Summary
此协议的目标是将优化的组织分离协议应用于脊髓损伤的鼠标模型，并验证通过流细胞学进行单细胞分析的方法。
Abstract
我们描述了脊髓损伤在小鼠的实施，以引起脱毛器括约肌发育不良，功能性膀胱出口阻塞，以及随后的膀胱壁改造。为了促进评估非损伤控制和脊髓损伤小鼠膀胱壁的细胞组成，我们开发了一个优化的分离方案，支持高细胞存活率，并允许通过流细胞检测离散亚人口。
脊髓损伤是由胸脊髓的完全转位造成的。在组织收获时，动物在深度麻醉下注入磷酸盐缓冲盐水，膀胱被收获到Tyrode的缓冲液中。组织在消化缓冲区孵化之前切碎，消化缓冲区根据小鼠膀胱的胶原蛋白含量进行优化，通过对公开的基因表达数据库的询问确定。单细胞悬浮后，通过流细胞学分析材料，以评估细胞存活率、细胞数和特定子群落。我们证明，该方法产生细胞群超过90%的生存能力，并有力地表示细胞的间质和上皮起源。这种方法将能准确分析小鼠膀胱和其他器官中的离散细胞类型。
Introduction
正常尿囊功能的扰动会导致许多人生活质量下降。为了更好地了解损伤或疾病如何破坏膀胱的正常功能，重要的是要探索膀胱内细胞的正常生物状态，以及它们在实验扰动下是如何变化的。然而，迄今为止，尿囊内的特定细胞群以及它们如何随损伤而变化，其特征尚未完全确定。
单细胞剖析方法，如流细胞切除术或单细胞RNA测序（scRNA-seq），有可能揭示膀胱内的特定细胞类型。然而，要使这些方法成为信息性组织，必须以不影响收获组织的生存能力、基因表达和代表性细胞群百分比的方式进行消化。采用酶分聚的方案可以通过不分青红皂白的蛋白酶活性1影响表面标记表达，从而通过流细胞学影响细胞识别，而分离过程本身可导致立即早期基因的诱导，正如范登布林克及其同事最近描述的那样。作者表明，虽然受分离影响的亚人口很少，但由于即时早期基因的表达水平较高，它可能会在批量表达研究中触发强烈的污染信号。此外，分离协议的持续时间影响了某些亚种群所特有的基因的体积表达水平。因此，在不考虑分离协议影响的情况下生成的单个细胞数据集可能会产生分离方法产生的基因表达变化，而不是基础生物学。这些观察表明，发表的单细胞转录经济学数据应谨慎解释，结果应通过独立方法进行验证。
虽然，苛刻和冗长的分离方法可能会改变细胞2中的基因表达：有效分离细胞对于准确表示存在的细胞类型至关重要。由于膀胱是一个复杂的器官，由多种细胞类型组成，因此一些群体，如尿道细胞或频闪细胞，可能相对代表不足，而其他细胞类型，如成纤维细胞存在于细胞外基质内，可能难以分离。分离变得更加具有挑战性，如果膀胱经历了重大的改造和纤维化，如在脊髓损伤3，4或膀胱出口障碍5，6观察到。
在这里，我们描述了脊髓损伤小鼠膀胱下游单细胞分析的优化组织分离方法。使用流细胞学，我们比较了四种酶消化方案，它们能够产生单个细胞悬浮，支持细胞存活率，并保持细胞群的正确比例。基于这一分析，我们得出结论，尽量减少细胞死亡、细胞聚集物、非细胞核酸和下游分析的潜在抑制剂对于实现高质量的数据至关重要。
Protocol
这些程序是严格按照国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南中的建议执行的。所有实验都得到了波士顿儿童医院动物护理和使用委员会的批准。
注：老鼠被安置在AAALAC认可的动物设施中，可以接触到食物和水。这些实验使用了8-u201212周大的雌性小鼠。鉴于伤害的性质，为小鼠提供了额外的营养丰富，以确保它们的福祉。
1. 小鼠低胸脊髓转位
- 脊髓转选前的准备
注：此手术所需的手术器械为微解剖弹簧剪刀、微解剖钳、微缝针驱动器、造血剂和 7-0 多胶素 910 缝合。其他需要的手术用品包括手术窗帘、手术场的无菌床单、纱布海绵、棉尖施用器和带25G针头的1 mL注射器。- 手术前自动切除手术器械和用品。
- 用酒精湿巾清洁手术区和加热垫。一个加热垫将在手术期间使用，另一个用于术后立即保持动物的体温，直到恢复充分活动。
- 使用放大放大器（2.5倍或更多）执行外科手术。
- 打开加热垫、光源和玻璃珠消毒器，准备在手术过程中使用。
- 打开手术窗帘和仪器。使用无菌手套将手术场披上，并将仪器放置在手术场中。
- 动物的准备
- 将小鼠带到手术室，并为脊髓受伤的小鼠带上干净的笼子。
- 将鼠标放入感应室，异氟流设置为 3.0%，氧气流量为 1 L/min，吸力为 20 mmHg，直到没有爪夹响应，从而进行麻醉。
- 立即称量动物，然后将动物放在加热垫上的易发位置。
- 将麻醉锥体紧贴在鼠标的鼻子上，将气体流从感应室切换到鼻锥，并将异氟气流设置为 2%，氧气流为 1 L/min。
- 确认动物在没有对爪子捏的响应的情况下充分麻醉。将动物的四肢胶带到加热垫上。将一块卷起的纱布海绵放在下胸部下部，以提升和弯曲打开下胸椎骨。
- 将眼科润滑剂涂抹在双眼上。施用止痛药（甲氧西卡姆，10毫克/千克，皮下）和抗生素（恩罗弗洛沙辛，5毫克/千克，皮下）。
注：最终使用者应使用当地动物护理和使用委员会推荐的止痛药和抗生素。 - 触觉胸椎中最突出的旋转过程，通常与T13旋转过程7相对应。将鼠标背面的纵向矩形区域从下颈部剃到最突出的旋转过程 （T13） 下方，并在中线的每一侧剃掉 1 厘米。
- 手术
- 用 10% 的 povidone 碘溶液和 70% 的乙醇以圆形方式准备剃须区域三次，从切口部位向外工作开始，然后用无菌的 4 x 4 纱布海绵覆盖动物，在手术场中央有一个窗口。
- 使用在最突出的旋转过程 （T13） 结束时的细剪刀在背部中线切口 1.5 厘米。切口应包括皮肤和表面筋膜。使用剪刀将两侧的皮肤和表面筋膜分开，以暴露脊柱过程和周围的寄生肌肉。
- 使用尖锐和钝的解剖将肌肉与T9、T10和T11椎骨的旋转过程和层压分离。
- 用细剪刀将T9和T10之间的交叉韧带和T10和T11之间的韧带严重分割，然后切除T10的脊柱过程，并仔细进行T10层压切除术，以暴露脊髓。确保层压完全去除。
- 使用细剪刀切除脊髓。由于脊髓血管的转位，此时通常会发生最小出血。用无菌棉尖施用器压缩出血面积，实现止血。确认完全血吸虫后，用 7-0 多糖素 910 连续缝合皮肤。
- 皮下施用1 mL盐溶液，防止术后脱水。
- 术后护理
- 将动物放在加热垫上，直到完全恢复，然后转移到只有脊髓受伤的老鼠的笼子里。
- 术后护理包括每天观察和称量动物，以及监测切口部位的感染迹象长达7天。每天在皮下施用1 mL盐水溶液、镇痛剂（甲氧西卡姆10毫克/千克）和抗生素（enrofloxacin 5毫克/千克）。
注：最终使用者应使用当地动物护理和使用委员会推荐的止痛药和抗生素。 - 每12小时进行一次手动膀胱表达（Credé机动），直到动物能够自己小便（通常在10至14天内）。用一只手握住动物，用另一只手按摩下腹部，然后用食指和拇指感觉并轻轻地压缩分散的尿囊。温和的瞬态压缩应与放松交替。手动表达后，用自来水清洗下腹部，用纸巾轻轻擦干，不会过度摩擦。
注：在表达开始前膀胱的一小尺寸和尿液下腹部的湿润表明动物已经获得了自己失效的能力。 - 为了尽量减少体重减轻，以营养凝胶和其他营养食品（培根软糖、水果脆饼和蔬菜叮咬）的形式为小鼠提供营养丰富，这些食物被放置在笼子的地板上，便于进入。
- 术后并发症
- 通过不完全表达膀胱来最大限度地降低膀胱破裂的可能性，因为手动膀胱表达过于热情。
- 通过用自来水清洗腹膜区域，防止腹膜皮肤连续暴露在不称职的括约肌中。通过应用三重抗生素软膏，最大限度地减少炎症。
注：在瞬时血尿期间，或由于雄性小鼠逆行射精而引起的血栓梗阻，可能发生脊髓损伤后。雄性小鼠完全尿道阻塞经常导致膀胱破裂和死亡。根据我们的经验，导致死亡的雄性小鼠尿道阻塞的频率是10%。
2. 注入和组织采购
注：对于某些细胞类型的下游分析，如外周组织中的免疫细胞，在组织收获时通过注水去除血液是有益的，如下所述。
- 手术中提到的麻醉（第2.2步），并确认动物被充分麻醉，没有前兆捏反应（动物是截瘫的，因此后肢感觉减弱，后爪捏反应变得无关紧要）。
- 将动物放在超正位置，用70%的乙醇拭拭腹部和胸部，以湿润毛皮，防止其进入操作部位。
- 从骨盆到隔膜进行中线腹腔切除术。将隔膜从肋骨上剪下来。
注意：按照这一步骤，速度是重要的，因为胸腔压力差不再存在，肺不能膨胀，所以动物开始窒息。 - 沿着左侧和右侧的肋骨切开，沿着与胸骨平行的线的骨软骨边框，从隔膜开始，一直走到第一根肋骨。
- 将完整的前胸壁放在动物的头上，并用毛巾夹将其固定在这个位置。不要切断前胸壁，因为这会导致两条内胸动脉严重出血。
- 用细剪刀切掉围场。
- 将 23 G 针连接到注水装置，然后将其插入左心室并慢慢插入主动脉，注意不要刺穿它。
注：灌注装置包括一个灌注泵和50 mL注射器连接到静脉输液管。 - 开始灌注，并迅速用细剪刀尖在右中庭进行小切口排水。在输液过程中注意不要引入气泡。
- 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液进行灌注，运行速度为 15 mL/min。当排水清晰，肝脏颜色变浅时，灌注完成（图1）。
注：平均输液时间为3.5-4分钟。输液不足表现为组织发白进展缓慢，通常是由于针头在左心室的位置不正确。调整针头，将输液时间延长1至2分钟，将确保组织充分注入。 - 停止输液，从血管足部和尿道中分离出膀胱，并将其放置在含有冰冷泰罗德溶液的微中心水管中。
3. 控制性尿囊和脊髓损伤小鼠的消化
注：为了形成适合小鼠尿囊的有效消化混合物，我们寻求调整用于降解主要细胞外基质成分（如胶原蛋白和透明质酸）的酶单位。因此，我们使用鼠标 ENCODE 项目 （生物项目： PRJNA66167） 生成的公开 RNA 测序数据来提取每千基基百万分之一 （RPKM） 和 Tabula Muris8 的读数，用于评估膀胱内的空间表达。胶原蛋白1、3和6是42种不同胶原蛋白（图2A）中表达最为高的三个基因。这些胶原蛋白和透明质合成酶1（Has1）的表达大多在膀胱壁的肌肉细胞和成纤维细胞（图2B）中观察到。
- 准备缓冲区和解决方案
- 在干净的 500 mL 瓶中按照 表 1 准备酪化钠溶液。添加300毫升的ddH2O。制备后溶液为酸性。使用NaOH将pH调整为7.4。使用双蒸馏H2O将体积调至500 mL，然后在-20°C下进行点名和存储。
注：此缓冲器可保持消化缓冲液中的pH值和渗透平衡，并为细胞提供水和必要的无机离子。它含有镁，以及葡萄糖作为能量来源。溶液中的钾对分离细胞溶液中的机电活动具有保护作用。粉末盐是湿润的，应防止水分。混合的整个内容应在准备后立即使用。不建议准备浓缩盐溶液，因为沉淀物可能形成。如果细胞在分析后要培养，则可以使用过滤（0.22 μm 过滤器）进行灭菌。 - 通过为每个组件添加推荐的体积和量（表 2），在 15 mL 圆锥管中准备酶消化液。添加钠泰罗德溶液高达 2.5 mL。漩涡彻底溶解。
注：木瓜是来自卡丽卡木瓜乳胶的硫氢蛋白酶。帕潘具有广泛的特异性，它会降解大多数蛋白质基质9。帕潘已经证明比细胞分离协议10中的其他蛋白酶的危害性更小，效果更强。我们提供 表2中的四个分离协议的详细信息：我们遵守协议第3节，以支持最高的可行性（93%）从小鼠膀胱准备的细胞悬浮物。
- 在干净的 500 mL 瓶中按照 表 1 准备酪化钠溶液。添加300毫升的ddH2O。制备后溶液为酸性。使用NaOH将pH调整为7.4。使用双蒸馏H2O将体积调至500 mL，然后在-20°C下进行点名和存储。
- 分离程序和细胞悬浮的准备
- 在输液后从小鼠身上收集膀胱。
- 穿刺膀胱释放内容，如果有的话。
- 将 100μL 的 Tyrode 溶液添加到空的 1.5 mL 离心管和塔雷中。将膀胱放在管子中，再称重以确定准确的膀胱重量。
- 将膀胱放在冰上 10 厘米的培养皿上，并加入 100μL 的 Tyrode 溶液进行切碎。
- 使用手术剪刀，尽可能小地切割碎片，同时将切碎时间最小化为每个膀胱不超过 2\u20123 分钟。如果从多种动物中汇集膀胱组织，一次切碎膀胱。
- 使用宽孔移管尖将切碎的膀胱组织转移到每个膀胱的 2.5 mL 消化缓冲液中。如果汇集了多个膀胱，则调整体积。在37°C的消化液中孵育组织，在螺母搅拌机上孵化40分钟。
- 在潜伏期结束时，从孵化器中取出消化管。使用 5 mL 移液器进行 1 分钟的三叶草（上下管道）消化溶液。
- 离心机10分钟，350 x g，4°C。 取出超纳坦，在1mL的细胞分离溶液中重新悬浮颗粒。在螺母搅拌机上放置37°C的孵化器10分钟。
- 离心机10分钟，350 x g，4°C。 取出超纳坦，在 1 mL 的 RBC 裂解缓冲区 （1x） 中重新悬浮颗粒。孵化1分钟。
- 添加 9 mL PBS 以稀释 RBC 缓冲区并停止 RBC 裂解。
- 将细胞通过 70μm 细胞滤网进入 50 mL 圆锥管，使用注射器中的柱塞轻轻刮擦细胞滤网，以确保完全细胞通过。请确保收集通过过滤器但可能夹在过滤器下侧的液体。
- 离心机10分钟，350 x g，4°C。 取出超纳坦，在 200μL 的细胞染色缓冲区（带 2% FBS 的 PBS）中重新悬浮颗粒。
- 数细胞。
- 流细胞切除术特定细胞的免疫带
注：为了检测膀胱中不同类型的细胞，我们设计了一个多色流细胞学面板。为了进行补偿并设计适当的门控策略，我们包括未染色和荧光减去一 （FMO） 控制。FMO 控制对于门正人口非常重要，尤其是当正部分变暗时。染色程序如下。-
阻断细胞上的FcγRII/III受体
注：我们建议通过预孵育具有单克隆抗Fc受体抗体或重组Fc蛋白的细胞来阻止单克隆抗体的非特异性结合。- 在 4 °C 下以 350 x g 的离心洗净细胞 5 分钟，并添加细胞染色缓冲区。
- 丢弃超纳坦剂，在细胞上阻断FcγRII/III受体，防止非特异性抗体染色，在细胞染色缓冲区添加CD16和CD32抗体，稀释1：100。
- 在冰上孵育10分钟。
注意：无需清洗细胞：在此阶段之后，细胞可以直接染色。
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染色 FMOs
注意：荧光减去一 （FMO） 控制是实验中使用的所有荧光素管，其中包含除一个以外的所有荧光素。- 例如，如果一个人有4种不同的氟铬（A、B C和D+附件五和碘化铀（PI），则准备FMO管如下。FMO管1：与B、C、D氟铬+（附件V和PI）结合的抗体;FMO管2：与A、C、D氟铬+（附件V和PI）结合的抗体;FMO管3：与A、B、C荧光胶结合的抗体+（附件V和PI）;FMO管4：与A、B、C、D氟铬+（附件五）结合的抗体;FMO管5：与A、B、C、D荧光+（PI）结合的抗体。
- 考虑附件 V 抗体的结合荧光素的性质。
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用所需的抗体染色阻塞的细胞
- 在冰上对所需的蛋白质进行适当的荧光结合抗体的混合，在冰上孵化阻塞的细胞，防止光线照射20分钟。请记住包括FMO。
- 用1 mL的细胞染色缓冲液清洗电池添加到每个管子中，然后在350 x g 再次离心，在10°C下5分钟。
- 丢弃超纳坦，在200μL的细胞染色缓冲区重新悬浮细胞颗粒。保持冰上，直到荧光数据可以使用流细胞计获得。
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应用附件 V/PI 污渍。
- 在 1x 附件绑定缓冲区中准备 PI （100 μg/mL） 的工作解决方案，如制造商的死亡细胞凋亡套件协议中所述。
- 确定细胞密度并注意存储它们的缓冲区和体积。
- 离心机样品在 350 x g 5 分钟内，将超纳坦和重新悬浮的细胞丢弃在 1x 附件结合缓冲区中，密度为 ±1 x 106 细胞/mL，体积为 100μL。
- 将 FITC-附件 V （5 μL） 和 PI 工作解决方案 （1 μL） 添加到每个样品 （100 μL），如制造商协议中所述，并在室温下孵育 15 分钟。
- 将 400 μL 的 1x 附件绑定缓冲器添加到样品中，通过反转混合并保持在冰上，直到流细胞。
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阻断细胞上的FcγRII/III受体
- 法克斯校准
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流细胞学和纯度控制
- 通过测量未染色的细胞来描述细胞形态和荧色体的低谷，开始流细胞学分析。
- 通过修改每个荧光参数的电压来调整侧散射 （SSC） 和向前散射 （FSC）。测量 530 nm （附件 V） 和 + 575 nm （PI） 的荧光排放。
- 使用每个点图上的网格来定义头十年的负人口。将每个 FMO 控制置于细胞计中，并纠正光谱重叠，直到负数和正数人口中位数对齐。
- 测量 100，000 个事件。测量带有特定标记的细胞，并为感兴趣的细胞群创建门。
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流细胞学和纯度控制
- 数据分析
- 从流细胞计收集数据。打开软件以可视化工作空间进行分析。
- 创建工作区
- 通过将FCS文件拖入工作区来导入FCS文件。文件将在工作空间的示例和组部分可见。双击样本名称以打开文件。
- 将侧散射区域 （SSC-A） 用于 x 轴（图 3A）的 y 轴和向前散射区域 （FSC-A）。单击图标以进行多边形盖上。
- 通过单击以创建门节点，然后继续点击细胞群，直到完成，从而在点图感兴趣的细胞群周围创建一个门：双击以关闭门。
- 根据捕获的人口（例如"所有单元"）命名门，然后单击 "确定"。
注："所有单元格"门内的双击将打开一个新的图形窗口，仅显示"所有单元格"中包含的事件。 - 通过单击黑色箭头，将新点图的 y 轴调整到 SSC-H（侧散射高度），然后选择更改 y 轴。
注：此门用于单个单元（单个），并排除双倍或更大的聚合（图 3B）。由于单个细胞具有比例宽度和长度，因此它们应表示为对角线上的人口。落在对角门外的细胞是双倍或更大的聚合体。 - 双击门分析坏死（PI阳性）、早期凋亡（附件V阳性、PI阴性）和晚凋亡（附件V阳性，PI阴性）细胞（图3C）。
- 将 x 轴标记为附件 V，将 y 轴标记为 PI。
注：在某些情况下，在信号强度较低的情况下，由于背景的校正，细胞群可能看起来具有负荧光值。在这种情况下，建议执行双指数转换。要做到这一点，请单击 y 轴旁边的 T， 然后选择 自定义轴。在新的窗口中，将刻度更改为双指数 （Biex），通过增加宽度基础并单击 "应用"，为轴添加负值。这将提高低信号强度事件的分辨率。 - 将数据显示为计数图。使用 x 轴正下方的 "选项" 选项卡，然后从菜单中选择 计数器绘图 。
- 在绘图上绘制 Quat 门，以定义 4 个离散目标人口。
- 单击窗口顶部以打开布局编辑器，只需单击 布局编辑器 并将人口拖入每个单独区域。
- 将绘图放入布局编辑器中，将人口从工作区拖入布局编辑器窗口。
- 使用直方图可视化
- 从 "选项" 选项选项卡中选择直方图。
- 应用门来选择附件V阳性细胞：或者，积极和消极的人口可以通过使用 比塞克托 工具来定义。示例部分现在必须显示已形成的不同人群及其层次结构。
- 要比较样本，将所有直方图拖动到彼此之上：右键单击直方图，并从 直方图 选择 交错偏移。
- 添加统计分析
- 通过双击感兴趣的人口来打开 统计 选项卡。选择要应用的功能和所涉及的参数。
- 与其他人口重复，将 西格玛 图标拖入人口名称。
- 将分析应用于所有样本，从兴趣样本中选择量子策略，并将其拖入利益标记定义的组中，例如附件五。
- 在 FMO 控制样本中创建门，并定义负数和阳性人群;此量具策略将应用于整个实验（图 3D\u2012F）。
注意：单独检查每个样本，以确保盖上正确的标点，并在必要时进行修改。 - 如果细胞被标记抗体染色（例如CD45），则相应地使用相应的FMO和门。
- 要导出布局，请单击 文件|出口图像|选择文件格式 （例如，jpg、pdf）。
- 单击 "创建表" 以打开带有表的最终版本的窗口。
- 通过选择文件|导出表 保存为|文件名。
Representative Results
手术
胸脊髓转选的成功取决于对若干参数的评估，其中最明显的是后肢瘫痪。动物只用前肢移动，拖着后肢。否则，活动水平，包括喂养，梳妆和警觉性通常是正常的。此外，动物失去意志性膀胱控制，导致研究者每12小时需要手动膀胱表达，直到反射无效，受伤后10至14天返回。安乐死后，损伤成功的额外迹象主要与膀胱与体重比的增加有关，表明组织重塑。组理分析显示尿道和光滑的肌肉隔间3内增生。
准备单细胞悬架
利用公开的表达数据，确定细胞外基质蛋白的膀胱组织富集（图2），用于为消化组合的配方提供信息。由于胶原蛋白是膀胱壁11，12的关键组成部分，首先我们试图确定最丰富的胶原蛋白（s）在鼠标膀胱使用RNA分析数据集产生的鼠标ENCODE项目13。我们的分析表明，胶原蛋白1A1、胶原蛋白3A1、胶原蛋白1A2和胶原蛋白6A1是小鼠膀胱内最丰富的胶原蛋白类型（图2A）。我们还使用 Tabula Muris（鼠标（肌肉）的单细胞转录体数据简编）8来确定胶原蛋白 1、3、6 和透明质的 mRNA 表达水平。这些数据允许直接和对组织之间共享的细胞类型的基因表达进行对比。分析表明，这些细胞外基质组件的表达在间质细胞类型中更为普遍，而不是尿素（图2B）。
分离对膀胱中分离细胞生存能力的影响
流细胞学分析表明，采用4种不同方案的酶消化的存活率分别为83%、86%、93%和90%。因此，协议第3节被认为对保持细胞存活性最有价值。我们还观察到，大约4%的细胞是坏死细胞（PI+/附件V-）（图4A）。这些观察强调了消化方案的效率以及随后对细胞生存能力的好处。
脊髓损伤对膀胱中不同细胞群的影响
与对照组相比，我们观察到SCI小鼠膀胱的总细胞数量显著增加。从SCI膀胱获得的点图模式也略有不同，与脊髓损伤引起的器官重塑（图4B：第一列）一致。与对照组相比，SCI动物的膀胱显示CD45阳性细胞显著增加。
图1：代表输液完成与肝脏的浅色。（A） 在输液开始时显示肝脏颜色。（B） 在输液结束时显示减轻的肝脏颜色。（A）中的小鼠在输液前两周进行脊髓转选，导致膀胱肥大，其突出出骨盆不像（B）中没有脊髓损伤的鼠标：在这种情况下，膀胱很小，隐藏在骨盆里。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：小鼠膀胱细胞外基质（ECM）组件的转录表达。（A） 43种不同胶原蛋白类型的条形图。该表达方式由每千万个映射读数（RPKM）（数据来自生物项目：PRJNA66167）14表示。（B） 在一池男性和女性分离的尿囊样本（男性和女性）中，从基于微流体液滴的3'end计数中获得的细胞类型的小提琴基因表达图谱。使用每百万 ln （CPM+1）8的自然对数，每个单元的计数均进行日志规范化。在进行对数之前添加了 1 个 CPM 的伪计数。请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：控制策略和FMO控制，以确定荧光扩散。（A） 细胞种群的选择。（B） 单打的格子策略。（C） 使用PI和附件V抗体对坏死细胞和早晚凋亡细胞进行治疗。（D_2012F）多色流细胞学的示意图点图（例如，与 A、B、C、D 荧光素 + （附件 V 和 PI）结合的抗体）。与未染色控制相比，FMO 控制显示的荧光通过荧光 A 通道扩散到抗体中。橙色虚线表示 FMO 界点边界，而未染色的边界为红色。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：膀胱中不同细胞类型的流细胞学。（A） 附件 V/PI 双染色流程图。每个协议所使用的酶和化学成分的不同组合在相应的生存图前表示。这些数据表明，通过协议第 3 节获得了最高的可行性。（B） 代表直方图，说明在单个通道中检测到的 Ly-6A/E （Sca-1） 和 CD326 （Ep-CAM） 的强度。（ C） SCI对小鼠膀胱细胞群的影响。上面板显示从对照非手术小鼠获得的三个分离膀胱上的染色结果，下面板显示三个带有SCI的动物染色的结果。第一栏是细胞总数。第二栏显示单项网格选择。第三栏显示了对B细胞、T细胞和NK细胞呈阴性的活细胞的亚群。第四栏显示活细胞的染色对CD45呈阳性。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 组件 | 金额（500 mL） | 摩尔 浓度 |
| Nacl | 4.091 克 | 140米 |
| 氯化钾 | 0.186 克 | 5米 |
| MgCl2 | 0.0476 克 | 1米 |
| D-葡萄糖 | 0.9 克 | 10米 |
| 海佩斯 | 1.19 克 | 10米 |
表1：泰罗德解决方案准备的组件。 指示的组件用于准备 500 mL 泰罗德的解决方案。
| 组件 | 量 | 协议第 1 节 | 协议第2节 | 协议第3节 | 协议第4节 |
| Bsa | 5毫克 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 |
| 卡克2 | 0.03 mM | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 |
| 拼贴酶 I 型 | 132.5 单位 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 |
| 拼贴酶类型 I | 96.4 单位 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 |
| 拼贴酶类型六 | 50 个单位 | - | - | 是的 | - |
| 纳塞 | 10 个单位 | 是的 | 是的 | 是的 | - |
| 木瓜 蛋白酶 | 115 单位 | - | - | 是的 | 是的 |
| 潘拼贴画 | 50 个单位 | - | - | 是的 | 是的 |
| 透明 质 酸 酶 | 10.5 单位 | - | - | 是的 | 是的 |
| 迪斯帕塞二世 | 1.25 单位 | 是的 | 是的 | - | - |
| 细胞分离溶液 | 1 mL | 是的 | - | 是的 | - |
| 重组酶 | 1 mL | - | 是的 | - | 是的 |
表2：用于准备消化缓冲液的组件。 所示组件用于制备 2.5 mL 消化混合物（1 U 催化 1 μmol 每分钟 37 °C 的基板水解。 有关每个酶单位的定义，请参阅产品数据表）。
Discussion
此处描述的鼠脊髓损伤模型提供了一种可重复的方法，由于膀胱收缩和外部尿道括约肌松弛之间失去协调，可产生功能性膀胱出口阻塞。这反过来又唤起了膀胱壁的深刻改造，早在受伤后2周，其特点是扩大尿道和光滑的肌肉隔间。在啮齿动物中实施SCI模型的关键步骤包括：（i） 在脊柱休克期间严格注意手动膀胱表达，在受伤后10-u201214天;（二） 营养丰富，以尽量减少体重减轻：（三） 缓解尿液烫伤的可能性，特别是用于超越反射失效返回的实验。该模型的局限性包括：在瞬时血尿期间，小鼠可能从血栓中排出尿道，另外，在手术后逆行射精后，来自精液库古鲁姆的雄性小鼠中。
此处描述的组织分离方法说明了考虑实验侮辱引起的组织结构变化的重要性，在这种情况下，SCI 之后的重大组织重塑可能会影响下游分析。随着单细胞分析的增加，必须确保在基因表达中观察到的差异不仅仅是分离引起的扰动的结果，而是真正代表与疾病模型相关的潜在生物变化。使用公开的表达数据使我们能够修改消化缓冲器的配方，以确保细胞外矩阵的有效消化，同时最大限度地提高可行性。在未来的应用中可以考虑的其他修改包括添加actinomycin D，以阻止对分离协议15敏感的即时早期基因的转录。
在分离组织或转移已经处于悬浮状态的细胞时，管道技术至关重要。为了减少剪切力对细胞的物理损害，在细胞重新悬念期间轻轻和缓慢地使用移液器非常重要。一般建议使用宽孔移液器提示。如果使用标准提示，则轻轻使用移液器细胞悬架，以避免剪切力，否则会损害细胞，这一点尤为重要。然而，使用细胞过滤器是不可避免的，但是，细胞浓度可以下降20%或更多，伴随着100μL或以上的体积损失。我们建议在紧张后确定细胞浓度，以确保精确的细胞计数。
在流细胞学中，FMO 控制提供背景的测量，因为信号从重叠的发射峰值出血。它们不是非特异性抗体结合的量度，也不是当抗体包含在该通道中时可能存在的背景染色。要考虑非特异性抗体结合，必须包括适当的同型控制：对于背景染色，需要包括负控制。综合起来，这些控制确保准确测量细胞群。
Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院（R01 DK077195至R.M.A、R01 DK104641至R.M.A和D.R.B）的赠款支持。我们感谢斯图亚特·奥金博士在血液学/肿瘤学系、波士顿儿童医院、儿科系、哈佛医学院和达纳-法伯癌症研究所提供的宝贵意见。我们还感谢凯尔·科斯塔、玛丽·塔利恩蒂和哈比巴拉·肖贾伊萨迪博士（儿科部杨石博士实验室、新生儿医学部、儿科部、新生儿医学部、波士顿儿童医院、哈佛医学院）在技术援助和有益讨论方面给予的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 X Magnifying Loupes | |||
| 7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
| 70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
| Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
| Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
| Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
| APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
| BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
| BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
| CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
| CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
| Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
| Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
| Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| DNase | Sigma | DN25-1G | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
| Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
| FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
| Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
| McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
| PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
| Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
| Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
| TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
| Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |
References
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