Summary
このプロトコルは、in vitro転写を用いて様々な牛脳解剖学的構造内の狂犬病ウイルスヌクレオプロテイン(N)遺伝子コピー数を決定するためのqRT-PCRベースのアプローチを提示する。
Abstract
牛麻痺狂犬病(BPR)は、大きな人獣共通感染症をもたらすラテンアメリカ全体で経済的に重要なウイルス性脳炎の一種です。ここで我々の目的は、実験プロトコルを用いて、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、異なる牛脳解剖学的構造における狂犬病ウイルス(RABV)ゲノムの相対的なコピー数を決定することであった。qRT-PCR は、サンプル中に存在する標的核酸の量に直接比例する増幅後に放出される蛍光に基づいてサンプルに存在する特定の数の遺伝子コピーを定量化します。この方法は、その短い期間、汚染のリスクの低減、および他の技術と比較してより容易に異なるサンプル内のウイルス核酸を検出する可能性のために有利である。狂犬病の6匹の動物の脳は、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床の6つの解剖学的構造に分けられた。すべての脳は、直接免疫蛍光試験に基づいてRABV抗原に陽性であると同定された。4つのRABV陰性ウシの脳から同じ解剖学的構造も評価された。RNAを各構造から抽出し、qRT-PCRに使用した。インビトロ転写されたヌクレオタンパク質遺伝子を用いてRABV遺伝子のコピー数を決定するためにアッセイを行った。ウイルスRNAを定量化するために使用される標準曲線は、100%の効率と0.99の直線性を示した。分析の結果、これらの構造がRABVの最高レベルを有するという観察に基づいて、皮質、髄質、視床がRABV検出に使用する理想的なCNS部分であることがわかりました。試験特異性は100%であった。すべてのサンプルは陽性であり、偽陽性は検出されなかった。BPRの診断中に、低レベルのRABVを含むサンプルでRABVを検出するために使用できます。
Introduction
狂犬病は、脳、皮膚、尿、または唾液中のウイルス核酸の検出を可能にする様々な技術によって、前死性および事後分析を確認することができる1。狂犬病ウイルスの核タンパク質(N)遺伝子の検出は、主に分子検査による狂犬病診断に用いられる。この遺伝子は、ウイルスのジェノタイピングにも使用されます。狂犬病は、影響を受けた脳の任意の部分を使用して動物で診断することができます。しかし、狂犬病の可能性を排除するために、脳内の少なくとも2つの領域からの組織を2をテストする必要があります。動物の狂犬病検出にはいくつかの診断方法が存在する。しかし、直接免疫蛍光試験は標準基準技術3のままである。その他の試験には、マウスの接種、組織培養における感染、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)4を組み込んだ生物学的試験が含まれる。これらの技術はすべて、世界保健機関(WHO)と世界動物衛生機構(OIE)が、人間と動物の狂犬病の診断に推奨しています。
核酸検出および増幅技術は、近年6年に狂犬病の診断に革命をもたらし、これらの技術はヒト狂犬病のアンティ・モーテム診断において重要な役割を果たしている。いくつかのPCRベースのテストは、アンティモテと死後の狂犬病の診断7、8、9、10のための従来のテストを補完するために評価されています。ほとんどのアッセイは、ウイルスゲノム1,11において最も保存性の高い領域である増幅のための狂犬病ウイルス核タンパク質遺伝子を標的とする。この20年の間にRABVを診断するために様々な分子アッセイが開発され、これらのアッセイの一部がウイルス特性評価に用いられてきた。ほとんどの試験は、ウイルスゲノム内の保存された遺伝子を検出することを目的としており、最も一般的には従来のまたは定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)アッセイ12,13を用いて行う。
PCRは、これらの組織が分解されても、組織内の特定の病原体のゲノムを検出することができる高感度診断技術です。PCRベースのアプローチを用いて、DNAヌクレオチド配列14の選択的かつ反復的な増幅を通して臨床サンプルで感染因子の最小量を検出することができる。蛍光プローブ(例えば、TaqMan)またはDNA結合色素(例えば、SYBRグリーン)を組み込んだqRT-PCRは、RABVを高感度で アンティと ポストの両方 の分析 の診断に試験で使用されています。ただし、このようなアプローチには特殊な機器が必要です。この制限を克服するために、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)は、その低コスト、シンプルさ、およびRABVの検出に望ましい特性に基づいて示唆されている。このアッセイは、発展途上国15で使用することができるので特に重要である。
qRT-PCR は分子の検出と定量に基づいており、蛍光シグナルの増加は、単一の反応で PCR 産物の量に直接比例します。核酸標的のコピー数が増加するにつれて、蛍光も増加する。蛍光色素およびクエンチャーを運ぶSYBRグリーンDNA結合色素や配列特異的オリゴヌクレオチドプローブなどの非特異的なインターカレート色素は、一般的にqRT-PCRで蛍光読み出しを提供するために使用されます。このアッセイは、試験時間の短縮(2~4時間)、閉管システムによる汚染リスクの低減(増幅産物のPCR後の操作の欠如)、および異なるターゲットを同時に検出する機能を含む従来のRT-PCRよりも利点を提供します。qRT-PCRは唾液および他のサンプルからの狂犬病の前検を診断するために使用することができる。このアッセイはまた、RABV15の異なるリッサウイルス種または系統の検出のための普遍的なリアルタイムテストとして使用することができる。このコンボRT-PCRアプローチでは、2つの反応が使用されます。最初はRABVの異なる遺伝的なリナジを検出し、第二はリサウイルス種を検出する。どちらのステップもqRT-PCRアッセイを含み、最初はハイブリダイゼーションプローブを使用し、2番目は染料15を使用します。この技術を用いてRABVの分子検出に成功した多数の試験のために、現在のOIE地球マニュアル(2018)は、RABV17の分子検出のためのPCRの使用を推奨しています。
メキシコは家畜の可能性が高い国です。家畜生産量が最も高い州には、狂犬病の主な送信機である吸血鬼コウモリ デスモドゥス・ロタンドゥス の存在により狂犬病の流行の危険にさらされている湿気の多い熱帯地域と乾燥した地域の両方が含まれています。そのため、メキシコの牛麻痺性狂犬病(BPR)の予防と制御のためのより多くのツールを開発することが不可欠です。これに基づいて、本研究の目的は、狂犬病感染による死亡後の牛脳の異なる解剖学的構造におけるウイルス粒子の数を決定するために定量的なqRT-PCRを使用することであった。
RABV陽性ウシから得られた6つの脳を、以下に記載するqRT-PCRプロトコルの開発に使用するために外部の実験室から寄贈された。ウシの脳構造サンプルを、INIFAP CENID-MAラボBSL-2施設に冷鎖輸送し、使用するまで-80°Cで保存した。脳はカンペチェ、ユカタン、ケレタロの州から動物から得られた。領収書の前に、様々な構造が脳から解剖されました。これらの構造には、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床18、19が含まれていました。遺伝物質は以下に記載されるように抽出した。RABV診断は、直接蛍光抗体(DFA)20を用いて確認した。陽性対照として、RABV21を接種したマウス脳が用いられた。さらに、4つのRABV陰性牛の脳(DFAによって決定される)を陰性対照として使用した。
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Protocol
この研究は、中央ナシオナル・デ・インベスティガシオン・ディシプリカルティフィケーション・エン・微生物学動物(CENID-MA)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供する動物の使用に関する勧告に従って承認され、厳格に実施されました。
1. サンプル
- RT-PCR分析のために6つの異なる狂犬病陽性ウシ脳から解剖された脳の異なる領域を使用してください。
2. 狂犬病を確認するための直接蛍光抗体(DFA)
注:DFAによる狂犬病抗原の検出は、フルオレセイン標識抗体を用いて狂犬病核タンパク質の存在を判定する定性的方法である。試験は、以下に説明するようにDeanら(1966)20によって提供されるプロトコルを用いて行った。
- 直径約15mmの無菌スライド上で、異なる脳構造から解剖された各組織から2つの印象を与えます。木製アプリケーターを使用して、組織の約3mm 3 部分を滅菌スライドに塗りつぶします。塗りつぶしを作成するには、手動で木製のアプリケーターをスライドに押し付けます。
- サンプルスミアスライドを-20°Cで1時間100%アセトンに沈め、スライドを固定します。 インキュベーション後、乾いた布でスライドを21°Cで30分間乾燥させます。
- フルオレセイン標識抗核タンパク質抗体の50 μLを、注射器を通して分配して1:10希釈時に各脳スミアに加えます。
- 37°Cの湿気の多いチャンバーにコンジュゲートでスライドを1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、スライドを水で2回洗浄し、PBSで余分なコンジュゲートを除去します。スライドを21°Cで乾燥させます。 慎重に余分な液体を除去し、取り付ける前に一時的に空気乾燥を除去するためにブロット。
- セクションの表面を覆うために50%リン酸グリセリンの滴を加え、カバースリップで覆います。40倍の拡大で、蛍光顕微鏡下で切片を観察します。
- 正および否定的なコントロール(陽性対照:RABVを接種したマウス脳;陰性対照:RABV陰性牛脳)をサンプルと同じ方法で処理し、観察する。
3. RT-PCRのポジティブコントロールの生成
- 胚芽バンクからBHK-21細胞を得る。70番目 の通路までの細胞を使用して、通路2を使用してRABVエブリン・ロキトニッキ・アバルセス(ERA)株を複製します。
- CO2(5%)の存在下で37 °Cで10%の胎児子牛血清(FCS)を補充した最低必須培地(MEM)を含むボトル内のBHK-21 細胞を維持し、伝播する(5%)湿気の多い条件下で。彼らは80%合流に達するまで25cm2 培養フラスコで細胞を成長させ、その後、サブカルチャー。
- 培養液を細胞から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でボトルを洗浄する。RABV株ERAの105 TCID /mLで培養を接種する。CO2(5%)の存在下で37°Cで一定の揺れの下で2時間ウイルス接種をインキュベートする(5%)湿気の多い条件下で。
- 感染培地を除去し、5%(胎児ウシ)SFBを添加したMEMを加える。CO2(5%)の存在下で37°Cで72 時間インキュベート湿気の多い状態で。
- 細胞が細胞性効果を示すときに接種後3日後にRABVを収穫する。感染した細胞を凍結し、4°Cで解凍して細胞を融解します。ボトルから培地を回収し、遠心分離チューブに細胞を入れ、4°Cで10分間1,050 x g で遠心分離します。
- RABVの上清を-80°Cで保存し、-70°Cで保管するための作業アリコートを準備します。
- 前工程で得られたウイルスを21日目の雌CD1マウスに脳内接種する。1mLシリンジを使用して、106 MICLD 50(マウス感染性培養致死量50%) を含む溶液50μLを接種する。マウスへの用量22.
4. RNA抽出
注:総RNAは、次のプロトコルに従って有機抽出法を使用してウシの脳から直接抽出しました。
- 各解剖学的構造から100mgの脳組織を使用して、グアニジウム・イソチオシアネートを含む市販の試薬を使用して全RNAを抽出する。
- グアニジウム・イソチオシアネート試薬の1mLの各構造から、最大速度で15sの小さな害虫を持つDounceホモジナイザーを使用して渦を出して、各構造から合計100mgの組織を手動で均質化する。
- サンプルを氷上で5分間インキュベートし、200 μLのクロロホルムを加えます。サンプルを15sの間激しく混ぜ、氷の上で2〜3分間インキュベートし、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 水相をきれいなチューブに移し、500 μLのイソプロピルアルコールを加えます。サンプルを21°Cで15分間インキュベートします。
- サンプルを12,000 x g で4°Cで10分間遠心します。 水性上清をピペットで吸引する。単離されたRNAは、チューブ内にペレットとして存在する。
- 次に、75%エタノールの1 mLでRNAペレットをピペット処理し、遠心分離機を7500 x g で4°Cで5分間洗浄します。
- 上清をデカントし、室温(21°C)でRNAペレットを空気乾燥します。次に、ペレットをヌクレアーゼを含まない水50μLで希釈します。
- 分光光度計を用いて260nmでRNA濃度と品質を決定します。使用するまで-80°CでRNAを保存します。
- DNase I.で消化してRNAサンプルからDNAを除去し、前のステップで抽出したRNAの1μg当たりDNase Iの2 Uを加えます。次に、5 μLの10倍反応バッファーを加え、37°Cで30分間インキュベートします。混合物に1μLのEDTAを加え、続いて65°Cで10分間インキュベーションを行い、DNase Iを不活性化します。
5. cDNA合成およびPCR
- オリゴdTと逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成する。RNA 1 μg ごとに、オリゴ DT (500 μg/mL) を 1 μL、1μL の 10 mM dNTP ミックス、ヌクレアーゼフリー蒸留水を最終体積 12 μL に加えます。65°Cで5分間インキュベートします。
- 反応混合物を4°Cに冷やす。 1,050 x gで30sのチューブを遠心し、4 μLの反応バッファー、2 μL 0.1 M DTT、リボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)を1 μL加えます。
- 反応混合物を37°Cで2分間インキュベートし、1μLの逆転写酵素(200U)を加える。次に、反応混合物を37°Cで50分間インキュベートし、その後70°Cで反応を15分間不活性化した。
- cDNAは使用前に-20°Cに保存してください。
注:合成されたcDNAの品質を検証するために、インビトロの合成を行う前にRABV N遺伝子の761 bp断片の増幅を行う。Loza-Rubioら.11 で説明するプロトコルを使用して、後述するステップ5.5に記載されている。 - 以下の条件でTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRを行う。以下のように設定した反応を実行します: 20 mM MgCl 2、0.2 mM dNTPs を含む10x Taqバッファー、 1 U Taqポリメラーゼ、各プライマーの10 μM(SuEli+:5′cgtrgaycaatatgagtaca 3′とSuEli-:5′caggctcraacatttttattta'3'、2.5 μLのcDNA、および超純水を50μLの最終体積にする。
- サーモサイクラーで増幅を行い、以下のサイクリング条件を使用して、3分間95°C。30 sの95°C、30 sのための60°C、および1分のための72 °Cの35サイクル;72°Cの1サイクル7分間。
- 1%アガロースゲルを使用して761 bp PCR産物の存在を評価します。
6. インビトロ転写
注:インビトロ転写は、標的遺伝子のmRNAを生成する。完全なRABV N遺伝子を増幅するプライマーペアと、qRT-PCRアッセイの陽性対照として使用されるプライマーペアを使用してください。これらのプライマーは、完全なRABV N遺伝子を増幅し、T7ポリメラーゼを認識するプロモーターを添加するように設計されている(TAATACGACTActATAG)。
- N遺伝子全体のRABVを増幅するには、プライマートランスNrabフォワード(5ʹガトガガクテクカトクトククトクト3ʹ)および逆(5ʹカアタカボクダクタガッガッガカガガート3ʹ)と高忠実度PCRキットを使用します。
- 各反応に対して、クリーン PCR チューブ反応バッファー 10x、2 mM DMSO、25 mM MgCl2、10 mM dNt、10 μM の各プライマー、0.5 U の高忠実度ポリメラーゼ、1.5 μL の cDNA (ステップ 5 で調製)、超純水を 50 μL の最終容積に加えて、PCR マスター ミックスを調製します。
- 増幅のために次の条件に設定されたサーモサイクラーを使用してください: 1分のための94 °C;94°Cの4サイクル(1分間、40°C)1分、72°C(2分間)94°Cの35サイクル(1分間、60°C)1分、72°C(2分間)2分間の72°Cの最終延長。
- インビトロ合成の鋳型としてPCR製品を使用し、ステップ6.1.2から酵素反応の成分を除去するには、メーカーの指示に従ってカラムベースの濃縮キットを使用してPCR製品を精製し、分光光度計を使用して定量化します。
- RNA合成には、インビトロ転写キットを使用し、次の反応混合物を使用します:5 μL T7転写5xバッファー、各三リン酸ヌクレオチドの1.9 μL、精製されたRABV N DNA VP2 DNAの10 μg、および酵素混合物の2.5 μL。次に、37°Cで4時間インキュベートする。その後、1 U/μg RNaseフリーDNaseを反応混合物に1μL加え、37°Cで15分間インキュベートしてDNA汚染を排除します。
- インビトロ転写RNAを精製し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を使用して濃縮します。
- 精製したRNAペレットを70μLのTEバッファーに再懸濁し、使用するまで-80°Cで保存します。
- ステップ6.1から約5μgのPCR産物が得られるまでPCRプロトコルを繰り返します。精製および濃縮後、インビトロ転写されたN遺伝子mRNAは4.711 μg/μLの濃度で存在します。
- in vitro転写されたmRNAがこのプロトコルのステップ5に続くN遺伝子に対応していることを確認し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)の陽性対照として使用する。
7. リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)
- qRT-PCR の場合、メーカーの指示に従ってハイブリダイゼーション プローブを使用して、市販のワンステップ qRT-PCR キットと共に、完全な N 遺伝子を正のコントロールとしてコードするインビトロ mRNA トランスクリプトを使用します。カルネイロらによって記述されたプローブおよびプライマーを使用してください。 (2010)23 RABV遺伝子Nの保存領域を検出する(BRDesrot-Rev:5'aaactcaagagaggaacca3'3'、BRDesrot-Fwd:5′cgtactgggggaagggaattg 3'、およびBRDesrot-Probe:5-FAM-acaagggacccactttattatattatgc-3gcgc-3)。
- 以下のサーマルサイクリング条件を使用してください:10分の50°Cの1サイクルと2分間の95°C;15sの場合は95°Cの40サイクル、30sの場合は50°C。
8. 較正曲線または標準曲線
- 6デクリュプル希釈が得られるまで、1μg/μLのmRNAをチューブに連続的にピペット処理して、インビトロ転写mRNAのシリアル希釈を行います。標準曲線の作成に使用するために、3重で100 μLの体積でチューブを準備します。ステップ 7 で説明されているように qRT-PCR を実行します。
- ロータを使用したサーモサイクラーでqRT-PCRを実行するには、様々な脳サンプルを、標準曲線を作成するためのランニング反応と同時に処理し、細胞培養から分離された正のコントロール、陰性コントロール、上清を使用します。
- 試験の検出限界、試験効果、感度を評価するには、同じ条件で三重化の標準曲線を使用します。
9. 生物学的サンプルのqRT-PCR
- RABV遺伝子Nの検出には、フィールドサンプルからのRNA、陽性対照、陰性対照、および細胞培養上清を使用して、ステップ7で説明したPCRキットを使用してqRT-PCRを行います。
- ウシの脳サンプルに存在するRABVゲノムのコピー数を決定するために、標準曲線および生体試料から、および較正曲線式から補間されたものからCtデータを得る。
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Representative Results
DFAの結果は、それぞれ100%、100%、83.3%、66%、および50%の皮質、視床、髄質、ポン、ホーンにおけるRABVの陽性を示した。これらの結果は、前の結果を確認し、各脳から解剖された構造の少なくとも3つはRABVに陽性であった。代表的な正の DAF 染色を 図 1に示します。
図2 は、Loza-Rubioららによって報告されたプライマーを最初に有するRABV N遺伝子の断片(ステップ5.5)の増幅を示す。これは、増幅に用いられる材料が良好な品質であることを示した。
PCR増幅フラグメントのサイズを 図3に示します。標準曲線の式は、サンプル中のRABV遺伝的含有量の量とPCR増幅断片のサイズとの関係を示す。RABV遺伝的含有量(ng)の量は 、図4に示した式を用いて較正曲線中のCt値の補間によって推定された。この式を用いて、ウイルスRNAの検出限界が1 x 105 μg/μLのRABVゲノムの36コピーに相当することが判明した。これらの結果は、アッセイが感受性であり、RABV N遺伝子のコピー数が少ないサンプル中のウイルスを検出するために使用できることを示している。アッセイの効率は、-3.28であった標準曲線の傾きを用いて計算した。qRT-PCRに使用したサンプルは、RABV N遺伝子の増幅を示した。
存在するウイルスコピーの数を決定するために、各サンプルのCt値を較正曲線式を用いて補間した。得られた結果(ナノグラムで)は、以下のref.24から下記の式に置換された。
RABV N遺伝子のコピー数=(ngサンプル* 6.022 x 10 23)/(104 bp(PCR産物の長さ)*1 x 109*650)。
比較的、qRT-PCRアッセイの結果はDFAを用いて得られたものと一致した。CおよびDの場合におけるqRT-PCR試験で得られた結果(表1)によれば、視床はRABV N遺伝子のコピー数が最も多い構造である。これは、これらのニューロンが動物の栄養機能を制御することを考えると、視床下部および視床神経の早期感染が疾患の発症に重要であることを示唆している。各サンプルの各構造で検出されたRABV N遺伝子のコピー番号を 表1に示す。すべてのサンプルが陽性であったため、qRT-PCR試験の感度と特異性はいずれも100%であった。この結果は、サンプルの初期診断と一致します。
図1:感染組織における狂犬病ウイルスタンパク質Nを検出する直接免疫蛍光試験に従って陽性染色を示す牛の脳組織。リンゴグリーンの着色は、抗体が狂犬病抗原に結合する染色時に観察される。スケールバー:50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:増幅産物を示す1.5%アガロースゲル。RABV N遺伝子の761 bp断片の増幅は、インビトロ転写に使用されるcDNAの存在および品質を実証する。レーン1は分子量マーカーを含み、ライン2:正のコントロールの増幅;レーン3:陰性コントロール(非感染サンプル);ライン4:インビトロ転写に用いられるcDNAの増幅。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:増幅産物を示す1.5%アガロースゲル。完全なN遺伝子の増幅はレーン2に示される。レーン1は分子量マーカーを含み、レーン3は陰性増幅制御を含む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:in vitroを用いたqRT-PCRの標準曲線は、RABV N遺伝子のコピー数を定量化するためにN遺伝子mRNAを転写した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ID脳 | 構造 | DAF | 番号部数 (x109) |
| A | アンモンの角 | + | 0.261 |
| 小脳 | + | 0.0663 | |
| 皮質 | + | 0.02 | |
| 髄質 | + | 0.146 | |
| ポンス | + | 30.7 | |
| 視床 | + | 108 | |
| ロ | アンモンの角 | - | 0.0251 |
| 小脳 | + | 4.64 | |
| 皮質 | + | 12.4 | |
| 髄質 | + | 0.175 | |
| ポンス | \u2012 | 0.0721 | |
| 視床 | + | 121 | |
| C | アンモンの角 | \u2012 | 0.168 |
| 小脳 | + | 0.0239 | |
| 皮質 | + | 21.5 | |
| 髄質 | + | 17.2 | |
| ポンス | + | 1.32 | |
| 視床 | + | 102 | |
| ニ | アンモンの角 | + | 11.8 |
| 小脳 | + | 0.0239 | |
| 皮質 | + | 8.72 | |
| 髄質 | + | 1.25 | |
| ポンス | \u2012 | 0.0165 | |
| 視床 | + | 33.4 | |
| E | アンモンの角 | + | 4.15 |
| 小脳 | + | 6.78 | |
| 皮質 | + | 1.53 | |
| 髄質 | + | 1.41 | |
| ポンス | + | 0.025 | |
| 視床 | + | 95 | |
| ヘ | アンモンの角 | + | 0.0221 |
| 小脳 | \u2012 | 0.00023 | |
| 皮質 | + | 4.95 | |
| 髄質 | \u2012 | 0.000556 | |
| ポンス | + | 1.02 | |
| 視床 | + | 89 |
表1:各脳構造内のRABV N遺伝子のコピー数の決定。 結果は、DFAを用いて診断されたRABV陽性ウシ脳の6つの解剖学的構造から得られた。太字で強調表示されている単語は、最も多くのコピーを持つ構造を示します。結果は、組織のミリグラム当たりN遺伝子のコピー数として発現した。
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Discussion
これまでの研究では、DFAは、試料が室温(21°C)14で保存されてから7日以内にRABVを検出することしかできないということが示されている。これに対し、この研究は、サンプルが室温に12日間曝露された後、RT-PCRの感度が低下し始めるということを実証した。したがって、RABVゲノムは、室温に曝露されたサンプル中のqRT-PCRによって最大23日間検出することができる。これは、より高度に分解されたサンプルに対してqRT-PCRの感度が比較的高いことを示しています。しかし、特異性25を損なわないより単純な方法を開発することは依然として必要である。本研究は、特定の脳構造に関わらずウイルスゲノムを検出できたという観察に基づき、DFAよりも高感度を有する分子アッセイを実証した。
感染性薬剤の検出に使用するRT-PCR技術の利点は、いくつかの科学的研究で強調されています。ただし、この手法には特殊な機器が必要なため、実行コストなどの欠点が発生する場合があります。分子生物学アッセイを扱うためには、訓練を受けた人材が必要です。さらに、高感度な手法として、最良の結果を得るためには、いくつかの手順が重要であることを述べるべきです。その一つがRNA抽出のためのサンプルの適切な取り扱いです。RNAが分解しやすくなるため、このステップは非常に重要であり、結果は影響を受ける可能性があります。工程中は、サンプルを低温状態(約4°C)で維持することを検討してください。さらに、ステップ6.1で述べたようにPCRアプリケーションのいくつかのラウンドが実施され、インビトロで転写産物を生成することを検討する。これは、反応が実質的な(ミリグラム以上)量のDNAを得るために大量の遺伝物質が必要であるためである。このアッセイのもう一つの重要な側面は、このステップ中にDNAも失われる可能性があるため、カラム内の遺伝物質の精製の要件です。
qRT-PCR は、WHO および OIE によって承認された標準テストである DFA テストと同じくらい特異的であることが知られています。しかし、RT-qPCRを用いた分子アッセイは、より高い感度を有し、したがって、ウイルスゲノムの比較的少数のコピーの検出を容易にするために、より高い分解度を有するサンプルの分析を可能にすることが示されている。また、はるかに高速であり、汚染のリスクを低減し、アンティ・モーテム26、27を使用することができます。
ビンガムとファンデルメルウェ(2002)28は 、どの脳構造がRABV N遺伝子のより高い濃度を有するかを決定するためにDFAを用いた研究を行った。いくつかの種から合計252の脳構造が評価された。視床、ポン、髄質は、評価されたすべての脳サンプルで陽性であったため、最も関連性の高い脳構造であった。これらの結果は、DFAと一致した結果が以下の構造で一致した結果と一致する:皮質および視床、100%;髄質、83.3%;ポン、66%;そしてホーン、50%。対照的に、以前の研究では偽陰性は報告されていませんでした。この研究では、以前に陽性と診断された完全な脳構造でいくつかの否定的な結果が検出された。これは、試験に用いたサンプルの部分に、抗体またはより敏感な分子アッセイによって同定されたウイルス粒子が含まれなかったためである可能性がある。もう一つの考えられる説明は、サンプルが適切に輸送されなかったか、実験室での受信前に保存されなかったということです。
この研究で行われたqRT-PCRアッセイは、組織の1ミリグラム当たりRABV N遺伝子の36.3コピーを検出することができた。qRT-PCRに最も適した脳構造には、皮質および視床が含まれていた。これは、これらの構造でRABV N遺伝子のより高い濃度が検出され、また、RABV参照試験を用いて陽性であることが判明したという観察に基づいています。この試験では、様々なサンプルでウイルスの非常に低い濃度(0.00023 x 109 コピー)を検出することができました。サンプル中のウイルス粒子を定量することに加えて、この試験はRABVの検出のための良好な代替診断および研究ツールを提供するように見える。
ここで示した狂犬病ウイルスウイルスゲノム検出プロトコルを用いて得られた結果により、この技術は、ウイルスゲノムの最小量を検出することができるため、異なるタイプのサンプルにおけるウイルスの分子診断に適用されることが期待される。DFAのような他の方法よりもその最大の利点は、他の著者によって示唆されているように、より敏感であり、 アンティモートを使用できることです。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、国立農林畜研究所(INIFAP)によって支援されました。この文書に関連するビデオの開発における彼のコラボレーションのためにJerzayn Fraustro Esquivelに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
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