Summary
Questo protocollo presenta un approccio basato su qRT-PCR per determinare il numero di copia genica della nucleoproteina del virus della rabbia (N) all'interno di varie strutture anatomiche cerebrali bovine utilizzando la trascrizione in vitro.
Abstract
La rabbia paralitica bovina (BPR) è una forma di encefalite virale di notevole importanza economica in tutta l'America Latina, dove presenta un grave rischio zoonotico. Qui, il nostro obiettivo era quello di utilizzare un protocollo di laboratorio per determinare il numero relativo di copie del genoma del virus della rabbia (RABV) in diverse strutture anatomiche del cervello bovino utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica il numero specifico di copie geniche presenti in un campione basato sulla fluorescenza emessa dopo l'amplificazione che è direttamente proporzionale alla quantità di acido nucleico bersaglio presente nel campione. Questo metodo è vantaggioso per la sua breve durata, il ridotto rischio di contaminazione e il potenziale di rilevare gli acidi nucleici virali in campioni diversi più facilmente rispetto ad altre tecniche. Il cervello di sei animali rabbiosi era diviso in sei strutture anatomiche, vale a dire il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, il pons e il talamo. Tutti i cervelli sono stati identificati come positivi per gli antigeni RABV sulla base di un test di immunofluorescenza diretta. Sono state valutate anche le stesse strutture anatomiche provenienti dal cervello di quattro bovini rabv-negativi. L'RNA è stato estratto da ogni struttura e utilizzato per qRT-PCR. È stato eseguito un test per determinare il numero di copie dei geni RABV utilizzando un gene nucleoproteina trascritto in vitro. La curva standard utilizzata per quantificare l'RNA virale presentava un'efficienza del 100% e una linearità dello 0,99. L'analisi ha rivelato che la corteccia, il midollo e il talamo erano le porzioni ideali del SNC da utilizzare nel rilevamento RABV, in base all'osservazione che queste strutture possedevano i più alti livelli di RABV. La specificità del test era del 100%. Tutti i campioni erano positivi, non sono stati rilevati falsi positivi. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare rabv in campioni che contengono bassi livelli di RABV durante la diagnosi di BPR.
Introduction
La rabbia può essere confermata ante mortem e post mortem con varie tecniche che consentono il rilevamento di acidi nucleici virali nel cervello, nella pelle, nelle urine o nella saliva1. L'individuazione del gene della nucleoproteina del virus della rabbia(N)viene utilizzata principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Questo gene è anche usato per il genotipizzazione virale. La rabbia può essere diagnosticata negli animali utilizzando qualsiasi porzione del cervello interessato; tuttavia, per escludere la possibilità di rabbia, i tessuti provenienti da almeno due regioni del cervello devono essere testati2. Esistono diversi metodi diagnostici per l'individuazione della rabbia negli animali; tuttavia, il test di immunofluorescenza diretta rimane la tecnica di riferimento standard3. Altri test includono test biologici che incorporano l'inoculazione del topo, l'infezione nella coltura tissutale e la reazione a catena della polimerasi (PCR)4. Tutte queste tecniche sono raccomandate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e dall'Organizzazione Mondiale della Sanità Animale (OIE) per la diagnosi di rabbia nell'uomo e negli animali,rispettivamente 5.
Le tecniche di rilevazione e amplificazione degli acidi nucleici hanno rivoluzionato la diagnosi di rabbia negliultimi anni 6 e queste tecniche svolgono un ruolo importante nella diagnosi ante mortem della rabbia umana. Diversi test basati su PCR sono stati valutati per integrare i test convenzionali per diagnosi di rabbia ante mortem e post mortem 7,8,9,10. La maggior parte dei saggi ha come obiettivo il gene della nucleoproteina virale della rabbia per l'amplificazione, che è la regione più conservata nel genomavirale 1,11. Negli ultimi 20 anni, vari saggi molecolari sono stati sviluppati per diagnosticare rabv, e alcuni di questi test sono stati utilizzati per la caratterizzazione del virus. La maggior parte degli studi ha mirato a rilevare geni conservati all'interno del genoma virale, più comunemente utilizzando test convenzionali o quantitativi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)12,13.
La PCR è una tecnica diagnostica altamente sensibile in grado di rilevare il genoma di un dato agente patogeno all'interno dei tessuti, anche quando questi tessuti sono decomposti. Utilizzando approcci basati su PCR, quantità minime di un agente infettivo possono essere rilevate in un campione clinico attraverso l'amplificazione selettiva e ripetitiva di una sequenza nucleotidica del DNA14. qRT-PCR che incorpora sonde fluorescenti (ad esempio, TaqMan) o coloranti leganti il DNA (ad esempio, SYBR Green) è stato utilizzato in studi per diagnosticare RABV sia ante- che post- mortem ad alta sensibilità; tuttavia, tale approccio richiede attrezzature specializzate. Per superare questa limitazione, è stata suggerita l'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP), basata sul suo basso costo, semplicità e caratteristiche desiderabili per il rilevamento di RABV. Questo saggio è particolarmente importante in quanto può essere utilizzato nei paesi in via disviluppo 15.
qRT-PCR si basa sul rilevamento e la quantificazione di una molecola, dove gli aumenti del segnale fluorescente sono in proporzione diretta alla quantità di prodotto PCR in una singola reazione. Con l'aumentare del numero di copie del bersaglio dell'acido nucleico, aumenta anche la fluorescenza. Coloranti intercalanti non specifici come il colorante SYBR Green per legare il DNA o sonde oligonucleotidi specifiche della sequenza che trasportano un fluoroforo e un quencher sono comunemente usati per fornire la lettura fluorescente in qRT-PCR. Questo test offre vantaggi rispetto all'RT-PCR convenzionale che include un tempo di test più breve (2-4 ore), un rischio ridotto di contaminazione a causa del sistema a tubo chiuso (mancanza di manipolazione post-PCR di prodotti amplificati) e la capacità di rilevare diversi obiettivicontemporaneamente 16. qRT-PCR può essere utilizzato per diagnosticare la rabbia ante mortem dalla saliva e da altri campioni. Questo saggio può anche essere utilizzato come test universale in tempo reale per il rilevamento di diverse specie di Lyssavirus o lignaggi di RABV15. In questo approccio combo RT-PCR, vengono utilizzate due reazioni. Il primo rileva diversi linaggi genetici della RABV, e il secondo rileva le specie di Lyssavirus. Entrambi i passaggi coinvolgono test qRT-PCR, in cui il primo utilizza sonde di ibridazione e il secondo utilizza coloranti15. A causa del gran numero di test che hanno dimostrato il successo del rilevamento molecolare del RABV utilizzando questa tecnica, l'attuale manuale terrestre OIE (2018) raccomanda l'uso della PCR per il rilevamento molecolare di RABV17.
Il Messico è un paese con un notevole potenziale zootecnico. Gli stati con la più alta produzione di bestiame contengono sia regioni tropicali umide che regioni secche che sono a rischio di epidemie di rabbia a causa della presenza del pipistrello vampiro Desmodus rotundus, il principale trasmettitore della rabbia. Pertanto, è essenziale sviluppare più strumenti per la prevenzione e il controllo della rabbia paralitica bovina (BPR) in Messico. Sulla base di ciò, lo scopo di questo studio era quello di utilizzare qRT-PCR quantitativo per determinare il numero di particelle virali in diverse strutture anatomiche del cervello bovino dopo la morte a causa di un'infezione da rabbia.
Sei cervelli ottenuti da bovini positivi alla RABV sono stati donati da un laboratorio esterno per l'uso nello sviluppo del protocollo qRT-PCR descritto di seguito. I campioni della struttura cerebrale bovina sono stati trasportati a catena fredda presso l'impianto INIFAP CENID-MA laboratorio BSL-2 e conservati a -80 °C fino all'uso. I cervelli erano ottenuti da animali provenienti dagli stati di Campeche, Yucatán e Querétaro. Prima della ricezione, varie strutture venivano sezionate dal cervello. Queste strutture includevano il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, i pons e il talamo18,19. Il materiale genetico è stato estratto come descritto di seguito. La diagnosi di RABV è stata confermata utilizzando anticorpi fluorescenti diretti (DFA)20. Come controllo positivo, sono stati utilizzati cervelli di topo inoculati con RABV21. Inoltre, quattro cervelli bovini negativi alla RABV (come determinato dal DFA) sono stati utilizzati come controlli negativi.
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Protocol
Questo studio è stato approvato e condotto in stretta conformità con le raccomandazioni per l'uso di animali fornite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Campioni
- Utilizzare diverse aree del cervello sezionate da 6 diversi cervelli bovini positivi alla rabbia per l'analisi RT-PCR.
2. Anticorpi fluorescenti diretti (DLA) per confermare la rabbia
NOTA: Il rilevamento dell'antigene della rabbia da parte del DFA è un metodo qualitativo per determinare la presenza della nucleoproteina della rabbia utilizzando anticorpi etichettati con fluoresceina. Il test è stato eseguito utilizzando il protocollo fornito daDean et al.
- Fai due impressioni da ogni tessuto sezionato da diverse strutture cerebrali su uno scivolo sterile di circa 15 mm di diametro. Utilizzare un applicatore di legno per spalmare una porzione di circa 3 mm3 del tessuto sullo scivolo sterile. Per creare lo striscio, premere delicatamente l'applicatore di legno contro lo scivolo manualmente.
- Fissare le diapositive di striscio campione sommergindo le diapositive in acetone al 100% per 1 h a -20 °C. Dopo l'incubazione, asciugare gli scivoli su un panno asciutto a 21 °C per 30 minuti.
- Aggiungere 50 μL dell'anticorpo anti-nucleoproteina etichettato con fluoresceina a ogni striscio cerebrale con una diluizione 1:10 erogando attraverso una siringa.
- Incubare gli scivoli con il coniugato in una camera umida a 37 °C per 1 h.
- Dopo l'incubazione, lavare gli scivoli due volte con acqua e con PBS per eliminare l'eccesso coniugato. Lasciare asciugare i vetrini a 21 °C. Pulire con cura per rimuovere il liquido in eccesso e quindi asciugare brevemente all'aria prima del montaggio.
- Aggiungere una goccia di glicerina fosfato al 50% per coprire la superficie della sezione, quindi coprire con un copripasci. Osservare le sezioni al microscopio a epifluorescenza con ingrandimento 40x.
- Elaborare e osservare i controlli positivi e negativi (controllo positivo: cervelli di topo inoculati con RABV; controlli negativi: cervello bovino rabv-negativo) allo stesso modo dei campioni.
3. Generazione di un controllo positivo per RT-PCR
- Ottenere cellule BHK-21 dalla banca del germoplasma. Utilizzare cellule fino al70° passaggio per replicare il ceppo RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) utilizzando il passaggio 2.
- Mantenere e propagare le cellule BHK-21 in bottiglie contenenti mezzo essenziale minimo (MEM) integrato con siero fetale al polpaccio al 10% (FCS) a 37 °C in presenza di CO2 (5%) e in condizioni umide. Far crescere le cellule in contenitori di coltura25 cm 2 fino a raggiungere l'80% di confluenza e quindi sottocultura.
- Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule e lavare la bottiglia con soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS). Inoculare la coltura con 105 TCID/mL di ceppo RABV ERA. Incubare l'inoculo virale per 2 ore sotto costante scuotimento a 37 °C in presenza di CO2 (5%) e in condizioni umide.
- Rimuovere il mezzo di infezione e aggiungere mem integrato con 5% (siero fetale bovino) SFB. Incubare per 72 ore a 37 °C in presenza di CO2 (5%) in condizioni di umidità.
- Raccogliere RABV 3 giorni dopo l'inoculazione quando le cellule mostrano effetti citopatici. Congelare le cellule infette e poi scongelarle a 4 °C per liscire le cellule. Raccogliere il mezzo dalla bottiglia, quindi posizionare le cellule in un tubo di centrifugazione per la centrifugazione a 1.050 x g per 10 min a 4 °C.
- Conservare i supernatanti di RABV a -80 °C e preparare le aliquote di lavoro per lo stoccaggio a -70 °C.
- Intracerebrally inoculare il virus ottenuto nella fase precedente in topi CD1 femmina di 21 giorni. Utilizzare una siringa da 1 ml per inoculare 50 μL di soluzioni contenenti 106 MICLD50 (dose letale di coltura infettiva del topo 50%) dosi neitopi 22.
4. Estrazione dell'RNA
NOTA: L'RNA totale è stato estratto direttamente dal cervello dei bovini utilizzando un metodo di estrazione organico secondo il seguente protocollo.
- Utilizzare 100 mg di tessuto cerebrale da ogni struttura anatomica per estrarre l'RNA totale utilizzando un reagente disponibile in commercio contenente isotiocianato di guanidio.
- Omogeneizzare manualmente un totale di 100 mg di tessuto da ogni struttura in 1 mL del reagente isotiocianato di guanidio con vortice utilizzando un omogeneizzatore Dounce con un piccolo pestello all'interno del microtubo per 15 s alla massima velocità.
- Incubare i campioni sul ghiaccio per 5 minuti, quindi aggiungere 200 μL di cloroformio. Mescolare vigorosamente i campioni per 15 s, incubare sul ghiaccio per 2-3 minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Trasferire la fase acquosa in un tubo pulito e aggiungere 500 μL di alcol isopropile. Incubare i campioni per 15 minuti a 21 °C.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante acquoso pipettando. L'RNA isolato sarà presente come pellet nel tubo.
- Successivamente, lavare il pellet di RNA con 1 mL di 75% di etanolo mediante pipettazione e centrifugare a 7500 x g per 5 min a 4 °C.
- Decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet di RNA a temperatura ambiente (21 °C). Successivamente, diluire il pellet in 50 μL di acqua priva di nucleasi.
- Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Conservare l'RNA a -80 °C fino all'uso.
- Rimuovere il DNA dai campioni di RNA mediante digestione con la DNasi I. Aggiungere 2 U di DNasi I per 1 μg di RNA estratto nella fase precedente. Quindi, aggiungere 5 μL di tampone di reazione 10x e quindi incubare a 37 °C per 30 min. Inattivare la DNasi I aggiungendo 1 μL di EDTA alla miscela seguita da incubazione per 10 min a 65 °C.
5. sintesi cDNA e PCR
- Sintetizzare cDNA primo filamento usando oligo dT e transcriptasi inversa. Per ogni 1 μg di RNA, aggiungere 1 μL di oligo DT (500 μg/mL), 1 μL di miscela dNTP da 10 mM e acqua distillata priva di nucleasi ad un volume finale di 12 μL. Incubare la miscela a 65 °C per 5 min.
- Raffreddare la miscela di reazione a 4 °C. Centrifugare il tubo per 30 s a 1.050 x g, quindi aggiungere 4 μL di tampone di reazione, 2 μL 0,1 M DTT e 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U/μL).
- Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 minuti, quindi aggiungere 1 μL di transcriptasi inversa (200 U). Successivamente, incubare la miscela di reazione per 50 min a 37 °C, quindi inattivare la reazione a 70 °C per 15 minuti.
- Conservare il cDNA a -20 °C prima dell'uso.
NOTA: Per verificare la qualità del cDNA sintetizzato, eseguire l'amplificazione di un frammento da 761 bp del gene RABV N prima di eseguire la sintesi in vitro. Utilizzare il protocollo descritto da Loza-Rubio etal. - Eseguire la PCR utilizzando la DNA polimerasi Taq nelle seguenti condizioni. Eseguire la reazione impostata come segue: tampone Taq 10x contenente 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 1 U Taq polimerasi, 10 μM di ogni primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ e SuEli-: 5′ caggctcraacatttctta 3′), 2,5 μL di cDNA e acqua ultrapura ad un volume finale di 50 μL.
- Eseguire l'amplificazione in un termociclo utilizzando le seguenti condizioni di ciclo: 95 ° C per 3 minuti; 35 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 1 min; un ciclo di 72 °C per 7 min.
- Valutare la presenza dei prodotti PCR da 761 bp utilizzando un gel di agarosio all'1%.
6. Trascrizione in vitro
NOTA: La trascrizione in vitro genera mRNA di un gene bersaglio. Utilizzare una coppia di primer che amplifica il gene RABV N completo e uno che viene utilizzato come controllo positivo per il test qRT-PCR. Questi primer sono progettati per amplificare il gene RABV N completo e per aggiungere un promotore che riconosca la T7 polimerasi (TAATACGACTCACTATAG).
- Per amplificare l'intero gene N RABV, utilizzare i primer Trans-Nrab avanti (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) e inverso (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) e un kit PCR ad alta fedeltà.
- Per ogni reazione, preparare un mix master PCR aggiungendo a un tampone di reazione del tubo PCR pulito 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM di ogni primer, 0,5 U di polimerasi ad alta fedeltà, 1,5 μL di cDNA (preparato nella fase 5) e acqua ultrapura ad un volume finale di 50 μL.
- Utilizzare un termociclo impostato sulle seguenti condizioni per l'amplificazione: 94 °C per 1 min; 4 cicli di 94 °C per 1 min, 40 °C per 1 min e 72 °C per 2 min; 35 cicli di 94 °C per 1 min, 60 °C per 1 min e 72 °C per 2 min; estensione finale di 72 °C per 2 min.
- Per utilizzare il prodotto PCR come modello per la sintesi in vitro e rimuovere i componenti della reazione enzimatica dal passaggio 6.1.2, purificare il prodotto PCR utilizzando un kit concentratore a colonna secondo le istruzioni del produttore, quindi quantificare utilizzando uno spettrofotometro.
- Per la sintesi dell'RNA, utilizzare un kit di trascrizione in vitro con la seguente miscela di reazione: 5 μL T7 Trascrizione 5x buffer, 1,9 μL di ogni nucleotide trifosfato, 10 μg di DNA VP2 RABV N purificato e 2,5 μL della miscela enzimatica. Successivamente, incubare la miscela a 37 °C per 4 ore. Quindi, aggiungere 1 μL di 1 DNA privo di RNasi U/μg alla miscela di reazione e incubare per 15 min a 37 °C per eliminare la contaminazione da DNA.
- Purificare l'RNA trascritto in vitro e quindi concentrarlo usando fenolo:cloroformio:alcol isoammil (25:24:1).
- Resopendare il pellet di RNA purificato in 70 μL di TE buffer, quindi conservare a -80 °C fino all'uso.
- Ripetere il protocollo PCR dal passaggio 6.1 fino a ottenere circa 5 μg di prodotto PCR. Dopo la purificazione e la concentrazione, l'mRNA genico N trascritto in vitro sarà presente ad una concentrazione di 4,711 μg/μL.
- Verificare che l'mRNA trascritto in vitro corrisponda al gene N dopo il passaggio 5 di questo protocollo e utilizzarlo come controllo positivo per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale in tempo reale (qRT-PCR).
7. Reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR)
- Per qRT-PCR, utilizzare una trascrizione di mRNA in vitro che codifica per il gene N completo come controllo positivo insieme a un kit qRT-PCR commerciale in un passaggio utilizzando sonde di ibridazione secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare la sonda e i primer descritti da Carneiro et al. BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, e BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
- Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo termico: 1 ciclo di 50 °C per 10 min e 95 °C per 2 min; 40 cicli di 95 °C per 15 s e 50 °C per 30 s.
8. Curva di calibrazione o curva standard
- Eseguire diluizioni seriali dell'mRNA trascritto in vitro mediante pipettazione seriale di 1 μg/μL di mRNA in tubi fino a ottenere sei diluizioni di decuple. Preparare tubi con un volume di 100 μL in triplice copia per l'uso nella creazione della curva standard. Eseguire qRT-PCR come descritto nel passaggio 7.
- Eseguire qRT-PCR in un termociclo con rotore elaborando i vari campioni cerebrali contemporaneamente alle reazioni di corsa per creare la curva standard e utilizzando controlli positivi, controlli negativi e supernanti isolati dalla coltura cellulare.
- Per valutare il limite di rilevamento, efficacia del test e sensibilità del test, utilizzare una curva standard in triplice copia nelle stesse condizioni.
9. qRT-PCR di campioni biologici
- Per il rilevamento del gene RABV N, utilizzare l'RNA da campioni di campo, controlli positivi, controlli negativi e supernanti di coltura cellulare per eseguire qRT-PCR utilizzando il kit PCR descritto nel passaggio 7.
- Per determinare il numero di copie del genoma RABV presenti nei campioni cerebrali bovini, ottenere i dati Ct dalla curva standard e dai campioni biologici e da quelli interpolati dall'equazione della curva di taratura.
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Representative Results
I risultati del DFA hanno mostrato rispettivamente 100%, 100%, 83,3%, 66% e positività del 50% per rabv nella corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati hanno confermato i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. Una colorazione DAF positiva rappresentativa è mostrata nella figura 1.
La figura 2 mostra l'amplificazione di un frammento del gene RABV N (fase 5.5) con i primi primer riportati da Loza-Rubio etal. Ciò ha dimostrato che il materiale ottenuto per essere utilizzato nell'amplificazione era di buona qualità.
Le dimensioni del frammento amplificato da PCR sono indicate nella figura 3. L'equazione della curva standard mostra la relazione tra la quantità di contenuto genetico RABV in un campione e la dimensione del frammento amplificato da PCR. La quantità di contenuto genetico RABV (in ng) è stata dedotta dall'interpolazione dei valori Ct nella curva di taratura utilizzando l'equazione presentata nella figura 4. Usando questa equazione, il limite di rivelazione di 1 x 105 μg/μL di RNA virale corrispondeva a 36 copie del genoma RABV. Questi risultati dimostrano che il saggio è sensibile e può essere utilizzato per rilevare il virus in campioni che contengono un basso numero di copie gene RABV N. L'efficienza del saggio è stata calcolata utilizzando la pendenza della curva standard, che era -3,28. I campioni utilizzati per qRT-PCR hanno mostrato l'amplificazione del gene RABV N.
Per determinare il numero di copie virali presenti, i valori Ct per ciascun campione sono stati interpolati utilizzando l'equazione della curva di calibrazione. Il risultato ottenuto (in nanogrammi) è stato sostituito nella formula descritta di seguito dal seguenterif.
Numero di copie RAV N gene = (campione ng * 6,022 x 1023) / (104 bp (lunghezza del prodotto PCR) * 1 x 109 * 650).
Comparativamente, i risultati dei test qRT-PCR erano coerenti con quelli ottenuti utilizzando il DFA. Secondo i risultati ottenuti nel test qRT-PCR nei casi C e D (Tabella 1), il talamo è la struttura che possiede il maggior numero di copie del gene RABV N. Ciò suggerisce che l'infezione precoce dei neuroni ipotalamici e talamici è importante nello sviluppo della malattia, dato che questi neuroni controllano le funzioni vegetative di un animale. I numeri di copia del gene RABV N rilevati in ciascuna struttura di ciascun campione sono riportati nella tabella 1. La sensibilità e la specificità del test qRT-PCR erano entrambe al 100%, poiché tutti i campioni erano positivi. Questo risultato è coerente con le diagnosi iniziali dei campioni.
Figura 1: Tessuti cerebrali bovini che mostrano colorazione positiva secondo il test di immunofluorescenza diretta che rileva la proteina del virus della rabbia N nei tessuti infetti. Una colorazione verde mela si osserva al momento della colorazione, dove l'anticorpo si lega all'antigene della rabbia. Barra di scala: 50 μm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gel di agarosio all'1,5% che mostra i prodotti di amplificazione. Amplificazione di un frammento da 761 bp del gene RABV N per dimostrare la presenza e la qualità del cDNA da utilizzare nella trascrizione in vitro. La corsia 1 contiene un marcatore di peso molecolare, linea 2: amplificazione del controllo positivo; corsia 3: controllo negativo (campione non infetto); linea 4: amplificazione del cDNA utilizzato per la trascrizione in vitro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gel di agarosio all'1,5% che mostra i prodotti di amplificazione. L'amplificazione del gene N completo è mostrata nella corsia 2. La corsia 1 contiene un marcatore di peso molecolare e la corsia 3 contiene il controllo di amplificazione negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curva standard del qRT-PCR utilizzando l'mRNA genico N trascritto in vitro per quantificare il numero di copie del gene RABV N. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Cervello ID | struttura | DAF | Copie numerie (x109) |
| un | Corno di Ammon | + | 0.261 |
| cervelletto | + | 0.0663 | |
| corteccia | + | 0.02 | |
| midollo | + | 0.146 | |
| Pons | + | 30.7 | |
| talamo | + | 108 | |
| B | Corno di Ammon | - | 0.0251 |
| cervelletto | + | 4.64 | |
| corteccia | + | 12.4 | |
| midollo | + | 0.175 | |
| Pons | \u2012 | 0.0721 | |
| talamo | + | 121 | |
| C | Corno di Ammon | \u2012 | 0.168 |
| cervelletto | + | 0.0239 | |
| corteccia | + | 21.5 | |
| midollo | + | 17.2 | |
| Pons | + | 1.32 | |
| talamo | + | 102 | |
| D | Corno di Ammon | + | 11.8 |
| cervelletto | + | 0.0239 | |
| corteccia | + | 8.72 | |
| midollo | + | 1.25 | |
| Pons | \u2012 | 0.0165 | |
| talamo | + | 33.4 | |
| ecstasy | Corno di Ammon | + | 4.15 |
| cervelletto | + | 6.78 | |
| corteccia | + | 1.53 | |
| midollo | + | 1.41 | |
| Pons | + | 0.025 | |
| talamo | + | 95 | |
| F | Corno di Ammon | + | 0.0221 |
| cervelletto | \u2012 | 0.00023 | |
| corteccia | + | 4.95 | |
| midollo | \u2012 | 0.000556 | |
| Pons | + | 1.02 | |
| talamo | + | 89 |
Tabella 1: Determinazione del numero di copie del gene RABV N all'interno di ciascuna struttura cerebrale. I risultati sono stati ottenuti da sei strutture anatomiche di cervelli bovini positivi alla RABV diagnosticati utilizzando il DFA. Le parole evidenziate in grassetto indicano le strutture con il maggior numero di copie. I risultati sono stati espressi come numero di copie del gene N per milligrammo di tessuto.
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Discussion
Studi precedenti hanno dimostrato che il DFA può rilevare rabv solo entro sette giorni dalla conservazione del campione a temperatura ambiente (21 °C)14. Al contrario, questo lavoro ha dimostrato che la sensibilità di RT-PCR inizia a diminuire dopo che i campioni sono stati esposti alla temperatura ambiente per 12 giorni. Pertanto, il genoma RABV può essere rilevato da qRT-PCR in campioni esposti a temperatura ambiente per un massimo di 23 giorni. Ciò dimostra che la sensibilità di qRT-PCR è relativamente più elevata per campioni più altamente decomposti. Tuttavia, rimane necessario sviluppare metodi più semplici che non compromettono la specificità25. La presente ricerca ha dimostrato un saggio molecolare che possiede una sensibilità superiore rispetto al DFA, basato sull'osservazione che era in grado di rilevare il genoma virale indipendentemente dalla specifica struttura cerebrale.
I vantaggi della tecnica RT-PCR per l'uso nel rilevamento di agenti infettivi sono stati evidenziati in diversi studi scientifici. Tuttavia, questa tecnica può presentare alcuni svantaggi, come il costo di esecuzione, in quanto richiede attrezzature specializzate. Personale addestrato è tenuto a gestire i test di biologia molecolare. Inoltre, va detto che come tecnica altamente sensibile, alcuni dei passaggi sono fondamentali per ottenere i migliori risultati. Uno di questi è la corretta gestione dei campioni per l'estrazione dell'RNA. Questo passaggio è fondamentale, poiché l'RNA è facilmente degradabile e i risultati potrebbero, quindi, essere influenzati. Prendere in considerazione la possibilità di mantenere il campione in condizioni di freddo (circa 4 °C) durante il processo. Inoltre, si consideri che diversi cicli di applicazione PCR vengono eseguiti come menzionato nella fase 6.1 per generare la trascrizione in vitro. Questo perché una grande quantità di materiale genetico è necessaria per la reazione per produrre quantità sostanziali (più di milligrammi) di DNA. Un altro aspetto cruciale di questo saggio è il requisito di purificazione del materiale genetico nelle colonne, poiché anche il DNA può essere perso durante questa fase.
qRT-PCR è noto per essere specifico come il test DFA, che è il test standard approvato dall'OMS e dall'OIE. Tuttavia, i saggi molecolari che impiegano RT-qPCR hanno dimostrato di avere una sensibilità più elevata e quindi di consentire l'analisi di campioni con un più alto grado di decomposizione per facilitare il rilevamento di un numero relativamente piccolo di copie del genoma virale. È anche molto più veloce, riduce il rischio di contaminazione e può essere utilizzato ante mortem26,27.
Bingham e van Der Merwe (2002)28 hanno condotto uno studio utilizzando il DFA per determinare quali strutture cerebrali possedevano concentrazioni più elevate del gene RABV N. Sono state valutate in totale 252 strutture cerebrali di diverse specie. Il talamo, il pons e il midollo erano le strutture cerebrali più rilevanti, in quanto erano positivi in tutti i campioni cerebrali valutati. Questi risultati concordano con i risultati qui presentati, che erano coerenti con i risultati del DFA nelle seguenti strutture: corteccia e talamo, 100%; midollo, 83,3%; pons, 66%; e corno, 50%. Al contrario, studi precedenti non riportano falsi negativi. In questo lavoro, alcuni risultati negativi sono stati rilevati in strutture cerebrali complete che erano state precedentemente diagnosticate come positive. Ciò può essere dovuto al fatto che la porzione del campione utilizzata per il test non conteneva particelle virali identificate dall'anticorpo o dal saggio molecolare più sensibile. Un'altra possibile spiegazione è che i campioni non sono stati trasportati o conservati correttamente prima della ricezione in laboratorio.
Il saggio qRT-PCR condotto in questo studio potrebbe rilevare fino a 36,3 copie del gene RABV N per milligrammo di tessuto. Le strutture cerebrali più adatte per qRT-PCR includevano la corteccia e il talamo. Ciò si basa sulle osservazioni secondo cui concentrazioni più elevate del gene RABV N sono state rilevate in queste strutture e che sono state trovate positive anche utilizzando il test di riferimento RABV. Il test è stato in grado di rilevare concentrazioni molto basse (0,00023 x 109 copie) del virus in vari campioni. Oltre a quantificare le particelle virali nel campione, il test sembra fornire un buon strumento diagnostico e di ricerca alternativo per l'individuazione del RABV.
Con i risultati ottenuti utilizzando il protocollo di rilevamento del genoma virale del virus della rabbia qui presentato, si prevede che questa tecnica possa essere applicata per la diagnosi molecolare del virus in diversi tipi di campioni, in quanto è in grado di rilevare quantità minime del genoma virale. Il suo più grande vantaggio rispetto ad altri metodi come DFA è che è più sensibile e può essere utilizzato ante mortem, come suggerito da altri autori.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto nazionale di ricerca agricola, forestale e zootecnica (INIFAP). Ringraziamo Jerzayn Fraustro Esquivel per la sua collaborazione nello sviluppo del video associato a questo documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
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