Summary
我们建立了培养神经祖细胞的条件，从辅助区和凹陷陀螺的成年大脑的草原卷，作为补充的体外研究，以分析神经基因利基之间的性别依赖差异，这可能是功能塑料变化的一部分相关的社会行为。
Abstract
神经球是组成神经干细胞和祖细胞的原发细胞聚集体。这些 3D 结构是确定神经干细胞的分化和增殖潜力以及生成细胞系的极佳工具。此外，神经球可以创建一个利基（体外），允许动态变化的环境建模，如不同的生长因子，激素，神经递质，等等。 微图色（ 草原卷）是理解社会性行为和社会认知的神经生物学基础的独特模型。然而，这些行为所涉及的细胞机制并不为人所知。该协议旨在从成人草原卷的神经原位获得神经祖细胞，这些细胞在非粘附条件下培养，以产生神经球。神经球的大小和数量取决于区域（辅助区或凹陷陀螺）和草原卷的性别。这种方法是研究体外神经基因利基的性别依赖差异和与社会行为相关的神经可塑性变化（如配对结合和双亲护理）的显著工具。此外，可以检查导致社会互动缺陷的认知条件（自闭症谱系障碍和精神分裂症）。
Introduction
草原卷（Microtus ochrogaster）是克里西蒂达家族的一员，是一种小型哺乳动物，其生命策略发展为社会一夫一妻制和高度善于交际的物种。雄性与雌性在交配或长期同居后建立持久的对结，其特点是共享巢，保卫自己的领地，并表现出双亲照顾他们的后代1，2，3，4。因此，草原卷是理解社会性行为和社会认知障碍的神经生物学基础的宝贵模型。
成人神经生成是导致行为变化的神经可塑性最重要的过程之一。例如，我们的研究小组在雄细胞中报告说，与交配的社会同居增加了在海马体凹陷陀螺（DG）的辅助区（VZ）和亚角区细胞增殖，这表明成人神经生成可以在草原卷交配诱导的配对结合（未公布的数据）中发挥作用。另一方面，虽然产生和整合新神经元的大脑区域是众所周知的，但由于整个大脑模型6的技术缺点，这些过程中涉及的分子和细胞机制仍然不确定。例如，控制基因表达和其他细胞活动的信号通路具有相对较短的激活期（磷蛋白群的检测）7。另一种模型是分离和培养成人神经干细胞或祖细胞，以阐明参与成人神经生成分子成分。
维持成年哺乳动物（小鼠）大脑中的神经前体的第一个方法是神经球的测定，神经球是在非粘附条件下生长的细胞聚集体，保留了其产生神经元的多能潜力，以及星细胞8、9、10。在它们的发展过程中，有一个选择过程，只有前体会响应米粒生长因子（EGF）和纤维细胞生长因子2（FGF2）等表皮生长因子（FGF2），以增殖和产生神经球8，9，10。
据我们所知，文献中没有关于从草原卷获得成人神经祖细胞的协议。在这里，我们建立了培养条件，通过神经球形成分析将神经元祖细胞从神经原位及其体外维持中分离。因此，实验可以设计为确定神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移、分化和存活的分子和细胞机制，这些机制在草原卷中仍然不为人知。此外，阐明从VZ和DG衍生的细胞的特性的体外差异，可以提供神经基因利基在神经可塑性中的作用的信息，与社会性行为和认知行为的变化，以及社会互动的不足（自闭症谱系障碍和精神分裂症），这也可能依赖于性别。
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Protocol
这项研究得到了墨西哥墨西哥国家国家大学神经生物学研究所研究伦理委员会和全国生物学研究所（2018-1-163）的批准。这些动物的繁殖、护理和人道终点是根据墨西哥卫生秘密协会"萨卢德总健康法"（卫生研究一般健康法）根据墨西哥官方标准（NOM-062-Z00-1999）建立的。
1. 解决方案和库存准备
- 准备N2培养基与485 mL的Dulbecco的修改鹰中-F12（DMEM-F12），5mL的N2补充剂（100x），5mL的谷氨酰胺补充剂（100x）和5mL的抗生素抗霉菌（100x）。
- 准备一个B27培养基与480 mL的神经基础介质，10 mL的B27补充剂（50x），5mL的谷氨酰胺补充剂，和5mL的抗生素抗真菌（100x）。
- 在 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）中重组胶酶粉，以获得活性为 100 单位/μL （1000x） 的等分，并储存在 -20 °C。 请注意，胶原酶的活动取决于公司的批号。
- 在 1x PBS （50 mg/mL） 中溶解 5 毫克的去色粉末，以准备 diss 库存等分。储存在-20°C。
- 制备具有 100 mMEM-F12 介质的酶溶液，50 μL 的库存胶酶（100 单位/μL），最终浓度为 50 U/mL 和 333 μL 的库存 dispase （50 mg/mL），最终浓度为 0.33 mg/mL。
- 要准备洗涤溶液，至 1000 mL 的 1x PBS，加入 0.4766 g HEPES（最终浓度 2 mM）、3.6 g D-葡萄糖（最终浓度 20 mM）和 2.1 g NaHCO3（ 最终浓度 25 mM）。
- 使用无菌水准备聚L-奥尼辛股票（1毫克/千升），储存在-20°C。
- 准备聚-L-奥尼辛的工作解决方案。在49毫升无菌水中稀释库存等分（1mg/mL），最终浓度为20μg/mL。
- 准备层压素的工作解决方案。将 25 μL 层薄荷（1 mg/mL 原库存）稀释在 5 mL 无菌水中，最终浓度为 5 μg/mL。
注：制备后，过滤培养介质、工作和库存解决方案，以避免污染。使用注射器或瓶顶真空过滤器（孔径为 0.2 μm 的聚氨酯膜）。培养基介质和工作解决方案可以在 4 °C 下存储长达 30 天，而在 -20°C 下可存储多达 4 个月。
2. 开始微分流前的准备
- 通过高压灭菌或热玻璃珠干消毒器对手术器械进行消毒。
- 在严格的无菌和防腐条件下（例如，用臭氧水）清洁微解表面积。
注：每个卷脑中两个神经基因利基的微致性分理的分显时间约为30分钟。建议使用1-4只动物完成整个过程。
3. 提取整个大脑
- 麻醉成人卷（12-16周）与过量的五巴比妥（6.3毫克/动物）通过内丙酮注射。通过没有踏板反射来响应坚定的脚趾捏，验证麻醉的深度。
- 一旦卷完全麻醉，通过斩首诱导安乐死，并恢复头部。
- 用剪刀从头骨中解剖皮肤，做一个骨-罗体切口（15毫米长）来暴露头骨。
- 切开腹骨和腹间骨骼，沿着下垂和腹牙线切入头骨。
- 用剪刀在正面骨骼和骨骼交界处的头骨上打个洞，小心不要损伤脑组织。
- 要暴露大脑，请用锋利的钳子取出覆盖两个大脑半球的剩余颅骨碎片。
- 使用不锈钢铲将整个大脑从颅基上抬起来。
- 用20 mL的冷洗溶液将大脑收集到离心管（50 mL）。
- 用冷洗溶液洗脑两次。
4. 神经组织的微切除
- 将培养皿放在被冰包围的表面上。
- 将大脑沉积在盘子上，加入20mL的冷洗溶液。
- 用手术刀，在日冕平面上，将大脑分成两个组织块（左体和骨。作为神经解剖学参考，在前后轴11（ 图1A，实线）的布雷格玛水平上执行日冕切割。
- 从骨骼块中提取VZ组织（图1B），而从骨块取出DG（图1C）。
- 在立体显微镜下解剖 VZ。
- 用杜蒙钳子，举行半球之一;然后，在心室的高度插入第二个杜蒙力的细尖，在组织下，线由胆小子-普塔门（图2A）。
- 沿多索文体轴打开钳子以分离组织。
- 使用 2 mL 的冷洗溶液在离心管中收集每个个体的 VZ 组织。不要将两种动物的组织集中。
- 在另一半球重复微切除。
- 将含有双边 VZ 组织的管子存放在冰上，并继续解剖 DG。
- 在立体显微镜下从考达尔块中解剖 DG。
- 用手术刀，做一个日冕切入块，以获得两片，其中海马的形成观察。作为一个里程碑，根据鼠标大脑图集11（ 图1A，虚线和图1C），在前部轴的-2毫米Bregma 坐标下进行切割。
- 使用 Dumont 钳子，握住其中一个切片，用细点 Dumont 钳子在 DG 和 CA1 之间进行水平切割，然后在 DG 和 CA3 之间执行垂直切口以分隔 DG（图 2B）。
- 在另一个半球的第一片中重复解剖。
- 在第二个切片中的两个半球中重复解剖。
- 在离心管中收集每卷的四个 DG 片。请勿将两种动物的 DG 组织集中。
注：如果需要解剖多个动物，请将附有VZ或DG组织的离心管储存在冰上，同时继续解剖大脑的其余部分。解剖时清除覆盖脑组织的所有血管。如果不丢弃这些血管，培养物可以与过量的红细胞混合，干扰神经球的形成。
5. 神经细胞分离
- 将离心管放在生物安全柜内，等待约 10 分钟，让组织碎片通过重力沉淀。
- 拆下洗涤液，将 1 mL 的暖酶溶液添加到每个管中。
- 在37°C下孵育管子10分钟。
- 分解组织碎片;移液器上下与 1 mL 尖端。不要移液超过30倍。
- 在37°C下进行10分钟的第二次孵育。
- 在第二次孵育结束时，移液器分解组织。不要移液超过30倍。
注：移液后，组织片段应完全分解;如果它们没有分解，在37°C下再孵育10分钟，然后重新移液。消化期不应超过30分钟。 - 每管加入9 mL的N2介质，稀释酶处理。
- 在室温下以 200 x g 离心管 4 分钟。
- 丢弃上一杯，用10 mL的N2介质清洗。
- 在步骤5.8相同的条件下进行离心机。
- 从每个管中去除上重物，并分别将VZ和DG的细胞颗粒在2 mL和1 mL的B27介质中重新暂停。
- 要去除任何非分解组织，请使用细胞滤株（大小 40 μm）过滤每个细胞悬浮液。
6. 神经球的形成
- 培养细胞通过过滤器进入一个超低的附件，24井板。使用两口用于 VZ 的井，一口用于 DG（1 mL 的 B27 介质/孔）。
- 在每个井中加入20纳克/mL的FGF2和20纳克/mL的EGF（最终浓度1x）。
- 在37°C、5%CO 2和高湿度（90-95%）下孵育。请勿打扰 48 小时（培养的第 1 天和第 2 天，D1-D2）。
- 在第三天（D3），去除一半的培养基，代之以新鲜的B27介质（每井500μL），并辅以双浓度（2倍）的生长因子。
- 每三天重复一次，改变培养基（其中一半），代之以新的B27培养基，辅以双浓度（2倍）的生长因子。
- 在不需要改变培养媒介的日子里，将生长因子添加到最终浓度的 1 倍。
- 确保神经球在 D8-D10 周围形成。
- 在 D10 中，更换完整的培养介质以清除所有碎屑。
- 在离心管中分别收集每一井的中层和神经球。
- 在室温下孵育10分钟。这个过程允许神经球通过重力沉淀。
- 去除上一升，在1 mL的新鲜B27介质中去除，并辅以生长因子。
- 将神经球放回同一超低附着板中，在37°C、5%CO2下孵育。
- 从 D10 到 D15，继续改变一半的介质并增加增长因子。
7. 神经球的通过
- 在主要培养的D15，使用1mL移液器将神经球收集到离心管中。切开移液器尖端以增加开口的大小，以避免对神经球的损伤。
- 在室温下孵育10分钟。神经球由重力沉淀。
- 取出介质，每管添加1 mL的细胞分离介质。
- 在37°C下孵育管子7分钟。
- 用 1 mL 尖端上下移液，以拆除神经球。
- 每管用3 mL的B27介质稀释细胞分离介质。
- 在 200 x g 下将电池悬浮液离心 5 分钟。
- 丢弃上一提液，用新鲜的B27培养基补充生长因子，重新暂停每个细胞颗粒。
- 在4mL的介质中重新发送VZ衍生细胞，在2mL的介质中重新暂停VZ衍生细胞。
- 通过将初级培养中使用的孔数（VZ 和 DG 分别用于 4 和 2 孔）增加一倍，在新的超低附着板中培养细胞（通道 1）。
- 每三天更换一半的介质，每日增加生长因子。
- 在第 1 通道中 10 天后 （D10），在下一通道中更改为粘附条件。
8. 附时条件下的通道
- 在执行通道 2 之前，准备涂有聚 L-奥尼辛和层氨基的涂层板。
- 在24孔板中，每孔加入500μL的1x聚L-奥尼辛（20μg/mL）。在37°C孵育过夜。
- 拆下聚-L-苯乙烯，用1x PBS（500μL/well）洗涤4x。
- 每井加入200μL（最小体积覆盖单个井表面）1x层明（5μg/mL），在培养细胞前在37°C下孵育2-3小时。
- 用带切头的 1 mL 移液器将神经球收集到离心管中。
- 在室温下孵育10分钟，通过重力沉淀神经球。
- 丢弃上一级，在没有生长因子的情况下，在新鲜的B27介质中重新暂停神经球。
- 从涂层板中吸出层压，并使用带切头的 1 mL 移液器将神经球沉积到井中。
注：防止涂层孔在去除层压和电镀神经球之间干燥。 - 将区域性分为两个条件：
- 保持差异化神经球6天（D6）。每三天更换一次介质，每日增加生长因子。
- 观察神经球衍生细胞的分化12天（D12）。每三天更换一次，没有生长因子。
注：在D6的末尾，对于未分化的或D12的分化条件，这些细胞可用于常规的免疫组织化学、细胞分选分析、5-Ethynyl-2'-脱氧核糖核酸（EdU）染色、RNA提取等。
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Representative Results
神经球是由从雌雄成年草原卷的VZ和DG分离出的神经干细胞形成的。开始培养后大约8-10天，细胞应该已经形成神经球。请注意，该板可能包含主培养物中的碎屑（图 3A）。然而，在第1段，培养者应该只包括神经球（图3B）。
与雌性VZ和雌性VZ相比，从女性VZ获得的神经球数量更高（图4A）。这些数据表明，获得的神经球的数量取决于增殖区和卷性。一旦神经球出现（D8-D10），它们被维持了7天的培养，在此期间，它们的生长受到监测。在D8、D11和D14上测量了神经球的直径（表1和图4B）。神经球的大小（直径）根据两个神经元区域的男性和女性卷的培养天逐渐增加。与来自两个神经源区域女性大脑的神经球相比，来自男性大脑的神经球更小（图4B）。
在浮动条件下进行15天的初级培养后，神经球在相同条件下在第1条中扩大。在随后的第 2 段中，细胞在粘合剂培养中生长，尽管它们能够自第 1 段以来粘附。在第六天（D6），在存在生长因子（未分化的情况，图 5A）或直到第15天（D15）没有生长因子（分化条件， 图5B） 存在时，粘附神经球的特征。
在D6的未分化条件下，神经球衍生细胞表示巢（神经祖细胞的标记）（图6）。此外，有可能识别双皮质蛋白（DCX）阳性细胞（迁移细胞）和增殖标记Ki67，这表明存在神经元前体或不成熟的神经元。然而，Ki67与DCX缺乏结肠化表明存在后位神经细胞（图7）。最后，在D15的分化条件下，发现了成熟的神经元（MAP2阳性细胞），以及具有胶质表型（GFAP阳性细胞）的细胞，这显示了分离细胞的分化潜力（图8）。
图1：成人血管脑及其神经生成区域的对病视图。（A） 布雷格玛水平的实线是解剖参考，将大脑分成两个块，左体和胸孔。虚线是除以 caudal 块以获取包含 DG 的两个切片的参考。（B） VZ位于第一个切口暴露的神经元区域的冠状视图。（C） DG位于第二个切口暴露的解剖区域的冠状视图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：神经原区解剖的解剖参考。（A） 从太阳区块显示VZ位置（虚线）的日冕部分的方案和照片。（B） 显示DG解剖的冠状部分的方案和照片。CPu， 考达特 · 普塔门;五、心室;VZ，心室区，DG，凹陷陀螺;CA1 和 CA3，海马区区域。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：神经球培养的代表性显微图，来自成年草原卷的神经原位。（A） 与D10雌性卷VZ分离的神经球的初级培养。（B） 从D10雌性卷的VZ派生的神经球的通道1。缩放杆 = 200 μm. n= 3 每个神经原生区域和卷的性别。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：神经球的数量和大小取决于性别和神经源。（A） D10雌雄卷中从VZ和DG获得的原培养中神经球的数量。数据分析了一个双向的 ANOVA，然后进行了图基的后期测试。女性 VZ 和其他组（***p<0.001）之间存在显著差异。（B） 在主要培养的 D8-D14 中，整个神经球的直径取决于卷性。数据分析了双向的 ANOVA，然后是 Tukey 的后期测试。组内比较（同一组内的差异）显示D8与D11和D14之间的神经球大小增加（*p<0.05，***p<0.001，***p<0.0001）;和 D11 vs. D14 （+ p<0.001） 在 VZ 和 DG 的母卷和男性卷。组间比较（同一区域各组之间的差异）显示，在D11和D14中，雌性VZ和DG神经球比男性神经球大。##p<0.0001。VZ是从男性和女性卷（n=3，每组）中获得的。分析了15个雌性神经球和10个男性神经球。DG 是从男性和女性卷（n=3，每组）中获得的。处理了8个女性神经球和5个男性神经球。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：从在第2段的粘附条件下培养的雌性VZ产生的神经球的代表性图像。（A） 神经球附在第2段与D2的生长因子。（B） 神经球衍生细胞附在D10没有生长因子的通道2中。比例线 = 200 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：神经球中巢的表达。代表性，在未分化阶段从女性和男性成年大脑的VZ中提取的巢状阳性细胞的荧光显微镜图像。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：DCX和Ki67在神经球中的表达。DCX-、Ki67阳性细胞的代表性荧光显微镜图像，以及从未分化阶段的成年女性和男性大脑的VZ派生的合并。比例线 = 25 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：MAP2和GGFAP在神经球中的表达。MAP2（成熟神经元）和GFAP（胶质细胞）阳性细胞的代表性，在分化阶段从成年女性和男性大脑的VZ中提取。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
| 神经球的大小 （μm） | |||||
| Vz | Dg | ||||
| 文化日 | 性 | 平均± SD | 文化日 | 性 | 平均± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5±15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 | F | 217.3±35.7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158.9±47.2 | M | 71.8±14.4 | ||
| D14 | F | 306.6±44.4 | D14 | F | 243.8±37.4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
表1：从原生培养培养中分离出的神经基因利基的神经球的平均大小（直径）的定量。 图 4 显示了显著差异。VZ是从男性和女性卷（n=3，每组）中获得的。分析了来自女性的15个神经球和10个来自男性的神经球。DG 是从男性和女性卷（n=3，每组）中获得的。处理了8个女性神经球和5个男性神经球。
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Discussion
获得神经干细胞培养的阶段是酶溶液的消化期，不应超过30分钟，因为它可能会降低细胞的生存能力。神经球应在初始培养后8-10天出现;如果第12天没有出现，就放弃培养，重复实验，缩短消化期。另一个问题就是覆盖脑组织的血管。在解剖过程中，它们应该被完全去除，因为红细胞的过量会干扰神经球的形成。
该协议允许扩展浮动神经球，直到通过2和改变粘附条件，以评估神经球衍生细胞。然而，它有一些限制，如神经原能降低，在连续的段落中切换到胶质分化，作为对体外条件的适应反应12。因此，我们建议在原培养和通道1中描述神经球，并且只有在需要扩展细胞以进行不涉及解释起源差异的实验时，才能继续下一段。
有趣的是，由于神经解剖学（VZ或DG）或性别依赖性（女性或男性）来源，神经球的初级培养中可以发现内在差异。因此，与男性相比，来自女性两个神经原产区的神经球的数量和直径更高。这可能是女性大脑与男性相比的功能差异，这种机制可以通过这种测定在体外研究。
从成人脑细胞中提取的神经球细胞培养是一个有价值的工具，可以帮助解决体内研究的差异。例如，Fowler 和同事报告说，48 小时的社会隔离会导致 VZ 中 5-Bromo-2'-2'-2'-脱氧核酸（BrdU）阳性细胞的增加，而不影响 DG6。相比之下，利伯沃斯等人;表明DG13中的细胞增殖减少。此外，体外培养可以作为评估神经原产区分子机制的模型，这些机制可能与诸如草原卷等社会模型中的行为变化有关。例如，有人建议，接触新生儿诱导，在非父母和父母卷，增加BrdU阳性细胞在DG14。本研究的结果可以使用我们的细胞培养协议与BrdU标签进行确认。然而，尽管大多数关于卷和其他哺乳动物的研究都使用BrdU标签来识别新细胞，但缺点是，实验室的标记可能会根据注射剂量15而改变。EdU， 另一个胸腺素模拟， 是识别细胞周期阶段下细胞在体外培养中的理想替代品.在同一实验中，EdU 的合并可能有几个周期，与 BrdU 不同，DNA 变性或与抗体的孵育是检测所必需的。此外，EdU阳性细胞可以评估与标记物的共同定位，以确定细胞分裂周期（Ki67），并使用神经干细胞或祖细胞（内辛、Sox2和Pax6）的标记确定其表型。
神经球培养可以建立作为一个模型，研究激素，小分子或药物对神经干细胞和草原卷的祖细胞的增殖率、神经发生和表观遗传修饰的影响。例如，先前的研究表明应激激素（如皮质酮）和雌激素在草原卷中成人神经发生调节中的作用，但潜在的调控机制是未知的6。
最后，自闭症谱系障碍（ASD）和精神分裂症（SZ）与社会认知障碍16、17有关。有趣的是，催产素和精氨酸-血管压素在社会和情感行为中具有根本作用，其受体的基因表达变异（OXTR和血管压素1a（V1AR）分别与ASD和SZ18、19、20、21相关。此外，神经发育过程中神经发生和神经迁移的改变与这些行为障碍22、23、24的生理学有关。因此，我们建议分析这些激素在神经发生、神经迁移和其他细胞事件上所培养的分子机制，这些细胞事件的改变与神经紊乱有关，这些细胞在体外模型中使用草原卷细胞培养，因为OXTR和V1AR受体在草原卷海马25、26中发现的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家委员会252756和253631赠款的支持;联南特派团-DGAPA-PAPIIT IN202818和203518;INPER 2018-1-163，NIH P51OD11132。我们感谢迪西·加斯卡、卡洛斯·洛扎诺、马丁·加西亚、亚历杭德拉·卡斯蒂利亚、尼迪亚·埃尔南德斯、杰西卡·诺里斯和苏珊娜·卡斯特罗的出色技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
