Summary
We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.
Abstract
Cutane T-cellymfomen (CTCL) zijn afgeleid van de transformatie en ongecontroleerde proliferatie van volwassen huid-homing T-cellen, en mycosis fungoides (MF) en Sézary-syndroom (SS) vertegenwoordigen de meest voorkomende subtypen. Ondanks een aantal studies naar het karakteriseren van genexpressie, genetische veranderingen en epigenetische afwijkingen van CTCL, blijft de moleculaire pathogenese van MF / SS onduidelijk. MF verwijst naar de meer voorkomende CTCL met een huidoverwicht en is meestal beperkt tot de huid, terwijl SS een agressieve leukemische variant van CTCL is met wijdverspreide betrokkenheid van de huid en wordt gekenmerkt door neoplastische distributie waarbij voornamelijk bloed, huid en lymfeklier betrokken zijn. Gericht op de klinische praktijk, heeft de identificatie van genexpressie biomarkers een enorm potentieel om de diagnose en behandeling van MF / SS te verbeteren. Inderdaad, recente transcriptomische studies hebben potentiële diagnostische biomarkers geïdentificeerd van verschillen in genexpressie tussen normale en kwaadaardige T-cellen, die ons begrip van SS-biologie kunnen verbeteren en potentiële therapeutische doelen kunnen onthullen. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd reproduceerbaar protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit vers volbloed van patiënten met de diagnose SS, selectie van CD4 + geheugen T-cellen (CD4 + CD45RO + T-cellen), chemische stimulatie en voorbereiding van RNA geschikt voor transcriptomische profilering om nieuwe prognostische moleculaire markers te ontdekken om extra inzicht te krijgen in de ziekte-etiologie. De stimulatie met behulp van chemische agonist om nucleaire regulatie te activeren, biedt een meer specifieke beoordeling voor routes die belangrijk zijn in de dynamische transcriptieregulatie en genexpressie en elimineert verstorende defecten die kunnen voortvloeien uit stroomopwaarts signalerende defecten die voortvloeien uit TCR-antigeenverlies bij het celmembraan. De gegevens verkregen uit vergelijking van transcriptoom van niet-gestimuleerde tot gestimuleerde SS T-cellen ontmaskeren functionele regulerende genexpressiedefecten die niet duidelijk zijn uit analyse van rustige niet-gestimuleerde cellen. Bovendien kan de methode die vanuit deze benadering wordt geschetst, worden aangepast voor het bestuderen van T-celgenexpressiedefecten in andere T-cel immuunziekten.
Introduction
Cutaan T-cellymfoom (CTCL), inclusief de meest voorkomende subtypes mycosis fungoides (MF) en Sézary syndroom (SS), is een heterogene groep ziekten afgeleid van transformatie en ongecontroleerde proliferatie van volwassen huid-homing T-cellen 1,2. De neoplastische T-cellen hebben een volwassen CD4 +CD45RO +, geheugenfenotype3 en drukken huid homing adhesiemarkers uit, waardoor epidermotropisme4 toeneemt, wat zich manifesteert als uitslag, vooral bij vroege ziekte. Het klinische beloop van MF is vaak indolent wanneer het onder routinematig beheerde zorg valt, maar een subgroep van patiënten kan evolueren naar een meer gevorderde ziekte. In deze MF-gevallen groeien huidlaesies en verdikken ze tot grote tumoren en kunnen neoplastische T-cellen zich verspreiden naar lymfeklieren en viscerale organen. Daarentegen is SS een agressievere, leukemische variant van CTCL5, gekenmerkt door een triade van symptomen: gegeneraliseerde erytrodermie (gedefinieerd als het beïnvloeden van >80% van het totale lichaamsoppervlak), lymfadenopathie en aanwezigheid van meer dan 1000 / mm3 circulerende klonale atypische T-cellen met cerebriforme kernen, zogenaamde Sézary-cellen 6,7 . De prognose voor SS-patiënten is significant slechter dan MF. SS is zeldzaam met een incidentie van 0,1/100.000 en vertegenwoordigt ongeveer 3% van de totale CTCL-gevallen 8,9. CTCL presenteert zich meestal bij oudere volwassenen met een mediane leeftijd van ongeveer 60 jaar10. De incidentie voor CTCL was toegenomen en hoewel de oorzaak onduidelijk is, is het percentage sinds 1998 gestabiliseerd11,12.
De moleculaire pathogenese van SS blijft onduidelijk. Genetische, epigenetische en genexpressiestudies hebben een schat aan nieuwe gegevens opgeleverd, maar er blijven inconsistente bevindingen, voornamelijk als gevolg van de kleine patiëntencohorten bestudeerd2, evenals verschillen in experimenteel ontwerp en controlepopulaties13,14. Verbeterde genomische en transcriptomische karakterisering kan licht werpen op zowel ziektemechanismen als eerder onontgonnen therapeutische doelen. Daarom zijn meer studies van een grotere patiëntenpopulatie nodig om deze heterogene maligniteit beter te begrijpen. Biomarkerpanelen die zeer gevoelig en specifiek zijn in één SS-cohort hebben minder uniform gepresteerd in andere cohorten15, wat een ernstig obstakel vormt bij de ontwikkeling van betrouwbare diagnostische en prognostische biomarkers voor SS16. Ideale diagnostische biomarkers zullen consistent en sterk overexpressie hebben in kwaadaardige T-cellen, terwijl ze afwezig of bijna afwezig zijn in normale T-cellen17. De ontdekking van ziektespecifieke biomarkers is belangrijk voor de vooruitgang van diagnostische en therapeutische protocollen voor SS.
Transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit voor zowel kwaadaardige als normale T-cellen vereisen een efficiënte en betrouwbare benadering van monstervoorbereiding. Hier zullen we een gedetailleerde maar eenvoudige strategie bespreken om RNA-monsters te verkrijgen van T-celpopulaties die relevant zijn voor SS. We zullen de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) uit volbloed bespreken, negatieve magnetische selectie van ziekterelevante CD4 + CD45RO + T-celpopulaties, chemische activering om verschillen in functionele responsen te onthullen en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering. In het huidige protocol is chemische activering uitgevoerd met behulp van phorbol myristaatacetaat (PMA) en calciumionofoor (A23187) 18,19, omdat eerdere studies defecte T-celreceptorsignalering in CTCL hebben aangetoond, en stimulatie met PMA / A23187 omzeilt de T-celreceptor20,21. Ook maakt PMA/A23187 een meer directe proximale activering mogelijk van nucleaire signalen die nodig zijn voor cytokine-genactivering. Ten slotte biedt stimulatie van T-cellen een extra niveau van inzicht in de regulatie van genexpressie die niet kon worden verkregen uit rustende T-cellen waar dynamische verandering afwezig is.
Protocol
Menselijke cellen zijn potentieel besmettelijk. Daarom worden de experimenten strikt uitgevoerd in overeenstemming met de vereiste voorzorgsmaatregelen en procedures die worden besproken als occupational safety and health administration (OSHA) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE).
1. Isolatie van PBMC's uit volbloed
- Verzamel alle benodigde materialen uit tabel 1 en breng ze op kamertemperatuur (RT). Warm RP10F tot 37 °C. Stel de centrifuge in op RT. Behalve voor centrifugaties en celtelling, voer je alle stappen uit met behulp van levensvatbare cellen in een biologische veiligheidskast.
- Verkrijg bloed in vijf buisjes van 10 ml (gewenste hoeveelheid) met antistollingsmiddel. Bewaar het volbloed bij omgevingstemperatuur (18\u201224 °C). Label 50 ml scheidingsbuizen met het nummer van de menselijke onderzoekspersoon voor het te verwerken bloedmonster.
- Breng 10\u201215 ml bloed over in elke scheidingsbuis(en) met het bijbehorende onderwerpnummer. Verdun het bloed minstens 2 keer met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Niet meer dan 35 ml verdund bloed per buis.
- Voorzichtig en langzaam onder het bloed met ~ 13 ml dichtheidsmedium. Kijk door het transparante dichtheidsmedium aan de onderkant van de buis en stop met pipetteren wanneer de pipet bijna leeg is (om te voorkomen dat de bel vrijkomt). Verwijder de pipet voorzichtig om te voorkomen dat het bloed en de medium lagen met de dichtheid worden gemengd.
- Breng de gevulde scheidingsbuizen voorzichtig over naar de centrifuge zonder de lagen te verstoren.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 30 minuten met de centrifugerem uit (vertraging ingesteld op nul).
OPMERKING: Als de centrifuge alleen toerentallen weergeeft, raadpleeg dan de rotorspecificaties om het toerentalequivalent voor 500 x g te schatten. - Verwijder voorzichtig scheidingsbuizen uit de centrifuge zonder de lagen te verstoren. Observeer de buffy coat, die is gevormd tussen de dichtheidsmedium- en plasmalagen.
- Pipetteer vanaf de bovenkant om het grootste deel van de bovenste plasmafractie te verwijderen en weg te gooien, zodat 10 ml boven de buffy vacht blijft. Verzamel voorzichtig en langzaam de buffy vacht. Breng de buffy coats van twee scheidingsbuizen over in een nieuwe voorgelabelde en steriele buis van 50 ml, zoals weergegeven in figuur 1.
- Verdun de PBMC's minstens 2 keer met HBSS, waardoor het volume in elke nieuwe buis op 50 ml komt. Vergeet niet om de centrifugerem op vol te zetten. Pellet PBMC's door centrifugeren bij 400 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk en tik op de bodem van de buis om de pellet los te maken.
- Om resterende rode bloedcellen (RBC) te lyseren, resuspendeert u elke celkorrel in 1 \ u20122 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer per 10 ml oorspronkelijk bloedvolume. Incubeer precies 5 min. Stop onmiddellijk met lysis met een gelijk of groter volume HBSS en pas het volume aan op 50 ml. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en tik op de bodem van de buis om de celkorrel los te maken. Poolcellen van dezelfde donor. Breng het volume tot 50 ml met HBSS. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en tik op de bodem van de buis om de celkorrel los te maken. Resuspend cellen in 10 ml warm RP10F-medium en neem een aliquot voor levensvatbare celtelling met trypan blue.
- Bereken het totale celgetal in elk monster met behulp van een hemocytometer.
2. Zuivering van CD4 + CD45RO + T-cellen van PBMC's
OPMERKING: Zuivering van CD4+CD45RO+ T-cellen van PBMC's gebeurt met behulp van in de handel verkrijgbare magnetische scheiding (zie Tabel met materialen) met kleine wijzigingen. Het verdient de voorkeur om de handleiding van de kit te volgen voor de incubatietijd, omdat elke commerciële kit zijn eigen instructies heeft.
- Was de gewenste hoeveelheid PBMC's in 10 ml selectiebuffer. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tik op de bodem van de buis om de pellet los te maken.
- Verdun PBMC's tot 5 x 107 cellen/ml in selectiebuffer en breng ze over naar een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem (12 x 75 mm).
- Voeg 50 μL antilichaamcocktail per 1 ml monster toe en meng voorzichtig. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Vlak voor gebruik, vortex magnetische deeltjes gedurende 30 sec op hoge snelheid. Voeg 50 μL magnetische deeltjes per 1 ml monster toe aan de buis met PBMC's en meng voorzichtig.
- Breng het volume op 2,5 ml met selectiebuffer en meng voorzichtig. Plaats de buis (zonder deksel) in de magneet en incubeer bij RT gedurende 2,5 min.
- Pak de magneet op en keer in een continue beweging de magneet en buis om om de verrijkte celsuspensie in een nieuwe steriele buis te gieten.
- Om het herstel te vergroten, voegt u 2,5 ml selectiebuffer toe aan de buis die in de magneet achterblijft, zonder de geïmmobiliseerde kralen te verstoren. Houd nog 2,5 minuut in de magneet en herhaal stap 2.6 om extra cellen te herstellen.
- Neem een aliquot voor levensvatbare celtelling met trypan blue. Bereken het totale celgetal met behulp van een hemocytometer of celteller.
- Bevestig de zuiverheid door middel van flowcytometrie (figuur 3).
3. Chemische activering
- Pas CD4+CD45RO+ T-cellen aan op 5 x 106 cellen/ml met warm RP10F-medium en verdeel cellen in kweekschalen van de gewenste grootte. Laat cellen een nacht rusten in een bevochtigde incubator van 37 °C 5% CO2 .
- Pellet rustende cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tik op de bodem van de buis om de celkorrel los te maken.
- Pas de celconcentratie aan tot 5 x 106 cellen /ml met warm RP10F-medium en verdeel 0,5 \ u20121 x 107 cellen in elk van de drie steriele schroefdoppenbuizen.
OPMERKING: Als er voldoende cellen beschikbaar zijn, kunnen dubbele stimulaties of extra tijdspunten in het experimentele ontwerp worden opgenomen. - Stimuleer cellen in buis 2 en 3 met PMA en A23187. Voeg PMA toe aan 25 ng/ml en A23187 aan 500 ng/ml en meng voorzichtig. Voeg een gelijk volume dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de cellen in buis 1 die als voertuig zullen dienen (controle). Als u bijvoorbeeld 1 μL PMA en 1 μL A23187 gebruikt, voeg dan 2 μL DMSO toe aan de buis van het voertuig. Houd de uiteindelijke concentratie DMSO in alle buizen onder de 0,5%.
- Maak de doppen op de buizen los en breng de cellen terug naar de incubator 37 °C 5% CO2 gedurende 2 uur (buis 2) en 6 uur (buis 1 en 3). Centrifugeer cellen op het aangegeven tijdstip gedurende 10 minuten bij 500 x g .
- Gooi voorafgaand aan lysis zoveel mogelijk van het supernatant weg, zonder de celkorrel te verstoren.
- Lyseer de cellen onmiddellijk, zoals aangegeven door instructies van de in de handel verkrijgbare RNA-isolatiekit (zie Tabel met materialen). Ga verder met RNA-isolatie of bevries het lysaat bij -80 °C om later te verwerken met extra monsters.
OPMERKING: De zuiverheid en integriteit van RNA kunnen worden geverifieerd met behulp van microcapillaire elektroforese. - Optioneel: Om alle sporen van DNA uit het gezuiverde RNA-monster volledig te verwijderen, gebruikt u een RNA-opruimkit (zie Tabel met materialen), volgens de instructies van de fabrikant.
Representative Results
Dit protocol omvat procedures voor de isolatie van PBMC's uit SS-bloed, zuivering van CD4 + CD45RO + T-cellen door negatieve selectie, stimulatie van gezuiverde T-cellen en isolatie van totaal RNA voor transcriptomische profilering. Figuur 1 beschrijft het proces van PBMC-isolatie uit volbloed. Houd er rekening mee dat de totale opbrengst van SS PBMC's zal variëren met het startbloedvolume en de circulerende tumorbelasting van elke patiënt. In ons laboratorium was de gemiddelde opbrengst van SS PBMC's 4,6 × 106 cellen/ml volbloed (1,85 × 106 – 3,25 x 107 cellen/ml voor 7 SS). De gemiddelde levensvatbaarheid van geïsoleerde PBMC's was 95\u201299%. Figuur 2 toont een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van geselecteerde CD4+CD45RO+ geheugen T-cellen. De gemiddelde opbrengst van CD4+CD45RO+ T-cellen van SS PBMC's was 75% (75,6% – 84%), vergeleken met 15,9% (3% – 30%) van normale donoren (ND) PBMC's verkregen uit leukoreductiesysteem (LRS) kamers. De levensvatbaarheid en zuiverheid van CD4+CD45RO+ T-cellen verkregen door dit negatieve selectieprotocol is consistent hoog (figuur 3).
We hebben eerder het bovenstaande activeringsprotocol gecombineerd met microarrays om de functionele veranderingen in de transcriptomen van zowel SS- als ND T-cellen te bestuderen, en hebben aangetoond dat SS-geheugen T-cellen en SS PBMC's cytokine en andere immuunresponsgenen slecht tot expressie brengen in vergelijking met ND T-cellen en PBMC's 19,22,23. Figuur 4 toont de robuuste activering van verschillende cytokinegenen waaronder IL4, IL 10, IL13 en IL22 in ND T-cellen, maar niet in SS T-cellen. Dit defect in functionele genexpressie in SS T-cellen is sindsdien bevestigd door andere groepen24. Bovendien komen veel genen die normaal niet tot expressie komen in ND T-cellen sterk tot expressie in SS T-cellen, zowel in rust als na stimulatie (figuur 4). Deze omvatten de eerder beschreven SS-biomarkergenen DNM3, PLS3, TOX en TWIST1 25,26,27, evenals ANK1 en SGCE, die voor het eerst door onze groep werden gerapporteerd. Deze positieve biomarkers komen sterk tot uiting in SS, maar niet in ND, en vermijden technische valkuilen geassocieerd met negatieve biomarkers.
Figuur 1: PBMC isolatie van volbloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Negatieve selectie van CD4+ geheugen T-cellen uit geïsoleerde PBMC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuiverheid van CD4+CD45RO+ T-cellen werd bevestigd door flowcytometrie. Lymfocyten werden gepoort door lichtverstrooiing (A), levende lymfocyten uitgesloten eFluor780 levensvatbaarheid kleurstof (B), en (C) vertegenwoordigt niet-geselecteerde normale donoren (ND). Negatieve selectie resulteerde in bijna zuivere populaties van CD45RO+ T-cellen bij ND (D) en SS-patiënten (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Differentiële genexpressie in rustende en geactiveerde CD4+CD45RO+ geheugen T-cellen van SS en ND. Genexpressie z-score wordt weergegeven door een kleurenschaal van rood (hoge expressie) tot groen (lage expressie). Gekleurde balken bovenaan de heatmap staan voor celbehandelingen: mock/vehicle treated (rood), 2 h gestimuleerd (blauw) en 6 h gestimuleerd (geel). Verschillende SS-biomarkergenen zijn sterk tot expressie gebracht en cytokinegenen komen slecht tot expressie in SS T-cellen in vergelijking met ND T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagentia | |
| Dichtheid Medium | Lymfocytenscheidingsmedium, ficoll-hypaque of medium met equivalente dichtheid met dichtheid = 1,077-1,080 g/ml bij 20oC. |
| HBSS | 1x Hank's gebalanceerde zoutoplossing, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 |
| RP10F | RPMI 1640 medium, 10 % warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1x penicilline-streptomycine-oplossing, pH 7.2 |
| ACK lysis buffer | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Geen noodzaak om de pH aan te passen. Het zou ~ 7.3 moeten zijn. |
| Selectiebuffer | 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA |
| phorbol12-myristate13-acetaat (PMA) | 50 μg/ml in DMSO |
| A23187 ionofoor | 500 μg/ml in DMSO |
Tabel 1: Reagentia.
Discussion
Er zijn verschillende manieren ontwikkeld om PBMC's te isoleren en elk heeft zijn eigen voordelen en beperkingen28. We verzamelen routinematig tot 50 ml bloed in vijf buisjes van 10 ml met antistollingsmiddel. Het volume van het bloed voor PBMC-isolatie hangt af van verschillende factoren, zoals gezondheid en leeftijd van het onderzoeksonderwerp en ook van flebotomistische expertise. Een cruciale procedurele stap in het protocol is de vorming van de stapgradiënt. Slechte gelaagdheid kan resulteren in gedeeltelijk of volledig falen van PBMC's om sediment op het grensvlak te bezinken. We geven de voorkeur aan de hier beschreven onderlaagmethode, omdat het gemakkelijk is om de onderste laag te starten. Om al het dichtheidsmedium onder het bloed volledig af te geven, is het van cruciaal belang om een pipethulpmiddel te gebruiken zonder luchtlekken. Verontreiniging van de PBMC-fractie door ongewenste celtypen kan worden geminimaliseerd door zorgvuldige en consistente verzameling van de buffy coat, die voor elke isolatie op dezelfde manier moet worden uitgevoerd. Als PBMC's niet verder worden gefractioneerd, moet het verzamelen van verschillende hoeveelheden van de dichtheidsgradiënt en plasmalagen tussen isolaties worden vermeden. RBC-lysis wordt uitgevoerd om de potentiële impact van contaminerend RBC- en reticulocyt-afgeleid RNA op downstream genexpressieanalyses te minimaliseren. Hypotone lysis zal worden geremd door een te hoge isotone buffer.
Verdere isolatie van T-cel subset is belangrijk voor moleculaire studies. Hier beschreven we de daaropvolgende CD4 + CD45RO + T-cellenselectie door negatieve selectie om ongewenste celtypen te verwijderen. Negatieve selectie is afhankelijk van antilichamen die specifieke celoppervlakmarkers herkennen voor alle ongewenste cellen. Antilichaam gecoate cellen worden vervolgens verwijderd door magnetische kralen. Dit selectieprotocol verwijdert ongewenste cellen terwijl onaangeroerde en niet-gestimuleerde doelcellen vrij zweven, wat essentieel is bij het bestuderen van genactivatie. Er moet echter voor worden gezorgd dat celklonten worden vermeden, die de uiteindelijke zuiverheid van geselecteerde CD4 + CD45RO + T-cellen verminderen. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) aanwezig in de selectiebuffer minimaliseert celklontering. De opbrengst van T-cellen hangt af van factoren zoals het initiële volume van het bloed, patiëntvariabelen zoals de behandeling die aan de patiënt wordt toegediend en het ziektestadium op het moment van monsterverzameling. Behandeling die aan de patiënten wordt gegeven, kan ook de levensvatbaarheid van de cel beïnvloeden. Bovendien heeft monsterverzameling vóór een procedure zoals fotoferese ook een positieve invloed op de zuiverheid van CD4 + CD45RO + T-cellen. We hebben waargenomen dat monsterverzameling na de behandelingsprocedure met fotoferese een negatieve invloed heeft op de opbrengst van CD4 + CD45RO + T-cellen.
Neoplastische T-celklonen van SS-patiënten drukken meestal oppervlaktemarkers uit die consistent zijn met een volwassen, geheugen CD4 T-celfenotype29,30. Fenotypische plasticiteit is echter af en toe waargenomen met betrekking tot oppervlaktemarkers, waaronder CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 en/of CD2631. Eerdere studies hebben ook de heterogeniteit in CD45RO- en CD45RA-expressie aangetoond bij SS-patiënten29, terwijl de meerderheid van de SS-gevallen nog steeds CD45RO + is. Roelens et al.31 toonden ook aan dat SS interindividuele en intraindividuele heterogeniteit kan vertonen met een gemengde populatie van naïeve (TN), centraal geheugen (TCM), overgangsgeheugen (TTM), effectorgeheugen (TEM) en terminale effectorgeheugen (TEMRA) subsets. Hun resultaten laten echter duidelijk zien dat de meerderheid van de SS-cellen TCM-fenotype heeft. We concentreerden onze studie op het CD45RO + oppervlakte-immunofenotype dat het meest voorkomt bij SS-patiënten en bevestigde fenotype door flowcytometrie. Bij het plannen van studies van T-celsubsets bij patiënten is het belangrijk om rekening te houden met fenotypische heterogeniteit van de bestudeerde ziekte, en de zuiveringsstrategie kan daarom indien nodig worden aangepast om de gewenste T-celpopulatie voor analyse te verkrijgen.
Er zijn verschillende manieren om T-cellen en PBMC's te stimuleren om functionele genexpressie te onderzoeken. We geven de voorkeur aan chemische activering (PMA + A23187 ionofoor), omdat we geïnteresseerd zijn in genregulatie in de kern. Chemische activering is een beste optie voor dit doel omdat het fungeert als een brede activator en uniformer is in vergelijking met antigeenspecifieke stimulatie. PMA is een kleine organische verbinding die door het celmembraan in het cytoplasma diffundeert en direct eiwitkinase C activeert. Deze verbindingen omzeilen oppervlaktereceptoren en bootsen samen de effecten van T-celreceptorligatie na met co-stimulatie gemedieerd door CD28. De chemicaliën activeren verschillende intracellulaire signaalroutes, wat resulteert in nucleaire transcriptiefactoractivering en upregulatie van cytokinegenen die toegankelijk zijn voor transcriptieactivering. Hoewel chemische activering en CD3CD28-ligatie opvallend vergelijkbare wereldwijde genexpressieprofielen produceren in normale cellen32, is chemische activering met PMA + A23187 een goede keuze omdat SS T-cellen de expressie van oppervlaktereceptoren kunnen verliezen, waaronder TCR-componenten33. Chong et al.22 vergeleken de activering van cytokinegenen tussen PMA/A23187 met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen in PBMC's van normale, vroege MF/CTCL en late MF/CTCL patiënten. Ze meldden dat PMA / A23187 een snellere en intensere activering van het IL-2-gen veroorzaakte in vergelijking met anti-CD3 / CD28-stimulatie. Bovendien toonden ze aan dat de langzamere activeringskinetiek met anti-CD3 / CD28-antilichamen mogelijk afkomstig is van cross-linking en membraansignalering die nodig is voor stimulatie. Bovendien werden trends in expressie van cytokines onder de verschillende bestudeerde celpopulaties bewaard met PMA/A23187. Omdat we geïnteresseerd zijn in genexpressie-activering, is chemische stimulatie een ideale benadering omdat het fungeert als een brede activator en consistenter is in vergelijking met antigeenspecifieke stimulatie. CD3/CD28 ligatie is ideaal om routes te onderzoeken die belangrijk zijn bij membraangebaseerde signaaltransductie. Bovendien is chemische activering minder duur en is er geen speciale apparatuur nodig. In de huidige studie activeerde PMA + A23187 cytokinegenen significant in ND- maar niet in SS T-cellen, wat suggereert dat SS T-cellen functionele tekortkomingen hebben stroomafwaarts van de TCR.
Samenvattend biedt dit protocol fenotypisch zuivere T-cellen uit kostbaar van de patiënt afgeleid bloed en een methode voor het beoordelen van genoombrede veranderingen in functionele genexpressie. We tonen aan dat transcriptomische profilering van SS T-cellen in vergelijking met normale CD45RO + T-cellen diepgaande verschillen in genactivatie in verse menselijke T-cellen van patiënten met CTCL onthult. Deze studies zullen helpen bij de ontwikkeling van diagnostische biomarkers en therapeutische strategieën gericht op nieuwe markers in CTCL. Bovendien kunnen deze strategie en dit protocol bij het bestuderen van primaire menselijke T-cellen waardevol zijn bij het aanpassen aan studies van andere door T-cellen gemedieerde ziekten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Ethische openbaarmaking:
Dit onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen (UAMS, Little Rock, AR) De microarray-gegevens die in deze studie werden gepresenteerd, werden gedaan op de monsters die werden gerekruteerd onder een onderzoeksprotocol dat is goedgekeurd door de IRB van Henry Ford Hospital (Detroit, MI).
Acknowledgments
We bedanken de patiënten en vrijwilligers die hebben deelgenomen aan ons onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 10 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| 1000 ul Pipet tips | VWR | 10017-038 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 352196 | |
| 25 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170357 | |
| 5 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170355 | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| A23187 ionophore | Fisher Scientific | BP595 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004381 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ml | |
| EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit | StemCell | 19157 | |
| FBS | GIBCO | 16140-071 | |
| HBSS | GIBCO | 14185-052 | |
| HEPES | Fisher Bioreagents | BP310-500 | |
| KHCO3 | Fisher Bioreagents | P184-500 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Corning | 25-072-CV | |
| Na2EDTA | ACROS | 10378-23-1 | |
| NaHCO3 | Fisher Bioreagents | S233-500 | |
| NH4Cl | Fisher Bioreagents | A661-500 | |
| Penicillin-streptomycin solution | GIBCO | 15140122 | |
| phorbol12-myristate13-acetate (PMA) | Sigma | P-8139 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | RAININ | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | RAININ | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | RAININ | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | RAININ | 17014392 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 31800-022 | |
| T-25 Flask | Thermo Scientific | 2024-10 |
References
- Kim, E. J., et al. Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).
- Wong, H. K., et al. Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome). British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).
- Whittaker, S. Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).
- Kallinich, T., et al. Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides. Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).
- Rodd, A. L., et al. Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors. Lymphoma. 2012, Article ID 290685 1-10 (2012).
- Olsen, E., et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood. 110, 1713-1722 (2007).
- Hameetman, L., et al. EPHA4 is overexpressed but not functionally active in Sézary syndrome. Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).
- Willemze, R., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood. 105, 3768-3785 (2005).
- Bradford, P. T., et al. Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases. Blood. 113, 5064-5073 (2009).
- Wilson, L. D., et al. Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma. Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).
- Li, Y., et al. Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options. Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).
- Korgavkar, K., et al. Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma. Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).
- Dulmage, B. O., Geskin, L. J. Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma. British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).
- Boonk, S. E., et al. Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for Sézary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients. Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).
- Scarisbrick, J. J., et al. Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model. Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).
- Benoit, B. M., et al. CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in Sézary syndrome: the Sézary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214. Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).
- Dulmage, B., et al. The biomarker landscape in mycosis fungoides and Sézary syndrome. Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).
- Pick, E., et al. Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187. Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).
- Chong, B. F., et al. Induced Sézary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells. Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).
- Fargnoli, M. C., et al. Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk. Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).
- Hansen, E. R., et al. Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex. Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).
- Chong, B. F., et al. Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides. Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).
- Moerman-Herzog, A. M., et al. Transcriptome analysis of Sézary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes. Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).
- Fanok, M. H., et al. Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma. Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).
- Su, M. W., et al.
- van Doorn, R., et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).
- Booken, N., et al. Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 22, 393-399 (2008).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P. Collection , storage, and preparation of human blood cells. Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).
- Fierro, M. T., et al. Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma. Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).
- Campbell, J. J., et al. Sézary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors. Blood. 116 (5), 767-771 (2010).
- Roelens, M., et al. Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity. Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).
- Diehn, M., et al. Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).
- Fuji, K. New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma. Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).
