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Immunology and Infection

Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l'infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.

Abstract

La meningite meningococcica è un'infezione pericolosa per la vita che si verifica quando Neisseria meningitidis (meningococco , Nm) può accedere al sistema nervoso centrale (SNC) penetrando nelle cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate. Poiché Nm è un patogeno specifico per l'uomo, la mancanza di solidi sistemi modello in vivo rende difficile lo studio delle interazioni ospite-patogeno tra Nm e BEC e stabilisce la necessità di un modello basato sull'uomo che imiti i BEC nativi. I BEC possiedono proprietà di barriera più strette rispetto alle cellule endoteliali periferiche caratterizzate da complesse giunzioni strette e da un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER). Tuttavia, molti modelli in vitro , come i BEC primari e i BEC immortalizzati, mancano o perdono rapidamente le loro proprietà di barriera dopo la rimozione dal microambiente neurale nativo. I recenti progressi nelle tecnologie delle cellule staminali umane hanno sviluppato metodi per derivare cellule endoteliali simili al cervello da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che fenopiano meglio le BEC rispetto ad altri modelli umani in vitro . L'uso di BEC derivati da iPSC (IPSC-BEC) per modellare l'interazione Nm-BEC ha il vantaggio di utilizzare cellule umane che possiedono proprietà di barriera BEC e può essere utilizzato per esaminare la distruzione della barriera, l'attivazione immunitaria innata e l'interazione batterica. Qui dimostriamo come derivare le iPSC-BEC dalle iPSC oltre alla preparazione batterica, all'infezione e alla raccolta del campione per l'analisi.

Introduction

La barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera meningea sangue-liquido cerebrospinale (mBCSFB) sono barriere cellulari estremamente strette che separano la circolazione dal sistema nervoso centrale (SNC) e sono costituite principalmente da cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate1,2. Insieme, i BEC mantengono una corretta omeostasi cerebrale regolando i nutrienti e i prodotti di scarto dentro e fuori il cervello, escludendo molte tossine, farmaci e agenti patogeni 1,2. La meningite batterica si verifica quando i batteri trasmissibili per via ematica sono in grado di interagire e penetrare la barriera formata dai BEC e causare infiammazione. Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è un batterio Gram-negativo che colonizza il rinofaringe del 10-40% degli individui sani, ma in alcuni casi può causare gravi malattie sistemiche3. Negli individui affetti, Nm può ottenere l'accesso al flusso sanguigno dove può causare porpora fulminante e penetrare i BEC ottenendo l'accesso al SNC causando la meningite3. La NM è una delle principali cause di meningite batterica in tutto il mondo e, nonostante gli sforzi di vaccinazione, è ancora una delle cause primarie di meningite4. L'intervento medico moderno, come il trattamento antibiotico, ha reso queste condizioni sopravvissute, tuttavia le persone colpite da meningite spesso rimangono con danni neurologici permanenti 5,6.

Studi precedenti hanno identificato i fattori batterici e la segnalazione dell'ospite che contribuiscono alle interazioni Nm-BEC 7,8,9,10,11. Le adesine e le invasine identificate, come la proteina di opacità Opc e i pili di tipo IV, così come i recettori come CD147, sono stati condotti su vari modelli BEC in vitro, tuttavia questi modelli mancano di molte proprietà di definizione della BBB 7,9,11,12. La comprensione completa delle interazioni Nm-BEC rimane elusiva a causa in parte dell'incapacità di utilizzare modelli in vivo, della protezione vaccinale incompleta e della mancanza di robusti modelli BEC umani in vitro.

La modellazione degli hBEC in vitro è stata impegnativa a causa delle proprietà uniche dei BEC. Rispetto alle cellule endoteliali periferiche, le BEC hanno una serie di fenotipi che migliorano le loro proprietà di barriera, come l'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) dovuta a complesse giunzioni strette12. Una volta rimossi dal microambiente cerebrale, i BEC perdono rapidamente le loro proprietà di barriera, limitando l'utilità di modelli primari o immortalizzati in vitro che formano solo una debole barriera12,13. La combinazione della specificità umana delle infezioni da NM, la mancanza di robusti modelli in vivo e le sfide che modellano i BEC umani in vitro crea la necessità di modelli migliori per comprendere la complessa interazione ospite-patogeno tra Nm e BAC. Recentemente, utilizzando tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) modello, le cellule simili a BEC sono state derivate da iPSC che imitano meglio le BEC in vivo12,13,14,15. Le iPSC-BEC sono di origine umana, facilmente scalabili e possiedono i fenotipi BEC attesi rispetto alle loro controparti primarie o immortalizzate12,13,14,15. Inoltre, noi e altri abbiamo dimostrato che le iPSC-BEC sono utili per modellare varie malattie del SNC come l'interazione ospite-patogeno, la malattia di Huntington e il deficit di MCT8 che causa la sindromedi Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Qui, dimostriamo come derivare le iPSC-BEC da fonti rinnovabili di iPSC e l'infezione delle iPSC-BEC con Nm che porta all'attivazione della risposta immunitaria innata. Riteniamo che questo modello sia utile per interrogare l'interazione ospite-patogeno che non può essere ricapitolata in altri modelli in vitro ed è particolarmente utile quando si esaminano le interazioni con patogeni specifici per l'uomo come il Nm.

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Protocol

NOTA: Tutte le fasi di preparazione del terreno/reagente, del mantenimento delle cellule staminali e della differenziazione sono adattate da Stebbins et al.22.

1. Preparazione dei materiali necessari per la coltura delle iPSC e il differenziamento delle BEC.

  1. Rivestimento della matrice della plastica per coltura tissutale (TC) per coltura iPSC IMR90-4
    1. Aliquote di gel di matrice di membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20 °C.
      NOTA: Lavorare rapidamente quando si maneggia il gel della matrice e l'aliquota sul ghiaccio, poiché forma un gel al di sopra dei 4 °C e non può essere aliquotato una volta che si è solidificato.
    2. Per rivestire la plastica TC, aggiungere rapidamente un'aliquota di gel matrice a 30 mL di terreno Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 di Dulbecco in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 1 mL di terreno sul gel a matrice congelata, pipettare su e giù fino a quando non viene scongelato e trasferire immediatamente nella provetta conica da 50 mL con il terreno rimanente.
    3. Utilizzare 1 mL di questa soluzione di gel-coating a matrice per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 12 mL per matraccio T75.
      NOTA: La plastica TC rivestita di gel Matrix può essere preparata fino a due settimane prima dell'uso. Tuttavia, è fondamentale evitare che la soluzione di gel della matrice si asciughi, il che potrebbe richiedere l'aggiunta occasionale di più DMEM/F12 sopra i pozzetti.
  2. Preparare il terreno di mantenimento delle cellule staminali aggiungendo 50 ml di supplemento 50x a 450 mL di terreno basale di mantenimento delle cellule staminali nell'ambiente sterile di una cabina di biosicurezza.
    NOTA: Altri terreni di mantenimento con cellule staminali (mTeSR ed E8) sono stati utilizzati in altri studi 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Per preparare 500 mL di terreno non condizionato (UM), combinare 392,5 mL di DMEM/F12 con 100 mL di sostituzione del siero knock out (KOSR), 5 mL di aminoacidi non essenziali, L-glutammina a una concentrazione finale di 1 mM e 3,5 μL di β-mercaptoetanolo. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  4. Per preparare 200 mL di terreno di coltura endoteliale (EC) più acido retinoico (RA) più bFGF, combinare 198 mL di terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM), 2 mL di siero derivato da piastrine (PDS) sterilizzato con filtro e 20 ng/mL di bFGF. Filtrare, sterilizzare e conservare per un massimo di 2 settimane a 4 °C. Appena prima dell'aggiunta alle cellule, aggiungere 10 μM di AR al terreno EC.
    NOTA: Poiché PDS è stato interrotto e potrebbe quindi essere limitato, questo protocollo è stato condotto con successo utilizzando B27 al posto di PDS 15,23,26.
  5. Per preparare 200 mL di terreno EC senza RA o bFGF, combinare 198 mL di hESFM e 2 mL di PDS sterilizzato con filtro e sterilizzare con filtro. Conservare fino a 4 settimane a 4 °C.

2. Mantenimento della coltura cellulare IMR90-4

NOTA: Qui usiamo la linea cellulare IMR90-4 come esempio, tuttavia altre linee di cellule staminali pluripotenti indotte come CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR e CS03iCTRn2 sono state impiegate con successo per la differenziazione in BEC 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Coltura di iPSC a 37 °C in CO 2 al 5% e in genere si mantengono su piastre da 6 pozzetti a varie densità con2 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali per pozzetto.
  2. Per il mantenimento della coltura iPSC, selezionare un singolo pozzetto per il passaggio che non sia confluente e che presenti spazi aperti tra le colonie.
    1. Aspirare il terreno di coltura, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare non enzimatica e incubare a 37 °C per 7 min. Mentre l'incubazione è in corso, sostituire la soluzione di gel della matrice, su una nuova piastra a 6 pozzetti, con 2 ml di terreno di mantenimento fresco di cellule staminali per pozzetto.
    2. Aspirare con cautela il reagente di dissociazione cellulare non enzimatica facendo attenzione a non aspirare le cellule ancora attaccate alla piastra.
    3. Aggiungere 6 ml di terreno di mantenimento delle cellule staminali e sciacquare il fondo del pozzetto alcune volte fino a quando tutte le cellule non sono completamente staccate. Quindi, seminare la nuova piastra a 6 pozzetti con densità variabili, in genere 1:6 o 1:12 per la normale manutenzione.
      NOTA: Utilizzando i rapporti di cui sopra, le celle vengono divise circa due volte a settimana.
    4. Spostare la piastra nell'incubatrice e distribuire equamente le cellule seminate sui pozzetti scuotendo la piastra avanti e indietro e da sinistra a destra, facendo una pausa tra movimenti di agitazione alternati fino a quando il terreno non si è stabilizzato.

3. Differenziamento delle cellule endoteliali cerebrali dalle iPSC umane

  1. Placcatura di iPSC per il differenziamento (giorno -3 del protocollo di differenziamento)
    1. Per il pozzetto di coltura di mantenimento IMR90-4 utilizzato per la piastra per la differenziazione, aspirare il terreno di coltura, aggiungere 1 mL di reagente enzimatico di dissociazione cellulare per pozzetto e incubare a 37 °C per 7 minuti.
    2. Inattivare il reagente enzimatico di dissociazione cellulare trasferendo 1 mL di sospensione cellulare dissociata in una provetta conica da 15 mL con almeno 2 mL di terreno fresco di mantenimento delle cellule staminali per 1 mL di cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.500 x g per 5 min.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali per pozzetto di cellule IMR90-4 utilizzate e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
      NOTA: Può essere utile diluire 1:1 con blu di tripano allo 0,4% per distinguere tra cellule vive e morte durante il conteggio. A seconda della densità delle iPSC, un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di solito produce 1\u20122 x 106 cellule.
    4. Per la differenziazione in un matraccio T75, aggiungere 7,5 x 105 cellule a 12 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali e inibitore ROCK (dicloridrato Y27632) a una concentrazione finale di 10 μM. Aspirare la soluzione di gel-coating della matrice da un matraccio T75 e trasferire la sospensione cellulare nel pallone. Distribuire equamente le cellule agitando il matraccio avanti e indietro e da sinistra a destra (vedere punto 2.2.4) e incubare a 37 °C e al 5% di CO2 .
      NOTA: È fondamentale aggiungere l'inibitore ROCK in questa fase per migliorare la sopravvivenza delle singole cellule staminali dissociate25,29. Le cellule devono essere distribuite uniformemente nel matraccio e nei singoletti che presentano una morfologia diffusa, simile a quella mesenchimale, dovuta al trattamento con inibitori di ROCK22.
  2. Il giorno -2 e il giorno -1, cambiare il terreno con un terreno fresco di mantenimento delle cellule staminali; 12 mL per T75.
  3. Il giorno 0, avviare la differenziazione modificando il supporto in messaggistica unificata; 12 mL per T75.
  4. Modificare la messaggistica unificata ogni giorno (giorno 1 - giorno 5).
    NOTA: Le cellule in genere raggiungono la confluenza dopo 2 o 3 giorni in UM, che può essere osservata ad occhio nudo o attraverso un microscopio a campo chiaro invertito. Man mano che la differenziazione progredisce, i "tratti neurali" di nestina+ diventano visibili con cellule PECAM-1+ intermedie, come descritto in precedenza13,14.
  5. Espandere selettivamente la popolazione di cellule endoteliali passando al terreno EC con 20 ng/mL di bFGF e 10 μM di acido retinoico (RA) (giorno 6) e incubando per due giorni. Il terreno EC con bFGF può essere preparato fino a due settimane prima. L'AR viene aggiunto dal brodo congelato il giorno dell'uso (ad esempio, 1 μL di 10 mM di stock di RA per 1 mL di EC + bFGF).
    NOTA: La differenziazione di successo può essere raggiunta anche senza l'integrazione di AR nei giorni 6 e 8. L'omissione dell'AR, tuttavia, produrrà BEC con TEERridotto 12,13,14.
  6. Rivestire le piastre di coltura cellulare e gli inserti di membrana (ad es. Transwell) con collagene IV e fibronectina (giorno 7), per la purificazione dei BEC e i successivi esperimenti.
    1. Per il rivestimento degli inserti a membrana, combinare 4 parti di collagene EV (1 mg/mL in 0,5 mg/mL di acido acetico), 1 parte di fibronectina (1 mg/mL) e 5 parti di acqua sterile per tessuti. La soluzione ECM può essere diluita 1:5 per il rivestimento di piastre di coltura cellulare (ad esempio, 4 parti di collagene IV, 1 parte di fibronectina, 45 parti di acqua). Incubare con soluzione di rivestimento a 37 °C per una notte.
      NOTA: Le piastre e gli inserti a membrana possono anche essere rivestiti per almeno 4 ore prima della subcoltura lo stesso giorno della fase di purificazione.
  7. Purificare i BEC subcolturando le cellule differenziate su piastre o inserti di membrana rivestiti di collagene IV e fibronectina (giorno 8).
    1. Aspirare il terreno EC e aggiungere il reagente enzimatico di dissociazione cellulare (12 mL per T75). Incubare a 37 °C fino a quando il 90% delle cellule si è staccato dal pallone.
      NOTA: La dissociazione cellulare può richiedere fino a 1 ora.
    2. Durante il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento di collagene IV/fibronectina dalle piastre/inserti precedentemente preparati e lasciarli asciugare in una cappa sterile. Ci vogliono circa 20 minuti perché gli inserti si asciughino.
    3. Una volta che le cellule si sono staccate, lavarle via dal matraccio con una pipetta da 10 ml. Pipettare su e giù per ottenere una sospensione a cellula singola.
      NOTA: La sospensione a cellula singola è importante per un conteggio affidabile delle cellule e per ottenere monostrati solidi.
    4. Diluire con un volume almeno uguale di hESFM fresco in una provetta conica da 50 mL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    5. Pellet le cellule a 1.500 x g per 10 min.
    6. Risospendere le cellule in un volume appropriato di EC + bFGF + RA appena preparato per ottenere una sospensione di 2 x 106 cellule/mL per la semina su inserti di membrana. Aggiungere 500 μL (1 x 106 cellule) sopra un inserto a 12 pozzetti e 1,5 mL di terreno EC + bFGF + RA sul fondo. Per la semina su piastre da 24 e 48 pozzetti, diluire la sospensione cellulare 1:2 e aggiungere rispettivamente 500 μL (5 x 10 5 cellule) e 250 μL (2,5 x 105 cellule) per pozzetto. Distribuire uniformemente le cellule nel pozzetto/inserto (vedere passaggio 2.2.4) e incubare a 37 °C con CO2 % al 5%.
  8. Cambiare i terreni su piastre/transpozzetti in EC senza bFGF o RA (giorno 9).
  9. Condurre esperimenti di infezione, misurazione del TEER e colorazione in immunofluorescenza come descritto nelle sezioni seguenti (giorno 10).
    NOTA: I BEC differenziati e purificati con successo raggiungono in genere il picco di TEER il giorno 10 ed esprimono marcatori caratteristici delle cellule endoteliali cerebrali come PECAM-1 (CD31) e VE-caderina, il trasportatore del glucosio GLUT-1, trasportatori di efflusso come la glicoproteina p e i componenti della giunzione stretta ZO-1, Occludin e Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Fare riferimento a Lippmann et al., Stebbins et al. e altri per ulteriori dettagli e immagini dei tipi cellulari, delle morfologie e dell'espressione di marcatori specifici del tipo di cellula durante il processo di differenziazione 13,14,15,16,17,19,22. Immagini rappresentative delle cellule IMR90-4 in diverse fasi del processo di differenziamento BEC sono disponibili nella Figura 1 supplementare.

4. Resistenza elettrica transendoteliale (TEER) come misura della tenuta della barriera

NOTA: Il TEER viene solitamente letto sugli inserti di membrana nei giorni 9 e 10 di differenziazione per confermare l'avvenuta generazione di iPSC-BEC che formano una barriera (Figura 1A).

  1. Posizionare il volt-ohmmetro epiteliale (EVOM) nell'ambiente sterile di una cappa di biosicurezza e collegare l'elettrodo all'EVOM.
  2. Disinfettare l'elettrodo immergendolo in EtOH al 70% per almeno 5 min e lasciarlo asciugare completamente.
    NOTA: Se necessario, è possibile un'incubazione più lunga in EtOH al 70% o la decontaminazione dell'elettrodo con una soluzione di ipoclorito al 5%.
  3. Recuperare le iPSC-BEC sugli inserti a membrana dall'incubatore e misurare il TEER.
    NOTA: È importante leggere rapidamente il TEER dopo la rimozione dall'incubatore poiché il cambiamento di temperatura può influire sulla misurazione del TEER.
  4. Leggere TEER immergendo l'elettrodo nel fluido in modo che l'elettrodo più corto sia posizionato sopra l'inserto e l'elettrodo più lungo raggiunga il fluido che circonda l'inserto.
    NOTA: Assicurarsi che gli elettrodi sulle punte delle "bacchette" siano completamente coperti da liquido. Se necessario, inclinare il pozzetto per ottenere questo risultato prima di appoggiare nuovamente la piastra per la misurazione.

5. Colorazione a immunofluorescenza (IF) per convalidare il fenotipo BEC

NOTA: Per convalidare la qualità delle cellule completamente differenziate e purificate, i monostrati di iPSC-BEC vengono colorati per i marcatori caratteristici delle cellule endoteliali cerebrali il giorno 10 del processo di differenziazione come descritto in precedenza (Figura 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Aspirare il mezzo e lavare 1 volta con PBS.
  2. Fissare le celle con metanolo ghiacciato a temperatura ambiente (RT) per 15 min.
  3. Lavare 3 volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) e bloccare con siero fetale bovino al 10% (FBS) in PBS a RT per 1 ora.
  4. Aspirare e aggiungere gli anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante. Incubare a 4 °C per una notte.
    NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali e a Stebbins et al. per informazioni relative alla fonte e alla diluizione degli anticorpi22.
  5. Lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere l'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante. Incubare a RT per 1 h. Da questo momento in poi, proteggere i campioni dalla luce.
  6. Lavare 2 volte con PBS. Quindi, aggiungere DAPI a una diluizione 1:5.000 in PBS e colorare a RT per 15 minuti.
  7. Lavare 1 volta lasciando il PBS acceso e scattare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.

6. Preparazione di batteri e infezione di iPSC-BEC

  1. Il giorno prima dell'esperimento di infezione (giorno 9 di differenziazione), iniziare una coltura notturna dei batteri da brodo congelato. Per l'infezione da Nm, striare i batteri sull'agar Columbia con il 5% di sangue di pecora (blood-agar). Incubare colture batteriche a 37 °C e 5% di CO2 per una notte.
  2. Il giorno successivo (giorno 10), preparare PPM+ fresco integrando il terreno peptone proteasi (PPM) con 50 μL di 2 M MgCl 2, 50 μL di2 M NaHCO3 e 100 μL di integratore Kellogg's per 10 mL. Inoculare 10 mL di terreno PPM+ in una provetta conica da 50 mL con Nm dalla piastra di coltura notturna utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Incubare agitando a 200 giri/min a 37 °C per 1,5 ore (cioè fino a quando i batteri non sono in fase di crescita logaritmica).
  3. Durante l'incubazione batterica, preparare le iPSC-BEC in una piastra da 24 pozzetti o su inserti di membrana per l'infezione sostituendo il vecchio terreno con 400 μL di terreno EC fresco (senza bFGF o RA) per pozzetto/parte superiore dell'inserto di membrana.
  4. Centrifugare la coltura batterica a 4000 x g per 10 min e aspirare il terreno. Risospendere il pellet batterico in 250 μL di PBS.
  5. In 4 mL di PBS fresco, utilizzare una porzione della sospensione cellulare batterica e regolare su un OD600 di 0,4 (circa 1 x 108 CFU/mL).
  6. Quindi, diluire i batteri in terreno di coltura cellulare (terreno EC) in base alla molteplicità di infezione desiderata (MOI).
    NOTA: Ad esempio, per un MOI di 10, diluire 1:10 o 1:5 quando si infettano iPSC-BEC in una piastra a 24 pozzetti o su inserti di membrana, rispettivamente (1 x 105 cellule per monostrato in una piastra a 24 pozzetti). L'aggiunta di siero umano non è inclusa nella preparazione di Nm per l'infezione, come è stato descritto in altri manoscritti, in quanto è stato osservato che ha un impatto deleterio sul fenotipo di barriera iPSC-BEC misurato da TEER (dati non mostrati)30,31. Tuttavia, l'interazione tra Nm e iPSC-BEC non è influenzata con o senza siero umano (dati non mostrati).
  7. Infettare le iPSC-BEC in ciascun pozzetto con 100 μL di sospensione batterica preparata e incubare per il tempo desiderato di infezione.
    NOTA: L'espressione di un certo numero di citochine e chemochine proinfiammatorie è elevata nelle iPSC-BEC quando infettate da Nm, in modo più evidente dopo 8 ore di infezione, come descritto in precedenza da Martins-Gomes et al (Figura 2)19.

7. Attivazione immunitaria innata mediante PCR quantitativa

NOTA: Utilizzando un protocollo preferito per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA e la qPCR, raccogliere campioni ed eseguire la qPCR su citochine selezionate.

  1. 7.1. Raccogliere l'RNA dai campioni BEC dopo l'infezione il giorno 10 del protocollo di differenziazione, utilizzando i reagenti di un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Evitare la contaminazione da nucleasi dei campioni lavorando con attenzione in un ambiente pulito e sterilizzato.
    1. Preparare il tampone di lisi e aggiungere 350 μL a ciascun pozzetto/monostrato di iPSC-BEC.
    2. Raccogliere i campioni pipettando su e giù numerose volte (ad es. 20x) e trasferendo la sospensione in una provetta sterile per microcentrifuga.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C fino a quando non sono pronti per l'isolamento dell'RNA.
    3. Seguire il protocollo fornito con il kit di isolamento dell'RNA per la purificazione dell'RNA da cellule e tessuti in coltura.
    4. Dopo l'eluizione in acqua priva di nucleasi, conservare i campioni di RNA su ghiaccio per ridurre al minimo qualsiasi potenziale attività della RNasi.
    5. Stimare le concentrazioni di RNA su uno spettrofotometro (ad esempio, Nanodrop).
  2. Generare una libreria di cDNA dall'RNA raccolto utilizzando un kit di sintesi di cDNA (vedi Tabella dei materiali).
    1. Impostare reazioni costituite da una miscela master di sintesi di cDNA, almeno 200 ng (idealmente 500 ng) di RNA campione e acqua priva di nucleasi in un volume di reazione totale definito, come descritto nel protocollo del kit di sintesi del cDNA.
    2. Su un termociclatore standard, eseguire un programma appropriato per i reagenti del kit di sintesi del cDNA utilizzato. Ad esempio: 25 °C per 2 min, 55 °C per 10 min, 95 °C per 1 min.
    3. Dopo la sintesi, diluire il cDNA fino a 1:10 in acqua priva di nucleasi e spostare i campioni a 4 °C per la conservazione a breve termine o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Una diluizione inferiore può essere necessaria se la concentrazione di RNA è bassa (ad esempio, inferiore a 50 ng). Il cDNA diluito può essere conservato a -20 °C per un massimo di un anno.
  3. Eseguire la qPCR sui campioni di cDNA mirando alle trascrizioni dei geni della risposta immunitaria innata come citochine e chemochine con primer accuratamente progettati e convalidati.
    NOTA: Poiché il design del primer è molto importante per la qualità dei risultati della qPCR, l'efficienza del primer deve essere testata conducendo una serie di diluizioni e l'assenza di più prodotti deve essere confermata su un gel di DNA.
    1. Per una reazione da 25 μL, utilizzare un primer diretto da 0,5 μL e un primer inverso da 0,5 μL (10 mM in acqua priva di nucleasi), 1 μL di cDNA, 10,5 μL di H2O privo di nucleasi e 12,5 μL di miscela master qPCR.
    2. Eseguire la reazione su una macchina qPCR utilizzando il seguente protocollo cycler: (a) 4 °C per 2 min; b) 95 °C per 15 min; c) 95 °C per 15 s; d) 60 °C per 1 min; scorrere (c) e (d) 45 volte; e) curva di fusione opzionale: 30\u201299 °C con incrementi di 1 °C; 25 °C per 5 min.
    3. Per l'analisi dei dati, utilizzare il calcolo ΔΔCT per confrontare i livelli di espressione di citochine e chemochine con un gene housekeeping di riferimento come 18S o GAPDH.

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Representative Results

Il protocollo qui descritto è adattato da Stebbins et al. ed evidenzia il processo per differenziare le iPSC in cellule endoteliali simili al cervello che possiedono proprietà BBB e come utilizzare questo modello per gli studi di infezione utilizzando iPSC-BEC con Nm19,22. Le iPSC-BEC, se differenziate correttamente, mostrano proprietà di barriera strette misurate da TEER che sono spesso superiori a 2000 Ω·cm2 ed esprimono marcatori endoteliali come VE-caderina e CD31 (PECAM) (Figura 1A\u2012C). Inoltre, esprimono e localizzano i marcatori di giunzione stretta Claudin-5, Occludin e ZO-1 (Figura 1 D\u2012F) e trasportatori come Glut-1 (Figura 1G). Dopo l'infezione da Nm, le iPSC-BEC rispondono all'infezione attraverso la sovraregolazione delle citochine proinfiammatorie neutrofile misurate mediante qPCR come IL-8 (CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 e IL6 (Figura 2A\u2012E). Questi risultati rappresentativi dimostrano come garantire che le iPSC-BEC siano differenziate in modo affidabile e come esaminare la risposta delle iPSC-BEC all'infezione da Nm.

Figure 1
Figura 1: Caratterizzazione delle iPSC-BEC. (A) TEER di due differenziazioni separate e individuali, lette nei giorni 9-12. Dati presentati come media di triplicati. Le barre di errore rappresentano ± SD. (B\u2012G) Dati rappresentativi di immunofluorescenza che mostrano l'espressione dei marcatori delle cellule endoteliali VE-caderina (B) e PECAM-1 (CD31; C), i componenti a giunzione stretta Claudin-5 (D), Occludin (E) e ZO-1 (F) e il trasportatore del glucosio GLUT-1 (G). La barra della scala rappresenta 50 μm. I pannelli B\u2012G di questa figura sono stati utilizzati con il permesso di Kim et al. originariamente pubblicati su Fluids and Barriers of the CNS, una rivista BMC17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Upregolazione delle citochine da parte delle iPSC-BEC in seguito all'infezione da Neisseria meningitidis. Dati rappresentativi della qPCR che mostrano l'espressione relativa dei trascritti CXCL8 (A), CXCL1 (B), CXCL2 (C), CCL20 (D) e IL6 (E) dopo 8 ore di infezione, confrontando monostrati iPSC-BEC infetti con quelli non infetti. Dati presentati come media di tre esperimenti indipendenti condotti in triplice copia. Le barre di errore rappresentano ± test t di S.D. Student utilizzato per determinare la significatività. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Questa figura è stata modificata e utilizzata con il permesso di Martins Gomes et al. originariamente pubblicata su Frontiers in Microbiology19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Cellule IMR90-4 in diverse fasi del processo di differenziamento BEC. Immagini rappresentative della coltura IMR90-4 di mantenimento pronte per essere sottoposte a passaggio (A) e cellule in diversi stadi del processo di differenziamento BEC: (B) dopo la semina con l'inibitore ROCK (giorno -2), (C) all'inizio del differenziamento (giorno 0), (D) primo giorno di confluenza (giorno 3), (E) fine della fase UM (giorno 6), (F) prima della purificazione BEC (giorno 8), e (G e H) dopo la purificazione BEC (giorno 9 e giorno 10). La barra della scala rappresenta 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La modellazione dei BEC e della BBB ha avuto delle sfide, poiché i BEC umani primari e immortalizzati, in vitro, tendono a mancare di fenotipi di barriera robusti. L'avvento delle tecnologie delle cellule staminali umane ha permesso la generazione di cellule BEC derivate da iPSC che mantengono i fenotipi tipici della BBB come i marcatori endoteliali, l'espressione della giunzione stretta, le proprietà di barriera, la risposta ad altri tipi di cellule del SNC e i trasportatori funzionali dell'efflusso 12,13,14,15,22, 24 , 25. Ciò ha permesso ai ricercatori di utilizzare BEC in vitro che imitano da vicino i BEC in vivo e modellano varie malattie con disfunzione BBBsegnalata 16,17,19,20,21,32. L'Nm è una delle principali cause di meningite batterica ed è un patogeno specifico per l'uomo che manca di robusti modelli in vivo 19. Questa limitazione ha reso necessario l'uso di modelli meglio ingegnerizzati per guidare la scoperta di una nuova interazione ospite-patogeno tra Nm e la BBB. Recentemente, abbiamo dimostrato che le iPSC-BEC sono un modello valido per interrogare l'interazione Nm-BEC19.

Qui descriviamo un metodo generale per derivare iPSC-BEC e infettare con Nm con conseguente sovraregolazione delle citochine proinfiammatorie che sono tipicamente indotte dall'infezione batterica19. Per la derivazione delle iPSC-BEC si segue generalmente il protocollo descritto in Stebbins et al. per la generazione di iPSC-BEC, con piccole modifiche22. In particolare qui utilizziamo terreni StemFlex al posto di mTesR1, tuttavia entrambi i terreni possono essere utilizzati per il mantenimento della coltura di cellule staminali17. È stato stabilito che questo protocollo funziona bene con molte linee di iPSC, tuttavia è importante determinare la densità di semina ottimale per ogni singola linea di iPSC15, 24. Per questo manoscritto abbiamo utilizzato la linea cellulare IMR90-4 ed è stato precedentemente stabilito che 1 x 105 cellule/cm2 era la densità di semina iniziale ottimale24. Infine, a dimostrazione dell'identità delle BEC generate, le iPSC-BEC esprimono i marcatori delle cellule endoteliali attese e le giunzioni strette, pur mostrando un elevato TEER (Figura 1)13,14,15,24. Questi fenotipi, oltre ad essere di origine umana, rendono le iPSC-BEC un potente strumento per interrogare l'interazione Nm-BEC.

La preparazione di Nm per l'infezione è stata adattata dai metodi precedentemente pubblicati19,33. Per garantire che i terreni di crescita batterica non venissero introdotti negli esperimenti di coltura cellulare, è stata condotta una fase di lavaggio e risospensione in PBS come descritto nei metodi. Infine, è stato precedentemente osservato che un MOI di 10 provoca l'attivazione delle iPSC-BEC attraverso una sovraregolazione delle citochine pro-infiammatorie19. L'attivazione dei BEC in risposta a vari batteri è stata osservata, in particolare attraverso la sovraregolazione di chemochine e citochine neutrofile6. È stato precedentemente osservato che le iPSC-BEC sovraregolano i potenti chemioattrattanti neutrofili IL-8, CXCL1 e CXCL2 dopo l'infezione da streptococco di gruppo B e Nm16,19. Questa risposta osservata delle iPSC-BEC dimostra che queste cellule sono in grado di rilevare i batteri e attivare un programma immunitario innato con conseguente sovraregolazione delle citochine. I metodi per rilevare la sovraregolazione di queste citochine mediante qPCR sono ben consolidati e sono brevemente descritti sopra. Tuttavia, è interessante notare che, mentre queste citochine pro-infiammatorie vengono rilevate mediante qPCR, i prodotti proteici coordinati non sono rilevati o sono molto bassi16,19. Al momento, non è chiaro se si tratti di un artefatto dei modelli iPSC-BEC o se la bassa abbondanza osservata di citochine sia biologicamente rilevante. Saranno necessarie ricerche future per determinare un meccanismo alla base della disconnessione tra espressione e secrezione.

Uno dei principali punti di forza del modello iPSC-BEC è l'espressione e la localizzazione di giunzioni strette che contribuiscono alla funzione di barriera, come si legge nei TEER 12,13,14,15,22. Precedenti lavori con Streptococcus agalactiae (Streptococco di gruppo B, GBS) hanno dimostrato che la sovraregolazione di Snail1 contribuisce alla distruzione delle giunzioni strette della BBB in vitro e in vivo34. Più recentemente, questa scoperta è stata confermata nel modello iPSC-BEC sia con GBS che con Nm, suggerendo un meccanismo per il modo in cui i batteri sono in grado di interrompere l'integrità della BBB durante l'infezione16,19. Inoltre, è stato dimostrato che Nm interagisce con CD147 sulle cellule endoteliali che promuovono l'attacco batterico e, in ultima analisi, la riorganizzazione delle giunzioni strette che portano alla disfunzione della barriera9. Abbiamo dimostrato che Nm colocalizza con CD147 nelle iPSC-BEC rendendo potenzialmente questo modello ideale per la futura delucidazione delle interazioni Nm-CD147 per quanto riguarda la disfunzione della BBB19.

Il metodo qui presentato dimostra la differenziazione delle iPSC-BEC da una fonte di cellule staminali pluripotenti e l'applicazione con l'infezione da Nm. Le iPSC-BEC sono di origine umana, esprimono marcatori endoteliali e possiedono fenotipi specifici per la BBB che li rendono un modello ideale per l'esame di patogeni specifici per l'uomo come Nm. Infine, siamo in grado di dimostrare che il modello iPSC-BEC risponde all'infezione batterica attraverso la sovraregolazione di una risposta citochinica neutrofila. Nel complesso, il modello iPSC-BEC presenta alcuni vantaggi rispetto ai sistemi di modelli primari e immortalizzati per esaminare le interazioni ospite-patogeno a livello della BBB. Ulteriori lavori dovrebbero essere volti a chiarire i meccanismi di distruzione della BBB durante la meningite batterica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

L.M.E. è supportato dal programma di formazione alla ricerca DFG GRK2157 dal titolo "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens" assegnato ad A.S-U. B.J.K. è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Alexander von Humboldt. Inoltre, ringraziamo Lena Wolter per la sua assistenza tecnica nella generazione delle iPSC-BEC in cultura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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References

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Tags

Neisseria meningitidis Meningite meningococcica Cellule endoteliali cerebrali Interazioni ospite-patogeno Sistemi modello in vivo Modello basato sull'uomo Giunzioni strette Resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) Modelli in vitro BEC primari BEC immortalizzati Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) BEC derivate da IPSC (IPSC-BEC) Distruzione barriera Attivazione immunitaria innata Interazione batterica

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Meningitidis di Neisseria</em> Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte
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Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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