Summary
该协议提出了一个基于qRT-PCR的方法，用于使用体外转录确定各种牛脑解剖结构中的狂犬病病毒核蛋白（N）基因拷贝编号。
Abstract
牛麻痹狂犬病（BPR）是一种病毒性脑炎，在整个拉丁美洲具有重要的经济意义，在那里它构成了严重的人畜共患风险。在这里，我们的目标是利用实验室协议，使用定量实时反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）确定不同牛脑解剖结构中狂犬病病毒（RABV）基因组的相对拷贝数。qRT-PCR 根据放大后释放的荧光来量化样品中存在的基因拷贝的具体数量，该副本与样品中的目标核酸含量成正比。与其他技术相比，这种方法的持续时间短、污染风险降低以及在不同样品中更容易检测病毒核酸的潜力是有利的。六只疯动物的大脑被分成六个解剖结构，即艾蒙的角、小脑、皮层、美杜拉、庞斯和塔拉穆斯。根据直接免疫荧光测试，所有大脑均被确认为RABV抗原阳性。还评估了四头RABV阴性牛大脑中相同的解剖结构。RNA 从每个结构中提取，用于 qRT-PCR。使用体外转录核蛋白基因进行检测以确定RABV基因的拷贝数。用于量化病毒RNA的标准曲线的效率为100%，线性为0.99。分析表明，皮层、梅杜拉和塔拉穆斯是用于RABV检测的理想CNS部分，其依据是这些结构拥有最高水平的RABV。测试特异性为100%。所有样本均呈阳性，未检测出误报。此方法可用于在 BPR 诊断过程中检测含有低水平 RABV 的样品中的 RABV。
Introduction
狂犬病可以通过各种技术进行确认，从而检测大脑、皮肤、尿液或唾液中的病毒核酸。狂犬病病毒核蛋白（N）基因的检测主要用于通过分子测试诊断狂犬病。这种基因也用于病毒基因化。狂犬病可以在动物中使用受影响的大脑的任何部分进行诊断：然而，为了排除狂犬病的可能性，必须测试来自大脑中至少两个区域的组织。动物狂犬病检测有几种诊断方法：然而，直接免疫荧光测试仍然是标准参考技术3。其他测试包括生物测试，包括小鼠接种，组织培养感染，聚合酶链反应（PCR）4。世界卫生组织（世卫组织）和世界动物卫生组织（OIE）分别推荐了所有这些技术用于人类和动物狂犬病的诊断。
核酸检测和扩增技术近年来对狂犬病的诊断进行了革命性变革，这些技术在人类狂犬病的尸检诊断中发挥了重要作用。已评估了数项基于PCR的测试，以补充常规的验尸和验尸狂犬病诊断7、8、9、10。大多数检测目标狂犬病病毒核蛋白基因放大，这是病毒基因组1，11中保存最高度的地区。在过去20年中，已经开发出各种分子检测来诊断RABV，其中一些检测结果被用于病毒特征分析。大多数试验都旨在检测病毒基因组中的保存基因，最常见的是使用常规或定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测12，13。
PCR 是一种高度敏感的诊断技术，即使在这些组织分解时，也能检测组织内特定病原体的基因组。使用基于PCR的方法，通过DNA核苷酸序列14的选择性和重复放大，可以在临床样本中检测到少量的传染性药物。qRT-PCR，结合荧光探头（如塔克曼）或DNA结合染料（如SYBR绿色）已用于试验诊断RABV前-和后-验尸具有高灵敏度;然而，这种方法需要专门的设备。为了克服这一限制，建议基于RABV检测的低成本、简单性和可取特性，反向转录循环介质同热放大（RT-LAMP）。这种检测是特别重要的，因为它可以在发展中国家使用15。
qRT-PCR 基于分子的检测和定量，荧光信号的增加与单个反应中的 PCR 产品量成正比。随着核酸靶的拷贝数量增加，荧光也增加。非特定的交错染料，如 SYBR 绿色 DNA 结合染料或带有氟磷和淬火器的序列特异性寡核苷酸探针，通常用于在 qRT-PCR 中提供荧光读出。此检测比传统的 RT-PCR 具有优势，包括更短的测试时间 （2–4 h）、由于封闭管系统（缺乏对放大产品的 PCR 后操作）导致的污染风险，以及同时检测不同目标的能力 16。qRT-PCR 可用于从唾液和其他样本中诊断狂犬病前发现。此检测还可用于检测 RABV15的不同Lyssa 病毒物种或血统的通用实时测试。在此组合 RT-PCR 方法中，使用两种反应。第一个检测RABV的不同遗传亚麻，第二个检测莱萨病毒物种。这两个步骤都涉及 qRT-PCR 检测，其中第一个使用杂交探头，第二个使用染料15。由于大量测试证明使用这种技术成功检测RABV分子，目前的OIE地面手册（2018年）建议使用PCR进行RABV17的分子检测。
墨西哥是一个具有巨大牲畜潜力的国家。牲畜产量最高的州包括潮湿的热带地区和干旱地区，由于存在狂犬病的主要传播者吸血鬼蝙蝠 Desmodus轮回病毒， 这些地区都面临狂犬病爆发的风险。因此，必须开发更多的工具，预防和控制墨西哥的牛麻痹狂犬病。在此基础上，本研究的目的是使用定量qRT-PCR来确定牛脑不同解剖结构中因狂犬病感染而死亡后病毒颗粒的数量。
从RABV阳性牛获得六个大脑是由外部实验室捐赠的，用于开发下文所述的qRT-PCR协议。牛脑结构样本被冷链运送到INIFAP CENID-MA实验室BSL-2设施，储存在-80°C，直到使用。大脑来自坎佩切州、尤卡坦州和克雷塔罗州的动物。在收到之前，从大脑中解剖了各种结构。这些结构包括埃蒙的角，小脑，皮层，美杜拉，庞斯和塔拉穆斯18，19。遗传物质提取如下所述。RABV诊断被证实使用直接荧光抗体（DFA）20。作为一种积极的控制，使用用RABV21接种的老鼠大脑。此外，四个RABV阴性牛脑（由DFA确定）被用作负控制。
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Protocol
这项研究是严格按照国家动物保护与使用委员会（动物研究所）提供的动物使用建议批准和进行的。
1. 样品
- 使用从 6 种不同的狂犬病阳性牛脑解剖的大脑的不同区域进行 RT-PCR 分析。
2. 直接荧光抗体（DFAs）确认狂犬病
注：DFA检测狂犬病抗原是一种定性方法，使用荧光素标记的抗体确定狂犬病核蛋白的存在。测试是使用Dean等人（1966年）20日提供的协议进行的，如下所述。
- 在直径约15毫米的无菌滑梯上，从不同大脑结构解剖的每个组织中留下两个印象。使用木制施用器将大约 3 mm3 部分的组织涂抹在无菌滑梯上。要创建涂片，轻轻按手动滑梯上的木制施用器。
- 通过在 -20 °C 下将幻灯片浸入 100% 丙酮中 1 小时，修复样本涂片幻灯片。 孵化后，在21°C的干布上干燥滑梯30分钟。
- 通过注射器在 1：10 稀释时，在每个脑涂抹中加入 50 μL 的荧光素标记抗核蛋白抗体。
- 在 37 °C 的潮湿室中用联体孵化幻灯片 1 小时。
- 孵化后，用水和PBS洗两次滑梯，以消除多余的结合。允许幻灯片在 21 °C 时干燥。 小心污点，去除多余的液体，然后在安装前短暂地空气干燥。
- 加入50%磷酸甘油，以覆盖该部分的表面，然后用盖片盖住。以40倍的倍数观察显微镜下的部分。
- 以与样本相同的方式处理和观察正负对照（正控制：用RABV接种的老鼠大脑;负控制：RABV阴性牛脑）。
3. 为 RT-PCR 生成正控
- 从种质库获取BHK-21细胞。使用第 70 通道的细胞使用通道 2 复制 RABV 伊芙琳 - 罗基特尼基 - 阿贝尔塞斯 （ERA） 菌株。
- 在含有最小基本介质 （MEM） 的瓶子中维护和繁殖 BHK-21 细胞，在 37 °C 处补充 10% 胎儿小腿血清 （FCS），同时存在 CO2 （5%）在潮湿的条件下在25厘米2 培养烧瓶中生长细胞，直到它们达到80%的汇合，然后亚文化。
- 从细胞中取出培养介质，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗瓶子。接种 105 TCID/mL 的 RABV 应变 ERA 文化。在 37 °C 的恒定震动下，在 CO2 （5%） 的情况下，将病毒接种孵化 2 小时在潮湿的条件下
- 去除感染介质，并添加MEM补充5%（血清胎儿牛）SFB。在 2 氧化碳 （5%） 的情况下在 37 °C 下孵化72 小时在潮湿的条件下。
- 收获RABV接种后3天，当细胞表现出细胞病变作用。冻结受感染的细胞，然后在 4 °C 解冻它们以解冻细胞。从瓶子中收集介质，然后将细胞放入离心管中，在 4 °C 下以 1，050 x g 进行离心 10 分钟。
- 将来自RABV的超纳特存储在-80°C，并准备工作单报价，以-70°C储存。
- 在前一步获得的病毒接种到21天大的雌性CD1小鼠。使用 1 mL 注射器接种 50 μL 的溶液，其中含有 106 MICLD50（ 鼠标传染性培养致命剂量 50%）剂量到小鼠22。
4. RNA 提取
注：根据以下协议，使用有机萃取方法直接从牛脑中提取RNA。
- 使用每个解剖结构中的 100 毫克脑组织，使用含有异氰酸钛的市售试剂提取总 RNA。
- 手动均匀化从每个结构共100毫克的组织在1mL的瓜尼迪姆异氰酸酯试剂通过漩涡使用Dounce同质化剂与一个小虫子在微管内15s的最大速度。
- 将样品在冰上孵化5分钟，然后加入200微L的氯仿。将样品大力混合15秒，在冰上孵育2至3分钟，然后在12，000 x 克 的离心机中，在4°C下15分钟。
- 将水相转移到干净的管子上，并加入 500 μL 的异丙醇。在 21 °C 时将样品孵化 15 分钟。
- 在 4 °C 下以 12，000 x g 的速度将样品离心 10 分钟。 通过管道吸气水性超自然。孤立的RNA将作为弹丸在管中存在。
- 接下来，通过管道清洗 RNA 颗粒，用 1 mL 的 75% 乙醇，在 7500 x g 的离心机中清洗 5 分钟，在 4 °C。
- 在室温（21 °C）下，对超自然现象进行除尘，使RNA颗粒空气干燥。接下来，在50微升无核糖水中稀释颗粒。
- 使用光谱仪确定RNA浓度和质量在260纳米。将RNA存储在-80°C，直到使用。
- 通过消化从RNA样本中去除DNA，用DNase I.在前一步提取的1μgRNA中加入2U的DNA酶I。接下来，加入5μL的10倍反应缓冲器，然后在37°C孵育30分钟。通过在混合物中加入 1μL 的 EDTA 来激活 DNase I，然后在 65 °C 时孵育 10 分钟。
5. cDNA 合成和 PCR
- 使用寡头 dT 和反向转录酶合成第一链 cDNA。每 1μg RNA，加入 1μL 的寡头 DT （500 μg/mL），1μL 的 10 mM dNTP 混合物，以及无核糖蒸馏水，最终体积为 12 μL。在 65 °C 下孵育混合物 5 分钟。
- 将反应混合物冷却至4°C。 在 1，050 x g时将管子离心 30s，然后加入 4 μL 反应缓冲器、2 μL 0.1 M DTT 和 1μL 核糖核糖酶抑制剂 （40 U/μL）。
- 在 37 °C 下孵育反应混合物 2 分钟，然后添加 1μL 的反向转录酶 （200 U）。接下来，在37°C下孵育反应混合物50分钟，然后在70°C下灭活反应15分钟。
- 使用前将 cDNA 存储在 -20 °C。
注意：为了验证合成的 cDNA 的质量，在体外进行合成之前，先对 RABV N 基因的 761 bp 片段进行放大。使用以下步骤5.5 中描述的 Loza-Rubio 等人描述的 11 号协议。 - 在下列条件下使用 塔克 DNA聚合酶执行PCR。执行设置的反应如下： 10x 塔克缓冲器包含 20 mM MgCl2， 0.2 mM dNTP， 1 U Taq 聚合酶，每个引物 10μM（苏埃利+： 5°cgtgatatgagtaca 3°和苏埃利 - ： 5°卡格克拉卡特克特克塔 3°）， 2.5 μL 的 cDNA， 和超纯水到 50 μL 的最终体积.
- 使用以下循环条件在恒温器中执行放大：95°C 3 分钟;30s 95°C的35个周期，30秒的60°C周期，1分钟的72°C：一个周期为72°C，7分钟。
- 使用 1% 的蔗糖凝胶评估 761 bp PCR 产品的存在。
6. 体外转录
注：体外转录产生目标基因的mRNA。使用放大完整RABV N基因的引言对和用作 qRT-PCR 检测正控的引言对。这些引物旨在放大完整的RABV N基因，并添加一个促进剂，识别T7聚合酶（TAATACACACTCACTAG）。
- 要放大整个 N 基因 RABV，请使用引物 Trans-Nrab 前进（5ʹ加特卡茨加塔特格特3ʹ）和反向（5ʹ卡塔加特加卡特3ʹ）和高保真 PCR 套件。
- 对于每个反应，通过添加干净的 PCR 管反应缓冲器 10 倍来准备 PCR 主组合， 2 mM DMSO， 25 m M mgCl2， 10 mM dNTP， 每个引物的 10μM， 0.5 U 的高保真聚合酶， 1.5μL 的 cDNA （在第 5 步中准备）， 和超纯水到 50 μL 的最终体积.
- 使用设置为以下条件的恒温器进行放大：94 °C 1 分钟;4个周期，94°C 1分钟，40°C 1分钟，72°C 2分钟;35 个周期，94 °C 1 分钟，60 °C 1 分钟，72 °C 2 分钟;72°C的最后扩展为2分钟。
- 要使用 PCR 产品作为体外合成的模板，并从步骤 6.1.2 中去除酶反应的组件，请根据制造商的说明使用基于柱的浓缩器套件净化 PCR 产品，然后使用光谱仪进行量化。
- 对于RNA合成，使用具有以下反应混合物的体外转录套件：5 μL T7转录5倍缓冲，每个三磷酸核苷酸的1.9μL，10μg纯化RABV N DNA VP2脱氧核糖核酸，以及酶混合物的2.5μL。接下来，在37°C的4小时孵育混合物。然后，在反应混合物中加入 1 μL 的 1 U/μg RNase 无鼻酶，在 37 °C 时孵育 15 分钟，以消除 DNA 污染。
- 净化体外转录RNA，然后使用酚：氯仿：异酰醇（25：24：1）浓缩。
- 将纯化的RNA颗粒重新插入 70 μL 的 TE 缓冲区，然后储存在 -80 °C，直到使用。
- 从步骤 6.1 重复 PCR 协议，直到获得大约 5μg 的 PCR 产品。净化和浓缩后，体外转录的N基因mRNA将以4.711微克/微L的浓度存在。
- 确认体外转录的 mRNA 在此协议第 5 步之后对应于 N 基因，并以此作为实时反转转录聚合酶链反应 （qRT-PCR） 的正控制。
7. 实时反转转转聚合酶链反应 （qRT-PCR）
- 对于 qRT-PCR，使用体外 mRNA 成绩单编码完整的 N 基因作为正控，以及使用混合探头使用混合探头的商业一步 qRT-PCR 套件。使用卡内罗等人描述的探针和引物（2010年）23 来检测RABV基因N（BRDesrot-Rev：5+阿法卡加卡卡卡3+的保存区域， 布尔德斯罗特 - 弗德： 5° 克特加格加特 3+， 和布尔德斯罗特 - 探针： 5 + - 法姆 - 阿卡加特克 - 3 + - Bhq） 。
- 使用以下热循环条件：1 个周期 50 °C 10 分钟，95 °C 2 分钟;40个周期，15s为95°C，30s为50°C。
8. 校准曲线或标准曲线
- 通过连续将 1μg/μL 的 mRNA 管道插入管中，直到获得六次去杯稀释，对体外转录的 mRNA 进行连续稀释。以三脚架的 100μL 音量准备管子，用于创建标准曲线。执行第 7 步中描述的 qRT-PCR。
- 通过同时处理各种大脑样本和运行反应，在带有转子的恒温器中执行 qRT-PCR，以创建标准曲线，并使用与细胞培养分离的正控制、负控制和超纳特。
- 要评估检测的极限、测试有效性和敏感性，请在相同条件下使用三位一体的标准曲线。
9. 生物样本的 qRT-PCR
- 要检测RABV基因N，请使用来自现场样本、阳性对照组、负对照组和细胞培养超纳特的RNA使用步骤 7 中描述的 PCR 套件执行 qRT-PCR。
- 要确定牛脑样本中存在的RABV基因组拷贝数量，从标准曲线和生物样本中获取Ct数据，并从校准曲线方程中插值的Ct数据中获取Ct数据。
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Representative Results
DFA结果显示，RABV在皮层、沙拉穆斯、美杜拉、庞斯和角中的积极性分别为100%、100%、83.3%、66%和50%。这些结果证实了先前的结果，从每个大脑中解剖出的结构中至少有三个对RABV呈阳性。 图1显示了具有代表性的阳性DAF染色。
图2 显示了RABV N基因片段的放大（第5.5步），引体由洛扎-鲁比奥等人等11人报告。这表明，用于放大的材料质量良好。
PCR 放大片段的大小显示在 图 3 中。标准曲线的方程显示了样本中RABV遗传成分的数量与PCR放大片段大小之间的关系。RABV遗传含量（在ng）的量是通过使用 图4中所列方程在校准曲线中的Ct值插值推断推断的。使用此方程，发现病毒RNA的检测限值为 1 x10 5 μg/μL，与 RABV 基因组的 36 个副本相对应。这些结果表明，检测是敏感的，可用于检测病毒的样本中含有少量的副本RABV N基因。使用标准曲线的斜率（为 -3.28）计算检测效率。用于 qRT-PCR 的样本显示了 RABV N 基因的放大。
为了确定病毒拷贝的数量，使用校准曲线方程对每个样本的 Ct 值进行插值。获得的结果（纳米图）被替换到下面的公式中，如下文第24条所示：
副本数量RABV N基因=（ng样本*6.022 x 10 23）/（104 bp（PCR产品的长度）*1 x 109 * 650）。
相比之下，qRT-PCR 检测结果与使用 DFA 获得的检测结果一致。根据在C和D（表1）的qRT-PCR测试中获得的结果，沙拉穆斯是拥有RABV N基因拷贝数量最多的结构。这表明，鉴于这些神经元控制着动物的植物功能，下丘脑和地中海神经元的早期感染对疾病的发展很重要。在每个样本的每个结构中检测到的RABV N基因的拷贝编号显示在 表1中。qRT-PCR 测试的灵敏度和特异性均为 100%，因为所有样本均呈阳性。此结果与样本的初始诊断一致。
图1：根据直接免疫荧光测试检测受感染组织中的狂犬病病毒蛋白N，牛脑组织呈阳性染色。在染色时观察到苹果绿色，抗体与狂犬病抗原结合。比例栏：50 μm 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：1.5%的阿加罗斯凝胶显示放大产品。放大RABV N基因的761 bp片段，以证明用于体外转录的cDNA的存在和质量。第1巷包含分子重量标记，行2：正控制放大：车道3：负控制（未受感染样本）：第4行：用于体外转录的cDNA的放大。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：1.5%的阿加罗斯凝胶显示放大产品。完整的N基因的扩增显示在2号车道上。1 号车道包含分子重量标记，3 号车道包含负放大控制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用体外转录的N基因mRNA来量化RABV N基因拷贝数量的qRT-PCR的标准曲线。请单击此处查看此图的较大版本。
| ID大脑 | 结构 | 达夫 | 编号副本 （x109） |
| 一 | 阿蒙的喇叭 | + | 0.261 |
| 小脑 | + | 0.0663 | |
| 皮层 | + | 0.02 | |
| 延髓 | + | 0.146 | |
| 庞斯 | + | 30.7 | |
| 丘脑 | + | 108 | |
| 乙 | 阿蒙的喇叭 | - | 0.0251 |
| 小脑 | + | 4.64 | |
| 皮层 | + | 12.4 | |
| 延髓 | + | 0.175 | |
| 庞斯 | \u2012 | 0.0721 | |
| 丘脑 | + | 121 | |
| C | 阿蒙的喇叭 | \u2012 | 0.168 |
| 小脑 | + | 0.0239 | |
| 皮层 | + | 21.5 | |
| 延髓 | + | 17.2 | |
| 庞斯 | + | 1.32 | |
| 丘脑 | + | 102 | |
| D | 阿蒙的喇叭 | + | 11.8 |
| 小脑 | + | 0.0239 | |
| 皮层 | + | 8.72 | |
| 延髓 | + | 1.25 | |
| 庞斯 | \u2012 | 0.0165 | |
| 丘脑 | + | 33.4 | |
| 戊 | 阿蒙的喇叭 | + | 4.15 |
| 小脑 | + | 6.78 | |
| 皮层 | + | 1.53 | |
| 延髓 | + | 1.41 | |
| 庞斯 | + | 0.025 | |
| 丘脑 | + | 95 | |
| F | 阿蒙的喇叭 | + | 0.0221 |
| 小脑 | \u2012 | 0.00023 | |
| 皮层 | + | 4.95 | |
| 延髓 | \u2012 | 0.000556 | |
| 庞斯 | + | 1.02 | |
| 丘脑 | + | 89 |
表1：确定每个大脑结构中RABV N基因的拷贝数量。 结果从使用DFA诊断的RABV阳性牛脑的六个解剖结构中获得。粗体突出显示的单词表示副本最多的结构。结果以每毫克组织N基因的拷贝数表示。
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Discussion
先前的研究表明，DFA只能在样品在室温（21°C）14下储存后7天内检测到RABV。相比之下，这项工作表明，在样品暴露在室温下12天后，RT-PCR的灵敏度开始降低。因此，RABV 基因组可以通过 qRT-PCR 在暴露在室温下的样品中检测到长达 23 天。这表明，对于更高分解的样品，qRT-PCR 的灵敏度相对较高。然而，仍然有必要开发更简单的方法，不损害具体性25。目前的研究表明，分子测定具有比DFA更高的灵敏度，其依据是观察到，无论特定的大脑结构如何，它都能检测出病毒基因组。
RT-PCR技术用于检测传染性病原体的优势在几项科学研究中得到了强调。然而，这种技术可能表现出一些缺点，如执行成本，因为它需要专门的设备。需要经过培训的人员来处理分子生物学检测。此外，还应提到，作为一种高度敏感的技术，某些步骤对于取得最佳结果至关重要。其中之一是正确处理RNA提取的样品。这一步骤至关重要，因为RNA很容易退化，因此结果可能会受到影响。考虑在此过程中在寒冷条件下（约 4 °C） 中保持样品。此外，请考虑按照步骤 6.1 中提到的几轮 PCR 应用进行，以在体外生成成绩单。这是因为大量的遗传物质是必要的反应，以产生大量的（超过毫克）的DNA。此检测的另一个关键方面是列中遗传物质的纯化要求，因为 DNA 也可能在本步骤中丢失。
众所周知，qRT-PCR 与 DFA 测试一样具体，DFA 测试是世卫组织和 OIE 批准的标准测试。然而，使用RT-qPCR的分子检测已被证明具有更高的灵敏度，从而允许分析分解程度较高的样本，以利于检测相对较少的病毒基因组副本。它也快得多，降低了污染的风险，并可用于前体26，27。
宾厄姆和范德梅尔韦（2002年）28 日利用DFA进行了一项研究，以确定哪些大脑结构具有较高浓度的RABV N基因。共评估了来自几个物种的252个大脑结构。塔拉穆斯、庞斯和美杜拉是最相关的大脑结构，因为它们在所有评估的大脑样本中都是阳性的。这些结果与此处介绍的结果一致，这些结果与 DFA 在以下结构中的结果一致：皮层和沙拉穆斯，100%：美杜拉， 83.3%：庞斯， 66%：和喇叭，50%。相比之下，先前的研究没有报告虚假的负面因素。在这项工作中，在以前被诊断为阳性的整个大脑结构中发现了一些负面结果。这可能是因为用于测试的样本中不包含抗体识别的病毒颗粒或更敏感的分子检测。另一种可能的解释是，样品在实验室接收之前没有正确运输或储存。
在这项研究中进行的qRT-PCR检测可以检测到每毫克组织RABV N基因的36.3个拷贝。qRT-PCR 最合适的大脑结构包括皮层和沙拉穆斯。这是基于在这些结构中检测到RABV N基因浓度较高的观察结果，并且使用RABV参考测试也发现它们呈阳性。该测试能够在各种样本中检测出非常低的病毒浓度（0.00023 x10 9 份）。除了量化样品中的病毒颗粒外，该测试似乎为检测RABV提供了一个很好的替代诊断和研究工具。
通过此处介绍的狂犬病病毒病毒基因组检测协议获得的结果，预计该技术可应用于不同类型样本中的病毒分子诊断，因为它能够检测少量的病毒基因组。它比其他方法，如DFA的最大优势是，它更敏感，可以使用 前体，正如其他作者建议。
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Disclosures
作者没有利益冲突可以申报。
Acknowledgments
这项工作得到了国家农林牧业研究所（INIFAP）的支持。我们感谢杰赞·弗劳斯特罗·埃斯奎维尔在开发与本文件相关的视频方面的合作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
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