Summary
Dit protocol presenteert een qRT-PCR-gebaseerde benadering voor het bepalen van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) genkopienummer binnen verschillende anatomische structuren van runderhersenen met behulp van in vitro transcriptie.
Abstract
Runderverlammingsdolheid (BPR) is een vorm van virale encefalitis die van aanzienlijk economisch belang is in heel Latijns-Amerika, waar het een groot zoönotisch risico vormt. Hier was ons doel om een laboratoriumprotocol te gebruiken om het relatieve kopienummer van het rabiësvirus (RABV) genoom in verschillende anatomische structuren van runderhersenen te bepalen met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR kwantificeert het specifieke aantal genkopieën in een monster op basis van fluorescentie die wordt uitgestoten na versterking die direct evenredig is met de hoeveelheid doelnucleïnezuur die in het monster aanwezig is. Deze methode is voordelig vanwege de korte duur, het verminderde risico op besmetting en het potentieel om virale nucleïnezuren in verschillende monsters gemakkelijker te detecteren in vergelijking met andere technieken. De hersenen van zes hondsdolle dieren waren verdeeld in zes anatomische structuren, namelijk de hoorn van de Ammon, cerebellum, cortex, medulla, pons en thalamus. Alle hersenen werden geïdentificeerd als positief voor RABV-antigenen op basis van een directe immunofluorescentietest. Dezelfde anatomische structuren uit de hersenen van vier RABV-negatieve runderen werden ook beoordeeld. RNA werd geëxtraheerd uit elke structuur en gebruikt voor qRT-PCR. Een test werd uitgevoerd om de kopieaantallen van RABV-genen te bepalen met behulp van een in vitro getranscribeerd nucleoproteïnegen. De standaardcurve die werd gebruikt om viraal RNA te kwantificeren vertoonde een efficiëntie van 100% en lineariteit van 0,99. Analyse toonde aan dat de cortex, medulla en thalamus de ideale CNS-porties waren voor gebruik bij RABV-detectie, gebaseerd op de observatie dat deze structuren de hoogste niveaus van RABV bezaten. De test specificiteit was 100%. Alle monsters waren positief, er werden geen valse positieven gedetecteerd. Deze methode kan worden gebruikt om RABV te detecteren in monsters die lage RABV-niveaus bevatten tijdens de diagnose van BPR.
Introduction
Rabiës kan antemortem en postmortem worden bevestigd door verschillende technieken die de detectie van virale nucleïnezuren in de hersenen, huid, urine of speeksel mogelijk maken1. Detectie van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) gen wordt voornamelijk gebruikt voor rabiësdiagnose door moleculaire tests. Dit gen wordt ook gebruikt voor virale genotypering. Hondsdolheid kan worden gediagnosticeerd bij dieren met behulp van een deel van de aangetaste hersenen; om de mogelijkheid van rabiës uit te sluiten, moet weefsel uit ten minste twee gebieden in de hersenen echter worden getest2. Er bestaan verschillende diagnostische methoden voor rabiësdetectie bij dieren; de directe immunofluorescentietest blijft echter de standaardreferentietechniek3. Andere tests omvatten biologische tests die muisinenting, infectie in weefselkweek en polymerasekettingreactie (PCR) bevatten4. Al deze technieken worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de Wereldorganisatie voor diergezondheid (OIE) voor de diagnose van rabiës bij mens en dier, respectievelijk5.
Nucleïnezuurdetectie- en versterkingstechnieken hebben de diagnose van rabiës de afgelopen jaren een revolutie teweeggebracht6 en deze technieken spelen een belangrijke rol bij de ante mortemdiagnose van menselijke rabiës. Verschillende pcr-gebaseerde tests zijn geëvalueerd als aanvulling op conventionele tests voor antemortem - en postmortale rabiësdiagnoses7,8,9,10. De meeste assays richten zich op rabiës viraal nucleoproteïne gen voor versterking , het meest geconserveerde gebied in het virale genoom1,11. In de afgelopen 20 jaar zijn verschillende moleculaire assays ontwikkeld om RABV te diagnosticeren, en sommige van deze assays zijn gebruikt voor viruskarakterisering. De meeste studies zijn gericht op het detecteren van geconserveerde genen in het virale genoom, meestal met behulp van conventionele of kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)assays 12,13.
PCR is een zeer gevoelige diagnostische techniek die het genoom van een bepaalde ziekteverwekker in weefsels kan detecteren, zelfs wanneer deze weefsels worden afgebroken. Met behulp van pcr-gebaseerde benaderingen kunnen minimale hoeveelheden van een infectieus agens in een klinisch monster worden gedetecteerd door de selectieve en repetitieve versterking van een DNA-nucleotidesequentie14. qRT-PCR die fluorescerende sondes (bijv. TaqMan) of DNA-bindende kleurstoffen (bijv. SYBR Green) bevat, is gebruikt in proeven om RABV zowel ante- als post- mortem met hoge gevoeligheid te diagnosticeren; een dergelijke aanpak vereist echter gespecialiseerde apparatuur. Om deze beperking te overwinnen, is omgekeerde transcriptielusgemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP) voorgesteld, op basis van de lage kosten, eenvoud en wenselijke kenmerken voor de detectie van RABV. Deze test is bijzonder belangrijk omdat zij in ontwikkelingslanden kan worden gebruikt15.
qRT-PCR is gebaseerd op de detectie en kwantificering van een molecuul, waarbij fluorescerende signaalverhogingen in directe verhouding staan tot de hoeveelheid PCR-product in één reactie. Naarmate het aantal kopieën van het nucleïnezuurdoel toeneemt, neemt ook de fluorescentie toe. Niet-specifieke intercalerende kleurstoffen zoals de SYBR Green DNA-bindende kleurstof of sequentiespecifieke oligonucleotidesondes met een fluorofoor en een quencher worden vaak gebruikt om de fluorescerende uitlezing in qRT-PCR te bieden. Deze test biedt voordelen ten opzichte van conventionele RT-PCR met een kortere testtijd (2-4 uur), een verminderd risico op besmetting als gevolg van het gesloten buissysteem (gebrek aan post-PCR-manipulatie van versterkte producten) en de mogelijkheid om verschillende doelen tegelijkertijd te detecteren16. qRT-PCR kan worden gebruikt om rabiës ante-mortem te diagnosticeren uit speeksel en andere monsters. Deze test kan ook worden gebruikt als een universele real-time test voor de detectie van verschillende Lyssavirus-soorten of -afstammingen van RABV15. In deze combo RT-PCR aanpak worden twee reacties gebruikt. De eerste detecteert verschillende genetische linages van RABV en de tweede detecteert de Lyssavirus-soort. Beide stappen omvatten qRT-PCR-tests, waarbij de eerste hybridisatiesondes gebruikt en de tweede kleurstoffen15. Vanwege het grote aantal tests dat succesvolle moleculaire detectie van RABV met behulp van deze techniek heeft aangetoond, beveelt de huidige OIE Terrestrial Manual (2018) het gebruik van PCR aan voor de moleculaire detectie van RABV17.
Mexico is een land met een aanzienlijk veepotentieel. De staten met de hoogste veeproductie bevatten zowel vochtige tropische regio's als droge gebieden die risico lopen op rabiësuitbraken vanwege de aanwezigheid van de vampiervleermuis Desmodus rotundus, de belangrijkste zender van hondsdolheid. Daarom is het van essentieel belang om meer instrumenten te ontwikkelen voor de preventie en bestrijding van runderverlammingsdolheid (BPR) in México. Op basis hiervan was het doel van deze studie om kwantitatieve qRT-PCR te gebruiken om het aantal virale deeltjes in verschillende anatomische structuren van runderhersenen na de dood als gevolg van rabiësinfectie te bepalen.
Zes hersenen verkregen uit RABV-positieve runderen werden gedoneerd door een extern laboratorium voor gebruik bij de ontwikkeling van het hieronder beschreven qRT-PCR-protocol. De monsters van de structuur van de runderhersenen werden koudketentransporten naar het INIFAP CENID-MA-laboratorium BSL-2-laboratorium vervoerd en tot gebruik bij -80 °C opgeslagen. Hersenen werden verkregen van dieren uit de staten Campeche, Yucatán en Querétaro. Voorafgaand aan het ontvangstbewijs werden verschillende structuren uit de hersenen ontleed. Deze structuren omvatten de hoorn van de Ammon, cerebellum, cortex, medulla, pons en thalamus18,19. Genetisch materiaal werd geëxtraheerd zoals hieronder beschreven. Rabv-diagnose werd bevestigd met behulp van directe fluorescerende antilichamen (DFA)20. Als positieve controle werden muishersenen gebruikt die werden ingeënt met RABV21. Daarnaast werden vier RABV-negatieve runderhersenen (zoals bepaald door DFA) gebruikt als negatieve controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen voor het gebruik van dieren die werden verstrekt door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Monsters
- Gebruik verschillende gebieden van de hersenen ontleed uit 6 verschillende rabiës-positieve runderhersenen voor RT-PCR analyse.
2. Directe fluorescerende antilichamen (DFAs) om rabiës te bevestigen
OPMERKING: Detectie van het rabiësantigeen door DFA is een kwalitatieve methode om de aanwezigheid van het rabiësnucleoproteïne te bepalen met behulp van fluoresceïne-gelabelde antilichamen. De test werd uitgevoerd met behulp van het protocol van Dean et al. (1966)20, zoals hieronder beschreven.
- Maak twee indrukken van elk weefsel dat is ontleed uit verschillende hersenstructuren op een steriele dia met een diameter van ongeveer 15 mm. Gebruik een houten applicator om een ongeveer 3 mm3 deel van het weefsel op de steriele glijbaan in te smeren. Om het uitstrijkje te maken, drukt u de houten applicator voorzichtig handmatig tegen de schuif.
- Bevestig de uitstrijkjes van het monster door de dia's gedurende 1 uur bij -20 °C in 100% aceton te dompelen. Droog de dia's na incubatie gedurende 30 minuten op een droge doek bij 21 °C.
- Voeg 50 μL van het antinucleoproteïneantilichaam met fluoresceïnelabel toe aan elk hersenuitstrijkje bij een verdunning van 1:10 door het door een spuit te doseren.
- Incubeer de dia's met het conjugaat in een vochtige kamer bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Was de dia's na incubatie twee keer met water en met PBS om overtollig conjugaat te elimineren. Laat de dia's drogen bij 21 °C. Vlek voorzichtig om overtollige vloeistof te verwijderen en vervolgens kort aan de lucht te drogen voordat u het monteert.
- Voeg een druppel 50% fosfaatglycerine toe om het oppervlak van de sectie te bedekken en dek vervolgens af met een afdeklip. Observeer de secties onder een epifluorescentiemicroscoop bij 40x vergroting.
- De positieve en negatieve controles (positieve controle: muizenhersenen ingeënt met RABV; negatieve controles: RABV-negatieve runderhersenen) op dezelfde manier verwerken en observeren als de monsters.
3. Het genereren van positieve controle voor RT-PCR
- Verkrijg BHK-21 cellen uit de kiemplasmabank. Gebruik cellen tot de 70e passage om de RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) stam te repliceren met behulp van passage 2.
- BHK-21-cellen onderhouden en vermeerderen in flessen met minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% foetale kalfsserum (FCS) bij 37 °C in aanwezigheid van CO2 (5%) en onder vochtige omstandigheden. Kweek de cellen in 25 cm2 kweekkolven tot ze 80% samenvloeiing bereiken en vervolgens subcultuur.
- Haal het kweekmedium uit de cellen en was de fles met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Ent de cultuur in met 105 TCID/ml RABV stam ERA. Incubeer het virale entmateriaal gedurende 2 uur onder constant schudden bij 37 °C in aanwezigheid van CO2 (5%) en onder vochtige omstandigheden.
- Verwijder het infectiemedium en voeg MEM toe aangevuld met 5% (serum foetale runderen) SFB. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 °C in aanwezigheid van CO2 (5%) in vochtige omstandigheden.
- Oogst RABV 3 dagen na inenting wanneer de cellen cytopathische effecten vertonen. Vries de geïnfecteerde cellen in en ontdooi ze vervolgens bij 4 °C om de cellen te lyseren. Verzamel het medium uit de fles en plaats de cellen vervolgens in een centrifugebuis voor centrifugeren op 1.050 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Bewaar de supernatanten van RABV bij -80 °C en bereid werkende aliquots voor opslag bij -70 °C.
- Intracerebrally inenten van het virus verkregen in de vorige stap in 21 dagen oude vrouwelijke CD1 muizen. Gebruik een spuit van 1 ml om 50 μL oplossingen te enten die 106 MICLD50 bevatten (dodelijke dosis voor infectieuze muizenkweek 50%) doses in muizen22.
4. RNA-extractie
OPMERKING: Totaal RNA werd rechtstreeks uit runderhersenen geëxtraheerd met behulp van een organische extractiemethode volgens het volgende protocol.
- Gebruik 100 mg hersenweefsel uit elke anatomische structuur om totaal RNA te extraheren met behulp van een in de handel verkrijgbaar reagens dat guanidium isothiocyanaat bevat.
- Homogeniseer handmatig in totaal 100 mg weefsel uit elke structuur in 1 ml van het guanidium isothiocyanaatreagens door vortexen met behulp van een Dounce-homogenisator met een kleine stamper in de microbuis gedurende 15 s bij maximale snelheid.
- Incubeer de monsters gedurende 5 minuten op ijs en voeg vervolgens 200 μL chloroform toe. Meng de monsters krachtig gedurende 15 s, incubeer gedurende 2 tot 3 min op ijs en centrifugeer vervolgens op 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Breng de waterfase over in een schone buis en voeg 500 μL isopropylalcohol toe. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 21 °C.
- Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Aspireer het waterige supernatant door pipetten. Het geïsoleerde RNA zal aanwezig zijn als een pellet in de buis.
- Was vervolgens de RNA-pellet met 1 ml 75% ethanol door pipetten en centrifugeer gedurende 5 minuten op 4 °C op 7500 x g.
- Decanteer het supernatant en droog de RNA-pellet aan de lucht bij kamertemperatuur (21 °C). Verdun vervolgens de pellet in 50 μL nucleasevrij water.
- Bepaal de RNA-concentratie en -kwaliteit bij 260 nm met behulp van een spectrofotometer. Bewaar RNA bij -80 °C tot gebruik.
- Verwijder DNA uit RNA-monsters door vertering met DNase I. Voeg 2 U DNase I toe per 1 μg RNA geëxtraheerd in de vorige stap. Voeg vervolgens 5 μL 10x reactiebuffer toe en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 30 minuten. Inactiveer de DNase I door 1 μL EDTA aan het mengsel toe te voegen, gevolgd door incubatie gedurende 10 minuten bij 65 °C.
5. cDNA-synthese en PCR
- Synthetiseer first-streng cDNA met behulp van oligo dT en reverse transcriptase. Voeg voor elke 1 μg RNA 1 μL oligo DT (500 μg/ml), 1 μL 10 mM dNTP-mix en nucleasevrij gedestilleerd water toe aan een eindvolume van 12 μL. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten op 65 °C.
- Koel het reactiemengsel af op 4 °C. Centrifugeer de buis gedurende 30 s bij 1.050 x gen voeg vervolgens 4 μL reactiebuffer, 2 μL 0,1 M DTT en 1 μL ribonucleaseremmer (40 U/μL) toe.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens 1 μL reverse transcriptase (200 U) toe. Incubeer vervolgens het reactiemengsel gedurende 50 minuten bij 37 °C en inactiveer de reactie vervolgens gedurende 15 minuten bij 70 °C.
- Bewaar de cDNA bij -20 °C voor gebruik.
OPMERKING: Om de kwaliteit van het gesynthetiseerde cDNA te controleren, voert u de versterking van een fragment van 761 bp van het RABV N-gen uit voordat u de synthese in vitro uitvoert. Gebruik het protocol beschreven door Loza-Rubio et al.11 zoals beschreven in stap 5.5 hieronder. - Voer PCR uit met Taq DNA polymerase onder de volgende omstandigheden. Voer de reactie als volgt uit: 10x Taq buffer met 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase, 10 μM van elke primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ en SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL cDNA, en 2,5 μL cDNA.
- Voer de versterking uit in een thermocycler met behulp van de volgende fietsomstandigheden: 95 ° C gedurende 3 minuten; 35 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 1 min; één cyclus van 72 °C gedurende 7 min.
- Beoordeel de aanwezigheid van de 761 bp PCR-producten met behulp van een 1% agarose gel.
6. In vitro transcriptie
OPMERKING: In vitro transcriptie genereert mRNA van een doelgen. Gebruik een primerpaar dat het volledige RABV N-gen versterkt en een dat wordt gebruikt als een positieve controle voor de qRT-PCR-test. Deze primers zijn ontworpen om het volledige RABV N-gen te versterken en een promotor toe te voegen die de T7-polymerase (TAATACGACTCACTATAG) herkent.
- Om het hele N-gen RABV te versterken, gebruikt u de primers Trans-Nrab forward (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) en reverse (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) en een high-fidelity PCR kit.
- Bereid voor elke reactie een PCR-mastermix voor door aan een schone PCR-buisreactiebuffer 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTPs, 10 μM van elke primer, 0,5 U high-fidelity polymerase, 1,5 μL cDNA (bereid in stap 5) en ultrapure water toe te voegen aan een eindvolume van 50 μL.
- Gebruik een thermocycler die is ingesteld op de volgende voorwaarden voor versterking: 94 °C gedurende 1 min; 4 cycli van 94 °C gedurende 1 min, 40 °C gedurende 1 min en 72 °C gedurende 2 min; 35 cycli van 94 °C gedurende 1 min, 60 °C gedurende 1 min en 72 °C gedurende 2 min; definitieve verlenging van 72 °C gedurende 2 min.
- Om het PCR-product te gebruiken als sjabloon voor de in vitro synthese en om componenten van de enzymatische reactie uit stap 6.1.2 te verwijderen, zuivert u het PCR-product met behulp van een kolomgebaseerde concentratorkit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeert u vervolgens met behulp van een spectrofotometer.
- Gebruik voor RNA-synthese een in vitro transcriptiekit met het volgende reactiemengsel: 5 μL T7 Transcriptie 5x buffer, 1,9 μL van elk trifosfaatnucleotide, 10 μg gezuiverd RABV N DNA VP2 DNA en 2,5 μL van het enzymmengsel. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 4 uur op 37 °C. Voeg vervolgens 1 μL 1 U/μg RNase-Vrije DNase toe aan het reactiemengsel en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om DNA-besmetting te elimineren.
- Zuiver het in vitro getranscribeerd RNA en concentreer het vervolgens met fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1).
- Resuspend de gezuiverde RNA-pellet in 70 μL TE-buffer en bewaar vervolgens bij -80 °C tot gebruik.
- Herhaal het PCR-protocol vanaf stap 6.1 tot ongeveer 5 μg PCR-product is verkregen. Na zuivering en concentratie zal het in vitro getranscribeerd N-gen mRNA aanwezig zijn bij een concentratie van 4,711 μg/μL.
- Bevestig dat het in vitro getranscribeerd mRNA overeenkomt met het N-gen na stap 5 van dit protocol en gebruik dit als een positieve controle voor de real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).
7. Real-time omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR)
- Gebruik voor qRT-PCR een in vitro mRNA-transcript dat het volledige N-gen codeert als een positieve controle, samen met een commerciële qRT-PCR-kit in één stap met hybridisatiesondes volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de sonde en primers beschreven door Carneiro et al. (2010)23 om een geconserveerd gebied van het RABV-gen N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtgggggggaattg 3′ te detecteren, en BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgt).
- Gebruik de volgende thermische fietsomstandigheden: 1 cyclus van 50 °C gedurende 10 minuten en 95 °C gedurende 2 minuten; 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 50 °C gedurende 30 s.
8. Kalibratiecurve of standaardcurve
- Voer seriële verdunningen van het in vitro getranscribeerd mRNA uit door 1 μg/μL mRNA in buizen te gieten totdat zes decupleverdunningen zijn verkregen. Bereid buizen met een volume van 100 μL in drievoud voor gebruik bij het maken van de standaardcurve. Voer qRT-PCR uit zoals beschreven in stap 7.
- Voer qRT-PCR uit in een thermocycler met een rotor door de verschillende hersenmonsters tegelijkertijd met de lopende reacties te verwerken voor het maken van de standaardcurve en met behulp van positieve controles, negatieve controles en supernatanten geïsoleerd uit celkweek.
- Om de detectielimiet, de testeffectiviteit en de gevoeligheid van de test te evalueren, gebruikt u een standaardcurve in drievoud onder dezelfde omstandigheden.
9. qRT-PCR van biologische monsters
- Gebruik voor de detectie van RABV-gen N het RNA uit veldmonsters, positieve controles, negatieve controles en celkweeksupernatanten om qRT-PCR uit te voeren met behulp van de PCR-kit die in stap 7 wordt beschreven.
- Om het aantal kopieën van het RABV-genoom in de monsters van runderhersenen te bepalen, moet ct-gegevens worden verkregen uit de standaardcurve en biologische monsters en uit de kopieën die zijn geïnterpoleerd uit de kalibratiecurvevergelijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DFA-resultaten toonden respectievelijk 100%, 100%, 83,3%, 66% en 50% positiviteit voor RABV in de cortex, thalamus, medulla, pons en hoorn. Deze resultaten bevestigden de vorige resultaten, en ten minste drie van de structuren ontleed uit elke hersenen waren positief voor RABV. Figuur 1geeft een representatieve positieve DAF-kleuring weer .
Figuur 2 toont de versterking van een fragment van het RABV N-gen (stap 5.5) met de primers eerst gemeld door Loza-Rubio et al.11. Hieruit bleek dat het verkregen materiaal voor versterking van goede kwaliteit was.
De grootte van het pcr-versterkte fragment is weergegeven in figuur 3. De vergelijking van de standaardcurve toont de relatie tussen de hoeveelheid RABV-genetische inhoud in een monster en de grootte van het pcr-versterkte fragment. De hoeveelheid RABV-genetische inhoud (in ng) werd afgeleid door interpolatie van de Ct-waarden in de kalibratiecurve met behulp van de vergelijking in figuur 4. Met behulp van deze vergelijking bleek de detectielimiet van 1 x 105 μg/μL viraal RNA overeen te komen met 36 kopieën van het RABV-genoom. Deze resultaten tonen aan dat de test gevoelig is en kan worden gebruikt om het virus te detecteren in monsters die een laag aantal kopieën RABV N-gen bevatten. De efficiëntie van de test werd berekend met behulp van de helling van de standaardcurve, die -3,28 was. De monsters die werden gebruikt voor qRT-PCR toonden versterking van het RABV N-gen.
Om het aantal aanwezige virale kopieën te bepalen, werden de Ct-waarden voor elk monster geïnterpoleerd met behulp van de kalibratiecurvevergelijking. Het verkregen resultaat (in nanogrammen) werd vervangen door de onderstaande formule uit de volgende ref.24:
Aantal kopieën RABV N gen = (ng monster * 6.022 x 1023) / (104 bp (lengte pcr product) * 1 x 109 * 650).
Relatief gezien waren de resultaten van qRT-PCR-assays consistent met die verkregen met behulp van DFA. Volgens de resultaten verkregen in de qRT-PCR-test in de gevallen C en D (tabel 1), is de thalamus de structuur die het hoogste aantal kopieën van het RABV N-gen bezit. Dit suggereert dat vroege infectie van hypothalamus en thalamische neuronen belangrijk is in de ontwikkeling van de ziekte, gezien het feit dat deze neuronen de vegetatieve functies van een dier controleren. De kopienummers van het RABV N-gen die in elke structuur van elk monster zijn gedetecteerd, zijn weergegeven in tabel 1. De gevoeligheid en specificiteit van de qRT-PCR-test waren beide 100%, omdat alle monsters positief waren. Dit resultaat komt overeen met de eerste diagnoses van de monsters.
Figuur 1: Runderhersenweefsels die positieve vlekken vertonen volgens de directe immunofluorescentietest die rabiësviruseiwit N in geïnfecteerde weefsels detecteert. Een appelgroene kleuring wordt waargenomen bij kleuring, waarbij het antilichaam zich bindt aan het rabiësantigeen. Schaalbalk: 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: 1,5% agarose gel met de versterkingsproducten. Versterking van een fragment van 761 bp van het RABV N-gen om de aanwezigheid en kwaliteit van het cDNA aan te tonen dat in in vitro transcriptie moet worden gebruikt. Baan 1 bevat een moleculaire gewichtsmarker, lijn 2: versterking van positieve controle; baan 3: negatieve controle (niet-geïnfecteerd monster); lijn 4: versterking van cDNA gebruikt voor in vitro transcriptie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: 1,5% agarose gel met de versterkingsproducten. Versterking van het volledige N-gen wordt weergegeven in baan 2. Baan 1 bevat een moleculaire gewichtsmarker en baan 3 bevat de negatieve versterkingscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Standaardcurve van de qRT-PCR met behulp van in vitro getranscribeerd N-gen mRNA om het aantal kopieën van het RABV N-gen te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| ID hersenen | structuur | DAF | Aantal exemplaren (x109) |
| A. | De hoorn van Ammon | + | 0.261 |
| kleine hersenen | + | 0.0663 | |
| cortex | + | 0.02 | |
| Medulla | + | 0.146 | |
| Pons | + | 30.7 | |
| thalamus | + | 108 | |
| B | De hoorn van Ammon | - | 0.0251 |
| kleine hersenen | + | 4.64 | |
| cortex | + | 12.4 | |
| Medulla | + | 0.175 | |
| Pons | \u2012 | 0.0721 | |
| thalamus | + | 121 | |
| C. | De hoorn van Ammon | \u2012 | 0.168 |
| kleine hersenen | + | 0.0239 | |
| cortex | + | 21.5 | |
| Medulla | + | 17.2 | |
| Pons | + | 1.32 | |
| thalamus | + | 102 | |
| Overleden | De hoorn van Ammon | + | 11.8 |
| kleine hersenen | + | 0.0239 | |
| cortex | + | 8.72 | |
| Medulla | + | 1.25 | |
| Pons | \u2012 | 0.0165 | |
| thalamus | + | 33.4 | |
| E. | De hoorn van Ammon | + | 4.15 |
| kleine hersenen | + | 6.78 | |
| cortex | + | 1.53 | |
| Medulla | + | 1.41 | |
| Pons | + | 0.025 | |
| thalamus | + | 95 | |
| F. | De hoorn van Ammon | + | 0.0221 |
| kleine hersenen | \u2012 | 0.00023 | |
| cortex | + | 4.95 | |
| Medulla | \u2012 | 0.000556 | |
| Pons | + | 1.02 | |
| thalamus | + | 89 |
Tabel 1: Bepaling van het aantal kopieën van het RABV N-gen binnen elke hersenstructuur. De resultaten werden verkregen uit zes anatomische structuren van RABV-positieve runderhersenen gediagnosticeerd met behulp van DFA. De vetgedrukte woorden geven de structuren met de meeste kopieën aan. De resultaten werden uitgedrukt als het aantal kopieën van het N-gen per milligram weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat DFA RABV alleen kan detecteren binnen zeven dagen nadat het monster bij kamertemperatuur (21 °C) is opgeslagen14. Dit werk toonde daarentegen aan dat de gevoeligheid van RT-PCR begint af te nemen nadat de monsters gedurende 12 dagen aan kamertemperatuur zijn blootgesteld. Daarom kan het RABV-genoom worden gedetecteerd door qRT-PCR in monsters die tot 23 dagen aan kamertemperatuur zijn blootgesteld. Dit toont aan dat de gevoeligheid van qRT-PCR relatief hoger is voor meer sterk ontbonden monsters. Het blijft echter noodzakelijk eenvoudigere methoden te ontwikkelen die specificiteit niet in gevaar brengen25. Het huidige onderzoek toonde een moleculaire test aan die een hogere gevoeligheid heeft dan DFA, gebaseerd op de observatie dat het in staat was om het virale genoom te detecteren, ongeacht de specifieke hersenstructuur.
De voordelen van de RT-PCR-techniek voor het gebruik bij het opsporen van infectieuze agentia zijn in verschillende wetenschappelijke studies benadrukt. Deze techniek kan echter enkele nadelen vertonen, zoals de uitvoeringskosten, omdat het gespecialiseerde apparatuur vereist. Opgeleid personeel is vereist om moleculaire biologietesten af te handelen. Bovendien moet worden vermeld dat als een zeer gevoelige techniek, sommige van de stappen van cruciaal belang zijn om de beste resultaten te verkrijgen. Een daarvan is de juiste behandeling van monsters voor RNA-extractie. Deze stap is van cruciaal belang, omdat RNA gemakkelijk kan worden afgebroken en de resultaten daarom kunnen worden beïnvloed. Overweeg het monster tijdens het proces in koude omstandigheden (ongeveer 4 °C) te bewaren. Houd er bovendien rekening mee dat verschillende rondes van PCR-toepassing worden uitgevoerd zoals vermeld in stap 6.1 om het transcript in vitro te genereren. Dit komt omdat een grote hoeveelheid genetisch materiaal nodig is om de reactie aanzienlijke (meer dan milligram) hoeveelheden DNA op te leveren. Een ander cruciaal aspect van deze test is de eis voor zuivering van het genetisch materiaal in de kolommen, omdat DNA ook tijdens deze stap verloren kan gaan.
qRT-PCR staat bekend als zo specifiek als de DFA-test, de standaardtest die is goedgekeurd door de WHO en de OIE. Het is echter aangetoond dat moleculaire assays die RT-qPCR gebruiken een hogere gevoeligheid hebben en aldus analyse van monsters met een hogere mate van ontbinding mogelijk maken om de detectie van een relatief klein aantal kopieën van het virale genoom te vergemakkelijken. Het is ook veel sneller, vermindert het risico op besmetting en kan antemortem26,27worden gebruikt .
Bingham en van Der Merwe (2002)28 voerden een studie uit met behulp van DFA om te bepalen welke hersenstructuren hogere concentraties van het RABV N-gen bezaten. In totaal werden 252 hersenstructuren van verschillende soorten geëvalueerd. De thalamus, pons en medulla waren de meest relevante hersenstructuren, omdat ze positief waren in alle geëvalueerde hersenmonsters. Deze resultaten komen overeen met de hier gepresenteerde resultaten, die consistent waren met DFA-resultaten in de volgende structuren: cortex en thalamus, 100%; medulla, 83,3%; pons, 66%; en hoorn, 50%. Eerdere studies daarentegen rapporteerden geen valse negatieven. In dit werk werden enkele negatieve resultaten gedetecteerd in volledige hersenstructuren die eerder als positief waren gediagnosticeerd. Dit kan zijn omdat het gedeelte van het voor de test gebruikte monster geen virale deeltjes bevatte die door het antilichaam of de meer gevoelige moleculaire test waren geïdentificeerd. Een andere mogelijke verklaring is dat de monsters niet goed zijn vervoerd of opgeslagen vóór ontvangst in het laboratorium.
De qRT-PCR-test die in deze studie werd uitgevoerd, kon slechts 36,3 kopieën van het RABV N-gen per milligram weefsel detecteren. De meest geschikte hersenstructuren voor qRT-PCR waren de cortex en thalamus. Dit is gebaseerd op de waarnemingen dat hogere concentraties van het RABV N-gen in deze structuren werden gedetecteerd en dat ze ook positief bleken te zijn met behulp van de RABV-referentietest. De test was in staat om zeer lage concentraties (0,00023 x 109 kopieën) van het virus in verschillende monsters te detecteren. Naast het kwantificeren van de virale deeltjes in het monster, lijkt de test een goed alternatief diagnostisch en onderzoeksinstrument te bieden voor de detectie van RABV.
Met de resultaten verkregen met behulp van het rabiësvirus virale genoomdetectieprotocol dat hier wordt gepresenteerd, wordt verwacht dat deze techniek kan worden toegepast voor de moleculaire diagnose van het virus in verschillende soorten monsters, omdat het in staat is om minimale hoeveelheden van het virale genoom te detecteren. Het grootste voordeel ten opzichte van andere methoden zoals DFA is dat het gevoeliger is en ante-mortemkan worden gebruikt , zoals door andere auteurs is gesuggereerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP). We danken Jerzayn Fraustro Esquivel voor zijn medewerking bij de ontwikkeling van de video die bij dit document horen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
- Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
- CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
- Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
- Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
- David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
- Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
- Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
- Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
- Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
- Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
- Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
- Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
- Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
- Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
- Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
- Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
- Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
- Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
- Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
- Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
- Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
- Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).
