Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.
Abstract
Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM). SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von etwa 100 nm erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.
Introduction
Das Verständnis und die Sicht der Synapse hat sich seit ihrer ersten Beschreibung durch Foster und Sherrington im Jahre 1897 enorm verändert1. Seitdem ist unser Wissen über neuronale Kommunikation und die dahinter stehenden molekularen Prozesse exponentiell gewachsen2. Es ist klar geworden, dass Synapsen als ein Zwei-Kompartime-System gedacht werden können: ein präsynaptisches Fach mit Vesikeln für die Freisetzung von Neurotransmittern und ein postsynaptisches Fach mit Rezeptoren3. Diese vereinfachende Sichtweise hat sich in den letzten zwanzig Jahren zu einem komplexen Netzwerk von Proteinen entwickelt, die erforderlich sind, um die Senderbindung in die Signalisierung4zu transduzieren.
Die Gewinne im Verständnis sind teilweise auf Super-Resolution-Techniken zurückzuführen, die die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie überschritten haben, um der Dimension der Synapsen besser5,6,7,8,9,10anzupassen. Aufgrund der Beugungsgrenze kann ein optisches Mikroskop seitlich keine Auflösung über 200 nmerreichen 11,12. Um diese Grenze zu umgehen, wurden Super-Resolution-Techniken entwickelt, die verschiedene Ansätze und verschiedene Sub-Diffraktions-Limit-Auflösungen erreichten: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdoppelt die räumliche Auflösung laserbasierter Weitfeldmikroskopiesysteme, indem ein Beugungsgitter in den Anregungsstrahlpfad15eingebracht wird. Das bewegliche Gitter diffriert die Laserstrahlen, um ein bekanntes Beleuchtungsmuster zu erzeugen, in der Regel Streifen. Dieses zweckdienlich strukturierte Lichtmuster wird der unbekannten räumlichen Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs (der Probe) überlagert. Die Interferenzfranen, die durch die beiden Muster gebildet werden, kodieren für sonst ununterscheidbare Feine Details mit normaler Weitfeldmikroskopie. Das endgültige superaufgelöste Bild wird durch Die Kombination und Dekodierung mit mathematischen Methoden mehrere Rohbilder derselben Probe erhalten durch die Übersetzungen und Drehungen des Beugungsgitters erhalten. Die Auflösung der superaufgelösten Bilder erreicht 100 nm in der Seitlichen und 500 nm in axialen Richtungen für 2D-SIM15 oder 100 nm in der Seitlichen und 250 nm in axialen Richtungen für 3D-SIM16.
Das neue Verständnis der Synapse ist noch wichtiger angesichts der vielen neurologischen Störungen, bei denen synaptische Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei Beginn und Progression17,18. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Parkinson-Krankheit, Prion-Erkrankungen, Epilepsie, Autismus-Spektrum-Störungen und fragile x-Syndrom unter anderem wurden mit Anomalien in der synaptischen Zusammensetzung, Morphologie und Funktion19,,20,21,22verbunden.
Kürzlich haben wir mit einer Reihe von SUMO-spezifischen Antikörpern SIM verwendet, um die Kolokalisierung in primären Hippocampus-Neuronen der SUMO-Proteine mit den prä- und postsynaptischen Markern Synaptophysin und PSD95 auf Superauflösungsebene23zu zeigen. Dies ermöglichte es uns, biochemische und konfokale Mikroskopie-Beweise für die SUMO-Lokalisierung in Neuronen zu bestätigen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Hippocampus-Primärneuronen. Gleichzeitig kann dieses Protokoll an verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen angepasst werden.
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Protocol
1. Primärkulturen
- Kultur Maus Hippocampus primäre Neuronen in kammerförmigen Abdeckungen (wie Ibidi μ-Slide 8 Well oder Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), die die objektive Anforderung für #1,5 (0,17 mm) Abdeckung dicke entsprechen.
- Mantelkammer-Abdeckungen mit 100 l Poly-L-Lysin (100 g/ml).
- Am nächsten Tag die kammerförmigen Deckel zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen.
- Um Maus primär neuronen zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1-P4 Welpen23.
- Legen Sie sezierte hippocampi in 10 ml Dissektionsmedien (Tabelle 1) und lassen Sie sie an der Unterseite der Röhre ablagern.
- Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette vorsichtig die Dissektionsmedien, sodass das Hippocampi am Boden des Rohres ungestört bleibt.
- 10 ml Medien 1 (Tabelle 1) in das Hippocampi geben und 30 Minuten bei 37 °C brüten.
- Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 1, so dass das Hippocampi an der Unterseite des Rohres ungestört bleibt.
- 10 ml Medien 2 (Tabelle 1) hinzufügen und das (gekapselte) Zentrifugenrohr horizontal für 45 Minuten unter der Haube lassen.
- Lassen Sie das Zentrifugenrohr vertikal stehen, damit sich das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen kann.
- Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 2, so dass das Hippocampi am Boden des Zentrifugenrohrs ungestört bleibt.
- Fügen Sie 2 ml Medien 3 hinzu (Tabelle 1).
- Mit einer p1000 Pipette mit gefilterter Spitze, trennen Sie zellen mechanisch vom Gewebe.
- Übertragen Sie den Überstand, in dem sich die isolierten Neuronen befinden, auf ein 15 ml Zentrifugenrohr.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 2 min bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT).
- Nach der Zentrifugation befinden sich die Zellen am Boden des Zentrifugenrohrs. Mit einer sterilen Pipette entsorgen Sie den Überstand.
- ResuspendZellen in 1 ml Von Medien 4.
- Verwenden Sie einen 70-mm-Filter, um nicht soziierte Zellen zu eliminieren.
- Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Bürker-Kammer, indem Sie 1 l von 0,4 % Trypan-Blaulösung zu 19 l der Zellsuspension hinzufügen.
- Plattenzellen bei 70.000 Zellen/Well in einem Volumen von 200 l pro Brunnen.
- Lassen Sie die Zellen für 2 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2anbringen.
- Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator und ersetzen Sie das Medium sorgfältig durch 200 L Kulturmedien.
- Lassen Sie die kammerförmigen Abdeckungen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
- Ersetzen Sie alle 5-7 Tage ein Drittel des Mediums durch frische Kulturmedien.
- Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus vollständig ausgereift sind (12-14 Tage nach der Beschichtung), um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen.
2. Immunfluoreszenzfärbung
- Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator.
- Entfernen Sie das Medium.
- Waschen Sie die Brunnen schnell mit 200 l PBS.
- Fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (200 L/Well) zu Neuronen hinzu, um sie schnell zu beheben.
- Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei RT.
- Entfernen Sie die PFA-Lösung.
- Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie PBS mit 0,2% Triton X-100 (200 l/well) hinzufügen.
- 1 min bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (200 l/well) für 1 h bei RT, um alle freien Bindungsflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken. Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als der gleiche Puffer mit 0,2% Triton X-100.
- Entfernen Sie die Lösung.
- Fügen Sie den primären Antikörper der Wahl in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (120-200 l/well, abhängig von der Antikörperverdünnung und Verfügbarkeit) hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 2 h.
- Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen. Mehrere Antikörper verschiedener Arten gegen unterschiedliche Ziele können gleichzeitig verwendet werden. Verwenden Sie einen Antikörper gegen MAP2 (einen neuronalen Marker), der in Hühnern aufgezogen wird, einen Antikörper gegen PSD95 oder Synaptophysin, der in der Maus aufgezogen wird, und einen Antikörper gegen ein Zielprotein, das bei Kaninchen aufgezogen wird. Dies ermöglicht dreifarbige SIM-Analysen.
- Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).
- Fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu (dyLight und Alexa sekundäre Antikörper können beide verwendet werden), die in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (200 l/well) verdünnt werden. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei RT.
- Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).
- Fügen Sie Hoechst-Farbstoff in einer Konzentration von 1 g/ml in PBS (200 l/well) verdünnt, um Kerne zu färben. Inkubieren Sie die Proben für 10 Minuten bei RT.
- Waschen Sie die Brunnen schnell zweimal mit PBS.
- Mounten Sie Zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant. Verwenden Sie 10 L/Well von ProLong Glass Antifade Mountant.
- Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas (z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von 8 mm). Quadratische können auch verwendet werden.
- Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei RT auf und warten Sie mindestens 48 h, bevor Sie Bilder erfassen. Diamond Glass benötigt mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution-Akquisitionen getätigt werden.
3. Antikörper-Spezifitätskontrolle
HINWEIS: Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Die erste Strategie besteht darin, mindestens zwei verschiedene Antikörper zu verwenden, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder dem Epitop, das zur Erhöhung des Antikörpers verwendet wird.
- Inkubieren Sie den Antikörper der Wahl mit einem fünfmal mehr als dem rekombinanten Ziel oder Epitop für 1 h bei RT in 1% BSA in PBS.
- Verwenden Sie nach der Inkubation den neutralisierten Antikörper in der üblichen Färbungskonzentration, wie oben beschrieben ab 2.11.
4. Mikroskopkalibrierung
HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM Super-Resolution Microscope System von Nikon für die Super-Resolution-Studien. Einige andere Unternehmen bieten in ihren Katalogen aber auch Hochauflösende Mikroskope an. Obwohl spezifische Indikationen für Nikons N-SIM-System beschrieben werden, können die folgenden Anweisungen auf andere Systeme verallgemeinert werden. Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind die TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.
- In einem Wasserbad beschallen sie 1,8 x 108 fluoreszierende Mikrosphären für 10 Minuten. Nikons N-SIM-System benötigt für die Kalibrierung eine dünn besiedelte mehrfarbige Perlenprobe. Dies kann sich bei anderen Systemen unterscheiden, die eine dichte Einzelschicht mit fluoreszierenden Perlen in Subauflösungsgröße benötigen. Passen Sie die Anzahl der fluoreszierenden Partikel entsprechend an.
- Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären 1:500 in doppelt destilliertem Wasser.
- Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.
- Pipetten Sie 15 l der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerkammerigen Deckellips.
- Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei RT trocknen.
- Fügen Sie 10 l der Montagelösung hinzu und legen Sie einen 8 mm Abdeckzettel darüber.
- Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen.
- Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.
- Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen. Das N-SIM Super-Resolution Microscope System benötigt mindestens 3 Stunden.
- Wählen Sie das 100x-Ziel aus.
- Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten. Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel.
- Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf in das Mikroskop ein, um ihn zu betrachten. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckslipdicke ein, indem Sie den Objektivkorrekturkragen anpassen. Die NIS-Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM Super-Resolution Microscope Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion zur Regulierung von Korrekturhalsbändern.
- Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die NIS-Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.
- Als nächstes erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Rekonstruieren Sie die Rohbilder, um ein super aufgelöstes Bild mit der Mikroskop-Software oder der Open-Source-Software-Plattform für die Analyse biologischer Bilder ImageJ24 und das Plugin fairSIM25zu erhalten.
- Berechnen Sie für jede getrennte Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes, das in 4.14 erhalten wurde. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung ab 4.11 neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.
- Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte jetzt in der Nähe von 100 nm seitlich sein.
- Führen Sie als Nächstes die Kanalregistrierung durch, indem Sie eine Mehrkanalerfassung der Mikrosphären überlagern. Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich.
- Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung mit den Funktionen "Illumination Phase Steps" und "Illumination Pattern Focus" von SIMcheck26, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ. Zu diesem Zweck bereiten Sie einen kammerförmigen Abdeckschein vor, um eine dichte Einzelschicht von TetraSpeck-Mikrosphären zu erhalten, und erfassen Sie ein 3D-SIM-Bild der Probe. Analysieren Sie das Bild in ImageJ, und starten Sie die Mikroskopkalibrierung ab Schritt 4.11 neu, wenn Aberrationen erkannt werden.
5. Erwerb
- Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation zum Beispiel, wobei gute Details und ein großes Sichtfeld beibehalten werden.
- Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu identifizieren, der neuronale Prozesse darstellt.
- Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Schlechte konfokale Qualität spiegelt sich in schlechter SIM-Qualität wider, so dass die Proben entsorgt werden müssen.
- Wenn der Bereich und die Qualität der Bilder zufriedenstellend sind, schalten Sie das Ziel auf 100x.
- Öl auf das 100x-Objektiv auftragen.
- Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des super aufgelösten Bildes zu bewerten (Abbildung 1A,B).
- Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus.
- Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren. In der Regel ist 16-Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen niedrigen Frequenzwert für die Erfassung, z. B. 1 MHz.
- Mit Histogrammfenstern können Sie die Leistung von Lasern einstellen, um eine lineare Signalantwort zu erhalten. Um Informationsverlust zu vermeiden, begrenzen Sie gesättigte Pixel in den Bildern. Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16-Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45.000 auswählen, um den Dynamikbereich der Erfassung zu maximieren.
- Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Abbildung der Proben und belichtungszeiten zwischen 50 ms und 2 s ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen.
- Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.
- Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassung der Rohbilder zu bewerten.
- Wenn SIMCheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus 4 technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen.
6. Postproduktion: Bildrekonstruktion
HINWEIS: 3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.
- Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten (Abbildung 1C). Alternativ können Sie das frei verfügbare ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um Rohbilder zu rekonstruieren.
- Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMCheck. Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Null-Ordnungsunterdrückung27ändern. In der NIS-Software, mit der Vorschau zu überwachen, wie das Ändern der Parameter auswirkungen sich auf das endgültige aufgelöste Bild, ändern Sie die Parameter i) Beleuchtung Modulation Kontrast, ii) High Resolution Noise Suppression und iii) Out of Focus Suppression.
- Als Nächstes analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL28verwenden, ein ImageJ-basiertes Plugin, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten.
- Wenn NanoJ-SQUIRREL Artefakte erkennt, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Unterdrückung ohne Ordnung ändern. Ändern Sie in der NIS-Software mithilfe der Vorschau, um zu überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, die Parameter Beleuchtungsmodulationskontrast, Rauschunterdrückung mit hoher Auflösung und Unterdrückung averfokussiert.
- Verwenden Sie die super aufgelösten Bilder, um das Kolokalisierungsprofil und/oder die Koeffizienten von Pearson und Mander zu berechnen.
7. Co-Lokalisierung mit Profilanalyse
HINWEIS: Als ersten Schritt zur Untersuchung der Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappung zu bestimmen.
- Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild.
- Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale des Ortes von Interesse.
- Exportieren Sie die Daten.
- Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analysesoftware, um alle Signalspitzen zu normalisieren und vergleichbare Signalintensitäten für jeden Kanal zu erhalten, mit dem Endziel, die locus-spezifische Co-Lokalisierung zu bestimmen.
8. Quantifizierung der Koeffizienten von Pearson und Mander
ANMERKUNG: Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander29,30durchgeführt werden.
- Verwenden Sie JACoP31, ein ImageJ-Plug-In, um die beiden Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen: Pearson es und Mander's.
9. Statistische Analyse
- Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analyse- und Grafiksoftware, um mit JACoP gesammelte Daten zu verarbeiten.
- Verwenden Sie mindestens 40 SIM-Bilder für jede analysierte Bedingung, um Diagramme zu erhalten und um statistische Relevanz zu erhalten.
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Representative Results
Wir präsentieren hier den Standard-Workflow zur Kolokalisierung neuronaler Proteine. Wir haben zuerst das Mikroskop kalibriert und als nächstes die SIM-Analyse der Proben durchgeführt. Zur Kalibrierung des Systems verwendeten wir fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 m. Nach dem Erhalt von super aufgelösten 3D-SIM-Bildern der Perlen werden die zugrunde liegenden Bilddaten Fourier-transformiert, um sie in eine räumliche Frequenzdarstellung umzuwandeln. In Abbildung 2Awird das unterschiedliche Blütenmuster als Hinweis auf Die Detailebenen mit Superauflösung dargestellt. Als nächstes haben wir die erreichte Auflösung gemessen, indem wir die volle Breite auf das halbe Maximum (FWHM) des Spitzenwerts des Intensitätsprofils einer einzelnen Perle berechnet haben (Abbildung 2B,C). Schließlich korrigierten wir die chromatische Aberration durch Kanalregistrierung, wiederum mit fluoreszierenden Mikrosphären (Abbildung 3A,B). Als nächstes begannen wir, das Sample mit einem 100-fachen Objektiv zu analysieren und erwarben 3D-SIM-Bilder. Wir haben SIMCheck verwendet, um die Gleichmäßigkeit der Feldbeleuchtung oder Bewegung während der Erfassung zu bewerten (Abbildung 4A). Wir überprüften die Intensitätsunterschiede zwischen den Beleuchtungsmusterwinkeln (Abbildung 4B) und berechneten das Verhältnis des Modulationskontrasts zu rauschen, um den lokalen Streifenkontrast zu messen (Abbildung 4C). Schließlich haben wir die effektive Lösung der Rekonstruktion geschätzt (Abbildung 4D).
Als nächstes bestätigten wir die Qualität der super aufgelösten Bilder mit NanoJ-SQUIRREL. Im ersten rekonstruierten Bild (Abbildung 5A) entdeckte NanoJ-SQUIRREL das Vorhandensein von Artefakten (Abbildung 5C). Wir änderten die Rekonstruktionsparameter, um ein neues superaufgelöstes Bild zu erhalten (Abbildung 5B) und NanoJ-SQUIRREL bestätigte den Mangel an Artefakten (Abbildung 5D). Nachdem wir das System kalibriert und die Qualität der rekonstruierten Bilder bewertet hatten, begannen wir als nächstes, die primären neuronalen Kulturen zu analysieren, die mit einem Antikörper gegen MAP2, einen neuronalen Marker, PSD95, einen postsynaptischen Marker und das Zielprotein SUMO1 gefärbt waren. Wir analysierten zuerst die Probe, die eine vierkanalige konfokale Mikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv durchführte (Abbildung 6A). Bei der Auswahl eines Bereichs, der neuronale Prozesse darstellt, haben wir auf ein 100-faches Ziel umgestellt. Wir haben sowohl Konfokal- als auch SIM-Bilder aus dem gleichen Bereich erworben, um die Qualität der Rekonstruktion mit NanoJ-SQUIRREL zu bewerten und eine Co-Lokalisierungsanalyse durchzuführen. In Abbildung 6Bzeigen wir das superaufgelöste 3D-SIM-Bild von Neuronen, die für SENP1 und Drebrin gebeizt wurden. Die Kolokalisierung in super aufgelösten Bildern kann mit Profilanalyse analysiert werden (Abbildung 7A) und Quantifizierung der Koeffizienten von Pearson und Mander (Abbildung 7B).
Abbildung 1: Vergleich von Widefield-, Konfokal- und SIM-Akquisitionen. (A) Weitfeldbild der primären Hippocampus-Neuronen immunostainiert für SENP1 (grün), Drebrin (rot) und MAP2 (mauve). DAPI wurde verwendet, um Kerne zu färben. Skala bar 5 m. (B) Konfokales Bild der gleichen Probe des Panels A. (C) SIM-Bild der gleichen Probe des Panels A und B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyse eines 3D-SIM-Bildes von Mikrosphären zur Mikroskopkalibrierung. (A) Schnelle Fourier-Transformation eines Erwerbs von Mikrosphären mit seiner blütenähnlichen Form. (B) Auswahl einer einzelnen Mikrosphäre zur Bestimmung der lateralen räumlichen Auflösung. (C) Intensitätsprofil der einzelnen Mikrosphäre in B mit der Messung ihres FWHM. Die Werte stellen die Auflösung dar, die durch das Instrument erreicht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dreikanalregistrierung. (A) Erfassung von mehrfarbigen (Wellenlängen 488nm, 555nm und 647nm) TetraSpeck Mikrosphären vor der Registrierung. (B) Erfassung derselben Probe nach der Kalibrierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Qualitätsbewertung von Roh- und rekonstruierten Bildern mit SIMcheck. (A) Bewegungs- und Beleuchtungsvariationsanalyse mit SIMCheck. Signalgrau bis Weiß steht für homogene Ausleuchtung und Bewegungsausfall während der Erfassung. (B) Kanalintensitätsprofil, das durch Analysieren des Rohbildes ermittelt wird. In diesem Beispiel gibt es Intensitätsvariation ist minimal, um Mangel oder Bleichen oder Schwankungen zu suggerieren. (C) Rohmodulationskontrast, um das Verhältnis des Modulationskontrasts zu dem Rauschen innerhalb des Bildes zu berechnen. Die Heatmap zeigt Modulationskontrastabweichungen. (D) Rekonstruiertes Fourier-Plot zur Analyse des Amplituden-Fourier-Spektrums, um die effektive Auflösung der Rekonstruktion zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bewertung der Bildqualität mit Superauflösung mit NanoJ-SQUIRREL. (A) Referenz bild mit Superauflösung mit Artefakten. (B) Referenz-Superauflösung Bild von guter Qualität. (C) Bild, das NanoJ-SQUIRREL Fehlerkarte von Adarstellt. Leichtere Bereiche stellen große Artefakte dar, während dunklere Artefakte eine korrekte Rekonstruktion darstellen. (D) NanoJ-SQUIRREL Fehlerkarte von B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: SIM-Bildbeispiel. (A) Konfokale Mikroskopie der primären Neuronen. Ein 40X-Ziel wurde gewählt, um einen Überblick über die Probe zu erhalten und gleichzeitig eine gute Auflösung beizubehalten. Die Zellen wurden für SUMO1 (grün), PSD95 (rot) und MAP2 (mauve) immungefärbt. DAPI wurde verwendet, um Kerne zu färben. Skalenstange 50 'm. Bilder wurden als Z-Projektion angezeigt. (B) SIM-Bilder für SUMO1 und PSD95 auf dem Im grünen Feld im Panel A mit einem 100X-Objektiv hervorgehobenen Bereich. Rote Pfeilspitzen geben die Position des Eintsets an, das in A zur Berechnung des Intensitätsprofils angezeigt wird. Skala bar 5 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Analyse der Kolokalisierung. (A) Super-aufgelöstes Bild der primären Neuronen, die mit einem Antikörper gegen SENP1 (in grün) und Drebrin (in rot), Skalenbalken 0,5 m und dessen Intensitätsprofil gefärbt sind. Die Werte des Diagramms wurden für jeden Kanal auf 100 normalisiert (willkürliche Einheit) und entsprechen der Pixelintensität, die durch den blauen Pfeil angezeigt wird. (B) Analyse mit JACoP zur Berechnung des Pearson-Korrelationskoeffizienten und des Mander-Koeffizienten zwischen SENP1 und Drebrin. Fenster der Plug-In-Einrichtung und des visuellen Schwellenwerts werden angezeigt. Der Mander-Koeffizient wird durch zwei Werte ausgedrückt – SENP1-Fraktion, die mit Drebrin (M1) kolokalisiert wird, und die Drebrin-Fraktion, die mit SENP1 (M2) kolokalisiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand, Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie auch zugrunde liegen komplexe neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit32. Das hier beschriebene Protokoll dient dazu, die Kolokalisierung neuronaler Proteine mit einer superhochauflösenden Mikroskopietechnik namens SIM zu untersuchen. Mit Hilfe eines bestimmten Beleuchtungsmusters kann SIM eine Auflösung von etwa 0,1 m erreichen, die für die Untersuchung von Synapsen geeignet ist, die normalerweise zwischen 0,03 und 0,15 m messen. Für noch detailliertere Details können andere Superauflösungstechniken wie STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) oder STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), die eine Auflösung von 10-20 nm erreichen können, angewendet werden33.
Hier beschreiben wir die Analyse der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in primären Neuronen. Das Protokoll kann auf jede primäre Kultur von neuronalen Zellen angewendet werden, wie Hippocampus, Kleinhirn oder kortikale Neuronen und sogar auf Kulturen von primären Neuronen, die nicht zum zentralen Nervensystem gehören, wie neuronische Neuronen des enterischen Nervensystems. Der Schlüssel zur Analyse auf Superauflösungsebene sind jedoch die bei der Erfassung verwendeten Reagenzien, wie z. B. kammerförmige Abdeckungen und Montagelösungen, die mit dem Beugungsindex des Ziels kompatibel sind. Wir verwendeten kammerförmige Abdeckungen für ihre Benutzerfreundlichkeit, aber die klassische, billigere Methode, Primärneuronen auf beschichtetem Deckglas anzubauen, ist dennoch gültig, insbesondere mit einem hochpräzisen #1,5H (0,17 mm) Deckglas. Darüber hinaus sollte ein Montagemedium verwendet werden, das einen Brechungsindex erreichen kann, der so nah wie möglich am Brechungsindex von Glas (1,52) liegt, und ein Tauchöl für das 100-fache Objektiv mit einem Brechungsindex von 1.515. Konstante Raumtemperatur und stabilisierte Tische sind ebenfalls obligatorisch, um die Genauigkeit der Erfassungen zu gewährleisten.
Wir verwenden sowohl dyLight als auch Alexa Sekundärantikörper in den SIM-Studien. Aufgrund ihrer engen Spitzen der Anregung und Emission und der guten Quantenausbeute sind sie für Super-Resolution-Techniken gekennzeichnet, die das beste Signal-Rausch-Verhältnis erfordern. Dempsey et al. verglichen Alexa, dyLight und andere Fluorophore für Super-Auflösung Bildgebung34.
Während der Aufnahme stellen wir die Kamera routinemäßig auf 1 MHz über 10 MHz ein. 1 MHz, dank einer langsameren Erfassungsgeschwindigkeit, gibt den Bildern mehr Genauigkeit und weniger Rauschen als 10 MHz. 1 MHz Auslesemodus kann auch mit einer Bittiefe von 16 Bit (im Vergleich zu den maximalen 14 Bit von 10 MHz) aufnehmen, was mehr Farbinformationen und einen präziseren Farbverlauf zu den Bildern gibt. Jedoch, 10 MHz, mit seiner Geschwindigkeit, ist nützlich für Live-Bilder. Um Bleichen zu vermeiden und Fluorophor zu erhalten, stellen wir auch die Laserleistung so gering wie möglich. Um die Signalintensität zu verbessern, können Gain-Werte erhöht werden. Es ist erwähnenswert, dass niedrigere Verstärkung sauberere Bilder garantiert, ohne das Rauschen zu verbessern. Im Allgemeinen werden die besten Ergebnisse erzielt, während die Bildgebung innerhalb von 7 m von der Unterseite des kammerierten Deckellipses aus abbildend ist. Dies ist besonders wichtig, wenn ein 100-faches Objektiv mit Öleintauchen verwendet wird. Wenn eine tiefere Erfassung über die Zellen/Gewebe erforderlich ist, kann die Verwendung eines 60-fachen Objektivs mit Wassereintauchen eine bessere Wahl sein.
Eine der größten Herausforderungen bei der Durchführung von SIM-Studien ist die Bildrekonstruktion35. Die Beschaffung von superaufgelösten Bildern ohne Artefakte und Aberration erfordert nicht nur die Verwendung von Ad-hoc-Experimentalbedingungen, sondern auch eine sorgfältige Kalibrierung des Systems und die Parameteroptimierung, um die endgültigen Bilder zu erhalten. Im Protokoll beschreiben wir, wie man einige der häufigsten Fehler vermeiden kann, indem die Kalibrierung des Systems und die Qualitätsanalyse von rohen und rekonstruierten Bildern bewertet werden. Insbesondere beschreiben wir die Verwendung der ImageJ-Plugins SIMCheck und NanoJ-SQUIRREL, um korrekte Geräteeinstellungen zu gewährleisten, um häufige Artefakte von super aufgelösten Bildern zu verhindern. Die Anwendungen ermöglichen eine unvoreingenommene Qualitätsbewertung der endgültigen Bilder, die nicht auf subjektiven Benchmarking der Ergebnisse mit Vorkenntnissen der Studienstrukturen basiert.
Wir empfehlen die Verwendung von Synaptophysin und PSD95 oder Drebrin als prä- und postsynaptische Marker, obwohl auch andere Marker gültig sind. Ein riesiger Literaturkörper beschreibt Proteine wie Fagott als synaptische Marker36,37. Es ist erwähnenswert, dass prä- und postsynaptische Marker jedoch in der gesamten Zelle vorhanden sind, mit Ausnahme des Zellkerns. Ein Großteil ihres Signals ist nicht synaptisch, stellt aber Proteine im Transport oder Abbau, Hintergrund oder andere Artefakte dar. Daher ist es wichtig, den Bereich der Analyse sorgfältig zu wählen. Wir verwenden MAP2 Antikörpersignal, um Axon- und Dendritische Klemmen zu wählen.
Bei der Analyse der Co-Lokalisierung verwenden wir zwei Ansätze. Der erste ist ein visueller Ansatz, der auf einer Profilanalyse basiert, die einzelne Ereignisse der Kolokalisierung zeigt und den Beitrag der einzelnen Kanäle identifiziert. Ein Vorbehalt dieses Ansatzes ist jedoch die schlechte statistische Leistung. Aus diesem Grund haben wir uns auch für eine zweite Methode entschieden, die auf der Analyse einer größeren Anzahl von Ereignissen basiert, die für das gesamte Feld jedes Bildes repräsentativ sind. Diese Methode basiert auf der Berechnung des Pearson-Korrelationskoeffizienten und der M1- und M2-Koeffizienten von Mander. Wir verwenden den Korrelationskoeffizienten des Pearson, um die Überlappung von Signalen im Bild und Manders M1 und M2 zu beschreiben, um die gegenseitige Kolokalisierung zwischen Interessensignalen38zu beschreiben. Für die Berechnung verwenden wir das ImageJ-Plugin JACoP, da es eine Funktion hat, mit der Sie einen manuellen Schwellenwert festlegen können, um jeden Hintergrundbeitrag zur Analyse zu verwerfen, besonders wichtig für Manders Analyse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Edoardo Micotti für die konstruktive Kritik an dem Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt von BrightFocus A2019296F, von Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), von Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) und vom Marie Skéodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
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