Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Neisseria meningitidis Infektion av inducerade pluripotenta stamcellshärledda endotelceller i hjärnan

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollet som beskrivs här belyser de viktigaste stegen i differentieringen av inducerade pluripotenta stamcellshärledda hjärnliknande endotelceller, beredningen av Neisseria meningitidis för infektion och provtagning för andra molekylära analyser.

Abstract

Meningokockmeningit är en livshotande infektion som uppstår när Neisseria meningitidis (meningokocker, Nm) kan få tillgång till det centrala nervsystemet (CNS) genom att tränga in i högspecialiserade endotelceller i hjärnan (BEC). Eftersom Nm är en människospecifik patogen gör bristen på robusta in vivo-modellsystem att det är svårt att studera värd-patogen-interaktionerna mellan Nm och BEC och skapar ett behov av en människobaserad modell som efterliknar naturliga BEC. BEC har tätare barriäregenskaper jämfört med perifera endotelceller som kännetecknas av komplexa täta korsningar och förhöjt transendotelialt elektriskt motstånd (TEER). Men många in vitro-modeller , såsom primära BEC och immortaliserade BEC, antingen saknar eller förlorar snabbt sina barriäregenskaper efter avlägsnande från den ursprungliga neurala mikromiljön. De senaste framstegen inom mänsklig stamcellsteknik har utvecklat metoder för att härleda hjärnliknande endotelceller från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som bättre fenokopierar BEC jämfört med andra in vitro-modeller för människa. Användningen av iPSC-härledda BEC:er (iPSC-BEC) för att modellera Nm-BEC-interaktion har fördelen att använda mänskliga celler som har BEC-barriäregenskaper och kan användas för att undersöka barriärdestruktion, medfödd immunaktivering och bakteriell interaktion. Här visar vi hur man härleder iPSC-BEC från iPSCs förutom bakteriell beredning, infektion och provtagning för analys.

Introduction

Blod-hjärnbarriären (BBB) och meningeal-blod-CSF-barriären (mBCSFB) är extremt täta cellulära barriärer som separerar cirkulationen från det centrala nervsystemet (CNS) och består främst av högspecialiserade hjärnendotelceller (BEC)1,2. Tillsammans upprätthåller BEC korrekt hjärnhomeostas genom att reglera näringsämnen och avfallsprodukter in och ut ur hjärnan, samtidigt som många gifter, droger och patogener utesluts 1,2. Bakteriell meningit uppstår när blodburna bakterier kan interagera med och tränga igenom den barriär som bildas av BEC och orsaka inflammation. Neisseria meningitidis (Nm, meningokocker) är en gramnegativ bakterie som koloniserar nasofarynx hos 10\u201240 % av friska individer, men som i vissa fall kan orsaka allvarlig systemisk sjukdom. Hos drabbade individer kan Nm få tillgång till blodomloppet där det kan orsaka purpura fulminans samt penetrera BEC och få tillgång till CNS som orsakar meningit3. Nm är en ledande orsak till bakteriell hjärnhinneinflammation över hela världen, och trots vaccinationsinsatser är det fortfarande en primär orsak till hjärnhinneinflammation4. Moderna medicinska ingrepp, såsom antibiotikabehandling, har gjort dessa tillstånd överlevnadsbara, men de som drabbas av hjärnhinneinflammation får ofta permanenta neurologiska skador 5,6.

Tidigare studier har identifierat bakteriella faktorer och värdsignalering som bidrar till Nm-BEC-interaktioner 7,8,9,10,11. De identifierade adhesinerna och invasinerna såsom opacitetsproteinet Opc och typ-IV pili, samt receptorer som CD147, har utförts på olika BEC-modeller in vitro, men dessa modeller saknar många definierande BBB-egenskaper 7,9,11,12. Fullständig förståelse av Nm-BEC-interaktioner är fortfarande svårfångad, delvis på grund av oförmågan att använda in vivo-modeller, ofullständigt vaccinationsskydd och brist på robusta humana BEC-modeller in vitro.

Modellering av hBEC in vitro har varit utmanande på grund av BEC:s unika egenskaper. Jämfört med perifera endotelceller har BEC ett antal fenotyper som förbättrar deras barriäregenskaper, t.ex. högt transendotelellt elektriskt motstånd (TEER) på grund av komplexa täta korsningar12. När BEC väl har avlägsnats från hjärnans mikromiljö förlorar de snabbt sina barriäregenskaper, vilket begränsar användbarheten av primära eller odödliga in vitro-modeller som endast bildar en svag barriär12,13. Kombinationen av den mänskliga specificiteten hos Nm-infektioner, bristen på robusta in vivo-modeller och utmaningar med att modellera humana BEC in vitro skapar ett behov av bättre modeller för att förstå den komplexa värd-patogeninteraktionen mellan Nm och BEC. Nyligen har BEC-liknande celler härletts från iPSC:er som bättre efterliknar BEC in vivo12,13,14,15 med hjälp av modeller för humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC). iPSC-BEC är av mänskligt ursprung, lätt skalbara och har förväntade BEC-fenotyper jämfört med sina primära eller odödliga motsvarigheter12,13,14,15. Dessutom har vi och andra visat att iPSC-BEC är användbara för att modellera olika sjukdomar i CNS såsom värd-patogeninteraktion, Huntingtons sjukdom och MCT8-brist som orsakar Allan-Hurndon-Dudleys syndrom 16,17,18,19,20,21. Här visar vi hur man härleder iPSC-BEC från förnybara iPSC-källor och infektion av iPSC-BEC med Nm som leder till aktivering av det medfödda immunsvaret. Vi tror att denna modell är användbar för att undersöka värd-patogeninteraktion som inte kan rekapituleras i andra in vitro-modeller och är särskilt användbar när man undersöker interaktioner med humanspecifika patogener som Nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla media/reagensberedning, stamcellsunderhåll och differentieringssteg är anpassade från Stebbins et al.22.

1. Förberedelse av material som krävs för iPSC-odling och BEC-differentiering.

  1. Matrisbeläggning av vävnadskulturplast (TC) för IMR90-4 iPSC-kultur
    1. Alikvot basalmembranmatrisgel (t.ex. Matrigel) till alikvoter på 2,5 mg och förvaras vid -20 °C.
      OBS: Arbeta snabbt när du hanterar matrisgelen och alikvoten på is, eftersom den bildar en gel över 4 °C och inte kan aliciteras när den väl har stelnat.
    2. För beläggning av TC-plast, tillsätt snabbt en alikvot matrisgel till 30 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)/F12-medium i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 1 ml av mediet till den frysta matrisgelen, pipettera upp och ner tills det är tinat och överför omedelbart till det 50 ml koniska röret med det återstående mediet.
    3. Använd 1 ml av denna matrisgelbeläggningslösning per brunn på en 6-hålsplatta och 12 ml per T75-kolv.
      OBS: Matrix gel-belagd TC-plast kan beredas upp till två veckor innan den används. Det är dock viktigt att undvika att matrisgellösningen torkar ut, vilket kan kräva tillfällig tillsats av mer DMEM/F12 ovanpå brunnarna.
  2. Förbered stamcellsunderhållsmedium genom att tillsätta 50 ml 50x tillskott till 450 ml basalmedium för stamcellsunderhåll i den sterila miljön i ett biosäkerhetsskåp.
    OBS: Andra medium för underhåll av stamceller (mTeSR och E8) har använts i andra studier 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. För att bereda 500 ml okonditionerat medium (UM), kombinera 392,5 ml DMEM/F12 med 100 ml knock out-serumersättning (KOSR), 5 ml icke-essentiella aminosyror, L-glutamin vid en slutlig koncentration av 1 mM och 3,5 μL β-merkaptoetanol. Filtersterilisera och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
  4. För att bereda 200 ml endotelcellsmedium (EC) plus retinsyra (RA) plus bFGF, kombinera 198 ml humant endotelserumfritt medium (hESFM), 2 ml filtersteriliserat trombocytfattigt härlett serum (PDS) och 20 ng/ml bFGF. Sterilisera filtret och förvara det i upp till 2 veckor vid 4 °C. Strax före tillsats till celler, tillsätt 10 μM RA till EC-medium.
    OBS: Eftersom PDS har upphört och därför kan vara begränsat, har detta protokoll framgångsrikt genomförts med B27 i stället för PDS 15,23,26.
  5. För att förbereda 200 ml EC-medium utan RA eller bFGF, kombinera 198 ml hESFM och 2 ml filtersteriliserad PDS och filtersterilisera. Förvaras i upp till 4 veckor vid 4 °C.

2. Underhåll IMR90-4 cellodling

OBS: Här använder vi IMR90-4-cellinjen som ett exempel, men andra inducerade pluripotenta stamcellslinjer såsom CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR och CS03iCTRn2 har framgångsrikt använts för differentiering till BEC 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Odla iPSCs vid 37 °C i 5 % CO2 och håll vanligtvis på 6-brunnsplattor vid olika densiteter med 2 ml stamcellsunderhållsmedium per brunn.
  2. För underhåll av iPSC-kulturen, välj en enda brunn för passage som inte är sammanflytande och har öppna utrymmen mellan kolonierna.
    1. Aspirera odlingsmediet, tillsätt 1 ml icke-enzymatiskt celldissociationsreagens och inkubera vid 37 °C i 7 minuter. Medan inkubationen pågår, byt ut matrisgellösningen på en ny 6-hålsplatta mot 2 ml färskt stamcellsunderhållsmedium per brunn.
    2. Aspirera försiktigt det icke-enzymatiska celldissociationsreagenset och var noga med att inte aspirera celler som fortfarande sitter fast på plattan.
    3. Tillsätt 6 ml stamcellsunderhållsmedium och skölj brunnsbotten några gånger tills alla celler är helt lossnade. Såd sedan den nya 6-hålsplattan med varierande densitet, vanligtvis 1:6 eller 1:12 för normalt underhåll.
      OBS: Med hjälp av de ovan nämnda förhållandena delas cellerna ungefär två gånger i veckan.
    4. Flytta plattan till inkubatorn och fördela de sådda cellerna jämnt över brunnarna genom att skaka plattan fram och tillbaka och från vänster till höger, pausa mellan alternerande skakningsrörelser tills mediet har lagt sig.

3. Differentiering av hjärnans endotelceller från humana iPSC

  1. Plätering av iPSC:er för differentiering (dag -3 i differentieringsprotokollet)
    1. Per IMR90-4 underhållsodlingsbrunn som används för att platta för differentiering, aspirera odlingsmediet, tillsätt 1 ml enzymatiskt celldissociationsreagens per brunn och inkubera vid 37 °C i 7 minuter.
    2. Inaktivera det enzymatiska celldissociationsreagenset genom att överföra 1 ml dissocierad cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör med minst 2 ml färskt stamcellsunderhållsmedium per 1 ml celler. Centrifugera cellsuspensionen med 1 500 x g i 5 minuter.
    3. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml stamcellsunderhållsmedium per brunn med IMR90-4-celler som används och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
      OBS: Det kan vara bra att späda 1:1 med 0,4 % trypanblått för att skilja mellan levande och döda celler vid räkning. Beroende på densiteten hos iPSCs ger en brunn på en 6-hålsplatta vanligtvis 1\u20122 x 106 celler.
    4. För differentiering i en T75-kolv, tillsätt 7,5 x 105 celler till 12 ml stamcellsunderhållsmedium och ROCK-hämmare (Y27632-dihydroklorid) vid en slutlig koncentration av 10 μM. Aspirera matrisgelbeläggningslösning från en T75-kolv och överför cellsuspensionen till kolven. Fördela cellerna jämnt genom att skaka kolven fram och tillbaka och från vänster till höger (se steg 2.2.4) och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 .
      OBS: Det är viktigt att lägga till ROCK-hämmare i detta steg för att förbättra överlevnaden av de dissocierade enskilda stamcellerna25,29. Cellerna ska vara jämnt fördelade över kolven och i linnen som uppvisar en spridd, mesenkymal morfologi som beror på behandling med ROCK-hämmare22.
  2. På dag -2 och dag -1, byt medium till färskt stamcellsunderhållsmedium; 12 ml per T75.
  3. På dag 0 börjar du differentiera genom att byta media till UM. 12 ml per T75.
  4. Byt UM dagligen (dag 1 – dag 5).
    OBS: Cellerna når vanligtvis sammanflöde efter 2 till 3 dagar i UM, vilket kan observeras med blotta ögat eller genom ett inverterat ljusfältsmikroskop. När differentieringen fortskrider blir nestin+ "neurala trakter" synliga med PECAM-1+-celler däremellan som tidigare beskrivits13,14.
  5. Expandera endotelcellspopulationen selektivt genom att byta till EC-medium med 20 ng/ml bFGF och 10 μM retinsyra (RA) (dag 6) och inkubera i två dagar. EC medium med bFGF kan förberedas upp till två veckor innan. RA tillsätts från fryst lager på användningsdagen (t.ex. 1 μl 10 mM RA-lager per 1 ml EC + bFGF).
    OBS: Framgångsrik differentiering kan också uppnås utan tillskott av RA vid dag 6 och 8. Utelämnande av RA kommer dock att ge BEC med reducerad TEER12,13,14.
  6. Bestryk cellodlingsplattor och membraninsatser (t.ex. Transwell) med kollagen IV och fibronektin (dag 7), för rening av BEC och efterföljande experiment.
    1. För beläggning av membraninsatser, kombinera 4 delar kollagen IV (1 mg/ml i 0,5 mg/ml ättiksyra), 1 del fibronektin (1 mg/ml) och 5 delar sterilt vävnadsklassat vatten. ECM-lösning kan spädas 1:5 för beläggning av cellodlingsplattor (dvs. 4 delar kollagen IV, 1 del fibronektin, 45 delar vatten). Inkubera med beläggningslösning vid 37 °C över natten.
      OBS: Plattor och membraninsatser kan också beläggas i minst 4 timmar före subkultivering samma dag i reningssteget.
  7. Rena BEC genom subkultivering av de differentierade cellerna på kollagen IV och fibronektinbelagda plattor eller membraninsatser (dag 8).
    1. Aspirera EC-medium och tillsätt enzymatiskt celldissociationsreagens (12 ml per T75). Inkubera vid 37 °C tills 90 % av cellerna har lossnat från kolven.
      OBS: Celldissociation kan ta upp till 1 timme.
    2. Under inkubationstiden avlägsnas kollagen IV/fibronektinbeläggningslösningen från tidigare förberedda plattor/insatser och låt dem torka i en steril huva. Det tar cirka 20 minuter för insatserna att torka.
    3. När cellerna har lossnat, tvätta av dem från kolven med en 10 ml pipett. Pipettera upp och ner för att uppnå en encellssuspension.
      OBS: Encellssuspension är viktigt för tillförlitlig cellräkning och för att uppnå fasta monolager.
    4. Späd med minst lika stor volym färsk hESFM i ett 50 ml koniskt rör och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
    5. Pelletera cellerna med 1 500 x g i 10 minuter.
    6. Återsuspendera cellerna i lämplig volym av nyberedd EC + bFGF + RA för att uppnå en suspension på 2 x 106 celler/ml för sådd på membraninsatser. Tillsätt 500 μL (1 x 106 celler) ovanpå en insats med 12 brunnar och 1,5 ml EC + bFGF + RA-medium i botten. För sådd på plattor med 24 och 48 brunnar, späd cellsuspensionen 1:2 och tillsätt 500 μl (5 x 10 5 celler) respektive 250 μl (2,5 x 105 celler) per brunn. Fördela cellerna jämnt över brunnen/insatsen (se steg 2.2.4) och inkubera vid 37 °C under 5 % CO2 %.
  8. Byt media på plattor/brunnar till EC utan bFGF eller RA (dag 9).
  9. Utför infektionsexperiment, TEER-mätning och immunofluorescensfärgning enligt beskrivningen i följande avsnitt (dag 10).
    OBS: Framgångsrikt differentierade och renade BEC når vanligtvis topp TEER på dag 10 och uttrycker karakteristiska markörer för hjärnans endotelceller såsom PECAM-1 (CD31) och VE-cadherin, glukostransportören GLUT-1, effluxtransportörer såsom p-glykoprotein och tight junction-komponenterna ZO-1, Occludin och Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Se Lippmann et al., Stebbins et al. och andra för ytterligare detaljer och bilder av celltyper, morfologier och uttryck av celltypsspecifika markörer under differentieringsprocessen 13,14,15,16,17,19,22. Representativa bilder av IMR90-4-cellerna i olika stadier i BEC-differentieringsprocessen finns i kompletterande figur 1.

4. Transendotelial elektrisk resistans (TEER) som ett mått på barriärtäthet

OBS: TEER avläses vanligtvis på membraninsatser på dag 9 och 10 av differentiering för att bekräfta framgångsrik generering av barriärbildande iPSC-BEC (Figur 1A).

  1. Placera epitelvolt-ohm-mätaren (EVOM) i den sterila miljön i en biosäkerhetshuv och anslut elektroden till EVOM.
  2. Desinficera elektroden genom att sänka ner den i 70 % EtOH i minst 5 minuter och låt den torka helt.
    OBS: Längre inkubation i 70 % EtOH eller dekontaminering av elektroden med 5 % hypokloritlösning är möjlig vid behov.
  3. Ta upp iPSC-BEC:erna på membraninsatser från inkubatorn och mät TEER.
    OBS: Det är viktigt att läsa TEER snabbt efter att ha tagits ut ur inkubatorn eftersom temperaturförändringar kan påverka TEER-mätningen.
  4. Läs TEER genom att doppa elektroden i mediet så att den kortare elektroden placeras ovanpå insatsen och den längre elektroden når in i mediet som omger insatsen.
    OBS: Se till att elektroderna vid spetsarna på "ätpinnarna" är helt täckta av vätska. Om det behövs, luta brunnen för att uppnå detta innan du sätter ner plattan igen för mätning.

5. Immunfluorescensfärgning (IF) för att validera BEC-fenotyp

OBS: För att validera kvaliteten på de helt differentierade och renade cellerna färgas iPSC-BEC-monolager för de karakteristiska markörerna för hjärnans endotelceller på dag 10 av differentieringsprocessen som tidigare beskrivits (Figur 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Aspirera medium och tvätta 1x med PBS.
  2. Fixera cellerna med iskall metanol vid rumstemperatur (RT) i 15 min.
  3. Tvätta 3 gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och blockera med 10 % fetalt bovint serum (FBS) i PBS vid RT i 1 timme.
  4. Aspirera och tillsätt primära antikroppar utspädda i blockerande lösning. Inkubera vid 4 °C över natten.
    OBS: Se materialtabellen och Stebbins et al. för information om källa och utspädning av antikropparna22.
  5. Tvätta 3 gånger med PBS innan du tillsätter sekundär antikropp utspädd i blockerande lösning. Inkubera vid RT i 1 timme. Skydda samples från ljus från och med nu.
  6. Tvätta 2 gånger med PBS. Tillsätt sedan DAPI vid en utspädning på 1:5 000 i PBS och färga vid RT i 15 minuter.
  7. Tvätta 1x och låt PBS vara på och ta bilder med ett fluorescensmikroskop.

6. Beredning av bakterier och infektion av iPSC-BEC

  1. Dagen före infektionsexperimentet (dag 9 av differentieringen) påbörjas en odling över natten av bakterierna från fryst lager. Vid infektion med Nm, strö bakterier på Columbia-agar med 5 % fårblod (blodagar). Inkubera bakteriekulturer vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.
  2. Nästa dag (dag 10) bereder du färsk PPM+ genom att komplettera proteaspeptonmedia (PPM) med 50 μL 2 M MgCl2, 50 μL 2 M NaHCO3 och 100 μL Kellogg's tillskott per 10 ml. Inokulera 10 ml PPM+-medium i ett 50 ml koniskt rör med Nm från odlingsplattan över natten med en steril bomullspinne. Inkubera skakning vid 200 varv per minut vid 37 °C i 1,5 timmar (dvs. tills bakterierna befinner sig i logaritmisk tillväxtfas).
  3. Under bakteriell inkubation, förbered iPSC-BEC i en 24-hålsplatta eller på membraninsatser för infektion genom att ersätta det gamla mediet med 400 μL färskt EC-medium (utan bFGF eller RA) per brunn/toppen av membraninsatsen.
  4. Centrifugera bakteriekulturen vid 4000 x g i 10 minuter och aspirera mediet. Återsuspendera bakteriepelleten i 250 μL PBS.
  5. I 4 ml färsk PBS, använd en del av bakteriecellssuspensionen och justera till en OD600 på 0,4 (cirka 1 x 108 CFU/ml).
  6. Späd sedan ut bakterierna i cellodlingsmedium (EC-medium) enligt önskad infektionsmultiplicitet (MOI).
    OBS: Till exempel, för ett MOI på 10, späd 1:10 eller 1:5 vid infektion av iPSC-BEC i en 24-hålsplatta respektive på membraninsatser (1 x 105 celler per monolager i en 24-hålsplatta). Tillsats av humant serum ingår inte i beredningen av Nm för infektion, vilket beskrivits i andra manuskript, eftersom det observerades ha en skadlig inverkan på iPSC-BEC-barriärfenotypen mätt med TEER (data visas inte)30,31. Interaktionen mellan Nm och iPSC-BEC påverkas dock inte med eller utan humant serum (data visas inte).
  7. Infektera iPSC-BEC i varje brunn med 100 μL av den beredda bakteriesuspensionen och inkubera under önskad infektionstid.
    OBS: Uttrycket av ett antal proinflammatoriska cytokiner och kemokiner är förhöjt i iPSC-BEC vid infektion med Nm, mest framträdande efter 8 timmars infektion som tidigare beskrivits av Martins-Gomes et al (Figur 2)19.

7. Medfödd immunaktivering genom kvantitativ PCR

OBS: Använd en föredragen RNA-isolering, cDNA-syntes och qPCR-protokoll, samla in samples och kör qPCR på utvalda cytokiner.

  1. 7.1 Samla in RNA från BEC-prover efter infektion på dag 10 i differentieringsprotokollet med hjälp av reagenser från ett kommersiellt tillgängligt RNA-isoleringskit (se materialtabellen).
    OBS: Undvik nukleaskontaminering av samples genom att arbeta noggrant i en rengjord och steriliserad miljö.
    1. Bered lysbufferten och tillsätt 350 μl till varje brunn/monolager av iPSC-BEC.
    2. Samla in proverna genom att pipettera upp och ner flera gånger (t.ex. 20x) och överföra suspensionen till ett sterilt mikrocentrifugrör.
      OBS: Samples kan förvaras vid -80 °C tills de är redo för RNA-isolering.
    3. Följ protokollet som medföljer RNA-isoleringssatsen för RNA-rening från odlade celler och vävnad.
    4. Efter eluering i nukleasfritt vatten, förvara RNA-prover på is för att minimera eventuell RNas-aktivitet.
    5. Uppskatta RNA-koncentrationer på en spektrofotometer (t.ex. Nanodrop).
  2. Generera ett cDNA-bibliotek från det insamlade RNA:t med hjälp av ett cDNA-synteskit (se materialförteckning).
    1. Ställ in reaktioner bestående av cDNA-syntesmastermix, minst 200 ng (helst 500 ng) prov-RNA och nukleasfritt vatten i en definierad total reaktionsvolym enligt beskrivningen i protokollet för cDNA-syntessatsen.
    2. På en vanlig termocykler kör du ett program som är lämpligt för reagenserna i det cDNA-synteskit som används. Till exempel: 25 °C i 2 min, 55 °C i 10 min, 95 °C i 1 min.
    3. Efter syntesen, späd cDNA upp till 1:10 i nukleasfritt vatten och flytta proverna till 4 °C för kortvarig eller -20 °C för långtidsförvaring.
      OBS: Lägre utspädning kan vara nödvändig om RNA-koncentrationen var låg (t.ex. under 50 ng). Det utspädda cDNA:t kan förvaras vid -20 °C i upp till ett år.
  3. Utför qPCR på cDNA-proverna som riktar sig mot transkript av medfödda immunsvarsgener som cytokiner och kemokiner med noggrant utformade och validerade primers.
    OBS: Eftersom primerns design är mycket viktig för kvaliteten på qPCR-resultaten, bör primerns effektivitet testas genom att genomföra en spädningsserie och frånvaron av flera produkter bör bekräftas på en DNA-gel.
    1. Använd 0,5 μL framåt och 0,5 μL omvänd primer per 25 μL reaktion (10 mM i nukleasfritt vatten), 1 μL cDNA, 10,5 μL nukleasfri H2 O och12,5μL qPCR master mix.
    2. Utför reaktionen på en qPCR-maskin med hjälp av följande cykelprotokoll: a) 4 °C i 2 minuter. b) 95 °C i 15 minuter. c) 95 °C i 15 s, d) 60 °C i 1 min. cykla genom (c) och (d) 45 gånger; e) Valfri smältkurva: 30–99 °C i steg om 1 °C. 25 °C i 5 min.
    3. För dataanalys, använd ΔΔCT-beräkningen för att jämföra cytokin- och kemokinuttrycksnivåer med en referenshushållsgen som 18S eller GAPDH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här är anpassat från Stebbins et al. och belyser processen för att differentiera iPSCs till hjärnliknande endotelceller som har BBB-egenskaper, och hur man använder denna modell för infektionsstudier med iPSC-BECs med Nm19,22. iPSC-BEC:erna, när de differentieras på rätt sätt, uppvisar täta barriäregenskaper mätta med TEER som ofta är större än 2000 Ω·cm2, och uttrycker endotelmarkörer såsom VE-cadherin och CD31 (PECAM) (Figur 1A\u2012C). Dessutom uttrycker och lokaliserar de täta korsningsmarkörerna Claudin-5, Occludin och ZO-1 (Figur 1 D\u2012F) och transportörer som Glut-1 (Figur 1G). Vid infektion med Nm svarar iPSC-BEC på infektion genom uppreglering av neutrofila proinflammatoriska cytokiner mätt med qPCR såsom IL-8 (CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 och IL6 (Figur 2A\u2012E). Dessa representativa resultat visar hur man säkerställer att iPSC-BEC differentieras på ett tillförlitligt sätt och hur man undersöker iPSC-BECs svar på Nm-infektion.

Figure 1
Figur 1: Karakterisering av iPSC-BEC. (A) TEER av två separata, individuella differentieringar, läses på dag 9–12. Data presenterade som medelvärde av triplikat. Felstaplar representerar ± SD. (B\u2012G) Representativa immunofluorescensdata som visar uttryck av endotelcellsmarkörerna VE-cadherin (B) och PECAM-1 (CD31; C), tight junction-komponenterna Claudin-5 (D), Occludin (E) och ZO-1 (F) och glukostransportören GLUT-1 (G). Skalstapeln representerar 50 μm. Panelerna B\u2012G av denna figur har använts med tillstånd från Kim et al. ursprungligen publicerad i Fluids and Barriers of the CNS, en BMC-tidskrift17. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Uppreglering av cytokiner med iPSC-BEC vid infektion med Neisseria meningitidis. Representativa qPCR-data som visar relativt uttryck av transkript av CXCL8 (A), CXCL1 (B), CXCL2 (C), CCL20 (D) och IL6 (E) efter 8 timmars infektion, jämfört infekterade med oinfekterade iPSC-BEC-monolager. Data presenteras som medelvärde av tre oberoende experiment utförda i tre exemplar. Felstaplar representerar ± SD Students t-test som används för att bestämma signifikans. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Denna figur har modifierats och använts med tillstånd från Martins Gomes et al., ursprungligen publicerad i Frontiers in Microbiology19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfigur 1: IMR90-4-celler i olika stadier i BEC-differentieringsprocessen. Representativa bilder av underhållsodling IMR90-4 redo att passera (A) och celler i olika stadier i BEC-differentieringsprocessen: (B) efter sådd med ROCK-hämmare (dag -2), (C) i början av differentieringen (dag 0), (D) Första dagen av sammanflödet (dag 3). (E) Slutet av UM-fasen (dag 6). (F) före BEC-rening (dag 8), och (G och H) efter BEC-rening (dag 9 och dag 10). Skalstapeln representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modellering av BEC och BBB har haft utmaningar, eftersom primära och odödliga humana BEC:er, in vitro, tenderar att sakna robusta barriärfenotyper. Tillkomsten av mänsklig stamcellsteknik har möjliggjort generering av iPSC-härledda BEC-liknande celler som behåller förväntade kännetecken BBB-fenotyper såsom endotelmarkörer, tight junction-uttryck, barriäregenskaper, svar på andra CNS-celltyper och funktionella effluxtransportörer 12,13,14,15,22, 24 , 25. Detta har gjort det möjligt för forskare att använda BEC in vitro som nära efterliknar in vivo BEC och modellerar olika sjukdomar med rapporterad BBB-dysfunktion 16,17,19,20,21,32. Nm är en ledande orsak till bakteriell meningit och är en humanspecifik patogen som saknar robusta in vivo-modeller 19. Denna begränsning har gjort det nödvändigt att använda bättre konstruerade modeller för att driva upptäckten av ny värd-patogen-interaktion mellan Nm och BBB. Nyligen har vi visat att iPSC-BEC är en gångbar modell för att undersöka Nm-BEC-interaktion19.

Här beskriver vi en generell metod för att härleda iPSC-BEC och infektera med Nm vilket resulterar i uppreglering av proinflammatoriska cytokiner som vanligtvis induceras av bakteriell infektion19. För härledning av iPSC-BEC följer vi i allmänhet protokollet som beskrivs i Stebbins et al. för generering av iPSC-BECs, med mindre modifieringar22. I synnerhet här använder vi StemFlex-media istället för mTesR1, men båda medierna kan användas för underhåll av stamcellskulturen17. Det har fastställts att detta protokoll fungerar bra med många iPSC-linjer, men det är viktigt att den optimala såddtätheten bestäms för varje enskild iPSC-linje15, 24. För detta manuskript använde vi IMR90-4-cellinjen och det var tidigare fastställt att 1 x 105 celler/cm2 var den optimala initiala såddtätheten24. Slutligen, som en demonstration av identiteten hos genererade BEC:er, uttrycker iPSC-BEC:er förväntade endotelcellsmarkörer och täta korsningar samtidigt som de uppvisar hög TEER (Figur 1)13,14,15,24. Dessa fenotyper, förutom att de är av mänskligt ursprung, gör iPSC-BEC till ett kraftfullt verktyg för att undersöka Nm-BEC-interaktion.

Beredningen av Nm för infektion anpassades från tidigare publicerade metoder 19,33. För att säkerställa att det bakteriella odlingsmediet inte fördes in i cellodlingsförsöken genomfördes ett tvättsteg och resuspension i PBS enligt beskrivningen i metoderna. Slutligen hade en MOI på 10 tidigare observerats för att resultera i aktivering av iPSC-BEC genom en uppreglering av proinflammatoriska cytokiner19. Aktivering av BEC som svar på olika bakterier har observerats, nämligen genom uppreglering av neutrofila kemokiner och cytokiner6. Det har tidigare observerats att iPSC-BEC uppreglerar de potenta neutrofila kemoattraherande medlen IL-8, CXCL1 och CXCL2 efter infektion med grupp B-streptokocker och Nm16,19. Detta observerade svar av iPSC-BEC visar att dessa celler kan upptäcka bakterier och aktivera ett medfött immunprogram som resulterar i uppreglering av cytokiner. Metoderna för att detektera uppreglering av dessa cytokiner med qPCR är väletablerade och beskrivs kortfattat ovan. Intressant nog, medan dessa proinflammatoriska cytokiner detekteras med qPCR, är koordinatproteinprodukterna antingen odetekterade eller mycket låga16,19. För närvarande är det oklart om detta är en artefakt av iPSC-BEC-modellerna, eller om den observerade låga förekomsten av cytokiner är biologiskt relevant. Framtida forskning kommer att krävas för att fastställa en mekanism bakom kopplingen mellan uttryck och utsöndring.

En stor styrka hos iPSC-BEC-modellen är uttrycket och lokaliseringen av täta korsningar som bidrar till barriärfunktionen enligt TEER 12,13,14,15,22. Tidigare arbete med Streptococcus agalactiae (grupp B-streptokocker, GBS) har visat att uppregleringen av Snail1 bidrar till att BBB-täta korsningar förstörs in vitro och in vivo34. På senare tid har detta fynd bekräftats i iPSC-BEC-modellen både med GBS och Nm som tyder på en mekanism för hur bakterier kan störa BBB-integriteten under infektion16,19. Dessutom visades det att Nm interagerar med CD147 på endotelceller som främjar bakteriell bindning och i slutändan omorganisation av täta korsningar som leder till barriärdysfunktion9. Vi har visat att Nm samlokaliseras med CD147 i iPSC-BEC, vilket potentiellt gör denna modell idealisk för framtida klargörande av Nm-CD147-interaktioner när det gäller BBB-dysfunktion19.

Metoden som presenteras här visar differentieringen av iPSC-BEC från en pluripotent stamcellskälla och tillämpning med Nm-infektion. iPSC-BEC:erna är av mänskligt ursprung, uttrycker endotelmarkörer och har BBB-specifika fenotyper vilket gör dem till en idealisk modell för undersökning av humanspecifika patogener såsom Nm. Slutligen kan vi visa att iPSC-BEC-modellen svarar på bakteriell infektion genom uppreglering av ett neutrofilt cytokinsvar. Sammantaget har iPSC-BEC-modellen vissa fördelar jämfört med primära och odödliga modellsystem för att undersöka värd-patogeninteraktioner vid BBB. Ytterligare arbete bör syfta till att belysa mekanismerna för BBB-destruktion vid bakteriell meningit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

L.M.E. stöds av DFG:s forskarutbildningsprogram GRK2157 med titeln "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens" som tilldelats A. S-U. B.J.K. stöds av ett postdoktoralt stipendium från Alexander von Humboldt-stiftelsen. Dessutom tackar vi Lena Wolter för hennes tekniska assistans i genereringen av iPSC-BEC i kulturen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Tags

Neisseria meningitidis meningokockmeningit endotelceller i hjärnan värd-patogeninteraktioner in vivo-modellsystem människobaserade modeller snäva korsningar transendotelial elektrisk resistans (TEER) in vitro-modeller primära BEC odödliga BEC inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) IPSC-härledda BEC (iPSC-BEC) barriärdestruktion medfödd immunaktivering bakteriell interaktion

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Neisseria meningitidis</em> Infektion av inducerade pluripotenta stamcellshärledda endotelceller i hjärnan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter