计数和实现固体单层非常重要。 - 在 50 mL 锥形管中用至少等体积的新鲜 hESFM 稀释,并使用血细胞计数器计数细胞。
- 将细胞以1,500×g沉淀10分钟。
- 将细胞重悬于适当体积的新鲜制备的 EC + bFGF + RA 中,以达到 2 x 106 个细胞/mL 的悬浮液,用于接种在膜插入物上。在 12 孔插入物顶部加入 500 μL(1 x 106 个细胞),在底部加入 1.5 mL EC + bFGF + RA 培养基。对于接种在 24 和 48 孔板上,以 1:2 稀释细胞悬液,每孔分别加入 500 μL(5 x 10 5 个细胞)和 250 μL(2.5 x 105 个细胞)。将细胞均匀分布在孔/插入物上(参见步骤2.2.4),并在37°C下在5%CO2下孵育。
- 吸出 EC 培养基并加入酶促细胞解离试剂(每 T75 12 mL)。在37°C孵育,直到90%的细胞从烧瓶中分离出来。
- 将平板/转孔上的培养基更换为 不含 bFGF 或 RA 的 EC(第 9 天)。
- 进行感染实验、TEER 测量和免疫荧光染色,如以下各节所述(第 10 天)。
注:成功分化和纯化的 BEC 通常在第 10 天达到峰值 TEER,并表达脑内皮细胞的特征标志物,例如 PECAM-1 (CD31) 和 VE-cadherin、葡萄糖转运蛋白 GLUT-1、外排转运蛋白(如 p-糖蛋白)和紧密连接成分 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 13,14,16,17,19,22 .有关分化过程中细胞类型、形态和细胞类型特异性标志物表达的更多详细信息和图像,请参阅 Lippmann 等人、Stebbins 等人13、14、15、16、17、19、22。IMR90-4细胞在BEC分化过程不同阶段的代表性图像可以在补充图1中找到。
4. 跨内皮电阻 (TEER) 作为屏障密封性的量度
注:通常在分化第 9 天和第 10 天在膜插入物上读取 TEER,以确认成功产生形成屏障的 iPSC-BEC(图 1A)。
- 将上皮伏欧表 (EVOM) 置于生物安全罩的无菌环境中,并将电极连接到 EVOM。
- 将电极浸入 70% EtOH 中至少 5 分钟,然后使其完全干燥,从而对电极进行消毒。
注意:如果需要,可以在 70% EtOH 中孵育更长时间或使用 5% 次氯酸盐溶液对电极进行去污。 - 从培养箱中取出膜插入物上的iPSC-BEC并测量TEER。
注意: 从培养箱中取出后快速读取 TEER 很重要,因为温度变化可能会影响 TEER 测量。 - 通过将电极浸入介质中来读取 TEER,以便将较短的电极放置在插入物的顶部,而较长的电极伸入插入插入物周围的介质中。
注意: 确保“筷子”尖端的电极完全被液体覆盖。如果需要,在再次放下板进行测量之前,倾斜孔以达到此目的。
5. 免疫荧光 (IF) 染色以验证 BEC 表型
注:为了验证完全分化和纯化细胞的质量,如前所述,在分化过程的第10天对iPSC-BEC单层的脑内皮细胞特征标志物进行染色(图1B - G)13,14,15,16,17,19,22。
- 吸出培养基并用PBS洗涤1x。
- 在室温(RT)下用冰冷的甲醇固定细胞15分钟。
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次,并在室温下用10%胎牛血清(FBS)在PBS中封闭1小时。
- 吸出并加入在封闭液中稀释的一抗。在4°C孵育过夜。
注:有关抗体的来源和稀释度的信息,请参阅 材料表 和Stebbins等人22。 - 用 PBS 洗涤 3 次,然后加入在封闭液中稀释的二抗。在室温下孵育1小时。从现在开始保护样品免受光线照射。
- 用 PBS 洗涤 2 次。然后,在PBS中以1:5,000稀释度加入DAPI,并在室温下染色15分钟。
- 洗涤 1 次,保持 PBS 开启状态,并使用荧光显微镜拍摄图像。
6. 细菌的制备和iPSC-BECs的感染
- 在感染实验的前一天(分化的第9天 ),开始从冷冻原液中培养细菌过夜。对于Nm感染,用5%绵羊血(血琼脂)将细菌条纹到哥伦比亚琼脂上。将细菌培养物在37°C和5%CO2 下孵育过夜。
- 第二天(第 10 天),通过每 10 mL 补充 50 μL 2 M MgCl 2、50 μL2 M NaHCO3 和 100 μL 凯洛氏补充剂来制备新鲜的 PPM+。使用无菌棉签将 10 mL PPM + 培养基接种在 50 mL 锥形管中,其中含有来自过夜培养板的 Nm。在37°C下以200rpm振荡孵育1.5小时(即,直到细菌处于对数生长阶段)。
- 在细菌孵育期间,通过用每孔/膜插入物顶部用 400 μL 新鲜 EC 培养基(不含 bFGF 或 RA)替换旧培养基,在 24 孔板或膜插入物上制备用于感染的 iPSC-BEC。
- 将细菌培养物以4000× g 离心10分钟并吸出培养基。将细菌沉淀重悬于 250 μL PBS 中。
- 在 4 mL 新鲜 PBS 中,使用一部分细菌细胞悬液并调节至 OD600 为 0.4(约 1 x 108 CFU/mL)。
- 然后,根据所需的感染多重性(MOI)稀释细胞培养基(EC培养基)中的细菌。
注:例如,对于 MOI 为 10,在 24 孔板或膜插入物中感染 iPSC-BEC 时,分别稀释 1:10 或 1:5(24 孔板中每单层 1 x 105 个细胞)。正如其他手稿中所描述的那样,添加人血清不包括在感染的 Nm 的制备中,因为它被观察到对 TEER 测量的 iPSC-BEC 屏障表型有有害影响(数据未显示)30,31。然而,无论是否使用人血清,Nm 和 iPSC-BEC 的相互作用都不会受到影响(数据未显示)。 - 用 100 μL 制备的细菌悬浮液感染每个孔中的 iPSC-BEC,并孵育所需的感染时间。
注:当感染 Nm 时,iPSC-BEC 中许多促炎细胞因子和趋化因子的表达升高,最突出的是感染 8 小时后,如 Martins-Gomes 等人先前描述的那样(图 2)19。
7. 通过定量PCR激活先天免疫
注:使用优选的RNA分离、cDNA合成和qPCR方案,收集样品并对选定的细胞因子进行qPCR。
- 7.1. 在分化方案的第 10 天 感染后,使用市售 RNA 分离试剂盒中的试剂从 BEC 样品中收集 RNA(参见 材料表)。
注意: 避免核酸酶污染 样品 在清洁和消毒的环境中小心工作。- 制备裂解缓冲液,并向每个孔/单层 iPSC-BEC 中加入 350 μL。
- 通过上下移液多次(例如,20x)并将悬浮液转移到无菌微量离心管中来收集样品。
注:样品可以储存在-80°C,直到准备进行RNA分离。 - 按照 RNA 分离试剂盒提供的方案从培养的细胞和组织中纯化 RNA。
- 在无核酸酶的水中洗脱后,将RNA样品保持在冰上,以尽量减少任何潜在的RNase活性。
- 在分光光度计(例如,Nanodrop)上估计RNA浓度。
- 使用cDNA合成试剂盒从收集的RNA生成cDNA文库(参见 材料表)。
- 按照cDNA合成试剂盒的方案所述,在规定的总反应体积中建立由cDNA合成预混液、至少200 ng(理想情况下为500 ng)样品RNA和无核酸酶水组成的反应。
- 在标准热循环仪上,运行适用于所用cDNA合成试剂盒试剂的程序。例如:25°C下2分钟,55°C下10分钟,95°C下1分钟。
- 合成后,在无核酸酶的水中将cDNA稀释至1:10,并将样品移至4°C进行短期或-20°C进行长期储存。
注:如果RNA浓度低(例如,低于50ng),则可能需要较低的稀释度。稀释的cDNA可以在-20°C下储存长达一年。
- 使用精心设计和验证的引物,对靶向先天免疫应答基因(如细胞因子和趋化因子)转录本的 cDNA 样品进行 qPCR。
注:由于引物设计对qPCR结果的质量非常重要,因此应进行稀释系列测试引物效率,并应在DNA凝胶上确认不存在多种产物。- 每 25 μL 反应,使用 0.5 μL 正向和 0.5 μL 反向引物(10 mM 无核酸酶水中)、1 μL cDNA、10.5 μL 无核酸酶 H2O 和 12.5 μL qPCR 预混液。
- 使用以下循环仪方案在qPCR机器上进行反应:(a)4°C2分钟;(b) 95°C下15分钟;(c) 95 °C下15 s;(d) 60°C下1分钟;循环 (c) 和 (d) 45 次;(e) 可选熔体曲线:30-99 °C,增量为 1 °C;25°C5分钟。
- 对于数据分析,使用 ΔΔCT 计算将细胞因子和趋化因子表达水平与参考管家基因(如 18S 或 GAPDH)进行比较。
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Representative Results
这里描述的方案改编自Stebbins等人,并强调了将iPSC分化为具有BBB特性的脑样内皮细胞的过程,以及如何利用该模型进行使用具有Nm19,22的iPSC-BEC的感染研究。当分化得当时,iPSC-BEC表现出通过TEER测量的紧密屏障特性,通常大于2000 Ω·cm 2,并表达内皮标志物,如VE-钙粘蛋白和CD31(PECAM)(图1A\u2012C)。此外,它们表达和定位紧密连接标记物 Claudin-5、Occludin 和 ZO-1(图 1 D\u2012F)以及转运蛋白,如 Glut-1(图 1G)。感染 Nm 后,iPSC-BEC 通过上调中性粒细胞促炎细胞因子(如 qPCR 测量)对感染做出反应,例如 IL-8 (CXCL8)、CXCL1、CXCL2、CCL20 和 IL6(图 2A\u2012E)。 这些代表性结果展示了如何确保iPSC-BECs被可靠地区分,以及如何检查iPSC-BECs对Nm感染的反应。
图 1:iPSC-BEC 的表征。 (A) 两个独立的个体分化的TEER,在第 9-12天读取。数据以一式三份的平均值表示。误差线表示± SD。 (B\u2012G) 代表性免疫荧光数据显示内皮细胞标志物 VE-cadherin (B) 和 PECAM-1 (CD31; C)、紧密连接组分 Claudin-5 (D)、Occludin (E) 和 ZO-1 (F) 以及葡萄糖转运蛋白 GLUT-1 (G)。比例尺表示 50 μm。该图的面板 B\u2012G 已获得 Kim 等人的许可使用,最初发表在 BMC 期刊 Fluids and Barriers of the CNS 上,第17 页。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:感染脑膜炎奈瑟菌后 iPSC-BEC 上调细胞因子。代表性qPCR数据显示感染8小时后CXCL8(A)、CXCL1(B)、CXCL2(C)、CCL20(D)和IL6(E)转录本的相对表达,比较感染与未感染的iPSC-BEC单层。数据以三项独立实验的平均值表示,一式三份。误差线表示用于确定显著性的 ± S.D. 学生的 t 检验。*p < 0.05;**p < 0.01;P < 0.001。该图经Martins Gomes等人修改和使用,最初发表在Frontiers in Microbiology19上。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1:IMR90-4细胞处于BEC分化过程的不同阶段。准备传代的维持IMR90-4培养物的代表性图像(A)和BEC分化过程不同阶段的细胞:(B)接种ROCK抑制剂后(第-2天),(C)分化开始时(第0天),(D)汇合的第一天(第3天),(E)UM期结束(第6天),(F)BEC纯化前(第8天), BEC 纯化后(第 9 天和第 10 天)和(G 和 H)。比例尺表示 500 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
BECs和BBB的建模遇到了挑战,因为在体外,原发性和永生化的人BEC往往缺乏强大的屏障表型。人类干细胞技术的出现允许产生 iPSC 衍生的 BEC 样细胞,这些细胞保留了预期的标志性 BBB 表型,例如内皮标志物、紧密连接表达、屏障特性、对其他 CNS 细胞类型的反应和功能性外排转运蛋白 12、13、14、15、22、24 、25。这使研究人员能够在体外利用与体内 BEC 非常相似的 BEC,并模拟各种疾病,据报道 BBB 功能障碍16、17、19、20、21、32。Nm 是细菌性脑膜炎的主要原因,是一种人类特异性病原体,缺乏强大的体内模型19。这种局限性需要使用更好的工程模型来推动 Nm 和 BBB 之间新型宿主-病原体相互作用的发现。最近,我们已经证明 iPSC-BEC 是研究 Nm-BEC 相互作用的可行模型19。
在这里,我们描述了一种获得 iPSC-BEC 并用 Nm 感染的通用方法,导致通常由细菌感染诱导的促炎细胞因子的上调19。对于 iPSC-BEC 的衍生,我们通常遵循 Stebbins 等人中描述的 iPSC-BEC 生成方案,并稍作修改22。特别是在这里,我们使用 StemFlex 培养基而不是 mTesR1,但是任何一种培养基都可用于维持干细胞培养物17。已经确定该协议适用于许多iPSC系,但是重要的是为每个单独的iPSC系15,24确定最佳接种密度。对于本手稿,我们使用了 IMR90-4 细胞系,先前确定 1 x 105 个细胞/cm2 是最佳初始接种密度24。最后,作为所生成BEC身份的证明,iPSC-BECs表达预期的内皮细胞标志物和紧密连接,同时表现出高TEER(图1)13,14,15,24。这些表型以及人类来源使 iPSC-BEC 成为研究 Nm-BEC 相互作用的有力工具。
用于感染的Nm的制备改编自先前发表的方法19,33。为确保细菌生长培养基不被引入细胞培养实验中,按照方法中的说明进行洗涤步骤和在PBS中重悬。最后,先前观察到 MOI 为 10 通过上调促炎细胞因子19 导致 iPSC-BEC 的激活。已经观察到 BEC 响应各种细菌的激活,即通过中性粒细胞趋化因子和细胞因子的上调6。先前已观察到,iPSC-BEC 在感染 B 族链球菌和 Nm16,19 后上调强效中性粒细胞化学引诱剂 IL-8、CXCL1 和 CXCL2。iPSC-BECs的这种观察到的反应表明,这些细胞能够检测细菌并激活先天免疫程序,从而导致细胞因子的上调。通过qPCR检测这些细胞因子上调的方法已经很成熟,如上所述。然而有趣的是,虽然这些促炎细胞因子是通过qPCR检测到的,但坐标蛋白产物要么未被检测到,要么非常低16,19。目前,尚不清楚这是否是iPSC-BEC模型的伪影,或者观察到的细胞因子低丰度是否与生物学相关。未来的研究将需要确定表达和分泌之间脱节背后的机制。
iPSC-BEC 模型的一个主要优势是紧密连接的表达和定位,这些连接有助于屏障功能,如 TEER 12、13、14、15、22 所示。先前对无乳链球菌(B 组链球菌,GBS)的研究表明,蜗牛 1 的上调有助于在体外和体内破坏 BBB 紧密连接 34。最近,这一发现在 GBS 和 Nm 的 iPSC-BEC 模型中得到证实,这表明细菌在感染期间如何破坏 BBB 完整性的机制16,19。此外,还证明 Nm 与内皮细胞上的 CD147 相互作用,促进细菌附着,并最终重组导致屏障功能障碍的紧密连接9。我们已经证明 Nm 与 CD147 在 iPSC-BEC 中共定位,可能使该模型成为未来阐明 Nm-CD147 相互作用的理想选择,因为它们与 BBB 功能障碍有关19。
这里介绍的方法证明了iPSC-BECs从多能干细胞来源的分化,以及在Nm感染中的应用。iPSC-BECs来源于人类,表达内皮标志物,并具有BBB特异性表型,使其成为检查人类特异性病原体(如Nm)的理想模型。最后,我们能够证明iPSC-BEC模型通过上调中性粒细胞因子反应来响应细菌感染。综上所述,iPSC-BEC模型在检查BBB的宿主-病原体相互作用方面比原代和永生化模型系统具有一定的优势。进一步的工作应旨在阐明细菌性脑膜炎期间BBB破坏的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
L.M.E. 得到了 DFG 研究培训计划的支持,该计划GRK2157题为“用于研究人类病原体微生物感染的 3D 组织模型”,授予 A. S-U.B.J.K. 得到了亚历山大·冯·洪堡基金会的博士后奖学金的支持。此外,我们感谢 Lena Wolter 在培养物中生成 iPSC-BEC 方面的技术援助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
Acetic acid | Sigma | A6283 | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
DMSO | ROTH | A994.1 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | ROTH | 4627.5 | |
MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
Serological pipettes | Sarstedt | ||
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |
References
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脑膜炎奈瑟菌、脑膜炎球菌性脑膜炎、脑内皮细胞、宿主-病原体相互作用、体内模型系统、基于人类的模型、紧密连接、跨内皮电阻 (TEER)、体外模型、原代 BEC、永生化 BEC、诱导多能干细胞 (iPSC)、IPSC 衍生的 BEC (iPSC-BEC)、屏障破坏、先天免疫激活、细菌相互作用Erratum
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama