Summary
Detta protokoll visar hur man använder super-upplösning mikroskopi för att studera protein medlokalisering i primära neuronala kulturer.
Abstract
Synapser är de funktionella elementen i nervceller och deras defekter eller förluster ligger på grundval av flera neurodegenerativa och neurologiska sjukdomar. Imaging studier används ofta för att undersöka deras funktion och plasticitet i fysiologiska och patologiska förhållanden. På grund av deras storlek och struktur kräver lokaliseringsstudier av proteiner högupplösta avbildningstekniker. I detta protokoll beskriver vi ett förfarande för att studera i primära nervceller samlokalisering av målproteiner med synaptiska markörer på en super-upplösning nivå med hjälp av strukturerad belysning mikroskopi (SIM). SIM är en mönstrad ljus belysning teknik som fördubblar den rumsliga upplösningen av breda fält mikroskopi, nå en detalj på cirka 100 nm. Protokollet anger de kontroller och inställningar som krävs för robusta samlokaliseringsstudier och en översikt över de statistiska metoderna för att analysera bilddata ordentligt.
Introduction
Förståelsen och synen på synapsen har förändrats enormt sedan dess första beskrivning av Foster och Sherrington 18971. Sedan dess har vår kunskap om neuronal kommunikation och de molekylära processerna bakom det vuxit exponentiellt2. Det har blivit tydligt att synapser kan ses som ett tvåfackssystem: ett pre-synapsfack som innehåller vesiklar för frisättning av signalsubstanser och ett postsynapsfack med receptorer3. Denna förenklade syn, under de senaste tjugo åren, har utvecklats till ett komplext nätverk av de proteiner som krävs för att transduce sändarbindning till signalering4.
Vinsterna i förståelsen beror delvis på super-upplösning tekniker som övervann diffraktion gränsen för konventionell ljusmikroskopi för att passa dimensionen av synapser bättre5,6,7,8,9,10. På grund av diffraktionsgränsen kan ett optiskt mikroskop inte nå en upplösning över 200 nm i lateritet11,12. För att kringgå denna gräns, super-upplösning tekniker skapades, med hjälp av olika tillvägagångssätt och nå olika sub-diffraktion gräns upplösningar: SIM, STED (Stimulerad emission depletion mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) och STORM (Stokastisk Optisk Rekonstruktion Mikroskopi)13,14. SIM fördubblar den rumsliga upplösningen hos laserbaserade mikroskopisystem med bredfältsbaserad genom att sätta in ett diffraktionsgaller i magnetiseringsstrålensväg 15. Den rörliga galler diffracts laserstrålarna för att skapa en känd belysning mönster, vanligtvis ränder. Detta avsiktligt strukturerade ljusmönster läggs ovanpå den okända rumsliga fördelningen av det fluorescerande färgämnet (av provet). De störningar fransar som bildas av de två mönster koda för annars omöjlig att skilja fina detaljer med normala wide-field mikroskopi. Den slutliga super-lösta bilden erhålls genom att kombinera och avkoda med matematiska metoder flera råa bilder av samma prov som erhållits genom översättningar och rotationer av diffraction galler. Upplösningen på de super-lösta bilderna når 100 nm i den laterala och 500 nm i axiella riktningar för 2D-SIM15 eller 100 nm i den laterala och 250 nm i axial riktningar för 3D-SIM16.
Den nya förståelsen av synapsen är ännu viktigare i ljuset av de många neurologiska sjukdomar där synaptisk dysfunktion spelar en stor roll i debuten och progression17,18. Alzheimers sjukdom, Downs syndrom, Parkinsons sjukdom, prionsjukdomar, epilepsi, autismspektrumstörningar och bräckligt X syndrom bland andra har kopplats till avvikelser i synapssammansättning, morfologioch funktion 19,20,21,22.
Nyligen, med hjälp av en uppsättning SUMO-specifika antikroppar, vi använde SIM för att visa samlokalisering i primära hippocampus nervceller av SUMO-proteinerna med pre- och post-synapsmarkörer synaptophysin och PSD95 på super-upplösning nivå23. Detta gjorde det möjligt för oss att bekräfta biokemiska och konfokala mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nervceller.
Här beskriver vi ett protokoll för att studera lokalisering av proteiner i mus hippocampus primära nervceller. Samtidigt kan detta protokoll anpassas till olika typer av primära neuronala kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primära kulturer
- Kultur mus hippocampus primära nervceller i kammar coverslips (såsom Ibidi μ-Slide 8 Well eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) som matchar det objektiva kravet på #1,5 (0,17 mm) coverslip tjocklek.
- Täckkammarens täckliner med 100 μL poly-L-lysin (100 μg/mL).
- Nästa dag, tvätta de kammade täcken två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- För att erhålla mus primära nervceller, isolera hippocampi från P1-P4 pups23.
- Placera dissekerade hippocampi i 10 mL dissection Media (Tabell 1) och låt dem deponera i botten av röret.
- Ta försiktigt bort Dissection Media med hjälp av en steril pipett och lämna hippocampi ostört längst ner på röret.
- Tillsätt 10 mL media 1 (tabell 1) till hippocampi och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Med hjälp av en steril pipett, försiktigt bort Media 1, lämnar hippocampi ostört längst ner på röret.
- Tillsätt 10 mL media 2 (tabell 1) och låt (det utjämnade) centrifugerröret vara under huven horisontellt i 45 minuter.
- Låt centrifugröret stå vertikalt för att låta vävnaden att bosätta sig i botten av röret.
- Ta försiktigt bort Media 2 med hjälp av en steril pipett och lämna hippocampi ostört i botten av centrifugröret.
- Lägg till 2 mL media 3 (tabell 1).
- Med hjälp av en p1000-pipett med filtrerad spets, tar mekaniskt isär celler från vävnaden.
- Överför supernatanten, i som lokaliseras de isolerade nervcellerna, till ett 15 mL centrifugrör.
- Centrifugera cellupphängningen i 2 min vid 300 x g vid rumstemperatur (RT).
- Efter centrifugering sitter celler längst ner i centrifugröret. Med hjälp av en steril pipett kasta supernatanten.
- Resuspend celler i 1 mL av Media 4.
- Använd ett 70 μm filter för att eliminera osedliga celler.
- Räkna livskraftiga celler i en Bürkerkammare genom att tillsätta 1 μL av 0,4 % Trypanblålösning till 19 μL av cellupphängningen.
- Plattceller vid 70 000 celler/brunn i en volym på 200 μL per brunn.
- Låt cellerna fästa i 2 h i en befuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ta ut de kammade täckkläcken från inkubatorn och byt försiktigt ut mediet med 200 μL Kulturmedier.
- Lämna de kammade täcksliparna i en befuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt ut en tredjedel av mediet mot färska odlingsmedier var 5-7:e dag.
- Vänta tills hippocampus primära nervceller är helt mognat (12-14 dagar efter plätering) att utföra samlokalisering studier.
2. Immunfluorescens färgning
- Ta de kammade täcken från inkubatorn.
- Ta bort mediet.
- Tvätta snabbt brunnarna med 200 μL PBS.
- Tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (200 μL/well) till nervceller för att åtgärda dem snabbt.
- Inkubera cellerna i 15 min vid RT.
- Ta bort PFA-lösningen.
- Permeabilisera cellerna genom att addera PBS med 0,2% Triton X-100 (200 μL/brunn).
- Inkubera i 1 min vid RT.
- Avlägsna lösningen och inkubera proverna med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (200 μL/brunn) i 1 h vid RT för att passivt täcka alla fria bindningsytor av plattan med ett irrelevant protein för analysen. En BSA-baserad blockerande buffert utan Triton X-100 minskar antikroppsbakgrunden effektivare än samma buffert med 0,2 % Triton X-100.
- Ta bort lösningen.
- Tillsätt den primära antikroppen av val utspädd i en PBS-lösning som innehåller 1% BSA och 0, 2% Triton X-100 (120-200 μL/brunn, beroende på antikroppsutspädning och tillgänglighet). Inkubera proverna i 2 h.
- Som en negativ kontroll, tillsätt inte någon primär antikropp till en av brunnarna. Flera antikroppar av olika arter mot olika mål kan användas samtidigt. Använd en antikropp mot MAP2 (en neuronal markör) upp i kyckling, en antikropp mot antingen PSD95 eller synaptophysin upp i musen, och en antikropp mot ett mål protein upp i kanin. Detta gör att tre-färg SIM-analyser.
- Tvätta snabbt brunnarna tre gånger med PBS (200 μL/brunn).
- Lägg till sekundära antikroppar (sekundära antikroppar från DyLight och Alexa kan båda användas) spädas ut i en PBS-lösning som innehåller 1% BSA och 0, 2% Triton X-100 (200 μL/brunn). Inkubera proverna för 1 h vid RT.
- Tvätta snabbt brunnarna tre gånger med PBS (200 μL/brunn).
- Tillsätt Hoechst-färgämne i en koncentration på 1 μg/mL utspädd i PBS (200 μL/brunn) för att fläcka ned kärnor. Inkubera proverna i 10 minuter vid RT.
- Tvätta snabbt brunnarna två gånger med PBS.
- Montera celler med hjälp av en SIM-kompatibel mountant. Använd 10 μL/brunn av ProLong Glass Antifade Mountant.
- Täck över och skydda cellerna med ett täckglas (t.ex. ett runt täckglas med en diameter på 8 mm). Ruta ettor kan också användas.
- Förvara de kammade täcken på RT och vänta minst 48 h innan du skaffar bilder. Diamond Glass kräver minst två dagars härdning innan super-upplösning förvärv.
3. Antikroppsspecifikitetskontroll
OBS: Använd två strategier för att försäkra antikroppssyrealitet. Den första strategin är att använda minst två olika antikroppar riktade mot samma substrat. Den andra strategin är antikroppsneutralisering genom inkubation med det renade proteinmålet eller epitopet som används för att höja antikroppen.
- Inkubera den antikropp som val med fem gånger överskott av det rekombinanta målet eller epitopet i 1 h vid RT i 1% BSA i PBS.
- Efter inkubationen, använd den neutraliserade antikroppen vid den vanliga koncentrationen för färgning enligt ovan beskrivet från 2.11.
4. Mikroskop kalibrering
OBS: Vi använder rutinmässigt en N-SIM Super-Resolution Microscope System som tillverkas av Nikon för super-resolution studier. Men flera andra företag erbjuder också super-resolution mikroskop i sina kataloger. Även om specifika indikationer för Nikons N-SIM-system beskrivs, kan de instruktioner som följer generaliseras till andra system. Innan förvärvet av SIM-bilder, systemet kräver en ordentlig kalibrering med särskilda sub-resolution storlek lysrör pärlor. Ett exempel är TetraSpeck mikrosfärerna. Dessa pärlor färgas med olika fluorescerande färgämnen för att möjliggöra kalibrering av olika lasrar med ett prov.
- I ett vattenbad sonikera runt 1,8 x 108 fluorescerande mikrosfärer i 10 minuter. Nikons N-SIM-system kräver en glest befolkade multicolor pärlor prov för kalibreringen. Detta kan skilja sig åt för andra system som kräver ett tätt enda lager av sub-resolution storlek fluorescerande pärlor. Justera antalet fluorescerande partiklar i enlighet med detta.
- Späd de fluorescerande mikrosfärerna 1:500 i dubbelt destillerat vatten.
- Sonikera en andra gång i ytterligare 10 minuter.
- Pipet 15 μL av de utspädda pärlorna i en brunn av en kammare coverslip.
- Låt lösningen torka i 5 minuter vid RT.
- Tillsätt 10 μL av monteringslösningen och lägg en 8 mm täckplatta ovanpå.
- Vänta minst 48 timmar för att möjliggöra korrekt härdning.
- Slå på mikroskopet och lasrar.
- Låt systemet värmas upp för att nå den termiska jämvikten av alla mikroskopkomponenter. N-SIM Super-Resolution Mikroskop System kräver minst 3 timmar.
- Välj målsättningen 100x.
- Starta kalibreringen genom att rikta in lasrarna till mitten av diffraktionsgallerblocket. I N-SIM-systemet tillåter en mikrometerknopp och en dedikerad kamera centrering av ljusstrålarna till målet.
- Sätt in det kammade täcket i mikroskopet för visning. Ställ in systemet på den kammade täcktjockleken genom att justera den objektiva korrigeringskragen. NIS programvara, den egenutvecklade programvara som tillhandahålls med N-SIM Super-Resolution Mikroskop system, har en automatisk funktion för att reglera korrigering kragar.
- Justera gallerblocksfokus för varje kanal för att säkerställa fokuserad strukturerad mönsterbelysning på provet. NIS programvara ger en automatisk funktion för denna uppgift.
- Nästa, förvärva rå 3D-SIM bilder av multicolor mikrosfärer. Rekonstruera de råa bilderna för att få en super-löst bild med hjälp av mikroskopet programvara eller öppen källkod plattform för analys av biologiska bilder ImageJ24 och plugin fairSIM25.
- Beräkna, för varje separerad våglängd, Fourier-transformen av den super-lösta bilden som erhålls i 4.14. Om den transformerade bilden inte lyckas få ett korrekt blomliknande mönster, starta om kalibreringen från 4.11 sedan superupplösning inte har uppnåtts.
- I den supermatchade bilden väljer du en enda mikrosfär och beräknar dess intensitetsprofil för varje kanal för att mäta den upplösning som uppnåtts. Det bör nu vara nära 100 nm laterally.
- Därefter utför kanalregistrering genom att överlagra ett flerkanaligt förvärv av mikrosfärerna. Målet är att samverka alla kanalsignaler i alls och axiellt. Detta kommer att eliminera kromatiska avvikelser på grund av feljustering av de olika kanalerna och hjälpa samlokalisering analys.
- Bekräfta kvaliteten på kalibreringen genom att använda funktionerna "Illumination Phase Steps" och "Illumination Pattern Focus" på SIMcheck26, en svit av insticksmoduler för open-source-applikationen ImageJ. För detta ändamål förbereda en kammare coverslip för att få ett tätt enda skikt av TetraSpeck mikrosfärer och förvärva en 3D-SIM bild av provet. Analysera bilden i ImageJ och, om avvikelser upptäcks, starta om mikroskopkalibreringen från steg 4.11.
5. Förvärv
- Börja analysera provet med hjälp av ett 40x-mål i konfokalt eller widefield-läge. Detta gör att navigering till provet, upprätthålla bra detaljer och ett stort synfält.
- Använd MAP2 antikroppssignal för att identifiera ett område som representerar neuronala processer.
- Skaffa bilder av provet i konfokalt läge för att bestämma kvaliteten på färgningen. Dålig konfokal kvalitet kommer att återspegla i dålig SIM-kvalitet, därför kräver proverna kasseras.
- Om området och kvaliteten på bilderna är tillfredsställande, växla målet till 100x.
- Applicera olja på 100x-målsättningen.
- Förvärva en vidfältsbild eller konfokal bild som kommer att användas senare för att bedöma kvaliteten på den super-lösta bilden (Bild 1A,B).
- Byt till 3D-SIM-läge.
- Med hjälp av dialogfönster för att ange parametrar för förvärv väljer du den högsta bitdjupsinställning som är tillgänglig för att maximera färginformation. Vanligtvis är 16-bitars standardvalet. För att förbättra signal-brusförhållandet väljer du dessutom ett lågfrekvensvärde för förvärv, till exempel 1 MHz.
- Med hjälp av histogram fönster, ställa in lasrar makt för att få en linjär svar av signal. Undvik att information går förlorad genom att begränsa mättade pixlar i bilderna. N-SIM-systemet använder en Andor iXon3-kamera. När du arbetar på 16-bitars, välj en målintensitet på 16.000 för att säkerställa den linjära svar av kameran. Alternativt väljer du ett intervall mellan 30 000-45 000 för att maximera det dynamiska omfånget i förvärvet.
- Ställ in lasereffekt mellan 0,1 % och 50 % vid avbildning av proverna och exponeringstiderna mellan 50 ms och 2 s. Laserkrafter över 50 % kan orsaka snabb fotoblekning av de fluorforer som används.
- Börja skaffa bilderna i 3D-SIM-läge.
- Använd SIMcheck, en svit av gratis plugins för ImageJ, för att bedöma kvaliteten på förvärvet av de råa bilderna.
- Om SIMCheck inte upptäcker några artefakter eller problem kvalitet, skaffa ett minimum av 10 bilder från 4 tekniska replikat för att möjliggöra statistisk analys.
6. Efterproduktion: bildrekonstruktion
OBS: 3D-SIM förvärvade bilder är råa bilder som måste bearbetas för att erhålla rekonstruerade super-lösta bilder. Felaktig rekonstruktion av råa bilder kan leda till artefakter som skulle påverka analysen av proverna. Stor uppmärksamhet bör därför ägnas åt att korrekt välja återuppbyggnadsparametrar.
- Bearbeta de obehandlade bilderna med hjälp av programvaran för analys av mikroskoprekonstruktion för att få en superförsenad bild (Figur 1C). Alternativt, använd fritt tillgängliga ImageJ plugin fairSIM att rekonstruera råa bilder.
- Beräkna Fourier-transformeringen av de super-lösta bilderna med hjälp av mikroskoprekonstruktionsprogramvaran eller ImageJ-plugin SIMCheck. En bra rekonstruerad bild bör återvända, för varje kanal, en blomma-liknande bild. Om de rekonstruerade bilderna misslyckas med att återskapa en blomliknande form, starta om från de obehandlade bilderna och rekonstruera dem genom att modifiera rekonstruktionsparametrarna som Wiener-filtrering, apodization och zero-order suppression27. I NIS-programvara, med hjälp av förhandsvisningen för att övervaka hur ändra parametrarna påverkar den slutliga löst bild, ändra parametrarna i) Belysning Modulation Kontrast, ii) Hög upplösning Noise Suppression och iii) Out of Focus Suppression.
- Därefter analysera rekonstruerade bilden för att opartiskt upptäcka artefakter med hjälp av NanoJ-SQUIRREL28, en ImageJ-baserad plugin för att bedöma kvaliteten på super-lösta bilder.
- Om NanoJ-SQUIRREL upptäcker artefakter, starta om från de obehandlade bilderna och rekonstruera dem genom att modifiera rekonstruktionsparametrarna som Wiener-filtrering, apodization och zero-order suppression. I NIS-programvara, med hjälp av förhandsvisningen för att övervaka hur ändra parametrarna påverkar den slutliga lösta bilden, ändra parametrarna Illumination Modulation Contrast, High Resolution Noise Suppression och Out of Focus Suppression.
- Använd de super-lösta bilderna för att beräkna samlokaliseringsprofilen och/eller Pearsons och Manders koefficienter.
7. Samlokalisering med profilanalys
OBS: Som ett första steg för att studera samlokalisering mellan synaptiska markörer och ett protein av intresse, ta en super-löst bild och analysera en enda locus att bestämma signal överlappning.
- Identifiera en enda locus på super-löst bild.
- Erhåll intensitetsprofilerna för locusens lysrörssignaler.
- Exportera data.
- Använd GraphPad Prism, eller en liknande analysprogramvara, för att normalisera alla signaltoppar och få jämförbara signalintensiteter för varje kanal med det slutliga målet att bestämma locusspecifik samlokalisering.
8. Kvantifiering av Pearsons och Manders koefficienter
OBS: Om profilanalys har föreslagit enkel locus samlokalisering, en mer allmän analys av hela bilden kan utföras genom att beräkna Pearsons och Manders koefficienter29,30.
- Använd JACoP31, en ImageJ plug-in, för att bestämma de två parametrarna för samlokalisering: Pearsons och Mander's.
9. Statistisk analys
- Använd GraphPad Prism, eller en liknande analys- och grafprogramvara, för att bearbeta data som samlats in med JACoP.
- Använd minst 40 SIM-bilder för varje tillstånd som analyseras för att erhålla grafer och för statistisk relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar här standard arbetsflödet för att studera neuronal proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerade först mikroskopet och nästa vi utförde SIM-analys av proverna. För att kalibrera systemet använde vi fluorescerande mikrosfärer med 0,1 μm diameter. Vid erhållande super-löst 3D-SIM bilder av pärlorna, är den underliggande bilddata Fourier-omvandlas för att åter konvertera dem till en rumslig frekvens representation. I figur 2Apresenteras det distinkta blommönstret som en indikation på detaljnivåer med superupplösning. Vi mätte nästa den upplösning som uppnås genom att beräkna hela bredden vid halv maximal (FWHM) av toppen av en enskild pärlas intensitetsprofil (Figur 2B,C). Slutligen korrigerade vi kromatisk aberration genom kanalregistrering, återigen med hjälp av fluorescerande mikrosfärer (Figur 3A,B). Därefter började vi analysera provet med ett 100x-mål och vi skaffade 3D-SIM-bilder. Vi använde SIMCheck för att bedöma jämnhet av fält-belysning eller rörelse under förvärv (Bild 4A). Vi kontrollerade skillnader i intensitet mellan belysningsmönstervinklarna (Figur 4B) och vi beräknade kvoten för modulationskontrasten till buller för att mäta den lokala randkontrasten (Figur 4C). Slutligen uppskattade vi den effektiva upplösningen av återuppbyggnaden (Figur 4D).
Vi bekräftade nästa kvaliteten på de super-lösta bilderna med hjälp av NanoJ-SQUIRREL. I den första rekonstruerade bilden (Figur 5A), NanoJ-SQUIRREL upptäckt förekomsten av artefakter (Figur 5C). Vi ändrade återuppbyggnadsparametrarna för att få en ny super-löst bild (Figur 5B) och NanoJ-SQUIRREL bekräftade bristen på artefakter (Figur 5D). Efter att ha kalibrerat systemet och bedömt kvaliteten på de rekonstruerade bilderna, började vi nästa analysera de primära neuronala kulturer färgas med en antikropp mot MAP2, en neuronal markör, PSD95, en post-synaptisk markör och målet protein SUMO1. Vi analyserade först provet utför fyra kanaler konfokala mikroskopi med en 40x mål (Figur 6A). Vid valet av ett område som representerar neuronala processer, bytte vi till en 100x mål. Vi förvärvade både confocal och SIM bilder av samma område för att bedöma kvaliteten på återuppbyggnaden med NanoJ-SQUIRREL och utföra samlokalisering analys. I Figur 6B, vi visar super-löst 3D-SIM bild av nervceller färgas för SENP1 och drebrin. Samlokalisering i super-lösta bilder kan analyseras med profilanalys (Bild 7A) och kvantifiering av Pearsons och Manders koefficienter (Figur 7B).
Figur 1: Jämförelse mellan förvärv av widefield, confocal och SIM. (A) Widefield bild av primära hippocampus nervceller immunsed för SENP1 (grön), drebrin (röd) och MAP2 (mauve). DAPI användes för att fläcka kärnor. Skala bar 5 μm. (B) Confocal bild av samma prov av panel A. (C) SIM-bild av samma prov av panel A och B. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av en 3D-SIM-bild av mikrosfärer för mikroskopkalibrering. (A) Fast Fourier transform av ett förvärv av mikrosfärer med sin blomliknande form. (B) Val av en enda mikrosfär för att bestämma lateral rumslig upplösning. (C) Intensitetsprofil för den enda mikrosfären i B med mätning av dess FWHM. Värdena representerar den resolution som uppnås av instrumentet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Tre kanalregistrering. (A) Förvärv av multicolor (våglängder 488nm, 555nm och 647nm) TetraSpeck mikrosfärer före registrering. (B) Förvärv av samma prov efter kalibrering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Kvalitetsbedömning av obearbetade och rekonstruerade bilder med hjälp av SIMcheck. (A) Rörelse och belysning Variation analys med hjälp av SIMCheck. Signal grå till vitt representerar homogen belysning och frånvaro av rörelse under förvärvet. (B) Kanalintensitetsprofil erhållen genom att analysera den obehandlade bilden. I detta exempel finns intensitet variation är minimal, att föreslå brist eller blekning eller fluktuationer. (C) Raw Modulation Kontrast för att beräkna förhållandet mellan moduleringen kontrast-till-brus inom bilden. Värmekartan visar moduleringskontrastvariationer. (D) Rekonstruerade Fourier Plot att analysera amplituden Fourier spektrum för att bestämma den effektiva upplösningen av återuppbyggnaden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Bedömning av superupplösningsbildkvalitet med hjälp av NanoJ-SQUIRREL. (A) Referens super-upplösning bild med artefakter. (B) Referens super-upplösning bild av god kvalitet. (C) Bild som representerar NanoJ-SQUIRREL fel karta över A. Lättare områden representerar storskaliga artefakter, medan mörkare representerar korrekt rekonstruktion. (D) NanoJ-SQUIRREL fel karta över B. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: SIM-bildprov. (A) Konfokalmikroskopi av primära nervceller. Ett 40X-objective valdes för att få en översikt över urvalet samtidigt som god upplösning bibehålls. Celler var immunostained för SUMO1 (grön), PSD95 (röd) och MAP2 (mauve). DAPI användes för att fläcka kärnor. Skala bar 50 μm. Bilder visades som Z-projektion. (B) SIM-bilder för SUMO1 och PSD95 på området som markerats i den gröna rutan i panel A med hjälp av ett 100X-mål. Röda pilspetsar anger positionen för inuppsättningen som visas i A som används för att beräkna intensitetsprofilen. Skala bar 5 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 7: Analys av samlokalisering. (A) Super-löst bild av primära nervceller färgas med en antikropp mot SENP1 (i grönt) och drebrin (i rött), skala bar 0,5 μm, och dess intensitet profil. Grafens värden normaliserades för varje kanal till 100 (godtycklig enhet) och motsvarar pixelintensiteten som visas av den blå pilen. (B) Analys med hjälp av JACoP för att beräkna Pearsons Korrelationskoefficient och Manders koefficient mellan SENP1 och drebrin. Fönster av plugin-programmet som ställts in och visuellt tröskelvärde visas. Manders koefficient uttrycks av två värden – SENP1-bråk som samlokaliserar med drebrin (M1) och den drebrinfraktion som samlokaliserar med SENP1 (M2). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att belysa synapsens struktur och sammansättning är avgörande för att förstå de fysiologiska och patologiska processer som reglerar minne och kognition. Även i det normala tillståndet, synapser är byggstenarna i minnet, de ligger också bakom komplexa neurologiska sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom32. Protokollet som beskrivs här tjänar till att studera samlokalisering av neuronala proteiner med en super-upplösning mikroskopi teknik som kallas SIM. Med hjälp av ett visst ljusmönster kan SIM nå en upplösning på ca 0,1 μm, som är lämpad för studier av synapser, som normalt mäter mellan 0,03 och 0,15 μm. För ännu större detalj, andra super-upplösning tekniker såsom STED (Stimulerad utsläppsutarmning Mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) eller STORM (Stochastic Optisk Rekonstruktion Mikroskopi), som kan nå en upplösning på 10-20 nm, kan tillämpas33.
Här beskriver vi analysen av samlokalisering av målproteiner med synapsmarkörer i primära nervceller. Protokollet kan tillämpas på någon primär kultur av neuronala celler, såsom hippocampus, cerebellar eller kortikala nervceller och även till kulturer av primära nervceller som inte tillhör det centrala nervsystemet, såsom enteric nervsystemet nervceller. Nyckeln till analysen på superupplösningsnivå är dock de reagenser som används vid förvärv, såsom kammaröverdrag och monteringslösningar som är kompatibla med syftets diffraktionsindex. Vi använde chambered coverslips för deras användarvänlighet, men den klassiska, billigare metoden för att odla primära nervceller på belagda coverglass är ändå giltig, särskilt med en hög precision #1.5H (0,17 mm) coverglass. Dessutom bör man använda ett monteringsmedi som kan nå ett refraktionsindex så nära glasets refraktionsindex (1,52) och en nedsänkningsolja för 100x-målsättningen med ett refraktionsindex på 1,515. Konstant rumstemperatur och stabiliserade tabeller är också obligatoriska för att garantera riktigheten av förvärven.
Vi använder både dyLight och Alexa sekundära antikroppar i SIM-studierna. På grund av deras smala toppar av excitation och utsläpp och god kvantavkastning, är de indicerade för super-upplösning tekniker som kräver bästa signal till brusförhållande. Dempsey et al. jämfört Alexa, dyLight och andra fluoroforer för super-upplösning bildbehandling34.
Under förvärvet ställer vi rutinmässigt in kameran på 1 MHz över 10 MHz. 1 MHz, tack vare en långsammare förvärvshastighet, ger bilderna mer noggrannhet och mindre brus än 10 MHz. 1 MHz avläsningsläge kan också spela in med lite djup på 16 bitar (jämfört med maximalt 14 bit av 10 MHz), vilket ger mer färginformation och en mer exakt färggradient till bilderna. Dock är 10 MHz, med sin hastighet, användbart för live-bilder. För att undvika blekning och bevara fluorofor, sätter vi också laserkraft så låg som möjligt. För att förbättra signalintensiteten kan förstärkningsvärden ökas. Det är värt att notera att lägre vinst garanterar renare bilder utan att förbättra buller. I allmänhet erhålls bästa resultat medan bildtagning inom 7 μm från botten av den kamrerade täckslip. Detta är särskilt viktigt när du använder en 100x mål med olja nedsänkning. Om djupare förvärv över cellerna / vävnader krävs, ett bättre val kan vara användningen av en 60x mål med vatten nedsänkning.
En av de största utmaningarna i att utföra SIM-studier är bildrekonstruktion35. Att få super-lösta bilder utan artefakter och villfarelse kräver inte bara användning av ad-hoc experimentella förhållanden, men också noggrann kalibrering av systemet och parameteroptimering för att få de slutliga bilderna. I protokollet beskriver vi hur man undviker några av de vanligaste misstagen genom att bedöma kalibrering av systemet och kvalitetsanalys av råa och rekonstruerade bilder. Specifikt beskriver vi användningen av ImageJ plugins SIMCheck och NanoJ-SQUIRREL för att försäkra korrekta instrumentinställningar för att förhindra vanliga artefakter av super-lösta bilder. Ansökningarna möjliggör en opartisk kvalitetsbedömning av de slutliga bilderna som inte bygger på subjektiv benchmarking av resultaten mot förkunskaper om studiens strukturer.
Vi föreslår att du använder synaptophysin och PSD95 eller drebrin som pre- och post-synaptic markörer, även om andra markörer är giltiga samt. En enorm litteraturkropp beskriver proteiner som fagott som synapsmarkörer36,37. Det är värt att notera att pre- och postynaptic markörer är dock närvarande i hela cellen, exklusive kärnan. Mycket av deras signal är icke-synaptisk men representerar proteiner i transport eller nedbrytning, bakgrund eller andra artefakter. Det är därför viktigt att noga välja området för analysen. Vi använder MAP2 antikroppssignal för att välja axon och dendritiska terminaler.
I analysen av samlokalisering använder vi två tillvägagångssätt. Den första är ett visuellt tillvägagångssätt, baserat på profilanalys som visar enstaka händelser av samlokalisering och identifierar bidraget från varje kanal. En varning för detta tillvägagångssätt är dock den dåliga statistiska makten. Av denna anledning beslutade vi också att använda en andra metod baserad på analys av ett större antal händelser representativa för hela fältet för varje bild. Denna metod bygger på beräkning av Pearsons korrelationskoefficient och Manders M1- och M2-koefficienter. Vi använder Pearsons korrelationskoefficient för att beskriva överlappningen av signaler i bilden och Manders M1 och M2 för att beskriva ömsesidig samlokalisering mellan signaler av intresse38. För beräkningen använder vi ImageJ plugin JACoP, eftersom den har en funktion som gör att du kan ställa in en manuell tröskel för att kassera någon bakgrund bidrag till analysen, särskilt kritiska för Mander analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Edoardo Micotti för konstruktiv kritik av manuskriptet. Denna studie stöddes av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) och av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A.
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T.
- Won, R.
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P.
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H.
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
