Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61476
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Colorado Center for Reproductive Medicine

Summary

Здесь мы описываем метод нагрева витроцистов человека, культивируя их через период имплантации в пробирке, переваривая их в одиночные клетки и собирая ранние клетки трофибласта для дальнейшего исследования.

Abstract

Имплантация человека, аппозиция и прилипание к эпителии поверхности матки и последующее вторжение бластоцист в материнское решение, является критическим, но загадочным биологическим событием, которое исторически было трудно изучить из-за технических и этических ограничений. Имплантация инициируется развитием трофикодерма до раннейтрофобласти и последующей дифференциацией в отдельные подлины трофибластов. Аномальная ранняя дифференциация трофибластов может привести к отказу имплантации, плацентарным патологиям, аномалиям плода и выкидышу. В последнее время были разработаны методы, позволяющие человеческим эмбрионам расти до 13-го дня после оплодотворения в пробирке в отсутствие материнских тканей, период времени, который охватывает период имплантации у человека. Это дало исследователям возможность исследовать имплантацию человека и резюмировать динамику дифференциации трофибластов в этот критический период, не путая материнские влияния и избегая присущих препятствий для изучения событий ранней дифференциации эмбрионов in vivo. Для характеристики различных подлинаций трофобласти во время имплантации мы приняли существующие двухмерные (2D) расширенные методы культуры и разработали процедуру для энзиматичного переваривания и изоляции различных типов трофибластных клеток для анализа ниже по течению. Эмбрионы, выучатые в 2D условиях, имеют относительно сплющенную морфологию и могут быть неоптимальными при моделировании трехмерных (3D) эмбриональных архитектур in vivo. Тем не менее, трофибласт дифференциации, как представляется, менее пострадавших, о чем свидетельствуют ожидаемые морфологии и экспрессии генов изменения в течение расширенной культуры. Различные подлины трофобласта, включая цитотрофобласт, синцитиотрофобласт и миграционную трофибласт, могут быть разделены по размеру, местоположению и временному появлению и использованы для дальнейшей характеристики или экспериментов. Исследование этих ранних клеток трофибласта может быть полезным в понимании имплантации человека, лечении общих плацентарных патологий и смягчении частоты потери беременности.

Introduction

Имплантация человека и появление ранней плаценты исторически трудно исследовать и остаются в значительной степени неизвестными, потому что человеческие ткани недоступны на данном этапе, когда беременность клинически не обнаруживается. Модели животных являются неадекватными, так как плацентация человека имеет свои уникальные особенности по сравнению с другими эвтерианскими млекопитающими. Например, человеческая плацента вторгается глубоко в decidua с некоторыми клетками trophoblast достижения по крайней мере внутренняя треть миометрия матки в то время как другие клетки реконструировать маточных спиральных артерий. Даже наши ближайшие эволюционные предки, не-человеческие приматы, показывают различия в плацентарный морфологии и трофибласт взаимодействия с материнскойрешающих тканей 1,2,3. Получение предварительной имплантации человеческих эмбрионов в пробирке было невозможно до 1980-х годов, когда клиническое оплодотворение человека в пробирке (ЭКО) началось как обычная практика длялечения бесплодия 4. Теперь, человеческие бластоцисты могут быть выращены в пробирке, чтобы обеспечить выбор более жизнеспособных эмбрионов для передачи, а также позволяют безопасное генетическое тестирование. Улучшение методов культуры эмбрионов, а также все более все более использование ЭКО дали много излишков бластоцист, который остается после цикла лечения пациента были завершены. С согласия пациента, IRB утверждения, и с определенными ограничениями, эти бластоцисты могут быть использованы для научных исследований. Они стали бесценным ресурсом, которые были использованы для получения человеческих эмбриональныхстволовых клеток 5,понимая переход внутренней клеточной массы к эмбриональным стволовым клеткам6,,7, а в последнее время, были успешно культурны до дня (D) 13для реконструкции человеческой имплантации 8,9. Используя недавно разработанные подходы одноклеточной омики, доступ к этой стадии имплантации тканей эмбриона человека предоставил уникальную возможность описать молекулярные механизмы, которые регулируют этот высокодинамительный процесс дифференциации клеток, которые ранеебыло невозможно исследовать 10,,11,12,13.

Здесь мы описываем методы, используемые в нашей недавней публикации, характеризующие динамику дифференциации трофибласта во время имплантациичеловека 12. Этот протокол включает в себя потепление vitrified бластоцисты, расширенный эмбрион культуры до D12 после ЭКО, энзиматическое переваривание эмбриона в одиночные клетки, и сбор клеток для вниз по течению анализы (Рисунок 1). Эта расширенная система культуры поддерживает пери-имплантации стадии развития эмбриона человека без материнского вклада и recapitulates трофибласт дифференциации, которая появляется в соответствии с наблюдениями, сделанными из гистологических образцовмного лет назад 14,15,16,17. Во время имплантации популяция трофибластов состоит как минимум из двух типов клеток: мононуклеастного прародителя типа цитотрофобласта (КТБ) и неизлечимо дифференцированного, многонуклеированного синцитиотрофобласта (СТБ). После пищеварения трипсина, CTB являются небольшими, круглые клетки, которые морфологически неотличимы от других клеточных линий(рисунок 2A, левая панель). Отделение CTB от других клеточных линий, таких как эпибласт и примитивный эндодерм, может быть достигнуто с помощью их различных транскриптомных профилей, выявленных одноклеточной РНК-секвенированием. Синцитиотрофобластные клетки могут быть легко идентифицированы как нерегулярные формы структур, которые значительно больше, чем другие типы клеток и в основном расположены на периферии эмбриона(рисунок 2A, средняя панель; Рисунок 2B, левая панель). Мигрирующие трофибластные клетки (МТБ) являются еще одним подлинием трофибласта, найденным во время расширенной культуры эмбриона, и могут быть признаны, казалось бы, отохаальными от основного тела эмбриона(рисунок 2A, правая панель, рисунок 2B, правая панель). Мигрирующая трофобласть, хотя и выражает многие из тех же маркеров, что и экстра-villous trophoblast (EVT), не следует называть EVT, так как поколенческие структуры в плаценте не появились на этой очень ранней стадии развития.

Экспериментально мы смогли собрать небольшие КТБ и большие СТБ, которые легко различимы после того, как эмбрионы перевариваются в одиночные клетки на D8, D10 и D12(рисунок 2A,B). Мигрирующие трофибласты возникают на более поздних стадиях расширенной культуры эмбриона и могут быть собраны в D12 до энзиматического пищеварения всего эмбриона(рисунок 2A,B). Фенотипически отделяя эти три подлинии трофибласта до анализа одноклеточных клеток, мы можем определить конкретные транскриптомные маркеры и определить биологическую роль каждого типа клеток. Цитотрофобласт являются высоко пролиферативными и выступать в качестве прародителя клеток в поставке СТБ иМТБ дифференцированных линий 10,11,12,13. Syncytiotrophoblast участвуют в производстве плацентарный гормонов для поддержания беременности, а также может быть ответственным за эмбрионы рытьсяв эндометрия 10,11,12,13. Мигрирующая трофибласт имеет еще более сильные особенности инвазивного, миграционного фенотипа и, вероятно, отвечает за более глубокую и обширную колонизациюэндометрия матки 10,,11,,12,,13. После определения транскриптомной подписи каждого типа клеток, кластеризации анализы также выявили два дополнительных подмножества клеток, которые были морфологически неотличимы от CTB и транскриптомы с особенностями STB и MTB, соответственно12. Эти промежуточные клетки стадии, вероятно, в процессе дифференциации от CTB либо MTB или STB подлинажей и были бы упущены, если эмбрионы были слепо усваивается и клетки были разделены транскриптома в одиночку.

Протокол, описанный здесь, использует двухмерную (2D) культурную систему и не может быть оптимальным для поддержки трехмерного (3D) структурного развития, как это было предложено в недавней публикации, описывающей недавно разработанную систему 3Dкультуры 13. Тем не менее, в этой 2D системе дифференциация раннего трофибласта, кажется, согласуется с наблюдениями, сделанными из образцов in vivo14,,15,,16,,17. Этот протокол также может быть легко адаптирован для использования в недавно описанной системе 3D культуры13 с минимальными изменениями. Все шаги выполняются с помощью портативной микроманипуляционной пипетки с коммерчески доступными одноразовыми наконечниками или ротовой пипеткой из тонко вытянутой стеклянной пипетки, прикрепленной к резиновым трубам, фильтру и мундштуку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все человеческие эмбрионы были пожертвованы с согласия на использование в исследованиях. Протоколы о расширенной культуре эмбрионов человека были одобрены Западным институциональным советом по обзору (исследование No 1179872) и следуют международным руководящим принципам. Любое использование человеческих эмбрионов должно быть рассмотрено соответствующими этическими и руководящими органами, связанными с научно-исследовательским учреждением, использующим этот протокол.

1. Подготовка

  1. Подготовка средств массовой информации и восстановления пластин за день до потепления эмбриона в стерильной ламинарный капюшон потока.
    1. Подготовка 2 мл бластоцист культуры СМИ (BM) с 10% V / V заменитель белка сыворотки (SPS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Blastocyst культуры СМИ могут или не могут содержать добавленный белок. Здесь мы использовали среду, которая должна быть дополнена 10% указанного белка альбумин. Проверьте руководство производителя для изменения в этом дополнении. Все средства массовой информации должны быть отфильтрованы с помощью стерильного фильтра 0,22 МК, прикрепленного к стерильному шприцу перед эквилибровом.
    2. Заполните два центра хорошо орган культуры мыть посуду с 500 йЛ БМ с 10% V / V SPS покрыты 500 йл эмбриона культуры класса нефти.
    3. В 60 мм ткани культуры блюдо, слой 8 мл масла культуры эмбриона, а затем якорь 20 капли БМ с 10% V / V SPS в нижней части пластины культуры. Сделайте 1 каплю для каждого подогретого эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больше средств массовой информации, капли, и мыть посуду могут быть сделаны по мере необходимости. Капли также могут быть добавлены в блюдо, прежде чем масло слоистых. Якорные капли под маслом помогут уменьшить испарение и любые последующие изменения осмолальности.
    4. Эквилибррат БМ с 10% v/v SPS мыть посуду и восстановление пластины в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 6% CO2, 5% O2, по крайней мере 4 ч.
    5. Оттепель один флакон первого шага расширенной культуры средств массовой информации (IVC1) в 4 кк или на скамейке сверху.
    6. Приготовьте одно блюдо для мытья 500 МКЛ IVC1 без наложения масла. Aliquot приблизительно 4 мл IVC1 в 5 мл оснастки крышка трубки.
    7. Equilibrate IVC1 мыть блюдо и небольшой оснастки крышка трубки IVC1 в 37 градусов по Цельсию, 6% CO2, и атмосферных O2, по крайней мере 4 ч.
  2. Подготовь расширенные культурные пластины за день до потепления эмбриона в стерильном ламинарный капюшон.
    1. Разбавить фибронектин из сыворотки человека в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) до 30 мкг/мл. Для покрытия камер потребуется 250 МКЛ из 30 мкг/мл фибронектина на эмбрион.
    2. Откройте 8 хорошо камерные крышки пакет под капотом, заботясь, чтобы не прикасаться к колодцам. Аккуратно пипетка 250 МКЛ по 30 мкг/мл фибронектина в каждую колодец.
    3. Верните крышку в камерную крышку и поместите в 4 градуса по Цельсию на 20-24 ч.
  3. Подготовка расширенной пластины культуры в первой половине дня потепления эмбриона.
    1. Получить камерный крышки с фибронектином и поместите в ламинарный капюшон потока. Удалите фибронектин смесь с 1 мл пипетки и выбросить в контейнер для отходов.
    2. Извлекать прогретые, уравновешенные средства IVC1 из небольшой 5 мл крышки крышки трубки.
    3. Pipette 300 йл equilibrated IVC1 в каждую колодец. Будьте осторожны, чтобы не позволить любой жидкости коснуться крышки, как это увеличит риск заражения.
    4. Вернуть камерный крышки с IVC1 инкубировать в 37 градусов по Цельсию, 6% CO2, и атмосферных O2 до удаления zona pellucida в шаге 4.

2. Потепление vitrified D5 человеческих эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Другие производители могут иметь несколько иные протоколы в соответствии с их собственной технологией витрификации. Если это применимо, можно посмотреть инструкции производителя по использованию.

  1. Разогрейте 3,0 мл раствора оттаивания (TS) в 35 мм блюде до 37 градусов по Цельсию. Принесите 300 МКЛ раствора разбавления (DS) и две скважины по 300 МКЛ раствора для мытья (WS) в 6 хорошо пластины до комнатной температуры.
  2. Используя миппы, тщательно снимите рукав крио-устройства, гарантируя при этом, что витрифицированный эмбрион всегда остается под жидким азотом.
  3. Быстро перемести крио устройство из жидкого азота и окунив кончик крио-устройства в 37 градусов по Цельсию. Установите таймер на 1 мин и держите крио устройство погруженным до тех пор, пока эмбрион не отсоединится в TS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теплые эмбрионы по одному, чтобы отслеживать идентичность эмбрионов, поскольку они могут относиться к демографической информации пациентов в анализе ниже по течению.
  4. Во время инкубации 1 мин в TS, тщательно удалите крио устройство и осторожно забрать эмбрион и перейти на противоположную сторону тарелки TS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если культивирование нескольких эмбрионов, быть прилежным, чтобы сохранить эмбрионы отдельно, чтобы обеспечить надлежащую идентичность поддерживаются.
  5. Через 1 мин, осторожно забрать эмбрион с небольшим количеством TS, примерно 2 хл. Переместите эмбрион на дно 300 хл DS хорошо, покрыв эмбрион тонким слоем TS из пипетки. Установите таймер на 3 мин и поместите 6-хорошо пластины на скамейке верхней при комнатной температуре.
  6. Через 3 мин. подберите эмбрион с небольшим количеством DS, приблизительно 2 МЛ, и переместите эмбрион на дно следующего колодец, содержащий 300 МКЛ WS. Опять же, осторожно слой небольшое количество DS из пипетки над эмбрионом. Установите таймер на 5 минут и вернуться на скамейку сверху.
  7. Через 5 минут, забрать эмбрион с минимальным объемом WS и перейти к вершине окончательной хорошо 300 йл WS. Эмбрион будет медленно падать и мыть через WS на дно. Изгнать любой сохраненный WS из пипетки в пустой колодец.
  8. Возьмите эмбрион с минимальным объемом и вернуться в верхней части той же 300 МКЛ хорошо WS. Эмбрион снова упадет на дно колодеца. Установите таймер на 1 мин и вернуть 6-хорошо пластины на скамейке сверху.

3. Восстановление прогретых эмбрионов

  1. По одному, переместить прогретые эмбрионы в центр хорошо орган ткани блюдо, содержащее 500 МКЛ равноотрехвой БМ с 10% v/v SPS под 500 йл равноотрехового эмбриона культуры класса нефти.
  2. Вымойте эмбрионы, подбирая каждый эмбрион и перемещая их в несколько областей в блюдо, выдувая старые средства массовой информации между движениями. Возьмите эмбрион и переместить его в отдельных 20 йл культуры падение equilibrated БМ с 10% V / V SPS под маслом.
  3. Пусть прогретые эмбрионы восстанавливаются в течение 2 ч в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 6% CO2, 5% O2.

4. Удаление Зоны

  1. После восстановления на 2 ч оцените эмбрионы для повторного расширения и сфот фотографируете каждый эмбрион.
  2. Перемещение эмбрионов индивидуально в 500 л 3-(N-morpholino)-пропансульфоновой кислоты (MOPS)-буферной обработки среды с 5% (V /V) плода теленка сыворотки (FCS) до лечения раствором кислой тирода.
  3. Быстро переместите один эмбрион через 300 МКЛ раствора подогретого кислого тирода, активно наблюдая через микроскоп. Зона pellucida визуально начнет растворяться. Это займет около 5 с.
  4. Немедленно переместите эмбрион с растворяемой зоной в 300 мкл разогретой MOPS буферной среды, чтобы утолить раствор кислотного тирода.
  5. Перемещение эмбриона с минимальным объемом MOPS буферной среды в центр хорошо органной ткани блюдо, содержащее 500 йл равноувеличатого БМ с 10% V / V SPS под 500 йл уравновешенного эмбриона культуры класса нефти для мытья.
  6. Верните эмбрион к падению восстановления на 20 мкл с 3,2 шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При визуальном обследовании после удаления зоны, любые эмбрионы с сохраненным zona pellucidae могут быть дополнительно обработаны раствором кислой тирода, если это необходимо, повторяя шаги 4.2-4.6. Необходимо свести к минимуму воздействие раствора тирода.

5. Blastocyst расширенной культуры

  1. Переместите эмбрионы по отдельности в мытье тарелки с equilibrated IVC1 СМИ от шага 1.1.6. Тщательно переместите один эмбрион в один колодец камерного крышки с equilibrated IVC1 и поддерживать идентификацию эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть завершен как можно быстрее, чтобы свести к минимуму среднее испарение.
  2. Возвращение камерного крышки в инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию, 6% CO2, атмосферный O2 в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте разморозить и уравночные средства массовой информации в 37 градусов по Цельсию, 6% CO2, атмосферные O2 для обмена средствами массовой информации 4 ч заранее.
  3. При перерастанию D2 (D7 после оплодотворения) внимательно изучите крепление эмбрионов под микроскопом и выполните медиа-обмен.
    1. Обратите внимание, какой эмбрион прикреплен к блюду перед обменом мультимедиа. Аккуратно коснитесь пластины и изучите, надежно ли эмбрион прикреплен к пластине под микроскопом.
    2. Снимите крышку и осторожно удалите 150 МКЛ IVC1 и отбросьте, не нарушая при этом прикрепленный эмбрион. Если эмбрион еще не прикреплен к пластине, не обмениваться средствами массовой информации, так как сыворотка в IVC1 поможет в вложении эмбриона.
    3. Pipette 150 йл equilibrated расширенной культуры средств массовой информации, IVC2, медленно в каждой хорошо и вернуть крышку камерной крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что удаление крышки с камерной крышки сведено к минимуму, чтобы избежать среднего испарения.
  4. Аккуратно верните камерную крышку в инкубатор, не брызгая мультимедиа на крышку. Повторите обмен мультимедиа и проверку вложений каждый день расширенной культуры до тех пор, пока эмбрионы не будут готовы к фиксации или перевариванию одной клетки.

6. Необязательная коллекция оттраченных средств массовой информации

  1. По желанию, собирать потраченные средства массовой информации во время обмена культурой средств массовой информации после D7 или в любой день после этого. Во время шага 5.3.2, вместо того, чтобы отбросить средний snap-freeze 150 МЛ удаленного IVC1 в стерильную, низкоперемятную трубку 0,5 мл для будущего анализа.

7. Необязательная фиксация иммунофлюоресценции

  1. Используйте 200 МКЛ пипетки для мытья эмбрионов с 1 / 2 средств массовой информации обменов PBS для 3x до фиксации, чтобы удалить любые внеклеточного мусора. Смывание лишнего мусора и белка поможет оптимизировать четкость и уменьшить фон на изображениях, полученных с помощью иммунофлуоресценции.
  2. Удалите все средства массовой информации и медленно добавить 200 йл 4% параформальдегида (PFA) в PBS к колодец. Эмбрион захочет прилипнуть к поверхности жидкости. Несколько 150 йл моет с 4% PFA перед удалением всей жидкости поможет свести к минимуму любые повреждения эмбриона.
  3. Инкубировать эмбрионы в 4% PFA в течение 20 минут для фиксации.
  4. Вымойте эмбрионы 3x в течение 10 мин на стирку с 200 йл 0,1% v/v полисорбат 20 в свежем PBS.
  5. Храните фиксированные эмбрионы в 0,1% v/v полисорбат 20 в PBS при 4 градусов по Цельсию, прежде чем приступить к протоколу иммунофлуоресценции.

8. Одноклеточное пищеварение с трипсином

ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие (не фиксированные) эмбрионы используются для переваривания одной клетки.

  1. Вымойте эмбрион один раз с 200 йЛ PBS и добавить 200 йл трипсина решение каждой хорошо. Верните камерные крышки в инкубатор на 5 минут.
  2. Удалите камерную крышку из инкубатора и осматриваете эмбрионы под стереоскопом. Клетки на периферии эмбриона начнут втягиваться, и МТБ все равно следует прикреплять к пластине, где они удаленно расположены от эмбриона.
  3. Используйте небольшую пипетки или мелко вытащил рот пипетки, чтобы забрать отдельных MTB, прежде чем разорвать весь эмбрион. Перейти вперед, чтобы шаг 9.1, чтобы сохранить MTB и вернуться к шагу 8.4 после шага 9.3.
  4. Используйте портативный микроманипуляции пипетки или рот пипетки мягко разобщить эмбрион, аспирируя вверх и вниз.
  5. Клетки начнут отмежеваться от всего эмбриона. Продолжайте аспирировать эмбрион мягко и неоднократно, используя кончик пипетки меньшего диаметра или пипетку рта до тех пор, пока эмбрион не будет инкубирован в общей сложности 10 минут в трипсине.

9. Единый отбор клеток и сбор образцов

  1. С минимальным трипсином, переместить диссоциированные клетки через три капли мытья 20 йл PBS и 0,1% поливинилпирролидон (PVP) под маслом культуры эмбриона с осторожностью, чтобы не потерять ни одной клетки.
  2. После мытья клеток используйте мелко вытянутую стеклянную пипетку, чтобы выбрать одну ячейку. Тщательно пипетка одной клетки в стерильные 0,2 мл низкоразумной трубки с минимальным объемом PBS-0,1% PVP.
  3. Snap заморозить одиночные клетки в жидком азоте(LN 2), и хранить в -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здоровые эмбрионы продемонстрировали продолжающееся распространение в течение расширенной культуры(рисунок 2B). Аномальные эмбрионы начали оттягиваться от внешних краев и распадаться(рисунок 2C). Из нашего опыта, около 75% эмбрионов были прикреплены к нижней части фибронектина покрытием блюдо на 48 ч и вложение увеличилось примерно до 90% на 72 ч в культуре. На успех вложений эмбрионов в значительной степени может повлиять начальное качество бластоцистов. Эмбрионы, не прикрепленные к 72 ч, скорее всего, не выживут.

На D8 после оплодотворения (D3 расширенной культуры), большинство клеток в эмбрионах были CTB, которые были положительными для trophoblast маркер GATA3 (Рисунок 3A). Цитотрофобласты уже начали дифференцироваться в многоядерный СТБ на периферии эмбриона(рисунок 2B, леваяпанель, пунктирная линия). Эти СТБ имели лист, как внешний вид и были окрашены положительные для человека хорионических гонадотропин субъединит бета (HCGB; Рисунок 3A, центральная панель). Эмбрионы быстро росли, между D8 и D10, предполагая быстрое распространение клеток CTB в течение этого периода. На D10 формирование положительного МТБ ЦГБ было на максимуме, что может быть подтверждено всплеском производства ХГЧ в это время(рисунок 3B). Мигрирующиетрофы также начали появляться и мигрировали от тела эмбриона и были окрашены положительным для маркера EVT, HLA-G (Рисунок 3A, правая панель). К D12 дифференциация СТБ была в упадке, и производство МТБ стало более заметным, что свидетельствует о сдвиге акцента с производства гормонов на D10 на миграцию клеток на D12. Эти изменения наблюдались с помощью замедленного видео, полученного в течение этого пери-имплантации(фильм 1). Наши данные о секвенировании одноклеточной РНК также отражают такие динамические изменения в функции клеток. Вместе эти данные свидетельствуют о ранней дифференциации трофибласта и появление ранней плаценты является динамичным процессом, в ходе которого эмбрион может расставить приоритеты в высокоспециализированных клеточных функций в очень конкретных точках времени для достижения успешной имплантации.

Figure 1
Рисунок 1: Процедурная схема расширенной культуры и сбора образцов одной ячейки.
Рабочий процесс нагрева витрифицированных эмбрионов, удаление зоны пеллуциды, расширенная культура эмбрионов, энзиматическое пищеварение и изоляция цитотрофобласта (КТБ), синцитиотрофобласта (СТБ) и мигрирующих трофибластов (МТБ). Эта цифра была изменена с Запада и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Морфология трофибластных клеток и эмбрионов во время продолжительной культуры.
(A)Репрезентативные изображения различных типов клеток-трофластов после энзиматического пищеварения с трипсином. Маленький CTB слева, большой СТБ посередине и МТБ справа. (B)Репрезентативные изображения здоровых эмбрионов на D8 (слева), D10 (средний) и D12 (справа). Dashed линии в левой панели наброски предположительно пролиферативной популяции CTB в то время как пунктирная линия очертания сплющенный СТБ. Розовые круги в правой панели контур MTB, которые были удаленно расположены от эмбриона. (C)Репрезентативные изображения аномальных эмбрионов начинают втягиваться и распадаться на D8 (слева), D10 (средний) и D12 (справа). Шкала баров 200 мкм. Некоторые изображения были адаптированы с Запада и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные изображения выражения маркера trophoblast и производства ХГЧ во время расширенной культуры.
(A) Представитель иммунофлуоресценции изображения эмбрионов, показывающие выражение маркера CTB GATA3 на D10 (слева), STB маркер CGB на D10 (средний), и MTB маркер HLA-G на D12 (справа). Шкала баров 200 мкм.(B) Представитель концентрации ХГЧ (mIU/mL) в течение расширенной культуры от D8 до D12 (средний SEM, n No 3). Статистический анализ проводился с помощью One-Way ANOVA, за которым последовал тест Туки (P lt; 0.05). Эти изображения были адаптированы с Запада и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Фильм 1: Замедленное видео человеческого эмбриона в расширенной культуре от D8 до D12. Видео демонстрирует коллапс бластерокоэля, образование СТБ (указывается зелеными кругами), а затем возможную дифференциацию и миграцию МТБ (на это указывают оранжевые круги). Это было адаптировано с Запада и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка протокола к культуре человеческих эмбрионов с помощью имплантации позволила ученым исследовать ранее неизведанное время вразработке 8,,9. Здесь мы используем расширенную культурную систему для культуры человеческих эмбрионов и изучаем раннюю дифференциацию трофибластов до образования поколенческой плаценты. Описанные здесь методы позволяют нам собирать различные подлинии туберкулеза для использования в анализе одноклеточных ниже по течению. Эта работа дает научному сообществу возможность понять этот критический и загадочный период в развитии человека, и может открыть новые возможности для терапевтического лечения выкидыша или других плацентарный патологий, таких как преэклампсии, а также предоставить новые идеи о раннем развитии человека.

Этот протокол требует навыков быстрого манипулирования эмбрионами во время потепления эмбриона, удаления zona и покрытия, чтобы свести к минимуму стресс эмбриона до расширенной культуры. Важное значение имеет минимизация испарения средств массовой информации и, следовательно, увеличение средней осмолальности путем ограничения времени воздействия при обмене средствами массовой информации. Забота об использовании правильной асептической техники при обмене средними и движущихся блюд поможет свести к минимуму загрязнение. Стабилизация блюдо, когда используется, чтобы свести к минимуму любые механические нарушения, как только эмбрионы прилагаются также важно. Эмбрионы, которые становятся подчеркнул начнет отступать их синцитиальных прогнозов и начинают apoptose. Также крайне важно не позволять менискам культурных средств массовой информации прикасаться к поверхности эмбриона и минимизировать любую нефть в скважинах. Любой из этих сценариев может уничтожить эмбрион.

Культивирование человеческих эмбрионов за пределами стадии бластоцистского является быстро развивающейся областью. Недавнее исследование13 показало, что новая система культуры, которая содержит 10% внеклеточной смеси белка матрицы и среды с дополнительными добавок пирувата натрия, лактата и родо-ассоциированного белка киназы (ROCK) ингибитор выгодно в моделировании in vivo 3D эмбриональных архитектур и дали значительно более жизнеспособных эмбрионов на более позднем этапе расширенной культуры по сравнению с расширенной системы культуры описаны здесь. Потребуется проверка этой новой системы для демонстрации ее воспроизводимости. Мы считаем, что описанные здесь процедуры могут быть адаптированы к этой новой 3D-системе с незначительными изменениями и, следовательно, могут принести пользу прогрессу в области методологии в этой области.

Этот протокол также может быть адаптирован, чтобы позволить расследование ЭКО культуры оптимизации средств массовой информации. Недавно мы показали, что в мыши, эмбрион развития во время расширенной культуры может предсказать успех развития плода после переноса эмбриона18. Аномально оплодотворенные и отбрасываемые человеческие зиготы с 3 pronuclei (PN) могут быть отучены для бластоцист на D5 в различных условиях, которые затем могут влиять на их развитие во время расширенной культуры. Пожертвованные D5 человеческие бластоцисты могут быть отстояли 48 ч в новых условиях, прежде чем быть помещены в расширенную систему культуры для оценки производительности. Регулярные измерения количества клеток эпибластов, общего числа клеток, площади наросты и ХГЧ позволили нашей лаборатории лучше понять, как различные условия сми культуры могут лучше поддерживать развитие эмбрионов до имплантации человека и влиять на их успех после имплантации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы отметить многих пациентов в Колорадо Центр репродуктивной медицины (CCRM), которые любезно пожертвовал свои эмбрионы для исследований. Мы также хотели бы поблагодарить Карен Маруняк и клиническую лабораторию CCRM за помощь в обработке образцов ХГЧ, а также Сью Маккормик и ее клиническую команду эмбриологии ЭКО в CCRM за помощь в сборе, хранении, отслеживании и донорстве эмбрионов. Финансирование было предоставлено внутри ККРМ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NORM JECT Luer Lock sterile syringe VWR 53548-019 Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

Tags

Биология Выпуск 160 человек эмбрион пери-имплантация трофибластные клетки расширенная культура одноклеточное пищеварение
Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Logsdon, D. M., Kile, R. A.,… More

Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter