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Immunology and Infection

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Este protocolo apresenta uma abordagem baseada em qRT-PCR para determinar o número de cópia genética do vírus da raiva (N) dentro de várias estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando transcrição in vitro.

Abstract

A raiva paralítica bovina (BPR) é uma forma de encefalite viral que é de importância econômica substancial em toda a América Latina, onde representa um grande risco zoonótico. Aqui, nosso objetivo era utilizar um protocolo laboratorial para determinar o número de cópia relativa do genoma do vírus da raiva (RABV) em diferentes estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica o número específico de cópias genéticas presentes em uma amostra baseada na fluorescência emitida após a amplificação que é diretamente proporcional à quantidade de ácido nucleico alvo presente na amostra. Este método é vantajoso devido à sua curta duração, risco reduzido de contaminação e potencial para detectar ácidos nucleicos virais em diferentes amostras mais facilmente em comparação com outras técnicas. Os cérebros de seis animais raivosos foram divididos em seis estruturas anatômicas, ou seja, o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo. Todos os cérebros foram identificados como positivos para antígenos RABV com base em um teste de imunofluorescência direta. As mesmas estruturas anatômicas do cérebro de quatro bovinos RABV negativos também foram avaliadas. O RNA foi extraído de cada estrutura e utilizado para qRT-PCR. Um ensaio foi realizado para determinar o número de cópias dos genes RABV usando um gene de nucleoproteína transcrito in vitro. A curva padrão utilizada para quantificar o RNA viral apresentou uma eficiência de 100% e linearidade de 0,99. A análise revelou que o córtex, medula e tálamo foram as porções ideais de CNS para uso na detecção de RABV, com base na observação de que essas estruturas possuíam os mais altos níveis de RABV. A especificidade do teste foi de 100%. Todas as amostras foram positivas, não foram detectados falsos positivos. Este método pode ser usado para detectar RABV em amostras que contenham baixos níveis de RABV durante o diagnóstico de BPR.

Introduction

A raiva pode ser confirmada antes-mortem e post-mortem por várias técnicas que permitem a detecção de ácidos nucleicos virais no cérebro, pele, urina ou saliva1. A detecção do gene nucleoproteína do vírus da raiva (N)é usada principalmente para o diagnóstico de raiva por testes moleculares. Este gene também é usado para genotipagem viral. A raiva pode ser diagnosticada em animais usando qualquer porção do cérebro afetado; no entanto, para excluir a possibilidade de raiva, tecidos de pelo menos duas regiões do cérebro devem ser testados2. Existem vários métodos de diagnóstico para detecção de raiva em animais; no entanto, o teste de imunofluorescência direta continua sendo a técnica de referência padrão3. Outros testes incluem testes biológicos que incorporam a inoculação do camundongo, infecção na cultura tecidual e reação em cadeia de polimerase (PCR)4. Todas essas técnicas são recomendadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e Pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o diagnóstico de raiva em humanos e animais,respectivamente 5.

Técnicas de detecção e amplificação de ácido nucleico revolucionaram o diagnóstico da raiva nos últimosanos 6 e essas técnicas desempenham um papel importante no diagnóstico ante mortem da raiva humana. Vários testes baseados em PCR foram avaliados para complementar os testes convencionais para diagnósticos de raiva pré-mortem e pós-morte 7,8,9,10. A maioria dos ensaios tem como alvo o gene de nucleoproteína viral da raiva para amplificação, que é a região mais conservada do genoma viral1,11. Nos últimos 20 anos, vários ensaios moleculares foram desenvolvidos para diagnosticar o RABV, e alguns desses ensaios têm sido usados para caracterização de vírus. A maioria dos ensaios tem como objetivo detectar genes conservados dentro do genoma viral, mais comumente usando ensaios de corrente de polimerase convencional ou quantitativo (qRT-PCR)12,13.

PcR é uma técnica de diagnóstico altamente sensível que pode detectar o genoma de um dado patógeno dentro dos tecidos, mesmo quando esses tecidos estão decompostos. Utilizando abordagens baseadas em PCR, quantidades mínimas de um agente infeccioso podem ser detectadas em uma amostra clínica através da amplificação seletiva e repetitiva de uma sequência de nucleotídeos de DNA14. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por exemplo, TaqMan) ou corantes de vinculação de DNA (por exemplo, SYBR Green) tem sido usado em ensaios para diagnosticar RABV tanto ante- quanto post- mortem com alta sensibilidade; no entanto, tal abordagem requer equipamentos especializados. Para superar essa limitação, foi sugerido amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP), com base em seu baixo custo, simplicidade e características desejáveis para a detecção de RABV. Este ensaio é particularmente importante, pois pode ser utilizado em países em desenvolvimento15.

qRT-PCR baseia-se na detecção e quantificação de uma molécula, onde os aumentos de sinal fluorescente são em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma única reação. À medida que o número de cópias do alvo do ácido nucleico aumenta, a fluorescência também aumenta. Corantes intercalantes não específicos, como o corante de dna verde SYBR ou sondas de oligonucleotídeos específicas da sequência que carregam um fluoróforo e um quencher são comumente usados para fornecer a leitura fluorescente em qRT-PCR. Este ensaio oferece vantagens sobre o RT-PCR convencional que incluem um tempo de teste mais curto (2-4 h), risco reduzido de contaminação devido ao sistema de tubo fechado (falta de manipulação pós-PCR de produtos amplificados) e a capacidade de detectar diferentes alvos simultaneamente16. qRT-PCR pode ser usado para diagnosticar raiva ante-mortem da saliva e outras amostras. Este ensaio também pode ser usado como um teste universal em tempo real para a detecção de diferentes espécies de Lyssavirus ou linhagens de RABV15. Nesta abordagem combo RT-PCR, duas reações são usadas. O primeiro detecta diferentes linagens genéticas de RABV, e o segundo detecta a espécie Lyssavirus. Ambas as etapas envolvem ensaios qRT-PCR, onde o primeiro usa sondas de hibridização e o segundo usa corantes15. Devido ao grande número de testes que demonstraram sucesso na detecção molecular do RABV utilizando essa técnica, o atual Manual Terrestre OIE (2018) recomenda o uso de PCR para a detecção molecular de RABV17.

O México é um país com considerável potencial pecuário. Os estados com maior produção pecuária contêm regiões tropicais úmidas e regiões secas que estão em risco de surtos de raiva devido à presença do morcego vampiro Desmodus rotundus, o principal transmissor da raiva. Por isso, é essencial desenvolver mais ferramentas para a prevenção e controle da raiva paralímtica bovina (BPR) no México. Com base nisso, o objetivo deste estudo foi utilizar o qRT-PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais em diferentes estruturas anatômicas de cérebros bovinos após a morte por infecção por raiva.

Seis cérebros obtidos de bovinos soropositivos de RABV foram doados por um laboratório externo para uso no desenvolvimento do protocolo qRT-PCR descrito abaixo. As amostras da estrutura cerebral bovina foram transportadas para a instalação do laboratório BSL-2 do laboratório INIFAP CENID-MA e armazenadas a -80 °C até o uso. Cérebros foram obtidos de animais dos estados de Campeche, Yucatán e Querétaro. Antes do recebimento, várias estruturas foram dissecadas do cérebro. Essas estruturas incluíam o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo18,19. O material genético foi extraído como descrito abaixo. O diagnóstico de RABV foi confirmado utilizando anticorpos fluorescentes diretos (DFA)20. Como controle positivo, foram utilizados cérebros de camundongos que foram inoculados com RABV21. Além disso, quatro cérebros de bovinos RABV negativos (determinados pela DFA) foram utilizados como controles negativos.

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Protocol

Este estudo foi aprovado e conduzido de acordo com as recomendações de uso de animais fornecidos pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Investigação Disciplinar en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Amostras

  1. Use diferentes áreas do cérebro dissecadas de 6 diferentes cérebros bovinos antirrábicos positivos para análise de RT-PCR.

2. Anticorpos fluorescentes diretos (DFAs) para confirmar raiva

NOTA: A detecção do antígeno da raiva pela DFA é um método qualitativo para determinar a presença da nucleoproteína da raiva usando anticorpos rotulados por fluoresceína. O teste foi realizado utilizando-se o protocolo fornecido por Dean et al. (1966)20, conforme descrito abaixo.

  1. Faça duas impressões de cada tecido dissecado de diferentes estruturas cerebrais em uma lâmina estéril de aproximadamente 15 mm de diâmetro. Use um aplicador de madeira para esfregar uma porção de aproximadamente 3 mm3 do tecido na lâmina estéril. Para criar a mancha, pressione suavemente o aplicador de madeira contra o slide manualmente.
  2. Fixar os slides de mancha de amostra submersando os slides em 100% acetona por 1 h a -20 °C. Após a incubação, seque as lâminas em um pano seco a 21 °C por 30 min.
  3. Adicione 50 μL do anticorpo antinucleoproteína rotulado por fluoresceína a cada mancha cerebral a uma diluição de 1:10, dispensando através de uma seringa.
  4. Incubar os slides com o conjugado em uma câmara úmida a 37 °C por 1 h.
  5. Após a incubação, lave as lâminas duas vezes com água e com PBS para eliminar o excesso de conjugados. Deixe os slides secarem a 21 °C. Limpe cuidadosamente para remover o excesso de líquido e, em seguida, seque brevemente o ar antes da montagem.
  6. Adicione uma gota de 50% de glicerina fosfato para cobrir a superfície da seção e, em seguida, cubra com uma mancha de cobertura. Observe as seções sob um microscópio de epifluorescência a 40x de ampliação.
    1. Processe e observe os controles positivos e negativos (controle positivo: cérebros de camundongos inoculados com RABV; controles negativos: cérebros bovinos RABV negativos) da mesma forma que as amostras.

3. Gerando controle positivo para RT-PCR

  1. Obtenha células BHK-21 do banco de germoplasma. Use células até apassagem 70 para replicar a cepa RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) usando a passagem 2.
  2. Manter e propagar células BHK-21 em garrafas contendo meio essencial mínimo (MEM) suplementados com soro de bezerro fetal de 10% (FCS) a 37 °C na presença de CO2 (5%) e sob condições úmidas. Cresça as células em frascos de cultura de25 cm 2 até atingirem 80% de confluência e, em seguida, subcultura.
  3. Remova o meio de cultura das células e lave a garrafa com soro fisco tamponado (PBS). Inocular a cultura com 105 TCID/mL de ERA de cepa RABV. Incubar o inóculo viral por 2 h sob agitação constante a 37 °C na presença de CO2 (5%) e sob condições úmidas.
  4. Remova o meio de infecção e adicione MEM suplementado com 5% (bovino fetal súmérico) SFB. Incubar por 72 h a 37 °C na presença de CO2 (5%) em condições úmidas.
  5. Colher RABV 3 dias após a inoculação quando as células apresentam efeitos citopáticos. Congele as células infectadas e descongele-as a 4 °C para lise as células. Colete o meio da garrafa e, em seguida, coloque as células em um tubo de centrífuga para centrifugação a 1.050 x g por 10 min a 4 °C.
  6. Armazene os supernacantes do RABV a -80 °C e prepare as alíquotas de trabalho para armazenamento a -70 °C.
  7. Intracerebrally inocula o vírus obtido na etapa anterior em camundongos CD1 femininos de 21 dias de idade. Use uma seringa de 1 mL para inocular 50 μL de soluções contendo 106 MICLD50 (dose letal de cultura infecciosa do camundongo 50%) doses em camundongos22.

4. Extração de RNA

NOTA: O RNA total foi extraído diretamente de cérebros bovinos usando um método de extração orgânica de acordo com o seguinte protocolo.

  1. Use 100 mg de tecido cerebral de cada estrutura anatômica para extrair RNA total usando um reagente comercialmente disponível contendo isothiocianato de guanidium.
  2. Homogeneize manualmente um total de 100 mg de tecido de cada estrutura em 1 mL do reagente de isothiocianato guanidium por vórtice usando um homogeneizador Dounce com um pequeno pilão dentro do microtubo para 15 s em velocidade máxima.
  3. Incubar as amostras no gelo por 5 minutos e, em seguida, adicionar 200 μL de clorofórmio. Misture as amostras vigorosamente por 15 s, incubar no gelo por 2 a 3 minutos e, em seguida, centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
  4. Transfira a fase aquosa para um tubo limpo e adicione 500 μL de álcool isopropílico. Incubar as amostras por 15 min a 21 °C.
  5. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernatante aquoso por pipetação. O RNA isolado estará presente como uma pelota no tubo.
  6. Em seguida, lave a pelota de RNA com 1 mL de 75% de etanol por pipetação, e centrífuga a 7500 x g por 5 min a 4 °C.
  7. Decante o supernatante e seque a pelota de RNA à temperatura ambiente (21 °C). Em seguida, diluir a pelota em 50 μL de água sem nuclease.
  8. Determine a concentração e qualidade do RNA a 260 nm usando um espectrofotômetro. Armazene o RNA a -80 °C até o uso.
  9. Remova o DNA das amostras de RNA por digestão com DNase I. Adicione 2 U de DNase I por 1 μg de RNA extraído na etapa anterior. Em seguida, adicione 5 μL de tampão de reação de 10x e, em seguida, incubar a 37 °C por 30 min. Inative o DNase I adicionando 1 μL de EDTA à mistura seguida de incubação por 10 min a 65 °C.

5. síntese cDNA e PCR

  1. Sintetizar cDNA de primeira cadeia usando oligo dT e transcriptase reversa. Para cada 1 μg de RNA, adicione 1 μL de oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mistura dNTP de 10 mM e água destilada sem nuclease a um volume final de 12 μL. Incubar a mistura a 65 °C por 5 min.
  2. Esfrie a mistura de reação a 4 °C. Centrifugar o tubo por 30 s a 1.050 x g, e depois adicionar 4 μL de tampão de reação, 2 μL 0,1 M DTT e 1 μL de inibidor de ribonuclease (40 U/μL).
  3. Incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 min e, em seguida, adicionar 1 μL de transcriptase reversa (200 U). Em seguida, incubar a mistura de reação por 50 min a 37 °C e, em seguida, inativar a reação a 70 °C por 15 min.
  4. Armazene o cDNA a -20 °C antes de usar.
    NOTA: Para verificar a qualidade do cDNA sintetizado, realize a amplificação de um fragmento de 761 bp do gene RABV N antes de realizar a síntese in vitro. Use o protocolo descrito por Loza-Rubio et al.11, conforme descrito na etapa 5.5 abaixo.
  5. Realize o PCR usando polimerase de DNA Taq nas seguintes condições. Execute a configuração de reação da seguinte forma: 10x tampão Taq contendo 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerase, 10 μM de cada primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ e SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, e água ultrauso a um volume final de 50 μL.
  6. Realizar a amplificação em um termociclador utilizando as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C para 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 30 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 1 min; um ciclo de 72 °C por 7 min.
  7. Avalie a presença dos produtos PCR de 761 bp utilizando um gel de 1% de agarose.

6. Transcrição in vitro

NOTA: A transcrição in vitro gera mRNA de um gene alvo. Use um par de primer que amplifica o gene RABV N completo e um que é usado como um controle positivo para o ensaio qRT-PCR. Estes primers são projetados para amplificar o gene RABV N completo e para adicionar um promotor que reconhece a polimerase T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. Para amplificar todo o gene N RABV, use os primers Trans-Nrab para a frente (50 gatgagtcactcgaatatgtctt 30) e reverso (50 caataatacgactactatagggatgagacaagatt 30) e um kit PCR de alta fidelidade.
    1. Para cada reação, prepare uma mistura mestre pcr adicionando a um buffer de reação de tubo PCR limpo 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM de cada primer, 0,5 U de polimerase de alta fidelidade, 1,5 μL de cDNA (preparado na etapa 5) e água ultrauso para um volume final de 50 μL.
    2. Use um termociclador definido para as seguintes condições para amplificação: 94 °C por 1 min; 4 ciclos de 94 °C para 1 min, 40 °C para 1 min e 72 °C por 2 min; 35 ciclos de 94 °C para 1 min, 60 °C para 1 min e 72 °C por 2 min; prorrogação final de 72 °C para 2 min.
  2. Para usar o produto PCR como modelo para a síntese in vitro e remover componentes da reação enzimática da etapa 6.1.2, purificar o produto PCR usando um kit concentrador baseado em coluna de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, quantificar usando um espectrofotômetro.
  3. Para síntese de RNA, use um kit de transcrição in vitro com a seguinte mistura de reação: 5 μL T7 Transcrição 5x tampão, 1,9 μL de cada nucleotídeo tripofásico, 10 μg de DNA PURIFICADO RABV N DNA VP2 e 2,5 μL da mistura enzimática. Em seguida, incubar a mistura a 37 °C por 4h. Em seguida, adicione 1 μL de 1 U/μg RNase-Free DNase à mistura de reação e incubar por 15 minutos a 37 °C para eliminar a contaminação do DNA.
  4. Purificar o RNA transcrito in vitro e depois concentre-o usando fenol:clorofórmio:álcool isoamyl (25:24:1).
  5. Resuspenquei a pelota de RNA purificada em 70 μL de tampão TE e, em seguida, armazene a -80 °C até usar.
  6. Repita o protocolo PCR da etapa 6.1 até que aproximadamente 5 μg de produto PCR seja obtido. Após a purificação e concentração, o gene N mRNA in vitro transcrito estará presente em uma concentração de 4.711 μg/μL.
  7. Confirme que o mRNA transcrito in vitro corresponde ao gene N após o passo 5 deste protocolo e use-o como um controle positivo para a reação em cadeia de transcriptase reversa em tempo real (qRT-PCR).

7. Reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR)

  1. Para qRT-PCR, use uma transcrição de mRNA in vitro codificando o gene N completo como um controle positivo, juntamente com um kit comercial de um passo qRT-PCR usando sondas de hibridização de acordo com as instruções do fabricante. Use a sonda e os primers descritos por Carneiro et al. (2010)23 para detectar uma região conservada do gene RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatggaaagggaattg 3′, e BRDesrot-Probe: 5'-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Use as seguintes condições de ciclismo térmico: 1 ciclo de 50 °C para 10 min e 95 °C para 2 min; 40 ciclos de 95 °C para 15 s e 50 °C para 30 s.

8. Curva de calibração ou curva padrão

  1. Realize diluições seriais do mRNA transcrito in vitro, pipetando 1 μg/μL de mRNA em tubos até que seis diluições descupadas sejam obtidas. Prepare tubos a um volume de 100 μL em triplicado para uso na criação da curva padrão. Execute qRT-PCR conforme descrito na etapa 7.
  2. Execute qRT-PCR em um termociclador com um rotor processando as várias amostras cerebrais simultaneamente com as reações em execução para criar a curva padrão e usar controles positivos, controles negativos e supernantes isolados da cultura celular.
  3. Para avaliar o limite de detecção, eficácia do teste e sensibilidade do teste, utilize uma curva padrão em triplicado sob as mesmas condições.

9. qRT-PCR de amostras biológicas

  1. Para a detecção do gene N rabv, use o RNA a partir de amostras de campo, controles positivos, controles negativos e supernantes de cultura celular para executar qRT-PCR usando o kit PCR descrito na etapa 7.
  2. Para determinar o número de cópias do genoma RABV presente nas amostras do cérebro bovino, obtenha dados de TC da curva padrão e amostras biológicas e daqueles interpolados da equação da curva de calibração.

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Representative Results

Os resultados do DFA mostraram 100%, 100%, 83,3%, 66% e 50% de positividade para RABV no córtex, tálamo, medula, pons e chifre, respectivamente. Esses resultados confirmaram os resultados anteriores, e pelo menos três das estruturas dissecadas de cada cérebro foram positivas para o RABV. Uma coloração da DAF positiva representativa é mostrada na Figura 1.

A Figura 2 mostra a amplificação de um fragmento do gene RABV N (passo 5.5) com os primeiros primers relatados por Loza-Rubio et al.11. Isso mostrou que o material obtido para ser utilizado na amplificação era de boa qualidade.

O tamanho do fragmento amplificado por PCR é mostrado na Figura 3. A equação da curva padrão mostra a relação entre a quantidade de conteúdo genético RABV em uma amostra e o tamanho do fragmento amplificado por PCR. A quantidade de teor genético RABV (em ng) foi deduzida pela interpolação dos valores da TC na curva de calibração utilizando a equação apresentada na Figura 4. Utilizando esta equação, o limite de detecção de 1 x 105 μg/μL de RNA viral foi encontrado correspondendo a 36 cópias do genoma RABV. Esses resultados demonstram que o ensaio é sensível e pode ser usado para detectar o vírus em amostras que contêm um baixo número de cópias do gene RABV N. A eficiência do ensaio foi calculada utilizando-se a inclinação da curva padrão, que foi de -3,28. As amostras utilizadas para qRT-PCR mostraram amplificação do gene RABV N.

Para determinar o número de cópias virais presentes, os valores de TC para cada amostra foram interpolados utilizando a equação da curva de calibração. O resultado obtido (em nanogramas) foi substituído na fórmula descrita abaixo do seguinte árbitro24:

Número de cópias do gene RABV N = (amostra ng * 6.022 x 1023) / (104 bp (comprimento do produto PCR) * 1 x 109 * 650).

Comparativamente, os resultados dos ensaios qRT-PCR foram consistentes com os obtidos utilizando DFA. De acordo com os resultados obtidos no teste qRT-PCR nos casos C e D (Tabela 1),o tálamo é a estrutura que possui o maior número de cópias do gene RABV N. Isso sugere que a infecção precoce de neurônios hipotálamo e talámicos é importante no desenvolvimento da doença, uma vez que esses neurônios controlam as funções vegetativas de um animal. Os números de cópia do gene RABV N que foram detectados em cada estrutura de cada amostra são mostrados na Tabela 1. A sensibilidade e especificidade do teste qRT-PCR foram de 100%, pois todas as amostras foram positivas. Este resultado é consistente com os diagnósticos iniciais das amostras.

Figure 1
Figura 1: Tecidos cerebrais bovinos mostrando coloração positiva de acordo com o teste de imunofluorescência direta que detecta a proteína do vírus da raiva N em tecidos infectados. Uma coloração verde-maçã é observada na coloração, onde o anticorpo se liga ao antígeno da raiva. Barra de escala: 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: 1,5% de gel de agarose mostrando os produtos de amplificação. Amplificação de um fragmento de 761 bp do gene RABV N para demonstrar a presença e a qualidade do cDNA a ser usado na transcrição in vitro. A faixa 1 contém um marcador de peso molecular, linha 2: amplificação do controle positivo; raia 3: controle negativo (amostra não infectada); linha 4: amplificação do cDNA usado para transcrição in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: 1,5% de gel de agarose mostrando os produtos de amplificação. A amplificação do gene N completo é mostrada na faixa 2. A faixa 1 contém um marcador de peso molecular, e a pista 3 contém o controle de amplificação negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Curva padrão do qRT-PCR usando mRNA de gene N transcrito in vitro para quantificar o número de cópias do gene RABV N. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cérebro de ID estrutura DAF Cópias numégrafas (x109)
um Chifre de Ammon + 0.261
cerebelo + 0.0663
córtex + 0.02
Medula + 0.146
Pons + 30.7
tálamo + 108
B Chifre de Ammon - 0.0251
cerebelo + 4.64
córtex + 12.4
Medula + 0.175
Pons \u2012 0.0721
tálamo + 121
C Chifre de Ammon \u2012 0.168
cerebelo + 0.0239
córtex + 21.5
Medula + 17.2
Pons + 1.32
tálamo + 102
D Chifre de Ammon + 11.8
cerebelo + 0.0239
córtex + 8.72
Medula + 1.25
Pons \u2012 0.0165
tálamo + 33.4
ecstasy Chifre de Ammon + 4.15
cerebelo + 6.78
córtex + 1.53
Medula + 1.41
Pons + 0.025
tálamo + 95
fá Chifre de Ammon + 0.0221
cerebelo \u2012 0.00023
córtex + 4.95
Medula \u2012 0.000556
Pons + 1.02
tálamo + 89

Tabela 1: Determinação do número de cópias do gene RABV N dentro de cada estrutura cerebral. Os resultados foram obtidos a partir de seis estruturas anatômicas de cérebros bovinos soropositivos hivs diagnosticados por DFA. As palavras destacadas em negrito indicam as estruturas com mais cópias. Os resultados foram expressos como número de cópias do gene N por miligrama de tecido.

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Discussion

Estudos anteriores mostraram que a DFA só pode detectar RABV dentro de sete dias após a amostra ser armazenada à temperatura ambiente (21 °C)14. Em contrapartida, este trabalho demonstrou que a sensibilidade do RT-PCR começa a diminuir depois que as amostras foram expostas à temperatura ambiente por 12 dias. Portanto, o genoma RABV pode ser detectado por qRT-PCR em amostras expostas à temperatura ambiente por até 23 dias. Isso demonstra que a sensibilidade do qRT-PCR é relativamente maior para amostras mais decompostas. No entanto, continua sendo necessário desenvolver métodos mais simples que não comprometam a especificidade25. A presente pesquisa demonstrou um ensaio molecular que possui maior sensibilidade do que o DFA, com base na observação de que foi capaz de detectar o genoma viral, independentemente da estrutura cerebral específica.

As vantagens da técnica RT-PCR para o uso na detecção de agentes infecciosos têm sido destacadas em diversos estudos científicos. No entanto, essa técnica pode apresentar algumas desvantagens, como o custo de execução, pois requer equipamentos especializados. Pessoal treinado é necessário para lidar com ensaios de biologia molecular. Além disso, deve-se mencionar que, como uma técnica altamente sensível, algumas das etapas são fundamentais para obter os melhores resultados. Uma delas é o manuseio adequado de amostras para extração de RNA. Este passo é crucial, pois o RNA é facilmente degradado, e os resultados poderiam, portanto, ser afetados. Considere manter a amostra em condições frias (aproximadamente 4 °C) durante o processo. Além disso, considere que várias rodadas de aplicação pcr são realizadas como mencionado na etapa 6.1 para gerar a transcrição in vitro. Isso ocorre porque uma grande quantidade de material genético é necessária para que a reação produza quantidades substanciais (mais de miligramas) de DNA. Outro aspecto crucial deste ensaio é a exigência de purificação do material genético nas colunas, pois o DNA também pode ser perdido durante esta etapa.

qRT-PCR é conhecido por ser tão específico quanto o teste DFA, que é o teste padrão aprovado pela OMS e pelo OIE. No entanto, ensaios moleculares que empregam RT-qPCR têm mostrado ter maior sensibilidade e, assim, permitir a análise de amostras com maior grau de decomposição para facilitar a detecção de um número relativamente pequeno de cópias do genoma viral. Também é muito mais rápido, reduz o risco de contaminação, podendo ser usado ante-mortem26,27.

Bingham e van Der Merwe (2002)28 realizaram um estudo usando dfa para determinar quais estruturas cerebrais possuíam maiores concentrações do gene RABV N. Foram avaliadas 252 estruturas cerebrais de várias espécies. O tálamo, pons e medula foram as estruturas cerebrais mais relevantes, pois foram positivas em todas as amostras cerebrais avaliadas. Esses resultados concordam com os resultados aqui apresentados, que foram consistentes com os resultados da DFA nas seguintes estruturas: córtex e tálamo, 100%; medulla, 83,3%; pons, 66%; e chifre, 50%. Em contraste, estudos anteriores não relataram falsos negativos. Neste trabalho, alguns resultados negativos foram detectados em estruturas cerebrais completas que haviam sido previamente diagnosticadas como positivas. Isso pode ocorrer porque a porção da amostra utilizada para o teste não continha partículas virais identificadas pelo anticorpo ou pelo ensaio molecular mais sensível. Outra explicação possível é que as amostras não foram devidamente transportadas ou armazenadas antes da recepção no laboratório.

O ensaio qRT-PCR realizado neste estudo pôde detectar apenas 36,3 cópias do gene RABV N por miligrama de tecido. As estruturas cerebrais mais adequadas para qRT-PCR incluíram o córtex e o tálamo. Isso se baseia nas observações de que foram detectadas maiores concentrações do gene RABV N nessas estruturas e que também foram encontradas positivas utilizando-se o teste de referência RABV. O teste foi capaz de detectar concentrações muito baixas (0,00023 x 109 cópias) do vírus em várias amostras. Além de quantificar as partículas virais na amostra, o teste parece fornecer uma boa ferramenta alternativa de diagnóstico e pesquisa para a detecção de RABV.

Com os resultados obtidos utilizando o protocolo de detecção do genoma viral do vírus da raiva apresentado aqui, prevê-se que essa técnica possa ser aplicada para o diagnóstico molecular do vírus em diferentes tipos de amostras, pois é capaz de detectar quantidades mínimas do genoma viral. Sua maior vantagem em relação a outros métodos, como o DFA, é que ele é mais sensível e pode ser usado ante-mortem,como tem sido sugerido por outros autores.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Pesquisas Agropecuárias, Florestais e Pecuária (INIFAP). Agradecemos a Jerzayn Fraustro Esquivel por sua colaboração no desenvolvimento do vídeo associado a este documento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

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References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

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Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas
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Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

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