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Immunology and Infection

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Dieses Protokoll stellt einen qRT-PCR-basierten Ansatz zur Bestimmung der Virus-Nukleoprotein (N)-Genkopienummer innerhalb verschiedener anatomischer Rinderhirnstrukturen unter Verwendung von In-vitro-Transkription dar.

Abstract

Rinder-Paralytische Tollwut (BPR) ist eine Form der viralen Enzephalitis, die in ganz Lateinamerika von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung ist und ein großes Zoonoserisiko darstellt. Hier galt es, mithilfe eines Laborprotokolls die relative Kopiernummer des Tollwutvirus-Genoms (RABV) in verschiedenen anatomischen Rinderhirnstrukturen mithilfe quantitativer Realzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zu bestimmen. qRT-PCR quantifiziert die spezifische Anzahl der Genkopien, die in einer Probe auf der Grundlage der nach der Amplifikation emittierten Fluoreszenz vorhanden sind und direkt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Zielnukleinsäure sind. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner kurzen Dauer, des reduzierten Kontaminationsrisikos und des Potenzials, virale Nukleinsäuren in verschiedenen Proben leichter als andere Techniken zu erkennen, von Vorteil. Die Gehirne von sechs tollwütigen Tieren wurden in sechs anatomische Strukturen unterteilt, nämlich das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus. Alle Gehirne wurden auf der Grundlage eines direkten Immunfluoreszenztests als positiv für RABV-Antigene identifiziert. Die gleichen anatomischen Strukturen aus den Gehirnen von vier RABV-negativen Rindern wurden ebenfalls bewertet. DIE RNA wurde aus jeder Struktur extrahiert und für qRT-PCR verwendet. Ein Test wurde durchgeführt, um die Kopiennummern von RABV-Genen unter Verwendung eines in vitro transkribierten Nukleoprotein-Gens zu bestimmen. Die Standardkurve zur Quantifizierung viraler RNA wies eine Effizienz von 100% und eine Linearität von 0,99 auf. Die Analyse ergab, dass der Kortex, die Medulla und der Thalamus die idealen ZNS-Portionen für den Einsatz bei der RABV-Erkennung waren, basierend auf der Beobachtung, dass diese Strukturen die höchsten RABV-Werte besaßen. Die Testspezifität betrug 100%. Alle Proben waren positiv, es wurden keine fehlpositiven Ergebnisse festgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um RABV in Proben zu erkennen, die während der Diagnose von BPR niedrige RABV-Spiegel enthalten.

Introduction

Tollwut kann ante-mortem und post-mortem durch verschiedene Techniken bestätigt werden, die den Nachweis von viralen Nukleinsäuren im Gehirn, Haut, Urin oder Speichel ermöglichen1. Der Nachweis des Tollwutvirus-Nukleoprotein (N) Wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Dieses Gen wird auch für die virale Genotypisierung verwendet. Tollwut kann bei Tieren mit jedem Teil des betroffenen Gehirns diagnostiziert werden; Um jedoch die Möglichkeit von Tollwut auszuschließen, muss Gewebe aus mindestens zwei Regionen im Gehirn getestet werden2. Es gibt mehrere diagnostische Methoden für den Tollwutnachweis bei Tieren; der direkte Immunfluoreszenztest bleibt jedoch die Standard-Referenztechnik3. Andere Tests umfassen biologische Tests, die Maus-Impfung, Infektion in der Gewebekultur und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)4. Alle diese Techniken werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) zur Diagnose von Tollwut bei Mensch und Tierempfohlen.

Nukleinsäurenachweis- und -amplifikationstechniken haben die Tollwutdiagnose in den letzten Jahren revolutioniert6 und diese Techniken spielen eine wichtige Rolle bei der Ante-mortem-Diagnose menschlicher Tollwut. Mehrere PCR-basierte Tests wurden als Ergänzung zu herkömmlichen Tests für Anti-Mortem- und Post-Mortem-Tollwut-Diagnosen 7,8,9,10ausgewertet. Die meisten Assays zielen auf das virale Nukleoproteingen tollwutium, das die am höchsten konservierte Region im viralen Genom1,11ist. In den letzten 20 Jahren wurden verschiedene molekulare Assays entwickelt, um RABV zu diagnostizieren, und einige dieser Assays wurden für die Viruscharakterisierung verwendet. Die meisten Studien zielten darauf ab, konservierte Gene innerhalb des viralen Genoms zu detektieren, am häufigsten mithilfe konventioneller oder quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Assays12,13.

PCR ist eine hochempfindliche diagnostische Technik, die das Genom eines bestimmten Krankheitserregers im Gewebe erkennen kann, auch wenn diese Gewebe zersetzt werden. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz14nachgewiesen werden. qRT-PCR, die fluoreszierende Sonden (z. B. TaqMan) oder DNA-Bindende Farbstoffe (z. B. SYBR Green) enthält, wurde in Studien zur Diagnose von RABV sowohl ante- als auch post- mortem mit hoher Empfindlichkeit verwendet; ein solcher Ansatz erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde reverse transkription-Loop-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) vorgeschlagen, basierend auf seinen niedrigen Kosten, Einfachheit und wünschenswerten Eigenschaften für die Erkennung von RABV. Dieser Test ist besonders wichtig, da er in Entwicklungsländern verwendet werden kann15.

qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen. Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Unspezifische interkalierende Farbstoffe wie der SYBR Green DNA-Bindender Farbstoff oder sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden mit einem Fluorophor und einem Quencher werden häufig verwendet, um die fluoreszierende Auslesung in qRT-PCR bereitzustellen. Dieser Test bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen RT-PCR, die eine kürzere Testzeit (2–4 h), ein geringeres Kontaminationsrisiko durch das geschlossene Rohrsystem (fehlende Post-PCR-Manipulation von verstärkten Produkten) und die Fähigkeit, verschiedene Ziele gleichzeitig zuerkennen, 16umfassen. qRT-PCR kann verwendet werden, um Tollwut ante-mortem aus Speichel und anderen Proben zu diagnostizieren. Dieser Assay kann auch als universeller Echtzeittest für den Nachweis verschiedener Lyssavirus-Arten oder Abstammungen von RABV15verwendet werden. Bei diesem Combo RT-PCR-Ansatz werden zwei Reaktionen verwendet. Die erste detektiert verschiedene genetische Linages von RABV, die zweite die Lyssavirus-Arten. Beide Schritte beinhalten qRT-PCR-Assays, wobei der erste Hybridisierungssonden und der zweite Farbstoff15verwendet. Aufgrund der Vielzahl von Tests, die eine erfolgreiche molekulare Detektion von RABV mit dieser Technik nachgewiesen haben, empfiehlt das aktuelle OIE Terrestrial Manual (2018) den Einsatz von PCR für den molekularen Nachweis von RABV17.

Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind. Daher ist es wichtig, mehr Instrumente zur Verhütung und Bekämpfung von rinderparalytischer Tollwut (BPR) in Mexiko zu entwickeln. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel dieser Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod durch Tollwutinfektion zu bestimmen.

Sechs Gehirne, die von RABV-positiven Rindern gewonnen wurden, wurden von einem externen Labor für den Einsatz bei der Entwicklung des unten beschriebenen qRT-PCR-Protokolls gespendet. Die Rinderstrukturproben wurden kaltkett in die INIFAP CENID-MA Laboranlage BSL-2 transportiert und bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert. Die Gehirne wurden von Tieren aus den Bundesstaaten Campeche, Yucatén und Querétaro gewonnen. Vor der Quittung wurden verschiedene Strukturen aus dem Gehirn seziert. Zu diesen Strukturen gehörten das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus18,19. Genetisches Material wurde wie unten beschrieben extrahiert. Die RABV-Diagnose wurde mit direkten fluoreszierenden Antikörpern (DFA)20bestätigt. Als positiv zu steuernde, Mausgehirne, die mit RABV21 geimpft wurden, wurden verwendet. Zusätzlich wurden vier RABV-negative Rinderhirne (wie von DFA bestimmt) als Negativkontrollen verwendet.

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Protocol

Diese Studie wurde von den Empfehlungen des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (IACUC) des Centro Nacional de Investigacion Disciplinaria en Microbiologa Animal (CENID-MA) genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Verwendung von Tieren durchgeführt.

1. Proben

  1. Verwenden Sie verschiedene Bereiche des Gehirns, die von 6 verschiedenen tollwut-positiven Rinderhirnen für die RT-PCR-Analyse seziert wurden.

2. Direkte fluoreszierende Antikörper (DFA) zur Bestätigung von Tollwut

HINWEIS: Der Nachweis des Tollwutantigens durch DFA ist eine qualitative Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins des Tollwutnucleoproteins mit fluorescein-markierten Antikörpern. Der Test wurde mit dem Von Dean et al. (1966)20bereitgestellten Protokoll durchgeführt, wie unten beschrieben.

  1. Machen Sie zwei Eindrücke von jedem Gewebe, das von verschiedenen Gehirnstrukturen auf einem sterilen Dia von ca. 15 mm Durchmesser seziert wird. Verwenden Sie einen Holzapplikator, um einen ca. 3 mm3 Teil des Gewebes auf den sterilen Schlitten zu schmieren. Um den Abstrich zu erstellen, drücken Sie den Holzapplikator vorsichtig manuell gegen die Folie.
  2. Befestigen Sie die Probenabstriche, indem Sie die Dias in 100% Aceton für 1 h bei -20 °C tauchen. Nach der Inkubation die Schlitten auf einem trockenen Tuch bei 21 °C 30 min trocknen.
  3. Fügen Sie jedem Gehirn 50 l des fluorescein-markierten Anti-Nukleoprotein-Antikörpers bei einer Verdünnung von 1:10 durch Abgabe durch eine Spritze hinzu.
  4. Die Dias mit dem Konjugat in einer feuchten Kammer bei 37 °C für 1 h inkubieren.
  5. Waschen Sie die Dias nach der Inkubation zweimal mit Wasser und mit PBS, um überschüssiges Konjugat zu vermeiden. Lassen Sie die Dias bei 21 °C trocknen. Sorgfältig ausbluten, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann kurz lufttrocken vor der Montage.
  6. Fügen Sie einen Tropfen von 50% Phosphatglycerin, um die Oberfläche des Abschnitts zu decken, und dann mit einem Deckelbedeckung abdecken. Beobachten Sie die Abschnitte unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
    1. Prozess und beobachten Sie die positiven und negativen Kontrollen (positive Kontrolle: Mausgehirne mit RABV geimpft; negative Kontrollen: RABV-negative Rindergehirne) in der gleichen Weise wie die Proben.

3. Generierung von Positivsteuerung für RT-PCR

  1. Erhalten Sie BHK-21-Zellen von der Keimplasmabank. Verwenden Sie Zellen bis zum70. Durchgang, um den RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA)-Stamm mit Durchgang 2 zu replizieren.
  2. BhK-21-Zellen in Flaschen pflegen und vermehren, die ein minimales wesentliches Medium (MEM) enthalten, ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum (FCS) bei 37 °C in Gegenwart vonCO2 (5%) und unter feuchten Bedingungen. Wachsen Sie die Zellen in 25cm2 Kulturkolben, bis sie 80% Zusammenfluss und dann Subkultur erreichen.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen und waschen Sie die Flasche mit Phosphatgepufferter Saline (PBS). Impfen Sie die Kultur mit 105 TCID/ml des RABV-Stamms ERA. Inkubieren Sie das virale Inokulum für 2 h unter ständigem Schütteln bei 37 °C in Gegenwart von CO2 (5%) und unter feuchten Bedingungen.
  4. Entfernen Sie das Infektionsmedium und fügen Sie MEM mit 5% (Serum fetale Rinder) SFB ergänzt. Inkubieren für 72 h bei 37 °C in Gegenwart von CO2 (5%) unter feuchten Bedingungen.
  5. Ernte RABV 3 Tage nach der Impfung, wenn die Zellen zytopathische Effekte aufweisen. Die infizierten Zellen einfrieren und dann bei 4 °C auftauen, um die Zellen zu lysieren. Das Medium aus der Flasche sammeln und die Zellen dann bei 10 min bei 4 °C in ein Zentrifugenrohr für zentrifugieren.
  6. Die Überräube von RABV bei -80 °C lagern und Arbeitsaliquots für die Lagerung bei -70 °C vorbereiten.
  7. Intracerebal impfen Sie das Virus, das im vorherigen Schritt in 21 Tage alte weibliche CD1-Mäuse erhalten wurde. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze, um 50 l Lösungen mit 106 MICLD50 (Maus-infektiöse Kultur tödliche Dosis 50%) zu impfen Dosen in Mäuse22.

4. RNA-Extraktion

HINWEIS: Die gesamte RNA wurde direkt aus Rinderhirnen mit einer organischen Extraktionsmethode gemäß folgendem Protokoll extrahiert.

  1. Verwenden Sie 100 mg Hirngewebe aus jeder anatomischen Struktur, um die gesamte RNA mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz zu extrahieren, das Guanidiumisothiocyanat enthält.
  2. Manuelle Homogenisierung von insgesamt 100 mg Gewebe aus jeder Struktur in 1 ml des Guanidium isothiocyanat reageimeimmittel durch Wirbeln mit einem Dounce Homogenisatmit mit einem kleinen Stößel im Mikrorohr für 15 s bei maximaler Geschwindigkeit.
  3. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 5 min, und fügen Sie dann 200 l Chloroform hinzu. Die Proben 15 s kräftig mischen, 2 bis 3 min auf Eis brüten und dann bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
  4. Übertragen Sie die wässrige Phase auf ein sauberes Rohr und fügen Sie 500 l Isopropylalkohol hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 15 min bei 21 °C.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den wässrigen Überstand durch Pipettieren. Die isolierte RNA wird als Pellet in der Röhre vorhanden sein.
  6. Als nächstes waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol durch Pipettieren und Zentrifugen bei 7500 x g für 5 min bei 4 °C.
  7. Den Überstand dekantieren und das RNA-Pellet bei Raumtemperatur (21 °C) lufttrocknen. Anschließend das Pellet in 50 l nukleasefreiem Wasser verdünnen.
  8. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. RNA bis zur Anwendung bei -80 °C lagern.
  9. Entfernen Sie DNA aus RNA-Proben durch Verdauung mit DNase I. Fügen Sie 2 U DNase I pro 1 g RNA hinzu, die im vorherigen Schritt extrahiert wurde. Als nächstes fügen Sie 5 l des 10-fachen Reaktionspuffers hinzu und inkubieren Sie dann 30 min bei 37 °C. Inaktivieren Sie die DNase I, indem Sie dem Gemisch 1 L EDTA hinzufügen, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 65 °C.

5. cDNA-Synthese und PCR

  1. Synthetisieren Sie die cDNA des ersten Strangs mit Oligo dT und Reverse-Transkriptase. Fügen Sie für jede 1 g RNA 1 l Oligo-DT (500 g/ml), 1 l 10 mM dNTP-Mix und nukleasefreies destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 12 l hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 65 °C für 5 min.
  2. Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf 4 °C. Zentrifugieren Sie das Rohr für 30 s bei 1.050 x g,und fügen Sie dann 4 l Reaktionspuffer, 2 l 0,1 M DTT und 1 l Ribonuklease-Inhibitor (40 U/L) hinzu.
  3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 2 min, und fügen Sie dann 1 l Reverse-Transkriptase (200 U) hinzu. Anschließend das Reaktionsgemisch 50 min bei 37 °C inkubieren und dann die Reaktion bei 70 °C für 15 min inaktivieren.
  4. Bewahren Sie die cDNA vor der Anwendung bei -20 °C auf.
    ANMERKUNG: Um die Qualität der synthetisierten cDNA zu überprüfen, führen Sie die Amplifikation eines 761 bp-Fragments des RABV N-Gens durch, bevor Sie die Synthese in vitro durchführen. Verwenden Sie das von Loza-Rubio et al.11 beschriebene Protokoll, wie in Schritt 5.5 unten beschrieben.
  5. PCR mit Taq DNA-Polymerase unter den folgenden Bedingungen durchführen. Führen Sie die Reaktion wie folgt aus: 10x Taq-Puffer mit 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq Polymerase, 10 m jeder Grundierung (SuEli+: 5" cgtrgaycaatatgagtaca 3" und SuEli-: 5" caggctcraacattcttcttctta 3'), 2,5 l cDNA und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 l.
  6. Führen Sie die Amplifikation in einem Thermocycler unter folgenden Fahrradbedingungen durch: 95 °C für 3 min; 35 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min; einen Zyklus von 72 °C für 7 min.
  7. Bewerten Sie das Vorhandensein der 761 bp PCR-Produkte mit einem 1% Agarose-Gel.

6. In-vitro-Transkription

HINWEIS: In-vitro-Transkription erzeugt mRNA eines Zielgens. Verwenden Sie ein Primer-Paar, das das gesamte RABV N-Gen verstärkt und das als Positivkontrolle für den qRT-PCR-Assay verwendet wird. Diese Primer wurden entwickelt, um das gesamte RABV N-Gen zu verstärken und einen Promotor hinzuzufügen, der die T7-Polymerase (TAATACGACTCACTATAG) erkennt.

  1. Um das gesamte N-Gen RABV zu verstärken, verwenden Sie die Primer Trans-Nrab vorwärts (5ʹ gatgagtcactcgaatatctt 3ʹ) und umgekehrt (5ʹ caataatacgactactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) und ein High-Fidelity PCR-Kit.
    1. Bereiten Sie für jede Reaktion einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie einen sauberen PCR-Rohrreaktionspuffer 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 m M jeder Grundierung, 0,5 U Hochtreuepolymerase, 1,5 l cDNA (in Schritt 5) und Reinstwasser auf ein Endvolumen von 50 l hinzufügen.
    2. Verwenden Sie einen Thermocycler,der die folgenden Bedingungen für die Amplifikation ansetzt: 94 °C für 1 min; 4 Zyklen von 94 °C für 1 min, 40 °C für 1 min und 72 °C für 2 min; 35 Zyklen von 94 °C für 1 min, 60 °C für 1 min und 72 °C für 2 min; Endverlängerung von 72 °C für 2 min.
  2. Das PCR-Produkt als Vorlage für die In-vitro-Synthese zu verwenden und Komponenten der enzymatischen Reaktion aus Schritt 6.1.2 zu entfernen, das PCR-Produkt mit einem säulenbasierten Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und dann mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.
  3. Für die RNA-Synthese verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit mit folgendem Reaktionsgemisch: 5 l T7 Transkription 5x Puffer, 1,9 l jedes Triphosphat-Nukleotids, 10 g gereinigte RABV N-DNA-VP2-DNA und 2,5 l des Enzymgemischs. Als nächstes die Mischung bei 37 °C für 4 h inkubieren. Dann fügen Sie dem Reaktionsgemisch 1 L von 1 U/g RNase-freie DNase hinzu und brüten 15 min bei 37 °C, um die DNA-Kontamination zu beseitigen.
  4. Reinigen Sie die in vitro transkribierte RNA und konzentrieren Sie sie dann mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1).
  5. Setzen Sie das gereinigte RNA-Pellet in 70 l TE-Puffer aus, und lagern Sie es dann bei -80 °C bis zur Verwendung.
  6. Wiederholen Sie das PCR-Protokoll von Schritt 6.1 bis ca. 5 g PCR-Produkt erhalten ist. Nach der Reinigung und Konzentration wird das in vitro transkribierte N-Gen mRNA in einer Konzentration von 4,711 g/l vorliegen.
  7. Bestätigen Sie, dass die in vitro transkribierte mRNA dem N-Gen nach Schritt 5 dieses Protokolls entspricht, und verwenden Sie diese als positive Kontrolle für die Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).

7. Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

  1. Verwenden Sie für qRT-PCR ein in vitro mRNA-Transkript, das das gesamte N-Gen als positive Kontrolle kodiert, zusammen mit einem kommerziellen einstufigen qRT-PCR-Kit mit Hybridisierungssonden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die von Carneiro et al. beschriebene Sonde und Primer. (2010)23 zum Nachweis einer konservierten Region des RABV-Gens N (BRDesrot-Rev: 5" aaactcaagagaaggccacaacca 3, BRDesrot-Fwd: 5" cgtactgatgtggaagggaattg 3" und BRDesrot-Probe: 5-FAM-acaagaccctctgtttcagagcatgc-3-BHQ).
  2. Verwenden Sie die folgenden thermischen Radfahrbedingungen: 1 Zyklus von 50 °C für 10 min und 95 °C für 2 min; 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 50 °C für 30 s.

8. Kalibrierkurve oder Standardkurve

  1. Führen Sie serielle Verdünnungen der in vitro transkribierten mRNA durch serielle Pipettierung von 1 g/l mRNA in Dier durch, bis sechs Dekuperlutionen erhalten sind. Bereiten Sie Rohre mit einem Volumen von 100 l in dreifacher Ausfertigung für die Erstellung der Standardkurve vor. Führen Sie qRT-PCR wie in Schritt 7 beschrieben durch.
  2. Führen Sie qRT-PCR in einem Thermocycler mit einem Rotor durch, indem Sie die verschiedenen Gehirnproben gleichzeitig mit den laufenden Reaktionen verarbeiten, um die Standardkurve zu erstellen und positive Steuerungen, Negativkontrollen und überzählige Stoffe zu verwenden, die aus der Zellkultur isoliert sind.
  3. Um die Nachweisgrenze, die Testwirksamkeit und die Empfindlichkeit des Tests zu bewerten, verwenden Sie eine Standardkurve in Dreifacharbeit unter den gleichen Bedingungen.

9. qRT-PCR biologischer Proben

  1. Verwenden Sie für den Nachweis des RABV-Gens N die RNA aus Feldproben, Positivkontrollen, Negativkontrollen und Zellkulturübersprechern, um qRT-PCR mit dem in Schritt 7 beschriebenen PCR-Kit durchzuführen.
  2. Um die Anzahl der Kopien des RABV-Genoms in den Rinderhirnproben zu bestimmen, erhalten Sie Ct-Daten aus der Standardkurve und biologischen Proben sowie aus den interpolierten aus der Kalibrierkurvengleichung.

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Representative Results

Die DFA-Ergebnisse zeigten 100%, 100%, 83,3%, 66% und 50% Positivität für RABV im Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn. Diese Ergebnisse bestätigten die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Eine repräsentative positive DAF-Färbung ist in Abbildung 1dargestellt.

Abbildung 2 zeigt die Verstärkung eines Fragments des RABV N-Gens (Schritt 5.5) mit den Primern, die zuerst von Loza-Rubio et al.11berichtet werden. Dies zeigte, dass das material, das für die Verstärkung gewonnen wurde, von guter Qualität war.

Die Größe des PCR-verstärkten Fragments ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gleichung der Standardkurve zeigt die Beziehung zwischen der Menge des RABV-Gengehalts in einer Probe und der Größe des PCR-verstärkten Fragments. Die Menge des RABV-Gengehalts (in ng) wurde durch Interpolation der Ct-Werte in der Kalibrierkurve unter Verwendung der in Abbildung 4dargestellten Gleichung abgeleitet. Mit dieser Gleichung wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze von 1 x 105 g/l viraler RNA 36 Kopien des RABV-Genoms entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Test empfindlich ist und verwendet werden kann, um das Virus in Proben zu erkennen, die eine geringe Anzahl von Kopien RABV N Gen enthalten. Der Wirkungsgrad des Assays wurde anhand der Steigung der Standardkurve berechnet, die -3,28 betrug. Die für qRT-PCR verwendeten Proben zeigten eine Amplifikation des RABV N-Gens.

Um die Anzahl der vorhandenen viralen Kopien zu bestimmen, wurden die Ct-Werte für jede Probe mit der Kalibrierungskurvengleichung interpoliert. Das erhaltene Ergebnis (in Nanogrammen) wurde in die nachstehend beschriebene Formel aus der folgenden Ref.24substituiert:

Anzahl der Kopien RABV N gen = (ng Probe * 6.022 x 1023) / (104 bp (Länge des PCR-Produkts) * 1 x 109 * 650).

Zum Vergleich: Die Ergebnisse der qRT-PCR-Assays stimmten mit denen über ein DFA überein. Nach den Ergebnissen des qRT-PCR-Tests in den Fällen C und D (Tabelle 1) ist der Thalamus die Struktur, die die höchste Anzahl von Kopien des RABV N-Gens besitzt. Dies deutet darauf hin, dass eine frühe Infektion von hypothalamischen und thalamischen Neuronen wichtig für die Entwicklung der Krankheit ist, da diese Neuronen die vegetativen Funktionen eines Tieres kontrollieren. Die Kopiernummern des RABV N-Gens, die in jeder Struktur jeder Probe nachgewiesen wurden, sind in Tabelle 1dargestellt. Die Empfindlichkeit und Spezifität des qRT-PCR-Tests betrug enden zu 100%, da alle Proben positiv waren. Dieses Ergebnis stimmt mit den ersten Diagnosen der Proben überein.

Figure 1
Abbildung 1: Rinderhirngewebe mit positiver Färbung gemäß dem direkten Immunfluoreszenztest, der das Tollwutvirusprotein N in infizierten Geweben erkennt. Eine apfelgrüne Färbung wird bei der Färbung beobachtet, wo der Antikörper an das Tollwutantigen bindet. Maßstabsleiste: 50 m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: 1,5% Agarose-Gel mit den Amplifikationsprodukten. Verstärkung eines 761 bp Fragments des RABV N-Gens zum Nachweis des Vorhandenseins und der Qualität der cDNA, die in der In-vitro-Transkription verwendet werden soll. Spur 1 enthält einen Molekulargewichtsmarker, Zeile 2: Verstärkung der Positivkontrolle; Spur 3: Negativkontrolle (nicht infizierte Probe); Zeile 4: Amplifikation von cDNA zur In-vitro-Transkription. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: 1,5% Agarose-Gel mit den Amplifikationsprodukten. Die Verstärkung des gesamten N-Gens wird in Spur 2 gezeigt. Spur 1 enthält eine Molekulargewichtsmarkierung, und Spur 3 enthält die negative Verstärkungssteuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Standardkurve der qRT-PCR unter Verwendung von in vitro transkribierten N-Gen mRNA zur Quantifizierung der Anzahl der Kopien des RABV N-Gens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ID Gehirn Struktur Daf Anzahl Kopien (x109)
Eine Ammon-Horn + 0.261
Kleinhirn + 0.0663
Kortex + 0.02
Medulla + 0.146
Pons + 30.7
Thalamus + 108
B Ammon-Horn - 0.0251
Kleinhirn + 4.64
Kortex + 12.4
Medulla + 0.175
Pons Nr. 2012 0.0721
Thalamus + 121
C Ammon-Horn Nr. 2012 0.168
Kleinhirn + 0.0239
Kortex + 21.5
Medulla + 17.2
Pons + 1.32
Thalamus + 102
D Ammon-Horn + 11.8
Kleinhirn + 0.0239
Kortex + 8.72
Medulla + 1.25
Pons Nr. 2012 0.0165
Thalamus + 33.4
E Ammon-Horn + 4.15
Kleinhirn + 6.78
Kortex + 1.53
Medulla + 1.41
Pons + 0.025
Thalamus + 95
F Ammon-Horn + 0.0221
Kleinhirn Nr. 2012 0.00023
Kortex + 4.95
Medulla Nr. 2012 0.000556
Pons + 1.02
Thalamus + 89

Tabelle 1: Bestimmung der Anzahl der Kopien des RABV N-Gens innerhalb jeder Gehirnstruktur. Die Ergebnisse wurden aus sechs anatomischen Strukturen von RABV-positiven Rinderhirnen gewonnen, die mit DFA diagnostiziert wurden. Die fett markierten Wörter geben die Strukturen mit den meisten Kopien an. Die Ergebnisse wurden als Anzahl der Kopien des N-Gens pro Milligramm Gewebe ausgedrückt.

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Discussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass DFA RABV nur innerhalb von sieben Tagen nach der Lagerung der Probe bei Raumtemperatur (21 °C)14erkennen kann. Im Gegensatz dazu zeigte diese Arbeit, dass die Empfindlichkeit von RT-PCR abnimmt, nachdem die Proben 12 Tage lang der Raumtemperatur ausgesetzt waren. Daher kann das RABV-Genom mit qRT-PCR in Proben nachgewiesen werden, die bis zu 23 Tage raumtemperaturexponiert sind. Dies zeigt, dass die Empfindlichkeit von qRT-PCR bei stärker zersetzten Proben relativ höher ist. Es bleibt jedoch notwendig, einfachere Methoden zu entwickeln, die die Spezifität nicht beeinträchtigen25. Die vorliegende Forschung zeigte einen molekularen Assay, der eine höhere Empfindlichkeit als DFA besitzt, basierend auf der Beobachtung, dass es in der Lage war, das virale Genom unabhängig von der spezifischen Gehirnstruktur zu erkennen.

Die Vorteile der RT-PCR-Technik für den Einsatz bei der Detektion von Infektionserregern wurden in mehreren wissenschaftlichen Studien hervorgehoben. Diese Technik kann jedoch einige Nachteile aufweisen, wie z. B. Ausführungskosten, da sie spezielle Ausrüstung erfordert. Für molekularbiologische Assays wird geschultes Personal benötigt. Darüber hinaus sollte erwähnt werden, dass als hochsensible Technik einige der Schritte entscheidend sind, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Eine davon ist die richtige Handhabung von Proben für die RNA-Extraktion. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die RNA leicht abgebaut werden kann und die Ergebnisse daher beeinflusst werden könnten. Erwägen Sie, die Probe während des Prozesses unter kalten Bedingungen (ca. 4 °C) zu halten. Berücksichtigen Sie außerdem, dass, wie in Schritt 6.1 erwähnt, mehrere Runden pcR-Anwendung durchgeführt werden, um das Transkript in vitro zu erzeugen. Dies liegt daran, dass eine große Menge an genetischem Material notwendig ist, damit die Reaktion erhebliche (mehr als Milligramm) Mengen an DNA ergibt. Ein weiterer entscheidender Aspekt dieses Tests ist die Anforderung für die Reinigung des genetischen Materials in den Säulen, da auch DNA während dieses Schritts verloren gehen kann.

qRT-PCR ist bekanntlich so spezifisch wie der DFA-Test, der von der WHO und dem OIE zugelassene Standardtest ist. Es hat sich jedoch gezeigt, dass molekulare Assays mit RT-qPCR eine höhere Empfindlichkeit aufweisen und somit eine Analyse von Proben mit einem höheren Zersetzungsgrad ermöglichen, um den Nachweis einer relativ geringen Anzahl von Kopien des viralen Genoms zu erleichtern. Es ist auch viel schneller, reduziert das Risiko einer Kontamination, und kann ante-mortem26,27verwendet werden.

Bingham und van Der Merwe (2002)28 führten eine Studie mit DFA durch, um festzustellen, welche Gehirnstrukturen höhere Konzentrationen des RABV N-Gens besaßen. Insgesamt wurden 252 Hirnstrukturen verschiedener Arten ausgewertet. Die Thalamus, Pons und Medulla waren die relevantesten Gehirnstrukturen, da sie in allen ausgewerteten Hirnproben positiv waren. Diese Ergebnisse stimmen mit den hier vorgestellten Ergebnissen überein, die mit den DFA-Ergebnissen in den folgenden Strukturen übereinstimmen: Kortex und Thalamus, 100%; Medulla, 83,3%; 66%; und Horn, 50%. Im Gegensatz dazu berichteten frühere Studien keine falschen Negative. In dieser Arbeit wurden einige negative Ergebnisse in kompletten Gehirnstrukturen festgestellt, die zuvor als positiv diagnostiziert worden waren. Dies kann daran liegen, dass der für den Test verwendete Teil der Probe keine virusbiologischen Partikel enthielt, die durch den Antikörper oder den empfindlicheren molekularen Test identifiziert wurden. Eine weitere mögliche Erklärung ist, dass die Proben vor dem Empfang im Labor nicht ordnungsgemäß transportiert oder gelagert wurden.

Der in dieser Studie durchgeführte qRT-PCR-Assay konnte nur 36,3 Kopien des RABV N-Gens pro Milligramm Gewebe erkennen. Zu den am besten geeigneten Hirnstrukturen für qRT-PCR gehörten der Kortex und der Thalamus. Dies basiert auf den Beobachtungen, dass in diesen Strukturen höhere Konzentrationen des RABV-N-Gens nachgewiesen wurden und dass sie auch mit dem RABV-Referenztest positiv waren. Der Test konnte sehr niedrige Konzentrationen (0,00023 x 109 Kopien) des Virus in verschiedenen Proben feststellen. Neben der Quantifizierung der Viruspartikel in der Probe scheint der Test ein gutes alternatives Diagnose- und Forschungswerkzeug für die Detektion von RABV zu sein.

Mit den hier vorgestellten Ergebnissen des Virus-Virus-Erkennungsprotokolls wird erwartet, dass diese Technik für die molekulare Diagnose des Virus in verschiedenen Arten von Proben angewendet werden kann, da es in der Lage ist, minimale Mengen des viralen Genoms zu erkennen. Sein größter Vorteil gegenüber anderen Methoden wie DFA ist, dass es empfindlicher ist und ante-mortemverwendet werden kann, wie von anderen Autoren vorgeschlagen wurde.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP) unterstützt. Wir danken Jerzayn Fraustro Esquivel für seine Mitarbeit bei der Entwicklung des Videos, das mit diesem Dokument verbunden ist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

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Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen
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Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

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