Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/61470
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Dermatology, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

نقدم بروتوكولا بسيطا لعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة من الدم الكامل الذي تم الحصول عليه من المرضى الذين تم تشخيصهم بمتلازمة سيزاري ، يليه اختيار الخلايا التائية CD4 + ، وتحفيزها باستخدام phorbol12-myristate13-acetate و A23187 ionophore ، وإعداد الحمض النووي الريبي للتنميط النسخي.

Abstract

تستمد الأورام اللمفاوية الجلدية للخلايا التائية (CTCL) من التحول والانتشار غير المنضبط للخلايا التائية الناضجة الموجهة للجلد ، وتمثل فطريات الفطار (MF) ومتلازمة سيزاري (SS) الأنواع الفرعية الأكثر شيوعا. على الرغم من عدد من الدراسات حول توصيف التعبير الجيني ، والتغيرات الجينية ، والتشوهات اللاجينية ل CTCL ، فإن التسبب الجزيئي في MF / SS لا يزال غير واضح. يشير MF إلى CTCL الأكثر شيوعا مع غلبة الجلد ، وعادة ما يقتصر على الجلد ، في حين أن SS هو متغير سرطان الدم العدواني من CTCL مع مشاركة الجلد على نطاق واسع ويتميز بتوزيع الأورام بشكل رئيسي على الدم والجلد والعقدة الليمفاوية. مع التركيز على الممارسة السريرية ، فإن تحديد المؤشرات الحيوية للتعبير الجيني لديه إمكانات هائلة لتحسين تشخيص وعلاج MF / SS. في الواقع ، حددت الدراسات النسخية الحديثة المؤشرات الحيوية التشخيصية المحتملة من الاختلافات في التعبير الجيني بين الخلايا التائية الطبيعية والخبيثة ، والتي قد تحسن فهمنا لبيولوجيا SS ، وتكشف عن الأهداف العلاجية المحتملة. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا قابلا للتكرار لعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة من الدم الكامل الطازج من المرضى الذين تم تشخيصهم ب SS ، واختيار الخلايا التائية للذاكرة CD4 + (CD4 + CD45RO + الخلايا التائية) ، والتحفيز الكيميائي ، وإعداد الحمض النووي الريبي المناسب للتنميط النسخي لاكتشاف علامات جزيئية تنبؤية جديدة للحصول على نظرة ثاقبة إضافية في مسببات المرض. يوفر التحفيز باستخدام ناهض كيميائي لتنشيط التنظيم النووي تقييما أكثر تحديدا للمسارات المهمة في تنظيم النسخ الديناميكي والتعبير الجيني ويزيل العيوب المربكة التي قد تنشأ عن عيوب إشارات المنبع الناشئة عن فقدان مستضد TCR في غشاء الخلية. البيانات التي تم الحصول عليها من مقارنة النسخ من الخلايا التائية SS غير المحفزة إلى المحفزة تكشف عن عيوب التعبير الجيني التنظيمي الوظيفي غير الواضحة من تحليل الخلايا غير المحفزة الهادئة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف الطريقة الموضحة من هذا النهج لدراسة عيوب التعبير الجيني للخلايا التائية في أمراض المناعة الأخرى للخلايا التائية.

Introduction

لمفومة الخلايا التائية الجلدية (CTCL) ، بما في ذلك الأنواع الفرعية الأكثر شيوعا من فطريات الفطريات (MF) ومتلازمة سيزاري (SS) ، هي مجموعة غير متجانسة من الأمراض المستمدة من التحول والانتشار غير المنضبط للخلايا التائية الناضجة الموجهة للجلد 1,2. تحتوي الخلايا التائية الورمية على CD4 + CD45RO + ناضج ، والنمط الظاهري للذاكرة3 ، وعلامات التصاق موجهة للجلد ، مما يزيد من تأثر البشرة4 ، والذي يتجلى كطفح جلدي خاصة في الأمراض المبكرة. غالبا ما يكون المسار السريري ل MF خاملا عندما يكون تحت الرعاية المدارة الروتينية ، ولكن يمكن لمجموعة فرعية من المرضى التقدم إلى مرض أكثر تقدما. في حالات MF هذه ، تنمو الآفات الجلدية وتزداد سماكة إلى أورام كبيرة ، وقد تنتشر الخلايا التائية الورمية إلى الغدد الليمفاوية والأعضاء الحشوية. في المقابل ، SS هو متغير أكثر عدوانية وسرطان الدم من CTCL5 ، يتميز بثالوث من الأعراض: الجلد الأحمر المعمم (الذي يعرف بأنه يؤثر على >80٪ من إجمالي مساحة سطح الجسم) ، واعتلال العقد اللمفاوية ، ووجود أكثر من 1000 / mm3 تنتشر الخلايا التائية النسيلية غير النمطية مع النوى الدماغية ، ما يسمى خلايا Sézary 6,7 . التشخيص لمرضى SS أسوأ بكثير من MF. SS نادر الحدوث بمعدل حدوث 0.1 / 100,000 ، ويمثل حوالي 3٪ من إجمالي حالات CTCL 8,9. عادة ما يظهر CTCL في كبار السن الذين يبلغ متوسط أعمارهم حوالي 60 عاما10. كان معدل الإصابة ب CTCL في تزايد ، وفي حين أن السبب غير واضح ، فقد استقر المعدل منذ عام 199811,12.

لا يزال التسبب الجزيئي ل SS غير واضح. أنتجت دراسات الوراثية واللاجينية والتعبير الجيني ثروة من البيانات الجديدة ، ومع ذلك لا تزال هناك نتائج غير متسقة ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى مجموعات المرضى الصغيرة التي تمت دراستها2 ، بالإضافة إلى الاختلافات في التصميم التجريبي ومجموعات التحكم13,14. قد يلقي تحسين التوصيف الجينومي والنسخي الضوء على كل من آليات المرض والأهداف العلاجية غير المستكشفة سابقا. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات من عدد أكبر من المرضى لفهم هذا الورم الخبيث غير المتجانس بشكل أفضل. وقد كان أداء لوحات المؤشرات الحيوية الحساسة للغاية والمحددة في مجموعة SS واحدة أقل اتساقا في الأفواج الأخرى15 ، مما يمثل عقبة خطيرة في تطوير مؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية موثوقة ل SS16. سيتم التعبير عن المؤشرات الحيوية التشخيصية المثالية باستمرار وبشكل مفرط في الخلايا التائية الخبيثة ، بينما تكون غائبة أو شبه غائبة في الخلايا التائية الطبيعية17. يعد اكتشاف المؤشرات الحيوية الخاصة بالأمراض أمرا مهما للنهوض بالبروتوكولات التشخيصية والعلاجية ل SS.

تتطلب البيانات النسخية عالية الجودة لكل من الخلايا التائية الخبيثة والطبيعية نهجا فعالا وموثوقا به لإعداد العينات. هنا ، سنناقش استراتيجية مفصلة ولكنها بسيطة للحصول على عينات الحمض النووي الريبي من مجموعات الخلايا التائية ذات الصلة ب SS. سنناقش عزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMC) عن الدم الكامل ، والاختيار المغناطيسي السلبي لمجموعات الخلايا التائية CD4 + CD45RO+ ذات الصلة بالأمراض ، والتنشيط الكيميائي للكشف عن الاختلافات في الاستجابات الوظيفية ، وإعداد الحمض النووي الريبي للتنميط النسخي. في البروتوكول الحالي ، تم إجراء التنشيط الكيميائي باستخدام خلات فوربول ميريستات (PMA) وأيونوفور الكالسيوم (A23187) 18,19 ، لأن الدراسات السابقة أظهرت إشارات مستقبلات الخلايا التائية المعيبة في CTCL ، والتحفيز باستخدام PMA / A23187 يتجاوز مستقبلات الخلايا التائية20,21. أيضا ، يسمح PMA / A23187 بتنشيط أقرب مباشر للإشارات النووية اللازمة لتنشيط جين السيتوكين. وأخيرا، يوفر تحفيز الخلايا التائية مستوى إضافيا من البصيرة في تنظيم التعبير الجيني الذي لا يمكن الحصول عليه من الخلايا التائية المريحة حيث يكون التغيير الديناميكي غائبا.

Protocol

الخلايا البشرية يحتمل أن تكون معدية. لذلك ، يتم إجراء التجارب بدقة وفقا للاحتياطات والإجراءات المطلوبة التي تمت مناقشتها مثل إدارة السلامة والصحة المهنية (OSHA) ومعدات الحماية الشخصية (PPE).

1. عزل PBMCs عن الدم الكامل

  1. جمع جميع المواد اللازمة من الجدول 1 وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة (RT). دافئ RP10F إلى 37 درجة مئوية. باستثناء أجهزة الطرد المركزي وعد الخلايا، قم بتنفيذ جميع الخطوات باستخدام خلايا قابلة للحياة في خزانة السلامة البيولوجية.
  2. الحصول على الدم في خمسة أنابيب 10 مل (الكمية المطلوبة) تحتوي على مضادات التخثر. تخزين الدم كله في درجة الحرارة المحيطة (18-201224 درجة مئوية). قم بتسمية أنابيب فصل 50 مل مع رقم موضوع البحث البشري لعينة الدم المراد معالجتها.
  3. نقل 10-1215 مل من الدم إلى كل أنبوب (أنابيب) فصل مع رقم الموضوع المطابق. تمييع الدم على الأقل 2 أضعاف مع محلول الملح المتوازن هانك (HBSS). لا تتجاوز 35 مل من الدم المخفف لكل أنبوب.
  4. بعناية وببطء الكامنة وراء الدم مع ~ 13 مل من وسط الكثافة. راقب وسط الكثافة الشفاف في أسفل الأنبوب ، وتوقف عن السحب عندما تكون الماصة فارغة تقريبا (لمنع إطلاق الفقاعة). قم بإزالة الماصة بعناية لتجنب خلط طبقات الدم والكثافة المتوسطة.
  5. انقل أنابيب الفصل المملوءة بعناية إلى جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات.
  6. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 × جم لمدة 30 دقيقة مع إيقاف تشغيل فرامل جهاز الطرد المركزي (ضبط التباطؤ على الصفر).
    ملاحظة: إذا كان جهاز الطرد المركزي يعرض دورة في الدقيقة فقط، فراجع مواصفات الدوار لتقدير مكافئ دورة في الدقيقة ل 500 × g.
  7. قم بإزالة أنابيب الفصل بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات. راقب المعطف الباهت ، الذي تم تشكيله بين وسط الكثافة وطبقات البلازما.
  8. ماصة من الأعلى لإزالة والتخلص من معظم جزء البلازما العلوي ، بحيث يبقى 10 مل فوق المعطف الناعم. بعناية وببطء جمع معطف بافي. انقل المعاطف اللامعة من أنبوبين منفصلين إلى أنبوب جديد معقم ومعقم مسبقا بسعة 50 مل، كما هو موضح في الشكل 1.
  9. قم بتخفيف PBMCs على الأقل 2 أضعاف باستخدام HBSS ، مما يجعل الحجم في كل أنبوب جديد يصل إلى 50 مل. تذكر تبديل فرامل أجهزة الطرد المركزي إلى الامتلاء. بيليه PBMCs عن طريق الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت قدر الإمكان واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لتخفيف الكريات.
  10. لتحليل خلايا الدم الحمراء المتبقية (RBC) ، أعد تعليق كل بيليه خلية في 1-1-mL من مخزن تحليل الأمونيوم وكلوريد والبوتاسيوم (ACK) لكل 10 مل حجم الدم الأصلي. احتضان لمدة 5 دقائق بالضبط. أوقف التحلل على الفور بحجم مساو أو أكبر من HBSS واضبط مستوى الصوت إلى 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق.
  11. قم بإزالة السوبرناتانت واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لتخفيف حبيبات الخلية. خلايا تجمع من نفس المتبرع. ارفع مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام HBSS. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق.
  12. قم بإزالة السوبرناتانت واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لتخفيف حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط RP10F الدافئ ، وخذ أليكوت لحساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام أزرق المثقبيات.
  13. احسب إجمالي عدد الخلايا في كل عينة باستخدام مقياس مرقئ الدم.

2. تنقية الخلايا التائية CD4 + CD45RO + من PBMCs

ملاحظة: يتم تنقية الخلايا التائية CD4+CD45RO+ من PBMCs باستخدام الفصل المغناطيسي المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) مع تعديلات طفيفة. يفضل اتباع دليل المجموعة لوقت الحضانة لأن كل مجموعة تجارية لها تعليماتها الخاصة.

  1. اغسل الكمية المطلوبة من PBMCs في 10 مل من المخزن المؤقت للاختيار. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لتخفيف الكرية.
  2. قم بتخفيف PBMCs إلى 5 × 107 خلايا/مل في مخزن الاختيار العازل وانقلها إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل (12 × 75 مم).
  3. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل 1 مل من العينة، واخلطها بلطف. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. مباشرة قبل الاستخدام ، دوامة الجسيمات المغناطيسية لمدة 30 ثانية على سرعة عالية. أضف 50 ميكرولتر من الجسيمات المغناطيسية لكل 1 مل من العينة إلى الأنبوب الذي يحتوي على PBMCs ، واخلطها بلطف.
  5. ارفع مستوى الصوت إلى 2.5 مل مع المخزن المؤقت للاختيار واخلطه بلطف. ضع الأنبوب (بدون غطاء) في المغناطيس ، واحتضنه في RT لمدة 2.5 دقيقة.
  6. التقط المغناطيس ، وفي حركة مستمرة ، اقلب المغناطيس والأنبوب لصب تعليق الخلية المخصب في أنبوب معقم جديد.
  7. لزيادة الاسترداد ، أضف 2.5 مل من المخزن المؤقت للاختيار إلى الأنبوب المتبقي في المغناطيس ، دون إزعاج الخرز المجمد. احتفظ به في المغناطيس لمدة 2.5 دقيقة أخرى، وكرر الخطوة 2.6 لاستعادة خلايا إضافية.
  8. خذ أليكوت لعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام أزرق التربان. احسب إجمالي عدد الخلايا باستخدام مقياس دمية أو عداد خلايا.
  9. تأكد من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).

3. التنشيط الكيميائي

  1. اضبط الخلايا التائية CD4 + CD45RO+ على 5 × 106 خلايا / مل مع وسط RP10F الدافئ ، وقم بتوزيع الخلايا في أطباق الزراعة بالحجم المطلوب. خلايا الراحة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. استقرت الخلايا الكروية عن طريق الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لتخفيف حبيبات الخلية.
  3. اضبط تركيز الخلايا على 5 × 106 خلايا/مل مع وسط RP10F دافئ، ووزع 0.5-10 × 107 خلايا في كل من ثلاثة أنابيب معقمة ذات غطاء لولبي.
    ملاحظة: في حالة توفر خلايا كافية، قد يتم تضمين محفزات مكررة أو نقاط زمنية إضافية في التصميم التجريبي.
  4. تحفيز الخلايا في الأنابيب 2 و 3 مع PMA و A23187. أضف PMA إلى 25 نانوغرام / مل و A23187 إلى 500 نانوغرام / مل واخلطه بلطف. أضف حجما متساويا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الخلايا الموجودة في الأنبوب 1 والتي ستكون بمثابة مركبة (تحكم). على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم 1 ميكرولتر من PMA و 1 ميكرولتر من A23187 ، فأضف 2 ميكرولتر من DMSO إلى أنبوب السيارة. حافظ على التركيز النهائي ل DMSO أقل من 0.5٪ في جميع الأنابيب.
  5. قم بفك الأغطية على الأنابيب ، وأعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة (الأنبوب2 ) و 6 ساعات (الأنابيب 1 و 3). في الوقت المشار إليه ، خلايا أجهزة الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 10 دقائق.
  6. قبل التحلل ، تخلص من أكبر قدر ممكن من supernatant ، دون إزعاج بيليه الخلية.
  7. قم بتحليل الخلايا على الفور ، وفقا للتوجيهات الواردة في تعليمات مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). تابع عزل الحمض النووي الريبي ، أو قم بتجميد الليزات عند -80 درجة مئوية لمعالجتها لاحقا بعينات إضافية.
    ملاحظة: يمكن التحقق من نقاء الحمض النووي الريبي وسلامته باستخدام الرحلان الكهربائي للشعيرات الدموية الدقيقة.
  8. اختياري: لإزالة جميع آثار الحمض النووي بالكامل من عينة الحمض النووي الريبي النقي، استخدم مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Representative Results

يتضمن هذا البروتوكول إجراءات لعزل PBMCs من دم SS ، وتنقية خلايا CD4 + CD45RO + T عن طريق الاختيار السلبي ، وتحفيز الخلايا التائية النقية ، وعزل الحمض النووي الريبي الكلي للتنميط النسخي. يصف الشكل 1 عملية عزل PBMC عن الدم الكامل. يرجى ملاحظة أن العائد الإجمالي ل SS PBMCs سيختلف مع بدء حجم الدم وعبء الورم المنتشر لكل مريض. في مختبرنا ، كان متوسط إنتاجية SS PBMCs 4.6 × 10 6 خلايا / مل من الدم الكامل (1.85 × 106 - 3.25 × 10 7 خلايا / مل ل7 SS). وبلغ متوسط صلاحية البلدان المساهمة بوزارة المعزولة 95-99 في المائة. يوضح الشكل 2 النقاء العالي والجدوى لخلايا الذاكرة التائية CD4 + CD45RO+ المحددة. كان متوسط العائد من الخلايا التائية CD4 + CD45RO + من SS PBMCs 75٪ (75.6٪ - 84٪) ، مقارنة ب 15.9٪ (3٪ - 30٪) من المتبرعين العاديين (ND) PBMCs التي تم الحصول عليها من غرف نظام الحد من الكريات البيض (LRS). كانت صلاحية ونقاء خلايا CD4 + CD45RO + T التي تم الحصول عليها بواسطة بروتوكول الاختيار السلبي هذا عالية باستمرار (الشكل 3).

لقد قمنا سابقا بدمج بروتوكول التنشيط أعلاه مع المصفوفات الدقيقة لدراسة التغيرات الوظيفية في النسخ لكل من خلايا SS و ND T ، وأثبتنا أن خلايا SS T Memory و SS PBMCs تعبر بشكل سيئ عن السيتوكين وجينات الاستجابة المناعية الأخرى مقارنة بخلايا ND T و PBMCs 19,22,23. يوضح الشكل 4 التنشيط القوي للعديد من جينات السيتوكين بما في ذلك IL4 و IL 10 و IL13 و IL22 في خلايا ND T ، ولكن ليس في الخلايا التائية SS. ومنذ ذلك الحين تم تأكيد هذا الخلل في التعبير الجيني الوظيفي في خلايا SS T من قبل مجموعات أخرى24. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن العديد من الجينات التي لا يتم التعبير عنها عادة في خلايا ND T بشكل كبير في خلايا SS T ، سواء أثناء الراحة أو بعد التحفيز (الشكل 4). وتشمل هذه الجينات الموصوفة سابقا SS المؤشرات الحيوية DNM3 و PLS3 و TOX و TWIST125,26,27 ، بالإضافة إلى ANK1 و SGCE ، والتي تم الإبلاغ عنها لأول مرة من قبل مجموعتنا. يتم التعبير عن هذه المؤشرات الحيوية الإيجابية بشكل كبير في SS ، ولكن ليس ND ، وتجنب المزالق التقنية المرتبطة بالمؤشرات الحيوية السلبية.

Figure 1
الشكل 1: عزل PBMC عن الدم الكامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاختيار السلبي لخلايا الذاكرة التائية CD4+ من PBMCs المعزولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تم تأكيد نقاء الخلايا التائية CD4 + CD45RO + عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم بوابات الخلايا الليمفاوية بواسطة تشتت الضوء (A) ، واستبعدت الخلايا الليمفاوية الحية صبغة الجدوى eFluor780 (B) ، و (C) تمثل المتبرعين الطبيعيين غير المختارين (ND). أدى الاختيار السلبي إلى مجموعات نقية تقريبا من الخلايا التائية CD45RO+ في مرضى ND (D) و SS (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التعبير الجيني التفاضلي في الخلايا التائية للذاكرة CD4 + CD45RO + المستريحة والمنشطة من SS و ND. يتم تمثيل التعبير الجيني z-score بمقياس لوني من الأحمر (التعبير العالي) إلى الأخضر (التعبير المنخفض). تمثل الأشرطة الملونة في الجزء العلوي من الخريطة الحرارية معالجات الخلايا: معالجة وهمية / مركبة (حمراء) ، 2 ساعة محفزة (زرقاء) ، و 6 ساعات محفزة (صفراء). يتم التعبير عن العديد من جينات المؤشرات الحيوية SS بشكل كبير ويتم التعبير عن جينات السيتوكين بشكل سيئ في خلايا SS T مقارنة بخلايا ND T. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشف
الكثافة المتوسطة وسط فصل الخلايا الليمفاوية ، Ficoll-Hypaque ، أو ما يعادلها من وسط الكثافة مع الكثافة = 1.077-1.080g / ml عند 20درجةمئوية.
إتش بي إس إس 1x محلول الملح المتوازن من هانك، 4.2 ملم ناهكو3، 10 ملم هيبس، الرقم الهيدروجيني 7.2
RP10F RPMI 1640 متوسطة ، 10٪ مصل بقري جنيني معطل حراري (FBS) ، محلول 1x البنسلين - الستربتومايسين ، درجة الحموضة 7.2
ACK المحلل التحلل المخزن المؤقت 155 mM NH4Cl ، 10 mM KHCO3 ، 0.1 mM Na2EDTA ، لا حاجة لضبط درجة الحموضة. يجب أن يكون ~ 7.3.
المخزن المؤقت للتحديد 1x HBSS، 2٪ FBS، 2 mM EDTA
phorbol12-myristate13-خلات (PMA) 50 ميكروغرام / مل في DMSO
A23187 الأيونوفور 500 ميكروغرام / مل في DMSO

الجدول 1: الكواشف.

Discussion

وقد تم تطوير عدة طرق لعزل PBMCs ، ولكل منها مزاياها وقيودها الخاصة28. نقوم بشكل روتيني بجمع ما يصل إلى 50 مل من الدم في خمسة أنابيب سعة 10 مل تحتوي على مضادات التخثر. يعتمد حجم الدم لعزل PBMC على عدة عوامل مثل صحة وعمر موضوع البحث وأيضا على خبرة أخصائي الفصد. الخطوة الإجرائية الحاسمة في البروتوكول هي تشكيل تدرج الخطوة. وقد تؤدي الطبقات الضعيفة إلى فشل جزئي أو كلي لمركبات PBMCs في الرواسب في الواجهة. نحن نفضل طريقة الطبقات السفلية الموضحة هنا ، حيث أنه من السهل بدء الطبقة السفلية. للتوزيع الكامل لجميع وسائط الكثافة تحت الدم ، من الضروري استخدام أداة مساعدة ماصة بدون تسرب للهواء. يمكن تقليل تلوث جزء PBMC بأنواع الخلايا غير المرغوب فيها عن طريق الجمع الدقيق والمتسق للمعطف الباهت ، والذي يجب تنفيذه بنفس الطريقة لكل عزلة. وإذا لم يتم تقسيم هذه المحطات إلى أجزاء أخرى، ينبغي تجنب جمع كميات مختلفة من تدرج الكثافة وطبقات البلازما بين العزلات. يتم إجراء تحلل RBC لتقليل التأثير المحتمل لتلويث الحمض النووي الريبي المشتق من RBC والخلايا الشبكية على تحليلات التعبير الجيني في المراحل النهائية. سيتم تثبيط التحلل الناقص التوتر بواسطة المخزن المؤقت متساوي التوتر الزائد.

مزيد من العزل للمجموعة الفرعية للخلايا التائية مهم للدراسات الجزيئية. وصفنا هنا تحديد خلايا CD4 + CD45RO + T اللاحقة عن طريق التحديد السلبي لإزالة أنواع الخلايا غير المرغوب فيها. يعتمد الاختيار السلبي على الأجسام المضادة التي تتعرف على علامات سطح خلية محددة لجميع الخلايا غير المرغوب فيها. ثم تتم إزالة الخلايا المغلفة بالأجسام المضادة بواسطة الخرز المغناطيسي. يزيل بروتوكول الاختيار هذا الخلايا غير المرغوب فيها مع السماح للخلايا المستهدفة التي لم تمسها أو تحفزها بالبقاء حرة التعويم ، وهو أمر ضروري في دراسة تنشيط الجينات. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب كتل الخلايا ، مما يقلل من النقاء النهائي لخلايا CD4 + CD45RO+ T المختارة. يقلل حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) الموجود في المخزن المؤقت للاختيار من تكتل الخلايا. يعتمد إنتاج الخلايا التائية على عوامل مثل الحجم الأولي للدم ومتغيرات المريض مثل العلاج الذي يتم إعطاؤه للمريض ومرحلة المرض في وقت جمع العينة. العلاج المعطى للمرضى قد يؤثر أيضا على صلاحية الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جمع العينات قبل أي إجراء مثل الفرز الضوئي له أيضا تأثير إيجابي على نقاء الخلايا التائية CD4 + CD45RO+. لقد لاحظنا أن جمع العينات بعد إجراء علاج الفريسة الضوئية له تأثير سلبي على إنتاج الخلايا التائية CD4 + CD45RO +.

غالبا ما تعبر نسخ الخلايا التائية الورمية من مرضى SS عن علامات السطح المتسقة مع النمط الظاهري للخلايا التائية CD4 T الناضجة29,30. ومع ذلك ، فقد لوحظت أحيانا اللدونة المظهرية فيما يتعلق بعلامات السطح بما في ذلك CD4 و CD45RO و CD45RA و CD7 و / أو CD2631. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا عدم التجانس في التعبير CD45RO و CD45RA بين مرضى SS29 ، في حين أن غالبية حالات SS لا تزال CD45RO +. أظهر Roelens et al.31 أيضا أن SS قد تظهر عدم تجانس بين الأفراد وداخل الأفراد مع مجموعات مختلطة من المجموعات الفرعية الساذجة (TN) والذاكرة المركزية (TCM) والذاكرة الانتقالية (TTM) والذاكرة المستجيبة (TEM) وذاكرة المستجيب الطرفي (TEMRA). ومع ذلك ، تظهر نتائجهم بوضوح أن غالبية خلايا SS لديها النمط الظاهري TCM. ركزنا دراستنا على النمط المناعي السطحي CD45RO+ الأكثر شيوعا في مرضى SS ، وأكدنا النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي. في دراسات التخطيط للمجموعات الفرعية للخلايا التائية في المرضى ، من المهم النظر في عدم التجانس الظاهري للمرض قيد الدراسة ، وبالتالي يمكن تعديل استراتيجية التنقية حسب الحاجة للحصول على مجموعة الخلايا التائية المطلوبة للتحليل.

هناك عدة طرق لتحفيز الخلايا التائية و PBMCs لفحص التعبير الجيني الوظيفي. نحن نفضل التنشيط الكيميائي (PMA + A23187 ionophore) ، لأننا مهتمون بتنظيم الجينات في النواة. يعد التنشيط الكيميائي خيارا أفضل لهذا الغرض لأنه يعمل كمنشط واسع النطاق وأكثر اتساقا مقارنة بالتحفيز المحدد للمستضد. PMA هو مركب عضوي صغير ينتشر عبر غشاء الخلية إلى السيتوبلازم ، وينشط مباشرة بروتين كيناز C. A23187 يسمح للكالسيوم بالمرور عبر الأغشية. هذه المركبات تتجاوز المستقبلات السطحية ، وتحاكي معا آثار ربط مستقبلات الخلايا التائية مع التحفيز المشترك بوساطة CD28. تقوم المواد الكيميائية بتنشيط العديد من مسارات الإشارات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تنشيط عامل النسخ النووي وزيادة تنظيم جينات السيتوكين التي يمكن الوصول إليها لتنشيط النسخ. على الرغم من أن التنشيط الكيميائي وربط CD3CD28 ينتجان ملفات تعريف تعبير جيني عالمية متشابهة بشكل لافت للنظر في الخلايا الطبيعية32 ، إلا أن التنشيط الكيميائي باستخدام PMA + A23187 يعد خيارا جيدا لأن خلايا SS T يمكن أن تفقد التعبير عن المستقبلات السطحية بما في ذلك مكونات TCR33. قارن Chong et al.22 تنشيط جينات السيتوكين بين PMA / A23187 بالأجسام المضادة المضادة ل CD3 و CD28 في PBMCs من مرضى MF / CTCL العاديين والمبكرين ومرضى MF / CTCL المتأخرين. وأفادوا بأن PMA / A23187 تسبب في تنشيط أسرع ومكثف للجين IL-2 مقارنة بالتحفيز المضاد CD3 / CD28. بالإضافة إلى ذلك ، أظهروا أن حركية التنشيط الأبطأ مع الأجسام المضادة المضادة CD3 / CD28 يحتمل أن تكون من الربط المتبادل وإشارات الغشاء اللازمة للتحفيز. علاوة على ذلك ، تم الحفاظ على الاتجاهات في التعبير عن السيتوكينات بين مجموعات الخلايا المختلفة التي تمت دراستها باستخدام PMA / A23187. نظرا لأننا مهتمون بتنشيط التعبير الجيني ، فإن التحفيز الكيميائي هو نهج مثالي لأنه يعمل كمنشط واسع النطاق وأكثر اتساقا مقارنة بالتحفيز الخاص بالمستضد. يعد ربط CD3 / CD28 مثاليا للتحقيق في المسارات المهمة في نقل الإشارة القائم على الغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنشيط الكيميائي أقل تكلفة ولا يتطلب معدات خاصة. في الدراسة الحالية ، قام PMA + A23187 بتنشيط جينات السيتوكين بشكل كبير في خلايا ND ولكن ليس SS T ، مما يشير إلى أن خلايا SS T لديها أوجه قصور وظيفية في مجرى TCR.

باختصار ، يوفر هذا البروتوكول خلايا تائية نقية ظاهريا من الدم الثمين المشتق من المريض ، وطريقة لتقييم التغيرات على مستوى الجينوم في التعبير الجيني الوظيفي. لقد أظهرنا أن التنميط النسخي لخلايا SS T مقارنة بالخلايا التائية CD45RO+ العادية يكشف عن اختلافات عميقة في تنشيط الجينات في الخلايا التائية البشرية الطازجة من المرضى الذين يعانون من CTCL. ستساعد هذه الدراسات في تطوير المؤشرات الحيوية التشخيصية والاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف علامات جديدة في CTCL. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هذه الاستراتيجية والبروتوكول في دراسة الخلايا التائية البشرية الأولية ذات قيمة في التكيف مع دراسات الأمراض الأخرى التي تتوسط فيها الخلايا التائية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

الإفصاح الأخلاقي:
تمت الموافقة على بروتوكول البحث هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لجامعة أركنساس للعلوم الطبية (UAMS ، Little Rock ، AR) تم إجراء بيانات microarray المقدمة في هذه الدراسة على العينات التي تم تجنيدها بموجب بروتوكول بحث معتمد من قبل IRB لمستشفى هنري فورد (ديترويت ، ميشيغان).

Acknowledgments

نشكر المرضى والمتطوعين الذين شاركوا في بحثنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170356
1000 ul Pipet tips VWR 10017-038
15 ml Conical Tubes Corning 352196
25 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170357
5 ml Disposable Plastic Pipette Thermo Scientific 170355
50 ml Conical Tubes Thermo Scientific 339652
A23187 ionophore Fisher Scientific BP595
Centrifuge Thermo Scientific 75004381
DMSO Sigma D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit StemCell 19157
FBS GIBCO 16140-071
HBSS GIBCO 14185-052
HEPES Fisher Bioreagents BP310-500
KHCO3 Fisher Bioreagents P184-500
Lymphocyte Separation Medium Corning 25-072-CV
Na2EDTA ACROS 10378-23-1
NaHCO3 Fisher Bioreagents S233-500
NH4Cl Fisher Bioreagents A661-500
Penicillin-streptomycin solution GIBCO 15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA) Sigma P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ RAININ 17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ RAININ 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ RAININ 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ RAININ 17014392
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1013
Rneasy Plus Mini Kit Qiagen 74136
RPMI 1640 GIBCO 31800-022
T-25 Flask Thermo Scientific 2024-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, E. J., et al. Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).
  2. Wong, H. K., et al. Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome). British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).
  3. Whittaker, S. Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).
  4. Kallinich, T., et al. Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides. Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).
  5. Rodd, A. L., et al. Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors. Lymphoma. 2012, Article ID 290685 1-10 (2012).
  6. Olsen, E., et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood. 110, 1713-1722 (2007).
  7. Hameetman, L., et al. EPHA4 is overexpressed but not functionally active in Sézary syndrome. Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).
  8. Willemze, R., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood. 105, 3768-3785 (2005).
  9. Bradford, P. T., et al. Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases. Blood. 113, 5064-5073 (2009).
  10. Wilson, L. D., et al. Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma. Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).
  11. Li, Y., et al. Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options. Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).
  12. Korgavkar, K., et al. Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma. Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).
  13. Dulmage, B. O., Geskin, L. J. Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma. British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).
  14. Boonk, S. E., et al. Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for Sézary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients. Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).
  15. Scarisbrick, J. J., et al. Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model. Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).
  16. Benoit, B. M., et al. CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in Sézary syndrome: the Sézary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214. Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).
  17. Dulmage, B., et al. The biomarker landscape in mycosis fungoides and Sézary syndrome. Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).
  18. Pick, E., et al. Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187. Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).
  19. Chong, B. F., et al. Induced Sézary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells. Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).
  20. Fargnoli, M. C., et al. Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk. Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).
  21. Hansen, E. R., et al. Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex. Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).
  22. Chong, B. F., et al. Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides. Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).
  23. Moerman-Herzog, A. M., et al. Transcriptome analysis of Sézary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes. Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).
  24. Fanok, M. H., et al. Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma. Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).
  25. Su, M. W., et al. Aberrant expression of T-plastin in Sezary cells. Cancer Research. 63, 7122-7127 (2003).
  26. van Doorn, R., et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).
  27. Booken, N., et al. Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 22, 393-399 (2008).
  28. Dagur, P. K., McCoy, J. P. Collection , storage, and preparation of human blood cells. Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).
  29. Fierro, M. T., et al. Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma. Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).
  30. Campbell, J. J., et al. Sézary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors. Blood. 116 (5), 767-771 (2010).
  31. Roelens, M., et al. Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity. Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).
  32. Diehn, M., et al. Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).
  33. Fuji, K. New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma. Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 176 ، سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية الجلدية ، متلازمة سيزاري ، خلية الدم أحادي النواة الطرفية ، phorbol-12-myrisate13-acetate ، A23187 ، المصفوفة الدقيقة ، التقدم ، الأورام.
عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehdi, S. J., Moerman-Herzog, A. M., … More

Mehdi, S. J., Moerman-Herzog, A. M., Wong, H. K. Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from Sézary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling. J. Vis. Exp. (176), e61470, doi:10.3791/61470 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter