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Immunology and Infection

विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क संरचनाओं में रेबीज वायरस का मात्रा

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करके विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क शारीरिक संरचनाओं के भीतर रेबीज वायरस न्यूक्लियोप्रोटीन (एन) जीन कॉपी नंबर का निर्धारण करने के लिए एक क्यूआरटी-पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है।

Abstract

गोजातीय लकवा ग्रस्त रेबीज (बीपीआर) वायरल इंसेफेलाइटिस का एक रूप है जो पूरे लैटिन अमेरिका में पर्याप्त आर्थिक महत्व का है, जहां यह एक प्रमुख ज़ूनोटिक जोखिम बन गया है। यहां, हमारा उद्देश्य मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क शारीरिक संरचनाओं में रेबीज वायरस (आरएबीवी) जीनोम की सापेक्ष प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए एक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल का उपयोग करना था। क्यूआरटी-पीसीआर प्रवर्धन के बाद उत्सर्जित फ्लोरेसेंस के आधार पर नमूने में मौजूद जीन प्रतियों की विशिष्ट संख्या की मात्रा निर्धारित करती है जो नमूने में मौजूद लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की मात्रा के सीधे आनुपातिक होती है। यह विधि अपनी छोटी अवधि, संदूषण के कम जोखिम और अन्य तकनीकों की तुलना में अधिक आसानी से विभिन्न नमूनों में वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की क्षमता के कारण लाभप्रद है। छह पागल जानवरों के दिमाग को छह शारीरिक संरचनाओं में विभाजित किया गया था, नामत अमोन का सींग, सेरिबैलम, कॉर्टेक्स, मेडुला, पोन और थैलेसीमिया। सभी दिमाग एक प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षण के आधार पर RABV एंटीजन के लिए सकारात्मक के रूप में पहचाने गए थे । चार राबवि-नकारात्मक बोवाइन के दिमाग से एक ही शारीरिक संरचनाओं का भी आकलन किया गया । आरएनए को प्रत्येक ढांचे से निकाला गया था और क्यूआरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता था। इन विट्रो लिखित न्यूक्लियोप्रोटीन जीन का उपयोग करके राबवी जीन की कॉपी संख्या निर्धारित करने के लिए एक परख का प्रदर्शन किया गया था। वायरल आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक वक्र ने 100% की दक्षता और 0.99 की रैखिकता का प्रदर्शन किया। विश्लेषण से पता चला है कि कॉर्टेक्स, मेडुला और थैलेसीमिया राबे का पता लगाने में उपयोग के लिए आदर्श सीएनएस भाग थे, जो इस अवलोकन के आधार पर थे कि इन संरचनाओं में राबवी के उच्चतम स्तर थे। परीक्षण विशिष्टता 100% थी। सभी नमूने सकारात्मक थे, कोई झूठी सकारात्मक पता नहीं चला । इस विधि का उपयोग उन नमूनों में आरएबीवी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जिनमें बीपीआर के निदान के दौरान राबवी का निम्न स्तर होता है।

Introduction

रेबीज की पुष्टि विभिन्न तकनीकों द्वारा पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम किया जा सकता है जो मस्तिष्क, त्वचा, मूत्र या लार1में वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम होते हैं। रेबीज वायरस न्यूक्लियोप्रोटीन(एन)जीन का पता लगाना मुख्य रूप से आणविक परीक्षणों द्वारा रेबीज निदान के लिए प्रयोग किया जाता है। इस जीन का इस्तेमाल वायरल जेनोटाइपिंग के लिए भी किया जाता है। रेबीज प्रभावित मस्तिष्क के किसी भी हिस्से का उपयोग कर जानवरों में निदान किया जा सकता है; हालांकि, रेबीज की संभावना को बाहर करने के लिए, मस्तिष्क में कम से कम दो क्षेत्रों से ऊतक2परीक्षण किया जाना चाहिए . जानवरों में रेबीज का पता लगाने के लिए कई नैदानिक तरीके मौजूद हैं; हालांकि, डायरेक्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस टेस्ट स्टैंडर्ड रेफरेंस तकनीक3रहता है . अन्य परीक्षणों में जैविक परीक्षण शामिल हैं जो माउस टीका, ऊतक संस्कृति में संक्रमण, और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) 4 को शामिलकरतेहैं। इन सभी तकनीकों की सिफारिश विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) और विश्व पशु स्वास्थ्य संगठन (OIE) द्वारा मनुष्यों और जानवरों में रेबीज के निदान के लिए क्रमशः5।

न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने और प्रवर्धन तकनीकों ने हाल के वर्षों में रेबीज के निदान में क्रांतिकारी बदलाव किया हैऔर ये तकनीकें मानव रेबीज के पूर्व पोस्टमार्टम निदान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । कई पीसीआर आधारित परीक्षणों का मूल्यांकन पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम रेबीज निदान 7,8,9,10के लिए पारंपरिक परीक्षणों के पूरक के लिए किया गया है । अधिकांश परखें रेबीज वायरल न्यूक्लियोप्रोटीन जीन को प्रवर्धन के लिए लक्षित करती हैं जो वायरल जीनोम 1,11में सबसे अधिकसंरक्षितक्षेत्र है । पिछले 20 वर्षों में, आरएबीवी का निदान करने के लिए विभिन्न आणविक परख विकसित की गई है, और इनमें से कुछ परख का उपयोग वायरस लक्षण वर्णन के लिए किया गया है। अधिकांश परीक्षणों का उद्देश्य वायरल जीनोम के भीतर संरक्षित जीन का पता लगाना है, जो आमतौर पर पारंपरिक या मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके12,13कहता है।

पीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील नैदानिक तकनीक है जो ऊतकों के भीतर किसी दिए गए रोगजनक के जीनोम का पता लगा सकती है, तब भी जब ये ऊतक विघटित होते हैं। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके, डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम14के चयनात्मक और दोहराव वाले प्रवर्धन के माध्यम से नैदानिक नमूने में संक्रामक एजेंट की न्यूनतम मात्रा का पता लगाया जा सकता है। क्यूआरटी-पीसीआर जिसमें फ्लोरोसेंट जांच (जैसे, TaqMan) या डीएनए बाध्यकारी रंगों (जैसे, SYBR ग्रीन) को शामिल किया गया है, का उपयोग परीक्षणों में किया गया है ताकि उच्च संवेदनशीलता के साथ आरएबीवी दोनों कानिदान किया जा सके और उच्चसंवेदनशीलता के साथ पोस्टमार्टम किया जा सके; हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। इस सीमा को दूर करने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) का सुझाव दिया गया है, जो आरएबीवी का पता लगाने के लिए इसकी कम लागत, सादगी और वांछनीय विशेषताओं के आधार पर है। यह परख विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका उपयोग विकासशीलदेशोंमें किया जा सकता है ।

क्यूआरटी-पीसीआर एक अणु का पता लगाने और परिमाणीकरण पर आधारित है, जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल बढ़ जाता है, एक ही प्रतिक्रिया में पीसीआर उत्पाद की मात्रा के प्रत्यक्ष अनुपात में होता है। जैसे-जैसे न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य की प्रतियों की संख्या बढ़ जाती है, इसलिए फ्लोरेसेंस बढ़ता है। गैर-विशिष्ट इंटरकैलिटिंग रंग जैसे SYBR ग्रीन डीएनए-बाध्यकारी डाई या अनुक्रम-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच एक फ्लोरोफोर और एक क्वेंचर ले जाने के लिए आमतौर पर क्यूआरटी-पीसीआर में फ्लोरोसेंट रीडआउट प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह परख पारंपरिक आरटी-पीसीआर पर लाभ प्रदान करती है जिसमें एक छोटा परीक्षण समय (2-4 एच), बंद ट्यूब सिस्टम (प्रवर्धित उत्पादों के पोस्ट-पीसीआर हेरफेर की कमी) के कारण संदूषण का कम जोखिम और एक साथ विभिन्न लक्ष्यों का पता लगाने की क्षमता16शामिल है। क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग लार और अन्य नमूनों से रेबीज पूर्व-पोस्टमार्टम का निदान करने के लिए किया जा सकता है। इस परख का उपयोग विभिन्न Lyssavirus प्रजातियों या आरएबीवी15की वंशावली का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक वास्तविक समय परीक्षण के रूप में भी किया जा सकता है। इस कॉम्बो आरटी-पीसीआर अप्रोच में दो रिएक्शन का इस्तेमाल किया जाता है। पहला राबाव के विभिन्न आनुवंशिक लिंगों का पता लगाता है, और दूसरा लाइसावायरस प्रजातियों का पता लगाता है। दोनों चरणों में क्यूआरटी-पीसीआर परख शामिल है, जहां पहला संकरण जांच का उपयोग करता है और दूसरा15रंगों का उपयोग करता है। इस तकनीक का उपयोग करके आरएबीवी के सफल आणविक पहचान का प्रदर्शन करने वाले परीक्षणों की बड़ी संख्या के कारण, वर्तमान ओआईई स्थलीय मैनुअल (2018) आरएबीवी17के आणविक पता लगाने के लिए पीसीआर के उपयोग की सिफारिश करता है।

मेक्सिको काफी पशुधन क्षमता के साथ एक देश है । सबसे अधिक पशुधन उत्पादन वाले राज्यों में आर्द्र उष्णकटिबंधीय क्षेत्र और शुष्क क्षेत्र दोनों होते हैं जो रेबीज के मुख्य ट्रांसमीटर पिशाच बैट डेस्मोडस रोटुंडस की उपस्थिति के कारण रेबीज फैलने के लिए खतरे में हैं । इसलिए, मक्सीको में गोजातीय लकवा रीज (बीपीआर) की रोकथाम और नियंत्रण के लिए अधिक उपकरण विकसित करना आवश्यक है। इसके आधार पर इस अध्ययन का उद्देश्य रेबीज संक्रमण के कारण होने वाली मौत के बाद गोजातीय दिमाग की विभिन्न शारीरिक संरचनाओं में वायरल कणों की संख्या निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करना था ।

नीचे वर्णित क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल के विकास में उपयोग के लिए एक बाहरी प्रयोगशाला द्वारा राब-पॉजिटिव बोवाइन से प्राप्त छह दिमाग दान किए गए थे। गोजातीय मस्तिष्क संरचना के नमूनों को कोल्ड-चेन इनीफाप सेनिड-एमए प्रयोगशाला बीएसएल-2 सुविधा में ले जाया गया और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। कैम्पेचे, युकाटन और क्वेरातारो राज्यों से जानवरों से दिमाग प्राप्त किया गया था। रसीद से पहले, दिमाग से विभिन्न संरचनाओं को विच्छेदित किया गया था। इन संरचनाओं में अमोन का सींग, सेरिबैलम, कॉर्टेक्स, मेडुला, पोन्स और थैलेसीमिया18,19शामिल थे। आनुवंशिक सामग्री के रूप में नीचे वर्णित निकाला गया था । आरएबीवी निदान की पुष्टि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए)20का उपयोग करके की गई थी । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, माउस दिमाग है कि RABV21 के साथ टीका लगाया गया था इस्तेमाल किया गया । इसके अतिरिक्त, चार RABV-नकारात्मक पशु दिमाग (डीएफए द्वारा निर्धारित के रूप में) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

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Protocol

इस अध्ययन को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा प्रदान की गई जानवरों के उपयोग के लिए सख्त अनुसार अनुमोदित और आयोजित किया गया था, जो सेंट्रो नैसिनल डी इन्वेस्टिगासिओन अनुशासिया एन माइक्रोबायोलॉजिया एनिमल (सेनआईडी-एमए) है।

1. नमूने

  1. आरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए 6 अलग-अलग रेबीज-पॉजिटिव गोजातीय दिमाग से विच्छेदित मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों का उपयोग करें।

2. रेबीज की पुष्टि करने के लिए प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (DFAs)

नोट: डीएफए द्वारा रेबीज एंटीजन का पता लगाना फ्लोरोसेइन-लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके रेबीज न्यूक्लियोप्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक गुणात्मक तरीका है। परीक्षण डीन एट अल (1966)20द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, जैसा कि नीचे वर्णित है।

  1. लगभग 15 मिमी व्यास की बाँझ स्लाइड पर विभिन्न मस्तिष्क संरचनाओं से विच्छेदित प्रत्येक ऊतक से दो इंप्रेशन बनाएं। बाँझ स्लाइड पर ऊतक के लगभग 3 मिमी3 हिस्से को धब्बा लगाने के लिए लकड़ी के एप्लीकेटर का उपयोग करें। धब्बा बनाने के लिए, धीरे-धीरे लकड़ी के एप्लिकेटर को मैन्युअल रूप से स्लाइड के खिलाफ दबाएं।
  2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100% एसीटोन में स्लाइड में स्लाइड पनडुब्बी द्वारा नमूना धब्बा स्लाइड फिक्स करें। इनक्यूबेशन के बाद, 30 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखे कपड़े पर स्लाइड सुखाएं।
  3. एक सिरिंज के माध्यम से वितरण द्वारा एक 1:10 कमजोर पड़ने पर प्रत्येक मस्तिष्क धब्बा करने के लिए फ्लोरोसेइन लेबल एंटी-न्यूक्लियोप्रोटीन एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें।
  4. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में संजूगेट के साथ स्लाइडों को इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, अतिरिक्त संजूद्वारा को खत्म करने के लिए स्लाइड को दो बार पानी से और पीबीएस के साथ धोएं। स्लाइड्स को 21 डिग्री सेल्सियस पर सूखने दें। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए सावधानी से दाग और फिर बढ़ते से पहले संक्षेप में हवा सूखी।
  6. अनुभाग की सतह को कवर करने के लिए 50% फॉस्फेट ग्लिसरीन की एक बूंद जोड़ें, और फिर एक कवरलिप के साथ कवर करें। 40x आवर्धन पर एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों का निरीक्षण करें।
    1. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की प्रक्रिया और निरीक्षण करें (सकारात्मक नियंत्रण: माउस दिमाग राब के साथ टीका लगाया गया; नकारात्मक नियंत्रण: राब-नकारात्मक गोजातीय दिमाग) नमूनों के समान तरीके से।

3. आरटी-पीसीआर के लिए सकारात्मक नियंत्रण पैदा करना

  1. जर्मप्लाज्म बैंक से बीएचके-21 कोशिकाएं प्राप्त करें। 70वें मार्ग तक कोशिकाओं का उपयोग करें राबवी एवलिन-रोकिटनिकी-अब्बलसेठ (युग) मार्ग 2 का उपयोग करके तनाव को दोहराने के लिए।
  2. सीओ 2 (5%) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) वाली बोतलों मेंबीएचके-21 कोशिकाओं को बनाए रखें और प्रचारित करें। और आर्द्र परिस्थितियों में। 25 सेमी2 संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं को तब तक बढ़ाएं जब तक कि वे 80% संगम और फिर उपसंस्कृति तक न पहुंच जाएं।
  3. कोशिकाओं से संस्कृति माध्यम निकालें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ बोतल धोएं। आरएबीवी स्ट्रेन एरा के 105 टीसीआईडी/एमएल के साथ संस्कृति का टीका एंव । सीओ 2 (5%) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगातार झटकों के तहत2 घंटे के लिए वायरल इनोकुलम को इनक्यूबेट करें और आर्द्र परिस्थितियों में।
  4. संक्रमण माध्यम को हटा दें और 5% (सीरम भ्रूण गोजातीय) एसएफबी के साथ पूरक एमईएम जोड़ें। सीओ 2 (5%) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर72 घंटे के लिए इनक्यूबेट आर्द्र परिस्थितियों में।
  5. टीका लगाने के 3 दिन बाद फसल राब जब कोशिकाएं साइटोपैथिक प्रभाव प्रदर्शित करती हैं। संक्रमित कोशिकाओं को फ्रीज करें और फिर कोशिकाओं को lyse करने के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर गलें। बोतल से माध्यम ले लीजिए, और फिर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,050 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
  6. -80 डिग्री सेल्सियस पर RABV से सुपरनेटेंट स्टोर करें, और -70 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए काम कर रहे aliquots तैयार करते हैं।
  7. इंट्रासेरेब्रली 21 दिन पुरानी मादा सीडी 1 चूहों में पिछले चरण में प्राप्त वायरस को टीका लगाते हैं। 106 MICLD 50 (माउस संक्रामक संस्कृति घातक खुराक 50%) चूहों में खुराक22.

4. आरएनए निष्कर्षण

नोट: कुल आरएनए को निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार एक कार्बनिक निष्कर्षण विधि का उपयोग करके गोजातीय दिमाग से सीधे निकाला गया था।

  1. प्रत्येक शारीरिक संरचना से मस्तिष्क के ऊतकों के 100 मिलीग्राम का उपयोग करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिवात guanidium आइसोथियोसायनेट युक्त अभिवास् ता का उपयोग कर कुल आरएनए निकालने के लिए।
  2. मैन्युअल रूप से ग्वानिडियम आइसोथियोसायनेट रिएजेंट के 1 मिलीलन में प्रत्येक संरचना से कुल 100 मिलीग्राम ऊतक को अधिकतम गति पर 15 एस के लिए माइक्रोट्यूब के अंदर एक छोटे मूसल के साथ एक Dounce समरूप का उपयोग करके भंवर द्वारा समरूपता।
  3. 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोल जोड़ें। नमूनों को 15 एस के लिए सख्ती से मिलाएं, 2 से 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
  4. जलीय चरण को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें और आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 500 माइक्रोन जोड़ें। नमूनों को 21 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें। पाइपिंग द्वारा जलीय अलौकिक को एस्पिरेट करें। इक्का-दुक्का आरएनए ट्यूब में पैलेट के रूप में मौजूद रहेंगे।
  6. इसके बाद, आरएनए गोली को पाइपिंग करके 75% इथेनॉल के 1 एमसीएल से धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
  7. सुपरनैंट और हवा-कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) पर आरएनए गोली को सूखा दें। इसके बाद, 50 माइक्रोन में पेलेट को नाभिक मुक्त पानी में पतला करें।
  8. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का निर्धारण करें। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर करें।
  9. DNase I. पिछले चरण में निकाले गए आरएनए के 1 माइक्रोन प्रति DNase I के 2 यू जोड़ें। इसके बाद, 10x रिएक्शन बफर के 5 माइक्रोन जोड़ें और फिर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण में ईडीटीए के 1 माइक्रोल जोड़कर DNase I को निष्क्रिय करें और इसके बाद 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेशन।

5. सीडीएनए संश्लेषण और पीसीआर

  1. ओलिगो डीटी और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग करके पहली-स्ट्रैंड सीडीएनए का संश्लेषण करें। आरएनए के हर 1 माइक्रोग्राम के लिए, ओलिगो डीटी (500 माइक्रोग्राम/एमएल), 10 एमएन डीएनटीपी मिश्रण के 1 माइक्रोन, और नाभिक मुक्त आसुत पानी को 12 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में जोड़ें। मिश्रण को 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. प्रतिक्रिया मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। 1,050 x ग्रामपर 30 एस के लिए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, और फिर 4 माइक्रोन रिएक्शन बफर, 2 माइक्रोन 0.1 एम डीटीटी, और 1 माइक्रोल रिबन्यूलिट अवरोधक (40 यू/माइक्रोन) जोड़ें।
  3. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें, और फिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 यू) के 1 माइक्रोल जोड़ें। इसके बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें।
  4. उपयोग करने से पहले सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: संश्लेषित सीडीएनए की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए, विट्रो में संश्लेषण करने से पहले राबवी एन जीन के 761 बीपी टुकड़े का प्रवर्धन करें। लोज़ा-रुबियो एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करें।11 के रूप में नीचे चरण 5.5 में वर्णित है।
  5. निम्नलिखित शर्तों के तहत Taq डीएनए बहुलक का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करें। इस प्रकार की स्थापना की प्रतिक्रिया प्रदर्शन: 10x Taq बफर जिसमें 20 mM MgCl2,0.2 m m dNTPs, 1 यू ताक़ पॉलीमरेज, प्रत्येक प्राइमर के 10 माइक्रोन (SuEli+: 5' cgtrgaycaatgataca 3'और Sueli-: 5 'caggctcraaccttctta 3′), सीडीएनए के 2.5 माइक्रोन, और अल्ट्रापुर पानी 50 μL की अंतिम मात्रा के लिए।
  6. निम्नलिखित साइकिल चालन स्थितियों का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर में प्रवर्धन करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का एक चक्र।
  7. 1% एगर उठे जेल का उपयोग करके 761 बीपी पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति का आकलन करें।

6. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन

नोट: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन एक लक्ष्य जीन के एमआरएनए उत्पन्न करता है। एक प्राइमर जोड़ी का उपयोग करें जो पूर्ण राबवी एन जीन को बढ़ाता है और एक जिसका उपयोग क्यूआरटी-पीसीआर परख के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। इन प्राइमर को पूर्ण आरएबीवी एन जीन को बढ़ाना और एक प्रमोटर जोड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो T7 पॉलीमरेज (TAATACGACTCACTATAG) को पहचानता है।

  1. पूरे एन जीन आरएबीवी को बढ़ाने के लिए, प्राइमर ट्रांस-एनआरएबी फॉरवर्ड (5 गैटगगेटपैकेक्टेटगॉट 3) और रिवर्स (5 caataatacgactactccatgatggatgatgagatt 3) और एक उच्च-निष्ठा पीसीआर किट का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक साफ पीसीआर ट्यूब रिएक्शन बफर 10x, 2 mm DMSO, 25 mM MgCl2,10 mm DNTPs, प्रत्येक प्राइमर के 10 माइक्रोन, उच्च निष्ठा बहुलक के ०.५ यू, सीडीएनए के १.५ माइक्रोन μL (कदम 5 में तैयार) और अल्ट्रापुरे पानी के लिए एक अंतिम मात्रा में जोड़ने के द्वारा एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार
    2. प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित शर्तों के लिए एक थर्मोसाइकिलर सेट का उपयोग करें: 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 4 चक्र, 1 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का अंतिम विस्तार।
  2. इन विट्रो संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पीसीआर उत्पाद का उपयोग करने के लिए और चरण 6.1.2 से एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के घटकों को हटाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित सांद्रता किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, और फिर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
  3. आरएनए संश्लेषण के लिए, निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करें: 5 μL T7 ट्रांसक्रिप्शन 5x बफर, प्रत्येक ट्रिप्होस्फेट न्यूक्लियोटाइड का 1.9 माइक्रोन, शुद्ध राबवी एन डीएनए वीपी 2 डीएनए का 10 माइक्रोन, और एंजाइम मिश्रण का 2.5 माइक्रोन। इसके बाद, 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। फिर, डीएनए संदूषण को खत्म करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में 1 यू/μg RNase-मुक्त DNase के 1 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. इन विट्रो लिखित आरएनए को शुद्ध करें और फिर इसे फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोअमिल अल्कोहल (25:24:1) का उपयोग करके केंद्रित करें।
  5. शुद्ध आरएनए गोली को ते बफर के 70 माइक्रोल में फिर से खर्च करें, और फिर उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. पीसीआर उत्पाद के लगभग 5 माइक्रोग्राम प्राप्त होने तक पीसीआर प्रोटोकॉल को चरण 6.1 से दोहराएं। शुद्धि और एकाग्रता के बाद, इन विट्रो लिखित एन जीन एमआरएनए 4.711 माइक्रोग्राम/माइक्रोन की एकाग्रता पर मौजूद होगा।
  7. पुष्टि करें कि इन विट्रो लिखित एमआरएनए इस प्रोटोकॉल के चरण 5 के बाद एन जीन से मेल खाता है और इसे वास्तविक समय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करता है।

7. रियल टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)

  1. क्यूआरटी-पीसीआर के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार संकरण जांच का उपयोग करके एक वाणिज्यिक एक-कदम क्यूआरटी-पीसीआर किट के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पूर्ण एन जीन को एन्कोडिंग करने वाले इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट का उपयोग करें। कार्नेरो एट अल (2010)23 द्वारा वर्णित जांच और प्राइमर का उपयोग करें ताकि राबवी जीन एन (BRDesrot-Rev: 5' aaactcaagaaga4acca 3′, के एक संरक्षित क्षेत्र का पता लगाया जा सके। BRDesrot-Fwd: 5 'cgtactgatgg 3', और BRDesrot-प्रोब: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ) ।
  2. निम्नलिखित थर्मल साइकिलिंग स्थितियों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस का 1 चक्र और 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 30 एस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस।

8. अंशांकन वक्र या मानक वक्र

  1. छह डिकुपल कमजोर पड़ने तक ट्यूबों में एमआरएनए के 1 μg/μL को क्रमिक रूप से पाइपिंग करके इन विट्रो लिखित एमआरएनए के धारावाहिक कमजोरीकरण का प्रदर्शन करें। मानक वक्र बनाने में उपयोग के लिए ट्रिपलिटेट में 100 माइक्रोन वॉल्यूम पर ट्यूब तैयार करें। कदम 7 में वर्णित क्यूआरटी-पीसीआर करें।
  2. मानक वक्र बनाने और सेल संस्कृति से अलग सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, और सुपरनेटेंट का उपयोग करने के लिए चल रही प्रतिक्रियाओं के साथ एक साथ विभिन्न मस्तिष्क नमूनों को संसाधित करके एक रोटर के साथ एक थर्मोसाइकिलर में क्यूआरटी-पीसीआर करें।
  3. परीक्षण की पहचान, परीक्षण प्रभावकारिता और संवेदनशीलता की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, एक ही शर्तों के तहत ट्रिपलीकेट में एक मानक वक्र का उपयोग करें।

9. जैविक नमूनों की क्यूआरटी-पीसीआर

  1. आरएबीवी जीन एन का पता लगाने के लिए, चरण 7 में वर्णित पीसीआर किट का उपयोग करके क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करने के लिए फील्ड नमूनों, सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और सेल कल्चर सुपरनेटेंट से आरएनए का उपयोग करें।
  2. गोजातीय मस्तिष्क के नमूनों में मौजूद राबवी जीनोम की प्रतियों की संख्या निर्धारित करने के लिए, मानक वक्र और जैविक नमूनों से सीटी डेटा प्राप्त करने और अंशांकन वक्र समीकरण से interpolated उन लोगों से ।

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Representative Results

डीएफए के परिणामों ने क्रमशः कॉर्टेक्स, थैलेसीमिया, मेडुला, पोन और हॉर्न में राबवी के लिए 100%, 100%, 83.3%, 66%, और 50% सकारात्मकता दिखाई। इन परिणामों ने पिछले परिणामों की पुष्टि की, और प्रत्येक मस्तिष्क से विच्छेदित संरचनाओं में से कम से कम तीन आरएबीवी के लिए सकारात्मक थे। एक प्रतिनिधि सकारात्मक डीएएफ धुंधला चित्र 1में दिखाया गया है ।

चित्रा 2 राबवी एन जीन (चरण 5.5) के एक टुकड़े के प्रवर्धन को दिखाता है, जिसमें प्राइमर पहले लोज़ा-रुबियो एट अल11द्वारा सूचित किए गए थे। इससे पता चला कि प्रवर्धन में इस्तेमाल की जाने वाली सामग्री अच्छी गुणवत्ता की थी ।

पीसीआर-प्रवर्धित टुकड़े का आकार चित्र 3में दिखाया गया है। मानक वक्र का समीकरण एक नमूने में राबवा आनुवंशिक सामग्री की मात्रा और पीसीआर-प्रवर्धित टुकड़े के आकार के बीच संबंध दिखाता है। आरएबीवी आनुवंशिक सामग्री (एनजी में) की मात्रा को चित्र 4में प्रस्तुत समीकरण का उपयोग करके अंशांकन वक्र में सीटी मूल्यों के इंटरपोलेशन द्वारा कम किया गया था। इस समीकरण का उपयोग करते हुए, वायरल आरएनए की 1 x10 5 μg/μL की पहचान सीमा राबवि जीनोम की 36 प्रतियों के अनुरूप पाई गई। इन परिणामों से पता चलता है कि परख संवेदनशील है और नमूनों में वायरस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रतियां RABV एन जीन की एक कम संख्या में होते हैं । परख की दक्षता मानक वक्र की ढलान का उपयोग करके गणना की गई थी, जो -3.28 थी। क्यूआरटी-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किए गए नमूनों में राबाउ एन जीन का प्रवर्धन दिखाया गया ।

वर्तमान वायरल कॉपी की संख्या निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए सीटी मानों अंशांकन वक्र समीकरण का उपयोग करके इंटरपोलेटेड किया गया था। प्राप्त परिणाम (नैनोग्राम में) को निम्नलिखित रेफरी से नीचे वर्णित सूत्र में प्रतिस्थापित किया गयाथा।

प्रतियों की संख्या RABV एन जीन = (एनजी नमूना * 6.022 x 1023)/ (104 बीपी (पीसीआर उत्पाद की लंबाई) * 1 x 109 * 650) ।

तुलनात्मक रूप से, क्यूआरटी-पीसीआर कीख के परिणाम डीएफए का उपयोग करके प्राप्त लोगों के अनुरूप थे। मामलों सी और डी(टेबल 1)में क्यूआरटी-पीसीआर परीक्षण में प्राप्त परिणामों के अनुसार, थैलेसीमिया वह संरचना है जिसमें राबवी एन जीन की प्रतियां सबसे अधिक हैं । इससे पता चलता है कि हाइपोथैलेमिक और थैलेसीमिक न्यूरॉन्स का प्रारंभिक संक्रमण रोग के विकास में महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि ये न्यूरॉन्स किसी जानवर के वनस्पति कार्यों को नियंत्रित करते हैं। प्रत्येक नमूने की प्रत्येक संरचना में पाए गए आरएबीवी एन जीन की प्रतिलिपि संख्या तालिका 1में दिखाई गई है । क्यूआरटी-पीसीआर टेस्ट की संवेदनशीलता और विशिष्टता दोनों 100% थी, क्योंकि सभी नमूने सकारात्मक थे। यह परिणाम नमूनों के प्रारंभिक निदान के अनुरूप है।

Figure 1
चित्रा 1: गोजातीय मस्तिष्क के ऊतकों को संक्रमित ऊतकों में रेबीज वायरस प्रोटीन एन का पता लगाने वाले प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षण के अनुसार सकारात्मक धुंधला दिखा। धुंधला होने पर एक सेब का हरा रंग मनाया जाता है, जहां एंटीबॉडी रेबीज एंटीजन से बांधता है। स्केल बार: 50 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 1.5% एगर उठे जेल प्रवर्धन उत्पादों को दिखाते हैं। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में उपयोग की जाने वाली सीडीएनए की उपस्थिति और गुणवत्ता को प्रदर्शित करने के लिए राबवी एन जीन के 761 बीपी टुकड़े का प्रवर्धन। लेन 1 में एक आणविक वजन मार्कर, लाइन 2 शामिल है: सकारात्मक नियंत्रण का प्रवर्धन; लेन 3: नकारात्मक नियंत्रण (गैर संक्रमित नमूना); लाइन 4: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले सीडीएनए का प्रवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 1.5% एगर उठे जेल प्रवर्धन उत्पादों को दिखा रहा है। पूर्ण एन जीन का प्रवर्धन लेन 2 में दिखाया गया है। लेन 1 में एक आणविक वजन मार्कर होता है, और लेन 3 में नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आरएबीवी एन जीन की प्रतियों की संख्या निर्धारित करने के लिए इन विट्रो लिखित एन जीन एमआरएनए का उपयोग करके क्यूआरटी-पीसीआर का मानक वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आईडी मस्तिष्क सुव्‍यवस्थित करना डीएएफ संख्या प्रतियां (x109)
एक अमोन का सींग + 0.261
अनुमस्तिष्क + 0.0663
झिल्‍ली + 0.02
मेडुला। + 0.146
पोन्स + 30.7
थैलेसीमिया + 108
जन्‍म अमोन का सींग - 0.0251
अनुमस्तिष्क + 4.64
झिल्‍ली + 12.4
मेडुला। + 0.175
पोन्स \u2012 0.0721
थैलेसीमिया + 121
के आसपास अमोन का सींग \u2012 0.168
अनुमस्तिष्क + 0.0239
झिल्‍ली + 21.5
मेडुला। + 17.2
पोन्स + 1.32
थैलेसीमिया + 102
डी अमोन का सींग + 11.8
अनुमस्तिष्क + 0.0239
झिल्‍ली + 8.72
मेडुला। + 1.25
पोन्स \u2012 0.0165
थैलेसीमिया + 33.4
ई अमोन का सींग + 4.15
अनुमस्तिष्क + 6.78
झिल्‍ली + 1.53
मेडुला। + 1.41
पोन्स + 0.025
थैलेसीमिया + 95
स्‍त्री-विषयक अमोन का सींग + 0.0221
अनुमस्तिष्क \u2012 0.00023
झिल्‍ली + 4.95
मेडुला। \u2012 0.000556
पोन्स + 1.02
थैलेसीमिया + 89

तालिका 1: प्रत्येक मस्तिष्क संरचना के भीतर RABV एन जीन की प्रतियों की संख्या का निर्धारण । परिणाम DFA का उपयोग कर निदान RABV-सकारात्मक गोजातीय दिमाग के छह शारीरिक संरचनाओं से प्राप्त किए गए थे । बोल्ड में हाइलाइट किए गए शब्द सबसे अधिक प्रतियों के साथ संरचनाओं को इंगित करते हैं। परिणाम ऊतक के मिलीग्राम प्रति एन जीन की प्रतियों की संख्या के रूप में व्यक्त किए गए थे ।

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Discussion

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डीएफए केवल नमूना कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस)14पर संग्रहीत होने के सात दिनों के भीतर आरएबीवी का पता लगा सकता है । इसके विपरीत, इस काम से पता चला कि 12 दिनों के लिए कमरे के तापमान के संपर्क में आने के बाद आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता कम होने लगती है । इसलिए, आरएबीवी जीनोम का पता क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा 23 दिनों तक कमरे के तापमान के संपर्क में आने वाले नमूनों में लगाया जा सकता है। यह दर्शाता है कि क्यूआरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता अधिक अत्यधिक विघटित नमूनों के लिए अपेक्षाकृत अधिक है। हालांकि, सरल तरीकों को विकसित करना आवश्यक है जो विशिष्टता से समझौता नहीं करते हैं25। वर्तमान शोध में एक आणविक परख का प्रदर्शन किया गया जो डीएफए की तुलना में उच्च संवेदनशीलता के पास है, अवलोकन के आधार पर कि यह विशिष्ट मस्तिष्क संरचना की परवाह किए बिना वायरल जीनोम का पता लगाने में सक्षम था।

संक्रामक एजेंटों का पता लगाने में उपयोग के लिए आरटी-पीसीआर तकनीक के फायदे कई वैज्ञानिक अध्ययनों में उजागर किए गए हैं । हालांकि, यह तकनीक कुछ नुकसान प्रदर्शित कर सकती है, जैसे निष्पादन की लागत, क्योंकि इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रशिक्षित कर्मियों को आणविक जीव विज्ञान परख को संभालने की आवश्यकता होती है । इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक के रूप में, कुछ कदम सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इनमें से एक आरएनए निष्कर्षण के लिए नमूनों की उचित हैंडलिंग है। यह कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि आरएनए आसानी से अपमानित होता है, और इसलिए परिणाम प्रभावित हो सकते हैं । प्रक्रिया के दौरान ठंड की स्थिति (लगभग 4 डिग्री सेल्सियस) में नमूने को बनाए रखने पर विचार करें। इसके अलावा, विचार करें कि पीसीआर एप्लिकेशन के कई दौर किए जाते हैं जैसा कि विट्रो में ट्रांसक्रिप्ट उत्पन्न करने के लिए चरण 6.1 में उल्लेख किया गया है। इसका कारण यह है कि डीएनए की पर्याप्त (मिलीग्राम से अधिक) मात्रा प्राप्त करने की प्रतिक्रिया के लिए बड़ी मात्रा में आनुवंशिक सामग्री आवश्यक है। इस परख का एक और महत्वपूर्ण पहलू स्तंभों में आनुवंशिक सामग्री के शुद्धिकरण के लिए आवश्यकता है, क्योंकि इस चरण के दौरान डीएनए भी खो सकता है।

क्यूआरटी-पीसीआर को डीएफए परीक्षण के रूप में विशिष्ट माना जाता है, जो डब्ल्यूएचओ और ओआईई द्वारा अनुमोदित मानक परीक्षण है। हालांकि, आर टी-क्यूपीसीआर को नियोजित करने वाले आणविक परख को उच्च संवेदनशीलता के लिए दिखाया गया है और इस प्रकार वायरल जीनोम की प्रतियों की अपेक्षाकृत कम संख्या का पता लगाने की सुविधा के लिए उच्च स्तर के अपघटन वाले नमूनों के विश्लेषण की अनुमति दी गई है । यह भी बहुत तेज है, संदूषण के जोखिम को कम करता है, और पूर्व पोस्टमार्टम26, 27का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

बिंघम और वैन डेर मर्वे (2002)28 ने डीएफए का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए एक अध्ययन किया कि कौन से मस्तिष्क संरचनाओं में राबवी एन जीन की उच्च सांद्रता थी। कई प्रजातियों से कुल २५२ मस्तिष्क संरचनाओं का मूल्यांकन किया गया । थैलेसीमिया, पोन और मेडुला सबसे प्रासंगिक मस्तिष्क संरचनाएं थीं, क्योंकि वे सभी मूल्यांकन मस्तिष्क नमूनों में सकारात्मक थे। ये परिणाम यहां प्रस्तुत परिणामों से सहमत हैं, जो निम्नलिखित संरचनाओं में डीएफए परिणामों के अनुरूप थे: कॉर्टेक्स और थैलेसीमिया, 100%; मेडुला, 83.3%; पोन्स, 66%; और सींग, 50%। इसके विपरीत, पिछले अध्ययनों में कोई झूठी नकारात्मक रिपोर्ट नहीं । इस काम में, पूर्ण मस्तिष्क संरचनाओं में कुछ नकारात्मक परिणाम पाए गए थे जिन्हें पहले सकारात्मक के रूप में निदान किया गया था। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि परीक्षण के लिए इस्तेमाल किए गए नमूने के हिस्से में एंटीबॉडी या अधिक संवेदनशील आणविक परख द्वारा पहचाने गए वायरल कण नहीं थे। एक और संभव स्पष्टीकरण यह है कि नमूनों को प्रयोगशाला में स्वागत से पहले ठीक से ले जाया या संग्रहीत नहीं किया गया था।

इस अध्ययन में किए गए क्यूआरटी-पीसीआर परख से प्रति मिलीग्राम ऊतक के आरएबीवी एन जीन की ३६.३ प्रतियां का पता लगाया जा सकता है । क्यूआरटी-पीसीआर के लिए सबसे उपयुक्त मस्तिष्क संरचनाओं में कॉर्टेक्स और थैलेसीमिया शामिल थे। यह उन टिप्पणियों पर आधारित है कि इन संरचनाओं में राबवी एन जीन की उच्च सांद्रता का पता लगाया गया था और उन्हें आरएबीवी संदर्भ परीक्षण का उपयोग करके सकारात्मक भी पाया गया था । परीक्षण विभिन्न नमूनों में वायरस की बहुत कम सांद्रता (0.00023 x 109 प्रतियां) का पता लगाने में सक्षम था। नमूने में वायरल कणों की मात्रा निर्धारित करने के अलावा, परीक्षण RABV का पता लगाने के लिए एक अच्छा वैकल्पिक नैदानिक और अनुसंधान उपकरण प्रदान करने के लिए प्रकट होता है ।

रेबीज वायरस वायरल जीनोम डिटेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के साथ यहां प्रस्तुत, यह प्रत्याशित है कि इस तकनीक के नमूनों के विभिंन प्रकार में वायरस के आणविक निदान के लिए लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह वायरल जीनोम की ंयूनतम मात्रा का पता लगाने में सक्षम है । डीएफए जैसे अन्य तरीकों पर इसका सबसे बड़ा लाभ यह है कि यह अधिक संवेदनशील है और पूर्व-पोस्टमार्टमका उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि अन्य लेखकों द्वारा सुझाया गया है।

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Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय कृषि, वानिकी संस्थान और पशुधन अनुसंधान संस्थान (INIFAP) द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस दस्तावेज़ से जुड़े वीडियो के विकास में उनके सहयोग के लिए जेरज़ाइन फ्रास्ट्रो एस्क्विवेल को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

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Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

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