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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Neisseria meningitidis Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

El protocolo descrito aquí destaca los principales pasos en la diferenciación de células madre pluripotentes derivadas de células madre cerebrales inducidas, la preparación de Neisseria meningitidis para la infección y la recolección de muestras para otros análisis moleculares.

Abstract

La meningitis meningocócica es una infección potencialmente mortal que se produce cuando Neisseria meningitidis (meningococo , Nm) puede acceder al sistema nervioso central (SNC) penetrando en las células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas. Dado que el Nm es un patógeno específico del ser humano, la falta de sistemas modelo in vivo robustos dificulta el estudio de las interacciones huésped-patógeno entre el Nm y los BEC y establece la necesidad de un modelo basado en el ser humano que imite a los BEC nativos. Las BEC poseen propiedades de barrera más ajustadas en comparación con las células endoteliales periféricas caracterizadas por uniones estrechas complejas y una elevada resistencia eléctrica transendotelial (TEER). Sin embargo, muchos modelos in vitro , como los BEC primarios y los BEC inmortalizados, carecen o pierden rápidamente sus propiedades de barrera después de la eliminación del microambiente neural nativo. Los avances recientes en las tecnologías de células madre humanas han desarrollado métodos para derivar células endoteliales similares al cerebro a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que fenocopian mejor las BEC en comparación con otros modelos humanos in vitro . El uso de BEC derivadas de iPSC (iPSC-BEC) para modelar la interacción Nm-BEC tiene la ventaja de utilizar células humanas que poseen propiedades de barrera BEC y puede utilizarse para examinar la destrucción de la barrera, la activación inmunitaria innata y la interacción bacteriana. Aquí demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de iPSC, además de la preparación bacteriana, la infección y la recolección de muestras para su análisis.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica meníngea (mBCSFB) son barreras celulares extremadamente estrechas que separan la circulación del sistema nervioso central (SNC) y están compuestas principalmente por células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas1,2. Juntos, los BEC mantienen una homeostasis cerebral adecuada mediante la regulación de nutrientes y productos de desecho dentro y fuera del cerebro, al tiempo que excluyen muchas toxinas, medicamentos y patógenos 1,2. La meningitis bacteriana se produce cuando las bacterias transmitidas por la sangre son capaces de interactuar y penetrar en la barrera formada por los BEC y causar inflamación. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) es una bacteria gramnegativa que coloniza la nasofaringe del 10-40 % de los individuos sanos, pero en algunos casos puede causar enfermedades sistémicas graves3. En los individuos afectados, el Nm puede acceder al torrente sanguíneo donde puede causar púrpura fulminante, así como penetrar en los BEC que acceden al SNC causando meningitis3. La NM es una de las principales causas de meningitis bacteriana en todo el mundo y, a pesar de los esfuerzos de vacunación, sigue siendo una de las principales causas de meningitis4. Las intervenciones médicas modernas, como el tratamiento con antibióticos, han hecho que estas condiciones sean superables, sin embargo, los afectados por meningitis a menudo quedan con daño neurológico permanente 5,6.

Estudios previos han identificado factores bacterianos y la señalización del huésped que contribuyen a las interacciones Nm-BEC 7,8,9,10,11. Las adhesinas e invasinas identificadas, como la proteína de opacidad Opc y los pili tipo IV, así como receptores como CD147, se han realizado en varios modelos BEC in vitro, sin embargo, estos modelos carecen de muchas propiedades definitorias de la BHE 7,9,11,12. La comprensión completa de las interacciones Nm-BEC sigue siendo difícil de alcanzar debido en parte a la incapacidad de utilizar modelos in vivo, la protección incompleta de la vacunación y la falta de modelos BEC humanos robustos in vitro.

El modelado de hBEC in vitro ha sido un reto debido a las propiedades únicas de los BEC. En comparación con las células endoteliales periféricas, las BEC tienen una serie de fenotipos que mejoran sus propiedades de barrera, como la alta resistencia eléctrica transendotelial (TEER) debido a las uniones estrechas complejas12. Una vez removidos del microambiente cerebral, los BEC pierden rápidamente sus propiedades de barrera, lo que limita la utilidad de los modelos primarios o inmortalizados in vitro que solo forman una barrera débil12,13. La combinación de la especificidad humana de las infecciones por Nm, la falta de modelos in vivo robustos y los desafíos para modelar BEC humanos in vitro crea la necesidad de mejores modelos para comprender la compleja interacción huésped-patógeno entre Nm y BEC. Recientemente, utilizando tecnologías modelo de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), se han derivado células similares a BEC a partir de iPSC que imitan mejor a las BEC in vivo12,13,14,15. Las iPSC-BEC son de origen humano, fácilmente escalables y poseen fenotipos BEC esperados en comparación con sus contrapartes primarias o inmortalizadas12,13,14,15. Además, nosotros y otros hemos demostrado que las iPSC-BEC son útiles para modelar diversas enfermedades del SNC, como la interacción huésped-patógeno, la enfermedad de Huntington y la deficiencia de MCT8 que causa el síndrome de Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Aquí, demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de fuentes renovables de iPSC y la infección de iPSC-BEC con Nm que conduce a la activación de la respuesta inmune innata. Creemos que este modelo es útil para interrogar la interacción huésped-patógeno que no se puede recapitular en otros modelos in vitro y es especialmente útil cuando se examinan las interacciones con patógenos específicos humanos como Nm.

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Protocol

NOTA: Todos los pasos de preparación de medios/reactivos, mantenimiento de células madre y diferenciación son una adaptación de Stebbins et al.22.

1. Preparación de los materiales necesarios para el cultivo de iPSC y la diferenciación de BEC.

  1. Recubrimiento matricial de plástico de cultivo de tejidos (TC) para cultivo IMR90-4 iPSC
    1. Gel de matriz de membrana basal alícuota (p. ej., Matrigel) en alícuotas de 2,5 mg y almacenar a -20 °C.
      NOTA: Trabaje rápidamente al manipular el gel de matriz y la alícuota en hielo, ya que forma un gel por encima de 4 °C y no se puede alícuota una vez que se ha solidificado.
    2. Para recubrir el plástico TC, agregue rápidamente una alícuota de gel de matriz a 30 ml de medio Eagle modificado (DMEM)/F12 de Dulbecco en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 1 ml del medio sobre el gel de matriz congelado, pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que se descongele y transfiéralo inmediatamente al tubo cónico de 50 ml con el medio restante.
    3. Utilice 1 ml de esta solución de recubrimiento de gel de matriz por pocillo de una placa de 6 pocillos y 12 ml por matraz T75.
      NOTA: El plástico TC recubierto de gel Matrix se puede preparar hasta dos semanas antes de su uso. Sin embargo, es fundamental evitar que la solución de gel de matriz se seque, lo que puede requerir la adición ocasional de más DMEM/F12 en la parte superior de los pocillos.
  2. Prepare el medio de mantenimiento de células madre agregando 50 mL de suplemento 50x a 450 mL de medio basal de mantenimiento de células madre en el ambiente estéril de un gabinete de bioseguridad.
    NOTA: En otros estudios se han utilizado otros medios de mantenimiento de células madre (mTeSR y E8) 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Para preparar 500 mL de medio incondicionado (UM), combine 392,5 mL de DMEM/F12 con 100 mL de reemplazo de suero knock out (KOSR), 5 mL de aminoácidos no esenciales, L-glutamina a una concentración final de 1 mM y 3,5 μL de β-mercaptoetanol. Filtrar-esterilizar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  4. Para preparar 200 mL de medio de células endoteliales (CE) más ácido retinoico (AR) más bFGF, combine 198 mL de medio libre de suero endotelial humano (hESFM), 2 mL de suero derivado pobre en plaquetas (PDS) esterilizado por filtro y 20 ng/mL de bFGF. Filtrar, esterilizar y almacenar hasta 2 semanas a 4 °C. Justo antes de la adición a las células, agregue 10 μM de AR al medio EC.
    NOTA: Dado que el PDS se ha descontinuado y, por lo tanto, puede ser limitado, este protocolo se ha llevado a cabo con éxito utilizando B27 en lugar de PDS 15,23,26.
  5. Para preparar 200 mL de medio EC sin AR o bFGF, combine 198 mL de hESFM y 2 mL de PDS esterilizado con filtro y esterilizante de filtro. Conservar hasta 4 semanas a 4 °C.

2. Mantenimiento del cultivo celular IMR90-4

NOTA: Aquí usamos la línea celular IMR90-4 como ejemplo, sin embargo, otras líneas de células madre pluripotentes inducidas como CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR y CS03iCTRn2 se han empleado con éxito para la diferenciación en BEC 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Cultive iPSC a 37 °C en CO 2 al 5% y, por lo general, manténgalas en placas de 6 pocillos a varias densidades con2 ml de medio de mantenimiento de células madre por pocillo.
  2. Para el mantenimiento del cultivo iPSC, seleccione un solo pozo para el paso que no sea confluente y que tenga espacios abiertos entre las colonias.
    1. Aspirar el medio de cultivo, añadir 1 ml de reactivo de disociación celular no enzimática e incubar a 37 °C durante 7 min. Mientras la incubación está en curso, reemplace la solución de gel de matriz, en una nueva placa de 6 pocillos, con 2 ml de medio de mantenimiento de células madre frescas por pocillo.
    2. Aspire con cuidado el reactivo de disociación celular no enzimática teniendo cuidado de no aspirar las células aún adheridas a la placa.
    3. Agregue 6 ml de medio de mantenimiento de células madre y enjuague el fondo del pocillo varias veces hasta que todas las células se desprendan por completo. Luego, siembre la nueva placa de 6 pocillos con densidades variables, generalmente 1:6 o 1:12 para un mantenimiento normal.
      NOTA: Usando las proporciones antes mencionadas, las celdas se dividen aproximadamente dos veces por semana.
    4. Mueva la placa a la incubadora y distribuya las células sembradas por igual a través de los pocillos agitando la placa hacia adelante y hacia atrás y de izquierda a derecha, haciendo una pausa entre movimientos de agitación alternos hasta que el medio se haya asentado.

3. Diferenciación de las células endoteliales cerebrales de las iPSC humanas

  1. Siembra de iPSCs para diferenciación (día -3 del protocolo de diferenciación)
    1. Según el pozo de mantenimiento IMR90-4, el cultivo se utiliza para colocar placas para la diferenciación, aspirar el medio de cultivo, agregar 1 ml de reactivo de disociación de células enzimáticas por pocillo e incubar a 37 °C durante 7 min.
    2. Inactive el reactivo de disociación de células enzimáticas transfiriendo 1 mL de suspensión celular disociada a un tubo cónico de 15 mL con al menos 2 mL de medio de mantenimiento de células madre frescas por 1 mL de células. Gire la suspensión celular a 1.500 x g durante 5 min.
    3. Vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de medio de mantenimiento de células madre por pocillo de células IMR90-4 utilizadas y cuente las células con un hemocitómetro.
      NOTA: Puede ser útil diluir 1:1 con azul de tripano al 0,4% para distinguir entre células vivas y muertas al contar. Dependiendo de la densidad de las iPSC, un pocillo de una placa de 6 pocillos suele producir de 1 a10 6 células.
    4. Para la diferenciación en un matraz T75, añadir 7,5 x 105 células a 12 ml de medio de mantenimiento de células madre y un inhibidor de ROCK (diclorhidrato Y27632) a una concentración final de 10 μM. Aspirar la solución de recubrimiento de gel de matriz de un matraz T75 y transferir la suspensión celular al matraz. Distribuir las celdas por igual agitando el matraz de un lado a otro y de izquierda a derecha (ver paso 2.2.4) e incubar a 37 °C y 5% deCO2.
      NOTA: Es fundamental agregar un inhibidor de ROCK en este paso para mejorar la supervivencia de las células madre individuales disociadas25,29. Las células deben distribuirse uniformemente a través del matraz y en los singletes que exhiben una morfología extendida, similar a la mesénquima, debido al tratamiento con inhibidores de ROCK22.
  2. En el día -2 y el día -1, cambie el medio a un medio de mantenimiento de células madre frescas; 12 mL por T75.
  3. En el día 0, comience la diferenciación cambiando los medios a UM; 12 mL por T75.
  4. Cambie UM diariamente (día 1 – día 5).
    NOTA: Las células suelen alcanzar la confluencia después de 2 a 3 días en UM, lo que se puede observar a simple vista o a través de un microscopio de campo claro invertido. A medida que avanza la diferenciación, los "tractos neurales" de nestina+ se hacen visibles con células PECAM-1+ en el medio, como se describió anteriormente13,14.
  5. Ampliar selectivamente la población de células endoteliales cambiando a medio EC con 20 ng/mL de bFGF y 10 μM de ácido retinoico (AR) (día 6) e incubando durante dos días. El medio EC con bFGF se puede preparar hasta dos semanas antes. La AR se añade a partir de existencias congeladas el día de su uso (por ejemplo, 1 μl de 10 mM de existencias de AR por 1 ml de EC + bFGF).
    NOTA: También se puede lograr una diferenciación exitosa sin suplementación de AR en los días 6 y 8. Sin embargo, la omisión de AR dará lugar a BEC con TEER reducida12,13,14.
  6. Recubrir las placas de cultivo celular y los insertos de membrana (p. ej., Transwell) con colágeno IV y fibronectina (día 7), para la purificación de los BEC y los experimentos posteriores.
    1. Para el recubrimiento de los insertos de membrana, combine 4 partes de colágeno IV (1 mg/ml en ácido acético de 0,5 mg/ml), 1 parte de fibronectina (1 mg/ml) y 5 partes de agua estéril de grado tisular. La solución de ECM se puede diluir 1:5 para recubrir placas de cultivo celular (es decir, 4 partes de colágeno IV, 1 parte de fibronectina, 45 partes de agua). Incubar con solución de recubrimiento a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Las placas y los insertos de membrana también se pueden recubrir durante al menos 4 h antes del subcultivo el mismo día de la etapa de purificación.
  7. Purificar los BEC mediante el subcultivo de las células diferenciadas en placas o insertos de membrana recubiertos de colágeno IV y fibronectina (día 8).
    1. Aspirar el medio EC y añadir el reactivo de disociación de células enzimáticas (12 ml por T75). Incubar a 37 °C hasta que el 90% de las células se hayan desprendido del matraz.
      NOTA: La disociación celular puede tardar hasta 1 h.
    2. Durante el tiempo de incubación, retire la solución de recubrimiento de colágeno IV/fibronectina de las placas/insertos previamente preparados y déjelos secar en una campana estéril. Los insertos tardan aproximadamente 20 minutos en secarse.
    3. Una vez que las células se hayan desprendido, lávelas del matraz con una pipeta de 10 ml. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para lograr una suspensión de una sola célula.
      NOTA: La suspensión de una sola célula es importante para un recuento fiable de células y para lograr monocapas sólidas.
    4. Diluir con al menos el mismo volumen de hESFM fresco en un tubo cónico de 50 ml y contar las células con un hemocitómetro.
    5. Gellet las células a 1.500 x g durante 10 min.
    6. Vuelva a suspender las células en el volumen adecuado de EC + bFGF + AR recién preparado para lograr una suspensión de 2 x 106 células/ml para la siembra en los insertos de membrana. Agregue 500 μL (1 x 106 celdas) en la parte superior de un inserto de 12 pocillos y 1,5 ml de medio EC + bFGF + AR en la parte inferior. Para la siembra en placas de 24 y 48 pocillos, diluya la suspensión celular 1:2 y agregue 500 μL (5 x 10 5 celdas) y 250 μL (2.5 x 105 celdas) por pocillo, respectivamente. Distribuya las células uniformemente por el pocillo/inserto (véase el paso 2.2.4) e incube a 37 °C con un 5% de CO2.
  8. Cambie el medio en placas/transpocillos a EC sin bFGF o AR (día 9).
  9. Realice experimentos de infección, medición de TEER y tinción de inmunofluorescencia como se describe en las siguientes secciones (día 10).
    NOTA: Las BEC diferenciadas y purificadas con éxito suelen alcanzar el pico de TEER en el día 10 y expresan marcadores característicos de las células endoteliales cerebrales como PECAM-1 (CD31) y VE-cadherina, el transportador de glucosa GLUT-1, transportadores de eflujo como la glicoproteína p y los componentes de unión estrecha ZO-1, Ocludina y Claudina-5 13,14,16,17,19,22 . Consulte Lippmann et al., Stebbins et al. y otros para obtener más detalles e imágenes de los tipos celulares, las morfologías y la expresión de marcadores específicos del tipo celular durante el proceso de diferenciación 13,14,15,16,17,19,22. En la Figura 1 se pueden encontrar imágenes representativas de las células IMR90-4 en diferentes etapas del proceso de diferenciación de BEC.

4. Resistencia eléctrica transendotelial (TEER) como medida de la estanqueidad de la barrera

NOTA: Por lo general, la TEER se lee en los insertos de membrana en los días 9 y 10 de la diferenciación para confirmar la generación exitosa de iPSC-BEC formadoras de barreras (Figura 1A).

  1. Coloque el voltímetro-ohmio epitelial (EVOM) en el ambiente estéril de una campana de bioseguridad y conecte el electrodo al EVOM.
  2. Desinfecte el electrodo sumergiéndolo en EtOH al 70% durante al menos 5 minutos y déjelo secar por completo.
    NOTA: Si es necesario, es posible una incubación más prolongada en EtOH al 70% o la descontaminación del electrodo con una solución de hipoclorito al 5%.
  3. Recupere los iPSC-BEC en los insertos de membrana de la incubadora y mida el TEER.
    NOTA: Es importante leer TEER rápidamente después de sacarlo de la incubadora, ya que el cambio de temperatura puede afectar la medición de TEER.
  4. Lea TEER sumergiendo el electrodo en el medio de modo que el electrodo más corto se coloque en la parte superior del inserto y el electrodo más largo llegue al medio que rodea el inserto.
    NOTA: Asegúrese de que los electrodos en las puntas de los "palillos" estén completamente cubiertos por líquido. Si es necesario, incline el pozo para lograr esto antes de volver a colocar la placa para medir.

5. Tinción de inmunofluorescencia (IF) para validar el fenotipo BEC

NOTA: Para validar la calidad de las células totalmente diferenciadas y purificadas, se tiñen monocapas de iPSC-BEC para los marcadores característicos de las células endoteliales cerebrales en el día 10 del proceso de diferenciación como se describió anteriormente (Figura 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Aspire el medio y lave 1 vez con PBS.
  2. Fije las celdas con metanol helado a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
  3. Lavar 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y bloquear con suero fetal bovino (FBS) al 10% en PBS a RT durante 1 h.
  4. Aspirar y añadir anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo. Incubar a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Consulte la Tabla de Materiales y Stebbins et al. para obtener información relacionada con la fuente y dilución de los anticuerpos22.
  5. Lavar 3 veces con PBS antes de agregar el anticuerpo secundario diluido en la solución de bloqueo. Incubar en RT durante 1 h. Proteja las muestras de la luz a partir de este momento.
  6. Lavar 2 veces con PBS. A continuación, añadir DAPI en una dilución de 1:5.000 en PBS y teñir en RT durante 15 min.
  7. Lávese 1 vez dejando el PBS encendido y tome imágenes con un microscopio de fluorescencia.

6. Preparación de bacterias e infección de iPSC-BECs

  1. El día antes del experimento de infección (día 9 de diferenciación), inicie un cultivo nocturno de la bacteria a partir de caldo congelado. Para la infección por Nm, escurra las bacterias en agar Columbia con un 5% de sangre de oveja (agar sangre). Incubar cultivos bacterianos a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
  2. Al día siguiente (día 10), prepare PPM+ fresco suplementando los medios de peptona proteasa (PPM) con 50 μL de 2 M MgCl2, 50 μL de 2 M NaHCO3 y 100 μL de suplemento de Kellogg's por 10 mL. Inocular 10 mL de medio PPM+ en un tubo cónico de 50 mL con Nm de la placa de cultivo durante la noche utilizando un hisopo de algodón estéril. Incubar agitando a 200 rpm a 37 °C durante 1,5 h (es decir, hasta que las bacterias estén en fase de crecimiento logarítmico).
  3. Durante la incubación bacteriana, prepare las iPSC-BEC en una placa de 24 pocillos o en insertos de membrana para la infección reemplazando el medio viejo con 400 μl de medio EC fresco (sin bFGF ni AR) por pocillo/parte superior del inserto de membrana.
  4. Centrifugar el cultivo bacteriano a 4000 x g durante 10 min y aspirar el medio. Resuspender el gránulo bacteriano en 250 μL de PBS.
  5. En 4 ml de PBS fresco, use una porción de la suspensión de células bacterianas y ajuste a un DO600 de 0.4 (aproximadamente 1 x 108 UFC/ml).
  6. A continuación, diluir las bacterias en un medio de cultivo celular (medio EC) de acuerdo con la multiplicidad de infección (MOI) deseada.
    NOTA: Por ejemplo, para un MOI de 10, diluya 1:10 o 1:5 cuando infecte iPSC-BEC en una placa de 24 pocillos o en insertos de membrana, respectivamente (1 x 105 células por monocapa en una placa de 24 pocillos). La adición de suero humano no se incluye en la preparación de Nm para la infección, como se describió en otros manuscritos, ya que se observó que tenía un impacto deletéreo en el fenotipo de barrera iPSC-BEC medido por TEER (datos no mostrados)30,31. Sin embargo, la interacción de Nm e iPSC-BEC no se ve afectada con o sin suero humano (datos no mostrados).
  7. Infectar las iPSC-BEC en cada pocillo con 100 μL de la suspensión de bacterias preparada e incubar durante el tiempo deseado de infección.
    NOTA: La expresión de una serie de citocinas y quimiocinas proinflamatorias está elevada en las iPSC-BEC cuando se infectan con Nm, sobre todo después de 8 h de infección, como se describió previamente por Martins-Gomes et al (Figura 2)19.

7. Activación inmunitaria innata por PCR cuantitativa

NOTA: Utilizando un protocolo preferido de aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y qPCR, recoja muestras y ejecute qPCR en citocinas seleccionadas.

  1. 7.1. Recoger el ARN de las muestras de BEC después de la infección en el día 10 del protocolo de diferenciación, utilizando los reactivos de un kit de aislamiento de ARN disponible en el mercado (véase la Tabla de materiales).
    NOTA: Evite la contaminación por nucleasas de las muestras trabajando cuidadosamente en un ambiente limpio y esterilizado.
    1. Prepare el tampón de lisis y añada 350 μL a cada pocillo/monocapa de iPSC-BEC.
    2. Recoja las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces (por ejemplo, 20x) y transfiriendo la suspensión a un tubo de microcentrífuga estéril.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C hasta que estén listas para el aislamiento del ARN.
    3. Siga el protocolo proporcionado con el kit de aislamiento de ARN para la purificación de ARN a partir de células y tejidos cultivados.
    4. Después de la elución en agua libre de nucleasas, mantenga las muestras de ARN en hielo para minimizar cualquier actividad potencial de ARNasa.
    5. Estimar las concentraciones de ARN en un espectrofotómetro (por ejemplo, Nanodrop).
  2. Genere una biblioteca de ADNc a partir del ARN recolectado utilizando un kit de síntesis de ADNc (consulte la Tabla de materiales).
    1. Configure reacciones que consistan en una mezcla maestra de síntesis de ADNc, al menos 200 ng (idealmente 500 ng) de ARN de muestra y agua libre de nucleasas en un volumen total de reacción definido como se describe en el protocolo del kit de síntesis de ADNc.
    2. En un termociclador estándar, ejecute un programa que sea apropiado para los reactivos del kit de síntesis de ADNc utilizado. Por ejemplo: 25 °C durante 2 min, 55 °C durante 10 min, 95 °C durante 1 min.
    3. Después de la síntesis, diluir el ADNc hasta 1:10 en agua libre de nucleasas y mover las muestras a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo o -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Puede ser necesaria una dilución más baja si la concentración de ARN es baja (por ejemplo, por debajo de 50 ng). El ADNc diluido puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de un año.
  3. Realice qPCR en las muestras de ADNc dirigidas a transcripciones de genes de respuesta inmunitaria innata, como citocinas y quimiocinas, con cebadores cuidadosamente diseñados y validados.
    NOTA: Dado que el diseño del cebador es muy importante para la calidad de los resultados de la qPCR, la eficiencia del cebador debe probarse realizando una serie de diluciones y la ausencia de múltiples productos debe confirmarse en un gel de ADN.
    1. Por reacción de 25 μL, utilice 0,5 μL de cebador directo y 0,5 μL de inverso (10 mM en agua sin nucleasa), 1 μL de ADNc, 10,5 μL de H2O libre de nucleasa y 12,5 μL de mezcla maestra de qPCR.
    2. Realice la reacción en una máquina de qPCR utilizando el siguiente protocolo de ciclador: (a) 4 °C durante 2 min; b) 95 °C durante 15 min; c) 95 °C durante 15 s; d) 60 °C durante 1 min; ciclo a través de (c) y (d) 45 veces; e) curva de fusión opcional: 30-99 °C en incrementos de 1 °C; 25 °C durante 5 min.
    3. Para el análisis de datos, utilice el cálculo de ΔΔCT para comparar los niveles de expresión de citocinas y quimiocinas con un gen de mantenimiento de referencia, como 18S o GAPDH.

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Representative Results

El protocolo descrito aquí es una adaptación de Stebbins et al. y destaca el proceso para diferenciar las iPSC en células endoteliales similares al cerebro que poseen propiedades de BBB, y cómo utilizar este modelo para estudios de infección utilizando iPSC-BEC con Nm19,22. Las iPSC-BECs, cuando se diferencian adecuadamente, exhiben propiedades de barrera ajustadas medidas por TEER que a menudo son mayores de 2000 Ω·cm2, y expresan marcadores endoteliales como VE-cadherina y CD31 (PECAM) (Figura 1A\u2012C). Además, expresan y localizan los marcadores de unión estrecha Claudin-5, Occludin y ZO-1 (Figura 1 D\u2012F), y transportadores como Glut-1 (Figura 1G). Tras la infección por Nm, las iPSC-BEC responden a la infección a través de la regulación positiva de citocinas proinflamatorias neutrofílicas medidas por qPCR, como IL-8 (CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 e IL6 (Figura 2A\u2012E). Estos resultados representativos demuestran cómo garantizar que las iPSC-BEC se diferencian de forma fiable y cómo examinar la respuesta de las iPSC-BEC a la infección por Nm.

Figure 1
Figura 1: Caracterización de iPSC-BECs. (A) TEER de dos diferenciaciones separadas e individuales, leídas en los días 9 a 12. Los datos se presentan como media de triplicados. Las barras de error representan ± SD. (B\u2012G) Datos representativos de inmunofluorescencia que muestran la expresión de los marcadores de células endoteliales VE-cadherina (B) y PECAM-1 (CD31; C), los componentes de unión estrecha Claudina-5 (D), Ocludina (E) y ZO-1 (F), y el transportador de glucosa GLUT-1 (G). La barra de escala representa 50 μm. Los paneles B\u2012G de esta figura se han utilizado con permiso de Kim et al. publicado originalmente en Fluids and Barriers of the CNS, una revista de BMC17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Regulación positiva de citocinas por iPSC-BECs tras la infección por Neisseria meningitidis. Datos representativos de qPCR que muestran la expresión relativa de las transcripciones de CXCL8 (A), CXCL1 (B), CXCL2 (C), CCL20 (D) e IL6 (E) después de 8 h de infección, comparando monocapas de iPSC-BEC infectadas con no infectadas. Los datos se presentan como media de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error representan ± prueba t de S.D. Student utilizada para determinar la significación. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Esta figura ha sido modificada y utilizada con permiso de Martins Gomes et al. publicada originalmente en Frontiers in Microbiology19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Células IMR90-4 en diferentes etapas del proceso de diferenciación de BEC. Imágenes representativas del cultivo IMR90-4 de mantenimiento listo para ser pasado (A) y células en diferentes etapas del proceso de diferenciación de BEC: (B) después de la siembra con inhibidor de ROCK (día -2), (C) al inicio de la diferenciación (día 0), (D) primer día de confluencia (día 3), (E) final de la fase UM (día 6), (F) antes de la purificación de BEC (día 8), y (G y H) después de la purificación BEC (día 9 y día 10). La barra de escala representa 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El modelado de BECs y la BBB ha tenido desafíos, ya que los BECs humanos primarios e inmortalizados, in vitro, tienden a carecer de fenotipos de barrera robustos. El advenimiento de las tecnologías de células madre humanas ha permitido la generación de células similares a BEC derivadas de iPSC que conservan los fenotipos característicos esperados de la BBB, como los marcadores endoteliales, la expresión de la unión estrecha, las propiedades de barrera, la respuesta a otros tipos de células del SNC y los transportadores de eflujo funcionales 12,13,14,15,22, 24 , 25. Esto ha permitido a los investigadores utilizar BEC in vitro que imitan de cerca a los BEC in vivo y modelar varias enfermedades con disfunción de BBB reportada 16,17,19,20,21,32. El Nm es una de las principales causas de meningitis bacteriana y es un patógeno específico del ser humano que carece de modelos in vivo robustos19. Esta limitación ha requerido el uso de modelos mejor diseñados para impulsar el descubrimiento de una nueva interacción huésped-patógeno entre Nm y la BBB. Recientemente, hemos demostrado que las iPSC-BEC son un modelo viable para interrogar la interacción Nm-BEC19.

Aquí describimos un método general para derivar iPSC-BECs e infectar con Nm, lo que resulta en la regulación positiva de las citoquinas proinflamatorias que son típicamente inducidas por la infección bacteriana19. Para la derivación de iPSC-BECs generalmente seguimos el protocolo descrito en Stebbins et al. para la generación de iPSC-BECs, con pequeñas modificaciones22. En particular, aquí utilizamos medios StemFlex en lugar de mTesR1, sin embargo, cualquiera de los dos medios se puede utilizar para el mantenimiento del cultivo de células madre17. Se ha establecido que este protocolo funciona bien con muchas líneas iPSC, sin embargo, es importante que se determine la densidad de siembra óptima para cada líneaiPSC individual 15, 24. Para este manuscrito se utilizó la línea celular IMR90-4 y se estableció previamente que 1 x 105 células/cm2 era la densidad óptima de siembra inicial24. Finalmente, como demostración de la identidad de las BEC generadas, las iPSC-BEC expresan marcadores de células endoteliales esperadas y uniones estrechas, mientras que exhiben una alta TEER (Figura 1)13,14,15,24. Estos fenotipos, además de ser de origen humano, hacen de las iPSC-BEC una poderosa herramienta para interrogar la interacción Nm-BEC.

La preparación de Nm para la infección fue adaptada de métodos previamente publicados19,33. Para asegurarse de que el medio de crecimiento bacteriano no se introdujera en los experimentos de cultivo celular, se llevó a cabo una etapa de lavado y resuspensión en PBS como se describe en los métodos. Por último, se había observado previamente que un MOI de 10 daba lugar a la activación de iPSC-BEC a través de una regulación positiva de las citoquinas proinflamatorias19. Se ha observado la activación de BEC en respuesta a diversas bacterias, concretamente a través de la regulación positiva de quimiocinas y citoquinas neutrofílicas6. Se ha observado previamente que las iPSC-BEC regulan al alza los potentes quimioatrayentes de neutrófilos IL-8, CXCL1 y CXCL2 después de la infección por estreptococos del grupo B y Nm16,19. Esta respuesta observada de las iPSC-BEC demuestra que estas células son capaces de detectar bacterias y activar un programa inmunitario innato que da lugar a la regulación positiva de las citocinas. Los métodos para detectar la regulación positiva de estas citoquinas mediante qPCR están bien establecidos y se describen brevemente anteriormente. Sin embargo, curiosamente, mientras que estas citoquinas proinflamatorias se detectan mediante qPCR, los productos de proteínas coordinadas no se detectan o son muy bajos16,19. En la actualidad, no está claro si se trata de un artefacto de los modelos iPSC-BEC, o si la baja abundancia de citocinas observada es biológicamente relevante. Se requerirán investigaciones futuras para determinar un mecanismo detrás de la desconexión entre la expresión y la secreción.

Una de las principales fortalezas del modelo iPSC-BEC es la expresión y localización de uniones estrechas que contribuyen a la función de barrera, como se lee en TEER 12,13,14,15,22. Trabajos previos con Streptococcus agalactiae (Streptococcus del Grupo B, GBS) han demostrado que la regulación positiva de Snail1 contribuye a la destrucción de las uniones estrechas de la BHE in vitro e in vivo34. Más recientemente, este hallazgo se confirmó en el modelo iPSC-BEC tanto con SGB como con Nm, lo que sugiere un mecanismo de cómo las bacterias son capaces de alterar la integridad de la BHE durante la infección16,19. Además, se demostró que el Nm interactúa con CD147 en las células endoteliales que promueven la unión bacteriana y, en última instancia, la reorganización de las uniones estrechas que conducen a la disfunción de la barrera9. Hemos demostrado que Nm se colocaliza con CD147 en las iPSC-BECs, lo que potencialmente hace que este modelo sea ideal para la futura elucidación de las interacciones Nm-CD147 en lo que respecta a la disfunción de la BHE19.

El método presentado aquí demuestra la diferenciación de iPSC-BECs a partir de una fuente de células madre pluripotentes, y su aplicación con la infección por Nm. Las iPSC-BEC son de origen humano, expresan marcadores endoteliales y poseen fenotipos específicos de BBB, lo que las convierte en un modelo ideal para el examen de patógenos específicos humanos como Nm. Finalmente, podemos demostrar que el modelo iPSC-BEC responde a la infección bacteriana a través de la regulación positiva de una respuesta de citoquinas neutrofílicas. En conjunto, el modelo iPSC-BEC tiene ciertas ventajas sobre los sistemas modelo primarios e inmortalizados para examinar las interacciones huésped-patógeno en la barrera hematoencefálica. Se deben realizar más trabajos para dilucidar los mecanismos de destrucción de la barrera hematoencefálica durante la meningitis bacteriana.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

L.M.E. cuenta con el apoyo del programa de formación en investigación de DFG GRK2157 titulado "Modelos de tejidos 3D para el estudio de infecciones microbianas por patógenos humanos" otorgado a A. S-U. B.J.K. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación Alexander von Humboldt. Además, reconocemos a Lena Wolter por su asistencia técnica en la generación de los iPSC-BEC en cultura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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References

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Neisseria Meningitidis Meningitis Meningocócica Células Endoteliales Cerebrales Interacciones Huésped-Patógeno Sistemas Modelo In Vivo Modelo Humano Uniones Estrechas Resistencia Eléctrica Transendotelial (TEER) Modelos In Vitro BECs Primarios BECs Inmortalizados Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) BECs Derivadas de IPSC (iPSC-BECs) Destrucción de Barrera Activación Inmune Innata Interacción Bacteriana

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Neisseria meningitidis</em> Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas
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Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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