Summary
Vi presenterar ett enkelt protokoll för isolering av mononukleära celler i perifert blod från helblod erhållet från patienter som diagnostiserats med Sézarys syndrom, följt av urval av CD4 + T-celler, deras stimulering med phorbol12-myristate13-acetat och A23187 jonofor och beredning av RNA för transkriptomisk profilering.
Abstract
Kutana T-cellslymfom (CTCL) härrör från transformation och okontrollerad spridning av mogna hud-homing T-celler, och mykos fungoides (MF) och Sézary syndrom (SS) representerar de vanligaste subtyperna. Trots ett antal studier om karakterisering av genuttryck, genetiska förändringar och epigenetiska avvikelser i CTCL är den molekylära patogenesen av MF / SS fortfarande oklar. MF hänvisar till den vanligare CTCL med huddominans och är vanligtvis begränsad till hud, medan SS är en aggressiv leukemisk variant av CTCL med utbredd hudengagemang och kännetecknas av neoplastisk distribution som huvudsakligen involverar blod, hud och lymfkörtel. Med fokus på klinisk praxis har identifieringen av genuttrycksbiomarkörer en enorm potential att förbättra diagnos och behandling av MF / SS. Faktum är att nyligen transkriptomiska studier har identifierat potentiella diagnostiska biomarkörer från skillnader i genuttryck mellan normala och maligna T-celler, vilket kan förbättra vår förståelse av SS-biologi och avslöja potentiella terapeutiska mål. Detta manuskript beskriver ett detaljerat reproducerbart protokoll för isolering av mononukleära celler i perifert blod från färskt helblod från patienter som diagnostiserats med SS, urval av CD4 + minnes-T-celler (CD4 + CD45RO + T-celler), kemisk stimulering och beredning av RNA som är lämplig för transkriptomisk profilering för att upptäcka nya prognostiska molekylära markörer för att få ytterligare insikt i sjukdomsetiologi. Stimuleringen med kemisk agonist för att aktivera kärnreglering ger mer specifik bedömning för vägar som är viktiga i den dynamiska transkriptionsregleringen och genuttrycket och eliminerar förvirrande defekter som kan uppstå från uppströms signaldefekter som härrör från TCR-antigenförlust vid cellmembranet. De data som erhållits från jämförelse av transkriptom av ostimulerade till stimulerade SS T-celler avslöjar funktionella reglerande genuttrycksdefekter som inte framgår av analys av vilande ostimulerade celler. Vidare kan metoden som beskrivs från detta tillvägagångssätt anpassas för att studera T-cellgenuttrycksdefekter i andra T-cellsimmunsjukdomar.
Introduction
Kutan t-cellslymfom (CTCL), inklusive de vanligaste subtyperna mycosis fungoides (MF) och Sézary syndrom (SS), är en heterogen grupp av sjukdomar som härrör från transformation och okontrollerad spridning av mogna hud-homing T-celler 1,2. De neoplastiska T-cellerna har en mogen CD4 + CD45RO +, minnesfenotyp3 och uttrycker hudhoming vidhäftningsmarkörer, vilket ökar epidermotropism4, vilket manifesterar sig som utslag särskilt vid tidig sjukdom. Den kliniska kursen av MF är ofta indolent när den är under rutinmässig hanterad vård, men en delmängd av patienterna kan utvecklas till mer avancerad sjukdom. I dessa MF-fall växer hudskador och tjocknar till stora tumörer, och neoplastiska T-celler kan spridas till lymfkörtlar och viscerala organ. Däremot är SS en mer aggressiv, leukemisk variant av CTCL5, kännetecknad av en triad av symtom: generaliserat erytrodermi (definierat som att det påverkar >80% av den totala kroppsytan), lymfadenopati och närvaro av mer än 1000 / mm3 cirkulerande klonala atypiska T-celler med cerebriforma kärnor, så kallade Sézary-celler 6,7 . Prognosen för SS-patienter är signifikant sämre än MF. SS är sällsynt med en incidens på 0,1/100 000 och representerar cirka 3% av de totala CTCL-fallen 8,9. CTCL förekommer vanligtvis hos äldre vuxna med en medianålder på cirka 60 år10. Incidensen för CTCL hade ökat och även om orsaken är oklar har hastigheten stabiliserats sedan 199811,12.
Den molekylära patogenesen av SS är fortfarande oklar. Genetiska, epigenetiska och genuttrycksstudier har producerat en mängd nya data, men det finns fortfarande inkonsekventa fynd, främst på grund av de små patientkohorterna som studerats2, liksom skillnader i experimentell design och kontrollpopulationer13,14. Förbättrad genomisk och transkriptomisk karakterisering kan belysa både sjukdomsmekanismer och tidigare outforskade terapeutiska mål. Därför behövs fler studier från en större patientpopulation för att bättre förstå denna heterogena malignitet. Biomarkörpaneler som är mycket känsliga och specifika i en SS-kohort har presterat mindre enhetligt i andra kohorter15, vilket utgör ett allvarligt hinder i utvecklingen av tillförlitliga diagnostiska och prognostiska biomarkörer för SS16. Ideala diagnostiska biomarkörer kommer att vara konsekvent och mycket överuttryckta i maligna T-celler, medan de saknas eller nästan saknas i normala T-celler17. Upptäckten av sjukdomsspecifika biomarkörer är viktig för utvecklingen av diagnostiska och terapeutiska protokoll för SS.
Högkvalitativa transkriptomiska data för både maligna och normala T-celler kräver ett effektivt och tillförlitligt tillvägagångssätt för provberedning. Här kommer vi att diskutera en detaljerad men ändå enkel strategi för att erhålla RNA-prover från T-cellpopulationer som är relevanta för SS. Vi kommer att diskutera isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från helblod, negativt magnetiskt urval av sjukdomsrelevanta CD4 + CD45RO + T-cellpopulationer, kemisk aktivering för att avslöja skillnader i funktionella svar och beredning av RNA för transkriptomisk profilering. I det nuvarande protokollet har kemisk aktivering utförts med användning av phorbol myristatacetat (PMA) och kalciumjonofor (A23187)18,19, eftersom tidigare studier har visat defekt T-cellsreceptorsignalering i CTCL, och stimulering med PMA / A23187 kringgår T-cellreceptorn20,21. PMA / A23187 tillåter också en mer direkt proximal aktivering av kärnsignaler som behövs för cytokingenaktivering. Slutligen ger stimulering av T-celler en ytterligare nivå av insikt i regleringen av genuttryck som inte kunde erhållas från vilande T-celler där dynamisk förändring saknas.
Protocol
Mänskliga celler är potentiellt smittsamma. Därför utförs experimenten strikt i enlighet med de nödvändiga försiktighetsåtgärder och förfaranden som diskuteras som arbetsmiljöadministration (OSHA) och personlig skyddsutrustning (PPE).
1. Isolering av PBMC från helblod
- Samla allt material som behövs från tabell 1 och ta dem till rumstemperatur (RT). Varm RP10F till 37 °C. Justera centrifugen till RT. Med undantag för centrifugationer och cellräkning, utför alla steg med hjälp av livskraftiga celler i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Skaffa blod i fem 10 ml rör (önskad mängd) innehållande antikoagulantia. Förvara hela blodet vid omgivningstemperatur (18\u201224 °C). Märk 50 ml separationsrör med det mänskliga forskningsämnesnumret för blodprovet som ska behandlas.
- Överför 10\u201215 ml blod till varje separationsrör med matchande ämnesnummer. Späd blodet minst 2 gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Överskrid inte 35 ml utspätt blod per rör.
- Försiktigt och långsamt underlag blodet med ~ 13 ml densitetsmedium. Titta igenom det transparenta densitetsmediet längst ner på röret och stoppa pipettering när pipetten är nästan tom (för att förhindra bubbelfrisättning). Ta försiktigt bort pipetten för att undvika att blanda blod- och densitetsmedelskikten.
- Överför försiktigt de fyllda separationsrören till centrifugen utan att störa skikten.
- Centrifug vid 500 x g i 30 min med centrifugbromsen avstängd (retardationen inställd på noll).
OBS: Om centrifugen endast visar varvtal, se rotorspecifikationerna för att uppskatta varvtalsekvivalenten för 500 x g. - Ta försiktigt bort separationsrören från centrifugen utan att störa skikten. Observera buffy coat, som har bildats mellan densitetsmediet och plasmaskikten.
- Pipett från toppen för att ta bort och kassera det mesta av den övre plasmafraktionen, så att 10 ml förblir ovanför buffybeläggningen. Samla försiktigt och långsamt buffyrocken. Överför buffyrockarna från två separationsrör till ett nytt förmärkt och sterilt 50 ml rör, som visas i figur 1.
- Späd PBMC: erna minst 2 gånger med HBSS, vilket ger volymen i varje nytt rör upp till 50 ml. Kom ihåg att byta centrifugbromsen till fullo. Pellets PBMC genom centrifugering vid 400 x g i 10 min. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt och knacka på botten av röret för att lossa pelletsen.
- För att lysa kvarvarande röda blodkroppar (RBC), resuspendera varje cellpellet i 1\u20122 ml ammoniumklorid-kalium (ACK) lysbuffert per 10 ml ursprunglig blodvolym. Inkubera i exakt 5 min. Stoppa omedelbart lysen med en lika stor eller större volym HBSS och justera volymen till 50 ml. Centrifug vid 400 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten och knacka på botten av röret för att lossa cellpelleten. Poolceller från samma givare. Ta upp volymen till 50 ml med HBSS. Centrifug vid 400 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten och knacka på botten av röret för att lossa cellpelleten. Resuspend celler i 10 ml varmt RP10F-medium och ta en alikvot för livskraftig cellräkning med trypanblå.
- Beräkna det totala cellnumret i varje prov med hjälp av en hemocytometer.
2. Rening av CD4+CD45RO+ T-celler från PBMC
OBS: Rening av CD4 + CD45RO + T-celler från PBMC görs genom att använda kommersiellt tillgänglig magnetisk separation (se materialtabell) med mindre modifieringar. Det är att föredra att följa kithandboken för inkubationstid eftersom varje kommersiellt kit har sina egna instruktioner.
- Tvätta önskad mängd PBMC i 10 ml urvalsbuffert. Centrifug vid 400 x g i 10 min. Ta bort supernatanten och knacka på botten av röret för att lossa pelletsen.
- Späd PBMC till 5 x 107 celler/ml i urvalsbufferten och överför dem till ett 5 ml polystyrenrundbottenrör (12 x 75 mm).
- Tillsätt 50 μL antikroppscocktail per 1 ml prov och blanda försiktigt. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Omedelbart före användning, virvelmagnetiska partiklar i 30 sekunder på hög hastighet. Tillsätt 50 μL magnetiska partiklar per 1 ml prov till röret som innehåller PBMC och blanda försiktigt.
- Hå upp volymen till 2,5 ml med markeringsbuffert och blanda försiktigt. Placera röret (utan lock) i magneten och inkubera vid RT i 2,5 min.
- Plocka upp magneten och invertera magneten och röret i en kontinuerlig rörelse för att hälla den berikade cellsuspensionen i ett nytt sterilt rör.
- För att öka återhämtningen, tillsätt 2,5 ml urvalsbuffert till röret som finns kvar i magneten utan att störa de immobiliserade pärlorna. Förvara i magneten i ytterligare 2,5 minuter och upprepa steg 2,6 för att återställa ytterligare celler.
- Ta en alikvot för livskraftig cellräkning med trypanblå. Beräkna det totala cellnumret med hjälp av en hemocytometer eller cellräknare.
- Bekräfta renheten genom flödescytometri (Figur 3).
3. Kemisk aktivering
- Justera CD4+CD45RO+ T-celler till 5 x 106 celler/ml med varmt RP10F-medium och fördela celler i odlingsskålar av önskad storlek. Vila celler i en fuktad 37 ° C 5% CO2 inkubator över natten.
- Pellets vilade celler genom centrifugering vid 400 x g i 10 min. Ta bort supernatanten och knacka på botten av röret för att lossa cellpelleten.
- Justera cellkoncentrationen till 5 x 106 celler/ml med varmt RP10F-medium och fördela 0,5\u20121 x 107 celler i vart och ett av tre sterila skruvlocksrör.
OBS: Om tillräckligt med celler finns tillgängliga kan dubbla stimuleringar eller ytterligare tidpunkter inkluderas i den experimentella designen. - Stimulera celler i rör 2 och 3 med PMA och A23187. Tillsätt PMA till 25 ng / ml och A23187 till 500 ng / ml och blanda försiktigt. Tillsätt en lika stor volym dimetylsulfoxid (DMSO) till cellerna i rör 1 som kommer att fungera som ett fordon (kontroll). Till exempel, om du använder 1 μL PMA och 1 μL A23187, tillsätt sedan 2 μL DMSO till fordonsröret. Håll den slutliga koncentrationen av DMSO under 0,5% i alla rör.
- Lossa locken på rören och återför cellerna till 37 ° C 5% CO2-inkubatorn i 2 timmar (rör 2) och 6 timmar (rör 1 och 3). Vid den angivna tiden centrifugceller vid 500 x g i 10 min.
- Före lys, kassera så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa cellpelleten.
- Omedelbart lysa cellerna, enligt instruktioner från det kommersiellt tillgängliga RNA-isoleringssatsen (se Materialtabell). Fortsätt med RNA-isolering, eller frys lysatet vid -80 ° C för att bearbeta senare med ytterligare prover.
OBS: RNA-renhet och integritet kan verifieras med hjälp av mikrokapillärelektrofores. - Valfritt: För att helt ta bort alla spår av DNA från det renade RNA-provet, använd RNA-rengöringssatsen (se Materialtabell), enligt tillverkarens instruktioner.
Representative Results
Detta protokoll innehåller procedurer för isolering av PBMC från SS-blod, rening av CD4 + CD45RO + T-celler genom negativt urval, stimulering av renade T-celler och isolering av totalt RNA för transkriptomisk profilering. Figur 1 beskriver processen för PBMC-isolering från helblod. Observera att det totala utbytet av SS PBMC varierar med startblodvolym och cirkulerande tumörbörda hos varje patient. I vårt laboratorium var det genomsnittliga utbytet av SS PBMC 4,6 × 106 celler / ml helblod (1,85 × 106 - 3,25 x 107 celler / ml för 7 SS). Den genomsnittliga livskraften för isolerade PBMC var 95\u201299%. Figur 2 visar hög renhet och livskraft hos utvalda CD4+CD45RO+-minnes-T-celler. Det genomsnittliga utbytet av CD4+CD45RO+ T-celler från SS PBMC var 75 % (75,6 % – 84 %), jämfört med 15,9 % (3 % – 30 %) från normala givare (ND) PBMC erhållna från leukoreduktionssystem (LRS) kamrar. Livskraften och renheten hos CD4+CD45RO+ T-celler erhållna genom detta negativa urvalsprotokoll har varit genomgående hög (figur 3).
Vi kombinerade tidigare aktiveringsprotokollet ovan med mikroarrayer för att studera de funktionella förändringarna i transkriptomerna hos både SS- och ND T-celler och har visat att SS-minnes-T-celler och SS PBMC dåligt uttrycker cytokin och andra immunsvarsgener jämfört med ND T-celler och PBMC 19,22,23. Figur 4 visar den robusta aktiveringen av flera cytokingener inklusive IL4, IL 10, IL13 och IL22 i ND T-celler, men inte i SS T-celler. Denna defekt i funktionellt genuttryck i SS T-celler har sedan bekräftats av andra grupper24. Dessutom uttrycks många gener som normalt inte uttrycks i ND T-celler starkt i SS T-celler, både i vila och efter stimulering (Figur 4). Dessa inkluderar de tidigare beskrivna SS-biomarkörgenerna DNM3, PLS3, TOX och TWIST1 25,26,27, samt ANK1 och SGCE, som först rapporterades av vår grupp. Dessa positiva biomarkörer uttrycks starkt i SS, men inte ND, och undviker tekniska fallgropar i samband med negativa biomarkörer.
Figur 1: PBMC-isolering från helblod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Negativt urval av CD4+ minnes-T-celler från isolerade PBMC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Renheten hos CD4+CD45RO+ T-celler bekräftades genom flödescytometri. Lymfocyter var gated av ljusspridning (A), levande lymfocyter exkluderade eFluor780 viabilitetsfärgämne (B) och (C) representerar icke-utvalda normala givare (ND). Negativt urval resulterade i nästan rena populationer av CD45RO+ T-celler hos ND (D) och SS-patienter (E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Differentiellt genuttryck i vilande och aktiverade CD4 + CD45RO + minnes-T-celler från SS och ND. Genuttryck z-poäng representeras av en färgskala från rött (högt uttryck) till grönt (lågt uttryck). Färgade staplar högst upp på värmekartan representerar cellbehandlingar: mock / fordonsbehandlad (röd), 2 h stimulerad (blå) och 6 h stimulerad (gul). Flera SS-biomarkörgener uttrycks starkt och cytokingener uttrycks dåligt i SS T-celler jämfört med ND T-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagenser | |
| Densitet Medium | Lymfocytseparationsmedium, Ficoll-Hypaque eller motsvarande densitetsmedium med densitet = 1,077-1,080 g / ml vid 20oC. |
| HBSS | 1x Hanks balanserade saltlösning, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 |
| RP10F | RPMI 1640 medium, 10 % värmeinaktiverat serum från fostrets nötkreatur (FBS), 1x penicillin-streptomycinlösning, pH 7.2 |
| ACK-lysbuffert | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Inget behov av att justera pH. Det ska vara ~ 7,3. |
| Val buffert | 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA |
| phorbol12-myristate13-acetat (PMA) | 50 μg/ml i DMSO |
| A23187 jonofor | 500 μg/ml i DMSO |
Tabell 1: Reagenser.
Discussion
Flera sätt att isolera PBMC har utvecklats, och var och en har sina egna fördelar och begränsningar28. Vi samlar rutinmässigt upp till 50 ml blod i fem 10 ml rör som innehåller antikoagulantia. Blodvolymen för PBMC-isolering beror på flera faktorer som forskningspersonens hälsa och ålder och även på flebotomistisk expertis. Ett kritiskt procedursteg i protokollet är bildandet av steggradienten. Dålig skiktning kan leda till att PBMC delvis eller fullständigt misslyckas med sediment vid gränssnittet. Vi föredrar underskiktningsmetoden som beskrivs här, eftersom det är lätt att starta bottenskiktet. För att helt avge allt densitetsmedium under blodet är det viktigt att använda ett pipethjälpmedel utan luftläckage. Kontaminering av PBMC-fraktionen med oönskade celltyper kan minimeras genom noggrann och konsekvent insamling av buffybeläggningen, som bör utföras på samma sätt för varje isolering. Om PBMC inte kommer att fraktioneras ytterligare bör man undvika att samla in olika mängder av densitetsgradienten och plasmaskikten mellan isoleringarna. RBC-lys utförs för att minimera den potentiella effekten av att förorena RBC- och retikuulocyt-härledd RNA på nedströms genuttrycksanalyser. Hypotonisk lys kommer att hämmas av överskott av isotonisk buffert.
Ytterligare isolering av T-celldelmängd är viktig för molekylära studier. Här beskrev vi efterföljande CD4 + CD45RO + T-cellerval genom negativt urval för att ta bort oönskade celltyper. Negativt urval bygger på att antikroppar känner igen specifika cellytemarkörer för alla oönskade celler. Antikroppsbelagda celler avlägsnas sedan med magnetiska pärlor. Detta urvalsprotokoll tar bort oönskade celler samtidigt som orörda och ostimulerade målceller förblir fritt flytande, vilket är viktigt för att studera genaktivering. Försiktighet måste dock iakttas för att undvika cellklumpar, vilket minskar den slutliga renheten hos utvalda CD4 + CD45RO + T-celler. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som finns i urvalsbufferten minimerar cellklumpning. Utbytet av T-celler beror på faktorer som blodets initiala volym, patientvariabler som behandlingen som administreras till patienten och sjukdomsstadiet vid tidpunkten för provtagningen. Behandling som ges till patienterna kan också påverka cellens livskraft. Dessutom har provinsamling före något förfarande som fotoferes också positiv inverkan på CD4 + CD45RO + T-cellernas renhet. Vi har observerat att provtagning efter fotoferesbehandlingsprocedur har negativ inverkan på CD4 + CD45RO + T-cellernas utbyte.
Neoplastiska T-cellkloner från SS-patienter uttrycker oftast ytmarkörer som överensstämmer med en mogen CD4 T-cellfenotyp29,30. Fenotypisk plasticitet har emellertid ibland observerats med avseende på ytmarkörer inklusive CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 och/eller CD2631. Tidigare studier har också visat heterogeniteten i CD45RO- och CD45RA-uttryck bland SS-patienter29, medan majoriteten av SS-fallen fortfarande är CD45RO+. Roelens et al.31 visade också att SS kan uppvisa interindividuell och intraindividuell heterogenitet med blandad population av naiva (TN), centralminne (TCM), övergångsminne (TTM), effektorminne (TEM) och terminal effektorminne (TEMRA) delmängder. Men deras resultat visar tydligt att majoriteten av SS-cellerna har TCM-fenotyp. Vi fokuserade vår studie på CD45RO + ytimmunofenotypen som är vanligast hos SS-patienter och bekräftade fenotyp genom flödescytometri. Vid planering av studier av T-cellsundergrupper hos patienter är det viktigt att beakta fenotypisk heterogenitet hos den sjukdom som studeras, och reningsstrategin kan därför justeras efter behov för att erhålla den önskade T-cellspopulationen för analys.
Det finns flera sätt att stimulera T-celler och PBMC att undersöka funktionellt genuttryck. Vi föredrar kemisk aktivering (PMA + A23187 jonofor), eftersom vi är intresserade av genreglering i kärnan. Kemisk aktivering är ett bästa alternativ för detta ändamål eftersom det fungerar som en bred aktivator och är mer enhetlig jämfört med antigenspecifik stimulering. PMA är en liten organisk förening som diffunderar genom cellmembranet in i cytoplasman och direkt aktiverar proteinkinas C. A23187 tillåter kalcium att passera genom membran. Dessa föreningar kringgår ytreceptorer och efterliknar tillsammans effekterna av T-cellreceptorligering med samstimulering medierade av CD28. Kemikalierna aktiverar flera intracellulära signalvägar, vilket resulterar i nukleär transkriptionsfaktoraktivering och uppreglering av cytokingener som är tillgängliga för transkriptionsaktivering. Även om kemisk aktivering och CD3CD28-ligering ger påfallande liknande globala genuttrycksprofiler i normala celler32, är kemisk aktivering med PMA + A23187 ett bra val eftersom SS T-celler kan förlora uttryck av ytreceptorer inklusive TCR-komponenter33. Chong et al.22 jämförde aktiveringen av cytokingener mellan PMA/A23187 med anti-CD3- och anti-CD28-antikroppar i PBMC från normala, tidiga MF/CTCL- och sena MF/CTCL-patienter. De rapporterade att PMA /A23187 orsakade snabbare och intensivare aktivering av IL-2-genen jämfört med anti-CD3/CD28-stimulering. Dessutom visade de att den långsammare aktiveringskinetiken med anti-CD3 / CD28-antikroppar potentiellt kommer från tvärbindning och membransignalering som är nödvändig för stimulering. Vidare bevarades trender i uttryck av cytokiner bland de olika studerade cellpopulationerna med PMA/A23187. Eftersom vi är intresserade av genuttrycksaktivering är kemisk stimulering ett idealiskt tillvägagångssätt eftersom det fungerar som en bred aktivator och är mer konsekvent jämfört med antigenspecifik stimulering. CD3/CD28-ligering är idealisk för att undersöka vägar som är viktiga vid membranbaserad signaltransduktion. Dessutom är kemisk aktivering billigare och kräver ingen specialutrustning. I den aktuella studien aktiverade PMA + A23187 signifikant cytokingener i ND men inte SS T-celler, vilket tyder på att SS T-celler har funktionella brister nedströms TCR.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll fenotypiskt rena T-celler från dyrbart patienthärledt blod och en metod för att bedöma genomomfattande förändringar i funktionellt genuttryck. Vi visar att transkriptomisk profilering av SS T-celler jämfört med normala CD45RO + T-celler avslöjar djupa skillnader i genaktivering i färska mänskliga T-celler från patienter med CTCL. Dessa studier kommer att bidra till utvecklingen av diagnostiska biomarkörer och terapeutiska strategier riktade mot nya markörer i CTCL. Dessutom kan denna strategi och protokoll för att studera primära humana T-celler vara värdefulla för att anpassa sig till studier av andra T-cellmedierade sjukdomar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Etiskt avslöjande:
Detta forskningsprotokoll godkändes av Institutional Review Board (IRB) vid University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS, Little Rock, AR) Mikroarraydata som presenteras i denna studie gjordes på de prover som rekryterades enligt ett forskningsprotokoll som godkänts av IRB of Henry Ford Hospital (Detroit, MI).
Acknowledgments
Vi tackar de patienter och volontärer som deltagit i vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 10 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| 1000 ul Pipet tips | VWR | 10017-038 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 352196 | |
| 25 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170357 | |
| 5 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170355 | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| A23187 ionophore | Fisher Scientific | BP595 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004381 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ml | |
| EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit | StemCell | 19157 | |
| FBS | GIBCO | 16140-071 | |
| HBSS | GIBCO | 14185-052 | |
| HEPES | Fisher Bioreagents | BP310-500 | |
| KHCO3 | Fisher Bioreagents | P184-500 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Corning | 25-072-CV | |
| Na2EDTA | ACROS | 10378-23-1 | |
| NaHCO3 | Fisher Bioreagents | S233-500 | |
| NH4Cl | Fisher Bioreagents | A661-500 | |
| Penicillin-streptomycin solution | GIBCO | 15140122 | |
| phorbol12-myristate13-acetate (PMA) | Sigma | P-8139 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | RAININ | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | RAININ | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | RAININ | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | RAININ | 17014392 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 31800-022 | |
| T-25 Flask | Thermo Scientific | 2024-10 |
References
- Kim, E. J., et al. Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).
- Wong, H. K., et al. Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome). British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).
- Whittaker, S. Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).
- Kallinich, T., et al. Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides. Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).
- Rodd, A. L., et al. Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors. Lymphoma. 2012, Article ID 290685 1-10 (2012).
- Olsen, E., et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood. 110, 1713-1722 (2007).
- Hameetman, L., et al. EPHA4 is overexpressed but not functionally active in Sézary syndrome. Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).
- Willemze, R., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood. 105, 3768-3785 (2005).
- Bradford, P. T., et al. Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases. Blood. 113, 5064-5073 (2009).
- Wilson, L. D., et al. Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma. Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).
- Li, Y., et al. Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options. Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).
- Korgavkar, K., et al. Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma. Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).
- Dulmage, B. O., Geskin, L. J. Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma. British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).
- Boonk, S. E., et al. Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for Sézary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients. Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).
- Scarisbrick, J. J., et al. Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model. Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).
- Benoit, B. M., et al. CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in Sézary syndrome: the Sézary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214. Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).
- Dulmage, B., et al. The biomarker landscape in mycosis fungoides and Sézary syndrome. Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).
- Pick, E., et al. Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187. Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).
- Chong, B. F., et al. Induced Sézary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells. Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).
- Fargnoli, M. C., et al. Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk. Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).
- Hansen, E. R., et al. Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex. Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).
- Chong, B. F., et al. Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides. Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).
- Moerman-Herzog, A. M., et al. Transcriptome analysis of Sézary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes. Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).
- Fanok, M. H., et al. Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma. Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).
- Su, M. W., et al.
- van Doorn, R., et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).
- Booken, N., et al. Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 22, 393-399 (2008).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P. Collection , storage, and preparation of human blood cells. Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).
- Fierro, M. T., et al. Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma. Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).
- Campbell, J. J., et al. Sézary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors. Blood. 116 (5), 767-771 (2010).
- Roelens, M., et al. Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity. Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).
- Diehn, M., et al. Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).
- Fuji, K. New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma. Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).
