Summary
Современные методы загрузки 96-х пластин для извлечения ДНК могут быть подвержены загрязнению. Мы подробно описали новый метод погрузки пластин 96 скважин, который снижает риск перекрестного загрязнения скважин. Наш метод поможет другим исследователям извлечь выгоду из эффективности высокой пропускной способности методов извлечения ДНК и свести к минимуму риск заражения.
Abstract
Методы секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью в значительной степени способствовали прогрессу в нашем понимании взаимосвязей между микробными сообществами, характеристиками хозяина и более широкими функциями экосистем. При этом быстрое увеличение широты и глубины возможностей секвенирования пришли методы для извлечения, усиления, анализа и интерпретации ДНК окружающей среды успешно с максимальной эффективностью. К сожалению, быстрое выполнение извлечения ДНК может произойти за счет увеличения риска заражения образцов. В частности, экстракции с высокой пропускной способностью, основанные на образцах, содержащихся в пластине 96-й пластины, предлагают относительно быстрый метод, по сравнению с однотрубными извлечениями, но также увеличивают возможности для хорошого перекрестного загрязнения. Чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения образцов, сохраняя при этом преимущества высокой пропускной способности методов экстракции, мы разработали новый метод загрузки образцов окружающей среды в 96-колодец пластин. Мы использовали проколочные пленки уплотнения ПЦР для покрытия каждой пластины при загрузке образцов и добавили образцы сначала в ПЦР трубки перед перемещением их в скважины; в совокупности такая практика снижает риск дрейфа проб и непреднамеренной двойной загрузки скважин. Метод, изложенный в настоящем документе, предоставляет исследователям подход к максимальному использованию доступных методов экстракции с высокой пропускной способностью при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения, присущего пластинам 96-й пластины. Мы предоставляем подробный шаг за шагом наброски того, как перейти от сбора образцов к извлечению ДНК при минимизации риска нежелательного перекрестного загрязнения.
Introduction
Недавние достижения в области секвенирования микробных сообществ с высокой пропускной способностью обеспечивают беспрецедентную глубину секвенирования и, следовательно, беспрецедентный взгляд на функционирование и разнообразие микробиомаЗемли 1. По мере увеличения способности мультиплекса все больше и больше образцов на одну полосу секвенирования, извлечение ДНК одной трубки может стать ограничивающим скорость шагом в генерации экологических данных. Тем не менее, новые методы в высокой пропускной способности ДНК извлечения обещают для обработки больших количеств образцов окружающей среды с большей эффективностью, чем это былоранее возможно 2. Эти методы часто включают в себя использование 96-хорошо пластин вместо однотрубных труб, тем самым увеличивая возможное количество извлечений, которые могут произойти одновременно. Таким образом, практичность и эффективность высокой пропускной способности методов экстракции очевидны и были реализованы для обработки экологическихобразцов,начинаяот почвы 3,4 ирастительных тканей 3,,5 до фекального веществачеловека 2.
Хотя эти методы могут резко ускорить обработку образцов и извлечение ДНК, начальный этап загрузки почвы и других экологических образцов в 96-хорошо пластин подвержены перекрестному загрязнению. Этот тип хорошо загрязнения может произойти во время извлеченияДНК 6,,7,,8 ,и скважиныособенно уязвимы на этом первом этапе, прежде чем образцы приостановлены в буферный раствор. McPherson et al.9 демонстрируют метод загрузки корневища почв в 96-колодец пластин с использованием воронок и 8-хорошо ПЦР полосы охватывает, но в то время как их метод является более контролируемым подходом к погрузке пластин, он по-прежнему предоставляет широкие возможности для загрязнения соседних скважин при загрузке каждого образца. Кроме того, открытые скважины позволяют отвлеченного исследователя поместить образец в неправильную скважину или добавить образец в колодец, который уже был загружен. Кроме того, различные типы образцов оказались неподходят для загрузки с помощью этого метода; влажные образцы часто прилипают к воронки и сухие образцы "прыгать" между скважинами из-за статического электричества.
Чтобы уменьшить возможности загрязнения скважин на первом этапе экстракции ДНК с высокой пропускной способностью, мы разработали новый подход к загрузке образцов почвы в пластины 96 скважин. Наши методы защищают скважины от воздействия окружающей среды и не позволяют нам случайно загрузить несколько образцов в одну скважину (двойная загрузка). Мы считаем, что метод, о которого сообщается ниже, обещает уменьшить потенциал загрязнения и как таковой обеспечивает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин для последующей экстракции ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лабораторная скамейка и подготовка инструмента для загрузки пластины из 96 колодец
- Очистить верхнюю скамейку, затуманив 70% этанола. Протрите и дайте воздуху высохнуть перед распылением скамейке сверху с 10% отбеливателя. Протрите скамейку сверху сухой.
- Стерилизовать микро-scoopula, шпатель, и хирургические ножницы (изогнутые) путем погружения в 95% этанола, а затем подвергать пламя. Опустите каждый в 10% отбеливатель и дайте высохнуть перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты должны быть стерилизованы между каждым образцом.
2. Подоборка и подготовка выборки
- Стерилизовать перчатки с использованием этанола до подоборки.
- Гомогенизировать образцы почвы тщательно до подсвеборки.
- Используя стерилизованные инструменты, загрузите помеченную 2 мл центрифуги трубку с образцом примерно до половины полной.
- Повторите шаг 2.2 до тех пор, пока все 95 образцов не будут отобраны в помеченные 2 мл центрифугных труб. 96-яколодец должна использоваться в качестве добывающей пустоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.3 и 2.4 сделаны для того чтобы свести к минимуму требуемое пространство хранения и предотвратить сверх или двойной выборки. - Храните 2 мл под образец труб на льду до загрузки пластины.
- Этикетка 96 стерильных 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки A1'u2012A12, B1'u2012B12, .... H1-u2012H12. Поместите эти трубки для того, чтобы в 96-хорошо стойку.
- Назначьте идентификатор образца с расположением хорошо (A1-u2012H12) и завечьте его.
3. Подготовка плиты
- Снимите резиновую крышку с пластины 96-колодец(рисунок 1А-1С)и поместите ее в стерильный полиэтиленовый пакет (см. таблицу материалов). Печать полиэтиленовый пакет для предотвращения загрязнения.
- Обложка 96-хорошо пластины с уплотнительной пленкой(рисунок 1D-1E); например, используйте заранее проколотую герметиза (см. таблицу материалов). Обеспечь уплотнение путем свертывать с резиновым роликом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пирсируемые силиконовые коврики потенциально могут предложить многоразовый вариант, при условии соответствующей очистки между использованиями, но силиконовые коврики, которые мы тестировали легко разделить вдоль проколов и не будет предлагать равную защиту для любых следующих пластин. - Поместите тарелку в холодильник (4 кк), чтобы сохранить прохладу.
4. Передача подпровеев
ПРИМЕЧАНИЕ: См. шаг 4.13 для модификаций, когда образец почвы очень мал.
- Поместите 24 из 2 mL подпроецов в ледяную глыму для холодного хранения.
- Используя имя образца и лист расположения хорошо выбрать правильный 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки.
- Возьмите 2 мл под образец трубки и вихря для 5 с, чтобы обеспечить гомогенизацию.
- Использование пламени и отбеливателя стерилизованных инструментов нагрузки 200 йл первого образца в правильной плоской крышкой ПЦР трубки(рисунок 1F).
- Повторите шаги 4.2'u20124.4 до тех пор, пока не будут загружены все 24 образца. Затем перейти к шагу 4.6.
- Используя отбеливание окунутой бумаги протрите, очистите снаружи 200 йл плоской трубки ПЦР.
- Переверните трубку и нажмите на скамейку, чтобы переместить образец к верхней части трубки. С обесцвеченными и стерилизованными пламенем ножницами, зажимайте дно трубки ПЦР, чтобы создать отверстие для образца, чтобы попасть в пластину 96-хорошо(рисунок 1G).
- Найти правильный хорошо на 96-хорошо пластины и пройти трубку через пластину с разрезом в конечном итоге лицом до достижения, что хорошо. Наклоните пластину немного, чтобы облегчить прокол предварительно прокалывания прокалывания пленки, и только тогда, когда трубка находится непосредственно над правильным хорошо инвертировать его так, что сократить кончик вписывается в колодец. Используя стерилизованные инструменты, нажмите верхнюю часть трубки ПЦР, пока вся почва не упала из трубки в колодец. Оставьте трубку в колодец с закрытой крышкой(рисунок 1H-1J).
- Удалите одну плоскоокупную трубку ПЦР на 200 йл за один раз и добавьте к этому хорошо 750 МКЛ шариковогораствора (рисунок 1K). Нажмите 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки вплоть до хорошо и пометить сверху с sharpie, чтобы указать, что эта хорошо была загружена. Повторите это для каждого образца.
- После того, как все 24 образца были загружены и бисером решение добавил, удалить 2 мл подпробных труб и заменить 24 неамперных труб.
- Повторите шаги 4.1'u20124.10 до тех пор, пока все 95 скважин не будут загружены образцом или раствором из чистого и бисера. Удалите трубки, не проходя их по открытым скважинам(рисунок 1L).
- Аккуратно снимите проколотую пленку и замените резиновую крышку, чтобы защитить пластину до началаизвлечения (рисунок 1М-1О).
- Для очень небольших количеств почвы, которые также мелкозернистые, добавить 750 йл шарикового раствора в образец трубки и использовать широкое отверстие пипетки отзыв для передачи всего содержимого в соответствующий колодец. Поместите трубку ПЦР в отверстие, чтобы предотвратить двойную загрузку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при реализации этой модификации, как твердые частицы органического вещества или мелкие фрагменты породы больше, чем отверстие кончика пипетки может засорить пипетку и сделать передачу образца суспензии трудно. - По мере необходимости замораживать при -20 градусов по Цельсию и хранить пластины загружены с образцом и шариком решение до запланированной добычи.
5. Сравнение методов погрузки пластин
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы проверить наш новый метод для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК, мы разделили одну пластину 96-колодец на три секции. Мы использовали три различных метода погрузки пластин для сравнения потенциала непреднамеренной загрузки почвы и перекрестного загрязнения. Три метода, которые мы использовали были методы, изложенные в McPherson et al.9, протокол загрузки по умолчаниюЗиагена 10, и протокол, который мы излагаем в этой публикации.
- Загрузка почвы в тарелку
- Раздел 96-хорошо пластины на три четыре колонки блоков. Загрузите каждый блок с помощью одного из трех методов, упомянутых выше.
- Загрузите почву во все остальные скважины, чтобы образцы и пустые колодцы были поражены. Такая схема позволяет получить максимальную возможность для непреднамеренной загрузки образцов и перекрестного загрязнения.
- Заморозить 96-хорошо пластины при -20 градусов по Цельсию до извлечения ДНК.
- Извлечение ДНК
- Извлекайте ДНК в соответствии с протоколом извлечения пластины 96-йпластины производителя 10.
- Храните экстракты ДНК при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
- Количественная оценка ДНК в пустых скважинах
- Оттепель ДНК экстракты при комнатной температуре, вихрь и спина вниз с помощью пластины счетчика.
- Измерьте и замитьте концентрацию ДНК пустых скважин с помощью спектрофотометра.
- Используйте ANVOA и пост-специальный тест Tukey для анализа различий в среднем концентрации ДНК в пустых скважинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значительные различия были зарегистрированы в No 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот новый метод был успешно использован для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК. Сравнение методов загрузки пластин показало, что наш метод имеет самую низкую концентрацию ДНК в пустых скважинах. Концентрация ДНК в пустых скважинах была значительно ниже, чем метод предложил мой McPherson et al.9 (p lt; 0.05), хотя концентрации ДНК в нашем методе статистически не отличались от метода по умолчанию Зиагена(рисунок 2). Все три метода производили средние концентрации ДНК при 2 нг/мл, хотя только наш новый метод производил скважины без измеримой концентрации ДНК.
Рисунок 1: Шаг за шагом методы для загрузки образцов в 96-хорошо пластин для извлечения ДНК при минимизации потенциала для перекрестного загрязнения среди скважин. Темно-серые крышки (присутствующие в шагах A, B, N и O) представляют собой кремниевую крышку, которая поставляется с набором экстракции. Светло-серая крышка (применяется в шаге D, удаляется после шага L) представляет собой прокалываемую ленту ПЦР, используемую для покрытия пластины во время загрузки. Хотя это и не на фото, инструменты должны быть стерилизованы до загрузки каждого образца, и ПЦР трубки должны быть уничтожены с отбеливателем до пирсинга ПЦР ленты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Концентрация ДНК пустых скважин. Концентрация ДНК представлена в ng/L. Буквы указывают на значительные парные различия в концентрациях ДНК на уровне 0,05 евро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод уменьшает возможности для хорошо колодец перекрестного загрязнения при загрузке высокой пропускной способности образца извлечения пластин и предлагает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин за пределами существующих стратегийзагрузки пластин 9,10. Загрязнение среди скважин может быть более распространенным в 96-ну пластины извлечения, чем в однотрубных извлечений, особеннопри автоматизированной 6,7, и, хотя и не специально протестированы в любой методологии, риск перекрестного загрязнения можно предположить, высокий, когда скважины добычи пластин остаются открытыми в течение всего срока загрузки пластины. Учитывая расширение возможностей для перекрестного загрязнения в добыче на основе пластин по сравнению с однотрубными извлечениями, защита скважин со стерильным покрытием следует рассматривать как ключевой первый шаг в загрузке образцов в пластину из 96 скважин. Несмотря на эту необходимость, инструкции, представленные в комплектах с высокой пропускной способностью извлечения просто сказать, чтобы загрузить пластину и "избежать перекрестного загрязнения между образцами скважин", но не предоставляют никакой дополнительной информации о том,как это сделать 10. Чтобы уменьшить загрязнение при добавлении образцов в 96-колодец извлечения пластины, McPherson и др.9 предложить покрытие пластины с разрезом полосы ПЦР герметизации ленты, пилинг их обратно, чтобы получить доступ к каждой хорошо. Этот метод сокращает общее время открытия всех скважин, но скважины открыты в течение неравного периода времени, а некоторые скважины, наиболее подверженные загрязнению – ближайшие к загруженной выборке – подвергаются воздействию во время события погрузки. Кроме того, пилинг ПЦР уплотнения ленты имеет потенциал для создания статического электричества, которые приводят к почве передается из скважины в хорошо и может быть ответственным за более высокие концентрации ДНК в пустых скважин наблюдается в нашей добыче. Кроме того, эта методология требует, чтобы образцы передавались по нескромным скважинам перед тем, как они были помещены в колодец, и ничто не мешает исследователю случайно загрузить два образца в одну скважину (двойная загрузка) или смешать местоположение двух или более образцов. Если поймали, двойная загрузка представляет собой не более чем пустая трата ресурсов. Однако, если двойная загрузка или смешивание мест выборки остается незамеченным, экспериментальные результаты могут быть искажены7.
Метод, о котором мы говорили выше, обеспечивает контролируемое средство для загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК. В частности, наш метод снижает риск перекрестного загрязнения, сохраняя скважины покрыты во все времена. Скважины сначала покрываются уплотнительной лентой, а затем покрываются ПЦР-трубкой, используемой для загрузки образцов. Этот метод не только снижает риск перекрестного загрязнения, но и полностью предотвращает риск загрузки двух образцов в одну колодец. Как только мы загружаем образец в колодец, трубка ПЦР служит блоком, предотвращая добавление другого образца. По маркировке всех трубок с расположением пластины (например, A1, A2... H11, H12) до загрузки образцов, этот метод также обеспечивает окончательную проверку, чтобы убедиться, что все образцы были загружены и не скважины были пропущены. Хотя этот метод обеспечивает более контролируемые средства для загрузки скважин, любой загрузки пластины должны принимать дополнительную осторожность при прохождении сократить ПЦР трубки над пластиной. Несмотря на то, что скважины опечатаны, любые частицы образца, которые падают на поверхность герметичной пластины, могут попасть в непреднамеренные скважины, когда техник пронзил пленку, чтобы загрузить правильные образцы в эти скважины. Чтобы избежать этой проблемы, мы наклоняем пластину 96-колодец до 40 евро, прежде чем проколоть уплотнительную ленту трубкой ПЦР. Такой подход помогает держать открытый конец трубки в вертикальном положении и вдали от неправильных скважин.
Когда образцы почвы имеют очень небольшие количества и/или чрезвычайно мелкозернистые, использование широкой наконечника пипетки вместо загрузки образцов почвы в ПЦР-трубки может быть более эффективным при передаче каждого образца. Для этой модификации, первый буфер решение должно быть добавлено в образец трубки, а затем как образец и раствор pipetted в 96-хорошо пластины. Добавление ПЦР трубки к каждому хорошо после этого шага предотвратит двойную загрузку. Как уже упоминалось в разделе протокола, при использовании этой модификации, исследователь или техник должен быть очень осведомлен о твердых частиц органических веществ или мелких фрагментов породы, поскольку они имеют потенциал, чтобы засорить отверстие пипетки.
Хотя ни один метод загрузки образцов не может полностью исключить риск загрязнения образца, метод, очертив выше, предоставляет средства для существенного снижения этих рисков и полностью устраняет риск двойной загрузки и смешивания мест выборки. В целом, мы считаем, что этот метод будет большим улучшением существующих методов для загрузки высокой пропускной способности пластины извлечения ДНК и предположить, что все микробиологи, использующие высокой пропускной способности экстракционных пластин перейти к использованию метода, такого как один из них изложены выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о конфликте интересов и не имеют ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано микробной экологии Сотрудничество с финансированием от NSF награду #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
