Summary
Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.
Abstract
İnsan implantasyonu, rahim yüzeyi epitelinin afipozve yapışıklığı ve blastosistin maternal decidua invazyonu, teknik ve etik sınırlamalar nedeniyle tarihsel olarak incelenmesi zor olan kritik ama esrarengiz bir biyolojik olaydır. İmplantasyon trophektoderm gelişimi ile erken trofoblast ve daha sonraki farklılaşma farklı trofoblast alt alt larına doğru başlatılır. Anormal erken trofoblast farklılaşması implantasyon yetmezliğine, plasental patolojilere, fetal anormalliklere ve düşüklere yol açabilir. Son zamanlarda insan embriyolarının, insanlarda implantasyon dönemini kapsayan bir zaman dilimi olan anne dokularının yokluğunda 13. Bu, araştırmacılara, anne etkilerini şaşırtmadan ve erken embriyo farklılaşma olaylarını in vivo'da incelemek için doğal engellerden kaçınmadan, bu kritik dönemde insan implantasyonunu araştırma ve trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini özetleme fırsatı vermiştir. İmplantasyon sırasında farklı trofoblast alt çizgilerini karakterize etmek için, mevcut iki boyutlu (2D) genişletilmiş kültür yöntemlerini benimsedik ve alt akım tahlilleri için farklı tipte trofenlast hücrelerini enzimatik olarak sindirmek ve izole etmek için bir prosedür geliştirdik. 2B koşullarda kültürlenen embriyolar göreceli olarak düzleştirilmiş morfolojiye sahiptir ve in vivo üç boyutlu (3D) embriyonik mimarilerin modelilmesinde suboptimal olabilir. Ancak, trophoblast farklılaşması, genişletilmiş kültür boyunca beklenen morfoloji ve gen ekspresyonu değişikliklerinden de anlaşıldığı gibi daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. Sitotrophoblast, syncytiotrophoblast ve göçmen trofoblast ı da dahil olmak üzere farklı trofoblast alt ları boyut, yer ve zamansal doğuşile ayrılabilir ve daha fazla karakterizasyon veya deney için kullanılabilir. Bu erken trofenlast hücrelerinin araştırılması insan implantasyonunun anlaşılmasında, yaygın plasental patolojilerin tedavisinde ve gebelik kaybı nın görülme sıklığının azaltılmasında etkili olabilir.
Introduction
İnsan implantasyonu ve erken plasentanın ortaya çıkması tarihsel olarak araştırmak zordur ve büyük ölçüde bilinmemektedir çünkü gebelik klinik olarak saptanamayan bu aşamada insan dokularına erişilemez. Hayvan modelleri yetersizdir, çünkü insan plasentasyonu diğer öther memelilere göre kendine özgü özelliklere sahiptir. Örneğin, insan plasenta diğer hücreler rahim spiral arterler remodel ise bazı trofenlast hücreleri rahim miyometrium en az iç üçte ulaşan ile yaprak içine derinden işgal. Hatta en yakın evrimsel atalarımız, insan olmayan primatlar, plasental morfoloji ve trofenlast etkileşimleri maternal desidualdokular1,2,3ile farklılıklar göstermektedir. 1980'li yıllarda klinik insan in vitro fertilizasyon (IVF) kısırlık tedavisinde rutin bir uygulama olarak başlayana kadar in vitro pre-implantasyon insan embriyolarının in vitro elde edilmesi mümkün değildi4. Şimdi, insan blastosistleri transfer için daha uygun embriyoların seçimi için izin vermek için in vitro yetiştirilebilir, hem de güvenli genetik test sağlamak. Embriyo kültürü tekniklerinde iyileşme, hem de IVF artan kullanımı hastanın tedavi döngüleri tamamlandıktan sonra kalır birçok artı blastosistler vermiştir. Hastanın onayı, IRB onayı ve bazı kısıtlamalar ile bu blastosistler araştırma çalışmaları için kullanılabilir. Onlar insan embriyonik kök hücrelerin türevi için kullanılan paha biçilmez bir kaynak haline gelmiştir5, embriyonik kök hücrelere iç hücre kütlesinin geçiş anlayışı6,7, ve daha yakın zamanda, başarıyla güne kadar kültürlü olmuştur (D) 13 insanimplantasyonuremodel 8,9. Son zamanlarda geliştirilen tek hücreli omik yaklaşımlar kullanarak, Bu implantasyon aşamasında insan embriyo dokularına erişim daha önce10keşfetmek imkansız olan bu son derece dinamik hücre farklılaşma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunmuştur 10,11,12,13.
Burada, insan implantasyonu sırasında trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini karakterize eden son yayınımızda kullanılan yöntemleri açıklıyoruz12. Bu protokol vitrifiye blastosistlerin ısınmasını, D12 sonrası IVF'ye kadar uzatılmış embriyo kültürünü, embriyonun tek hücrelere enzimatik sindirimini ve aşağı akım tahlilleri için hücre toplamayı içerir (Şekil 1). Bu genişletilmiş kültür sistemi anne girişi olmadan peri-implantasyon aşamasında insan embriyo gelişimini destekler ve yıllar önce histolojik örneklerden yapılan gözlemler ile tutarlı görünen trophoblast farklılaşması özetler14,15,16,17. İmplantasyon sırasında trofoblast popülasyonu en az iki hücre tipinden oluşur: mononükleli progenitor benzeri sitotrophoblast (CTB) ve ölümcül diferansiye, multinükleatlı sintiyotrophoblast (STB). Tripsin sindirimi üzerine, CTB morfolojik olarak diğer hücre soylarından ayırt edilemeyen küçük yuvarlak hücrelerdir(Şekil 2A, sol panel). CTB'nin epiblast ve ilkel endoderm gibi diğer hücre soylarından ayrılması, tek hücreli RNA dizilimi ile ortaya çıkan farklı transkripsiyon profilleri ile elde edilebilir. Syncytiotrophoblast hücreleri kolayca diğer hücre tiplerinden önemli ölçüde daha büyük ve esas olarak embriyo nun çevresinde bulunan düzensiz şekilli yapılar olarak tanımlanabilir (Şekil 2A, orta panel; Şekil 2B, sol panel). Göçmen trofoblast hücreleri (MTB) embriyo genişletilmiş kültür sırasında bulunan başka bir trofoblast alt çizgi ve görünüşte embriyoana gövdesinden hareket olarak kabul edilebilir(Şekil 2A, sağ panel, Şekil 2B, sağ panel). Göçmen trofoblast, ekstra villous trofoblast (EVT) ile aynı belirteçlerin çoğunu ifade etmesine rağmen, plasentadaki villous yapılar gelişmenin bu çok erken evresinde ortaya çıkmadığından, EVT olarak adlandırılmamalıdır.
Deneysel olarak, embriyolar D8, D10 ve D12'de tek hücrelere sindirildikten sonra kolayca ayırt edilebilen küçük CTB ve büyük STB'yi toplayabildik(Şekil 2A,B). Göçmen trofoblastlar genişletilmiş embriyo kültürünün ileri evrelerinde ortaya çıkar ve tüm embriyonun enzimatik sindiriminden önce D12'de toplanabilir(Şekil 2A,B). Bu üç trofoblast alt çizgisini tek hücre analizinden önce fenotipik olarak ayırarak, spesifik transkripsiyonel belirteçleri ve her hücre türünün biyolojik rolünü tanımlayabiliriz. Sitotrophoblast son derece proliferatif ve STB ve MTB farklılaştırılmış soy10,11,,12,13temininde progenitor hücreleri olarak hareket. Syncytiotrophoblast gebelik korumak için plasental hormonlar üretiminde yer alan ve aynı zamanda endometrium içine oyuk embriyolar sorumlu olabilir10,11,12,13. Göçmen trofoblast bir invaziv, göçmen fenotip daha güçlü özelliklere sahiptir ve muhtemelen rahim endometrium10,11,,12,13daha derin ve daha geniş kolonizasyon sorumludur. Her hücre tipinin transkripsiyon analizi, her hücre tipinin transkripsiyon izini tanımladıktan sonra, ctb'den morfolojik olarak ayırt edilemeyen ve sırasıyla12'de STB ve MTB özelliklerine sahip transkripsiyonlara sahip iki ek hücre alt kümesini ortaya çıkarmış bulunmaktadır. Bu ara evre hücreler, CTB'den MTB veya STB alt geçitlerine ayırt etme sürecinde dir ve embriyolar körü körüne sindirilseydi ve hücreler tek başına transkripsiyonla ayrılsaydı gözden kaçırılırlardı.
Burada açıklanan protokol iki boyutlu (2D) kültür sistemi kullanır ve yeni geliştirilen 3D kültür sistemi13açıklayan yeni bir yayın tarafından önerilen üç boyutlu (3D) yapısal gelişimi desteklemek için en uygun olmayabilir. Yine de, bu 2D sistemde erken trofoblast farklılaşması in vivo örnekleri14,15,,16,17yapılan gözlemler ile tutarlı gibi görünüyor. Bu protokol, en az değişiklikle en son tanımlanan 3B kültür sistemi13'teki kullanıma da kolayca uyarlanabilir. Tüm adımlar, ticari olarak kullanılabilen tek kullanımlık uçlar veya kauçuk boru, filtre ve ağızlık bağlı ince çekilmiş cam pipet bir ağız pipet ile bir el mikromanipülasyon pipet ile gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm insan embriyoları araştırmada kullanılmak üzere rıza ile bağışlanmıştır. Genişletilmiş insan embriyosu kültürü için protokoller Batı Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma no. 1179872) tarafından onaylanmıştır ve uluslararası yönergeleri izleyin. İnsan embriyolarının herhangi bir şekilde kullanımı, bu protokolü kullanarak araştırma kurumuyla ilişkili uygun etik ve yönetim organları tarafından gözden geçirilmelidir.
1. Hazırlık
- Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmasına bir gün önce ortam ve iyileşme plakaları hazırlayın.
- %10 v/v serum protein ikame (SPS) ile 2 mL blastosist kültür ortamı (BM) hazırlayın.
NOT: Blastosist kültür ortamı ilave protein içerebilir veya içermeyebilir. Burada, belirtilen albumin proteininin %10'u ile takviye edilmesi gereken bir ortam kullandık. Bu ek varyasyon için üretici kılavuzunu kontrol edin. Tüm ortamlar, dengelemeden önce steril bir şırıngaya bağlı steril 0,22 μM filtre kullanılarak filtrelenmelidir. - İki merkez-iyi organ kültürü yıkama bulaşıklarını 500 μL BM ile %10 v/v SPS ile doldurun ve 500 μL embriyo kültürü sınıfı yağ ile kaplayın.
- 60 mm'lik doku kültürü çanak kısmında, 8 mL'lik embriyo kültür yağı katmanı ve ardından kültür plakasının altına %10 v/v SPS ile 20 μL BM damlası çapalayın. Isınan her embriyo için 1 damla olun.
NOT: Gerektiğinde daha fazla ortam, damla ve yıkama yemeği yapılabilir. Damlalar da yağ katmanlı önce çanak eklenebilir. Yağın altına demirleme damlaları buharlaşmayı ve osmolalitedeki sonraki değişiklikleri azaltmaya yardımcı olur. - BM'yi 37 °C, %6 CO2, %5 O2 ve en az 4 saat boyunca bir kuluçka makinesinde %10 v/v SPS yıkama tabaklarını ve geri kazanım plakasını dengeleyin.
- Genişletilmiş kültür medyasının (IVC1) ilk adımının bir şişesini 4 °C'de veya bankın üstünde eritin.
- 500 μL IVC1'lik bir yıkama kabını yağ kaplaması olmadan hazırlayın. Aliquot yaklaşık 4 mL IVC1 5 mL snap kap tüp içine.
- IVC1 yıkama kabını ve IVC1'in küçük snap kap tüpünü 37 °C,%6 CO2 ve atmosferik O2'yi en az 4 saat eve yerleştirin.
- %10 v/v serum protein ikame (SPS) ile 2 mL blastosist kültür ortamı (BM) hazırlayın.
- Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmabir gün önce genişletilmiş kültür plakaları hazırlayın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ile 30 μg/mL arasında insan serumundan gelen fibronektinseyreltin. Odaları kaplamak için embriyo başına 250 μL 30 g/mL fibronektin gerekli olacaktır.
- Kuyulara dokunmamaya özen verirken kaputun altındaki 8 kuyu odalı kapak paketini açın. Hafifçe pipet 250 μL 30 g/mL fibronectin her kuyuya.
- Kapağı odalı kapak kaymasına geri döndürün ve 4 °C'ye 20-24 saat süreyle yerleştirin.
- Embriyo ısınma sabah genişletilmiş kültür plakası hazırlayın.
- Fibronektin ile odacıklı coverslip alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. 1 mL pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atık kabına atın.
- Küçük 5 mL snap kap tüpten ısıtılmış, dengelenmiş IVC1 ortamını alın.
- Pipet 300 μL'lik ivc1 her kuyuya. Bu kontaminasyon riskini artıracak gibi herhangi bir sıvı kapağı dokunmasına izin vermemeye dikkat edin.
- IVC1 ile odacıklı kapak kaymasını 37 °C, %6 CO2 ve atmosferik O2'yi 4.
2. Isınma vitrifiye D5 insan embriyoları
NOT: Diğer üreticilerin kendi vitrifikasyon teknolojisine göre biraz farklı protokolleri olabilir. Gerektiğinde üreticinin kullanım talimatlarına bakın.
- 35 mm çanak ila 37 °C arasında 3,0 mL erime çözeltisi (TS) sıcak. 300 μL seyreltme çözeltisi (DS) ve 300°L yıkama çözeltisi (WS) kuyusu 6 kuyulukta oda sıcaklığına getirin.
- Forceps kullanarak, vitrifiye embriyo her zaman sıvı azot altında kalır sağlarken dikkatle kriyo cihaz kol çıkarın.
- Kriyo cihazını sıvı nitrojenden hızlıca hareket ettirin ve 37 °C'de TS'deki kriyo cihazının ucunu daldırın. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve embriyo TS içine ayrılır kadar cryo cihazı batık tutun.
NOT: Sıcak embriyolar, alt akım analizinde hasta demografik bilgileriyle ilgili olabilecekleri için embriyo kimliklerini takip etmek için birer birer. - TS 1 dk kuluçka sırasında, dikkatle kriyo cihazı kaldırmak ve yavaşça embriyo almak ve TS çanak karşı tarafına taşımak.
NOT: Birden fazla embriyo kültüre, uygun kimlikleri nisbete tutulmasını sağlamak için embriyoları ayrı tutmak için gayretli olun. - 1 dakika sonra, yavaşça TS küçük bir miktar ile embriyo almak, yaklaşık 2 μL. Embriyoyu pipetten ince bir TS tabakası nda ts ile kaplarken embriyoyu 300 μL DS'nin altına taşıyın. 3 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve oda sıcaklığında tezgah üst 6 iyi plaka yerleştirin.
- 3 dakika sonra, embriyoyu az miktarda DS, yaklaşık 2 μL ile toplayın ve embriyoyu 300 μL WS içeren bir sonraki kuyunun dibine taşıyın. Yine, yavaşça embriyo üzerinde pipet DS küçük bir miktar katman. 5 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üst dönün.
- 5 dakika sonra, WS en az hacimli embriyo almak ve 300 μL WS son kuyunun üstüne taşımak. Embriyo yavaş yavaş düşecek ve bünyeden dibe doğru yıkayın. Tutulan herhangi bir WS'yi pipetten boş bir kuyuya at.
- Embriyoyu minimum hacimle toplayıp aynı 300 μL'lik WS kuyusuna geri dönün. Embriyo bir kez daha kuyunun dibine düşecek. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üstüne 6-iyi plaka dönmek.
3. Isınmış embriyoların geri kazanımı
- Birer birer, ısıtılmış embriyoları 500 μL'lik eşitlenmiş embriyo kültürü sınıfı yağın %10 v/v SPS'si ile 500 μL'lik dengelenmiş BM içeren merkezi bir organ dokusu kabına taşıyın.
- Her embriyo yutarak embriyoları yıkayın ve hareket arasında eski medya üfleme sırasında çanak çeşitli alanlara hareket ettirerek. Embriyoyu al ve %10 v/v SPS yağ altında dengelenmis BM'nin 20 μL kültür damlasına taşıyın.
- Isınan embriyolar 37 °C, %6 CO2, %5 O 2'de bir kuvözde 2 saat boyuncaiyileşin.
4. Zona kaldırma
- 2 saatlik bir iyileşmeden sonra, embriyoları yeniden genişleme için değerlendirin ve her embriyonun fotoğrafını çekin.
- Embriyoları tek tek 3-(N-morpholno)-propansülfonik asit (MOPS)-tamponlu işleme ortamı ile %5 (v/v) fetal baldır serumu (FCS) ile asidik Tyrode solüsyonu ile tedaviden önce hareket ettirin.
- Mikroskoptan aktif olarak izlerken bir embriyoyu 300 μL ısıtılmış asidik Tyrode çözeltisi boyunca hızlı bir şekilde hareket ettirin. Zona pellucida görsel olarak erimeye başlayacak. Bu yaklaşık 5 s sürer.
- Hemen 300 μL ısıtılmış MOPS tamponlu orta asit Tyrode çözeltisi söndürmek için zona eriterek embriyo hareket ettirin.
- MOPS tamponlu orta minimal hacmi ile embriyo taşımak bir merkezi iyi organ dokusu çanak içeren 500 μL dengelenmiş BM içeren 10% v / v SPS altında 500 μL dengelenmiş embriyo kültür sınıf yağ yıkamak için.
- Embriyoyu adım 3.2'den 20 μL'lik iyileşme düşüşüne geri döndürün.
NOT: Zona çıkarılmasını takiben yapılan görsel incelemede, zona pellucidae'li embriyolar gerekirse asidik Tyrode çözeltisi ile 4.2-4.6 adımlarını tekrarlayarak daha fazla tedavi edilebilir. Tyrode'un çözeltisine en aza indirgin bir şekilde istenir.
5. Blastosist genişletilmiş kültür
- Embriyoları tek tek yıkama kabına, 1.1.6 adımdan eşitlendirilmiş IVC1 ortamıyla taşıyın. Bir embriyoyu, elenmiş IVC1 ile odalı kapaklı bir kuyuya dikkatlice taşıyın ve embriyo tanımlamasını koruyun.
NOT: Orta buharlaşmayı en aza indirmek için bu adımın mümkün olan en kısa sürede tamamlanması gerekir. - 37 °C, %6 CO2, atmosferik O2 2 gün boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine döndürül.
NOT: 37 °C, %6 CO2, atmosferik O2 ortam değişimi için 4 saat önceden ortamları eritmeye ve dengelemeye dikkat edin. - D2 'de (D7 sonrası döllenme) embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya alışverişi gerçekleştirin.
- Ortam alışverişinden önce hangi embriyonun yemeğe bağlı olduğunu unutmayın. Plakaya hafifçe dokunun ve bir embriyonun mikroskop altında plakaya güvenli bir şekilde bağlanıp bağlanmadığını inceleyin.
- Kapağı çıkarın ve 150 μL'lik IVC1'i dikkatlice çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemek için atın. Eğer bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC1'deki serum embriyo ekinde yardımcı olacağı için ortam değiştirmeyin.
- Pipet 150 μL denli genişletilmiş kültür ortamı, IVC2, yavaş yavaş her kuyuya ve odacıklı kapak kapağı kapağı na geri dönün.
NOT: Orta buharlaşmayı önlemek için kapağın odalı kapak tan çıkarılmasının en aza indirilmesini sağlayın.
- Odacıklı kapak kapağını, kapağın üzerine herhangi bir ortam sıçramadan kuvöze dikkatlice geri döndürün. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar genişletilmiş kültürün her gün medya değişimi ve eki kontrol tekrarlayın.
6. Harcanan ortamın isteğe bağlı olarak toplanması
- İsteğe bağlı olarak, D7'den sonra veya sonraki herhangi bir gün kültür ortamı alışverişi sırasında harcanan medyayı toplayın. Adım 5.3.2 sırasında, orta snap-freeze 150 μL çıkarılan IVC1 steril, düşük bağlayıcı 0,5 mL tüp içine atmak yerine ileride analiz için.
7. İmmünfluoresans için isteğe bağlı fiksasyon
- Herhangi bir hücre dışı enkaz kaldırmak için fiksasyon önce 3x için PBS 1/2 medya alışverişi ile embriyoyıkamak için 200 μL pipet kullanın. Aşırı enkaz ve proteinin yıkanması, netliği optimize etmeye ve immünoresans ile elde edilen görüntülerde arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır.
- Tüm ortamları çıkarın ve pbs'deki %4 paraformaldehitin (PFA) 200 μL'sini yavaşça kuyuya ekleyin. Embriyo sıvının yüzeyine yapışmak isteyecektir. Tüm sıvıyı çıkarmadan önce %4 PFA ile birden fazla 150 μL yıkayarak embriyodaki hasarı en aza indirmeye yardımcı olur.
- Fiksasyon için 20 dakika için% 4 PFA embriyolar inkübasyon.
- Embriyoları yıkama başına 10 dakika boyunca 3x yıkayın ve 200 μL %0,1 v/v polisorbat 20 taze PBS'de.
- Sabit embriyoları immünoresans protokolüne geçmeden önce 4 °C'de PBS'de %0,1 v/v polisorbat 20 olarak saklayın.
8. Trypsin ile tek hücreli sindirim
NOT: Taze (sabit olmayan) embriyolar tek hücreli sindirim için kullanılır.
- Embriyoyu 200 μL PBS ile bir kez yıkayın ve her kuyuya 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak lını 5 dakika boyunca kuvöze geri döndürün.
- Odacıklı kapak kapağını kuvözden çıkarın ve embriyoları stereoskop altında inceleyin. Embriyonun çevresinde bulunan hücreler geri çekilmeye başlar ve MTB yine de embriyodan uzakta bulunan tabağa iliştirilmelidir.
- Tüm embriyo parçalamadan önce tek tek MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın. MTB'yi kurtarmak için adım 9.1'e geçin ve adım 9.3'ten sonra adım 8.4'e dönün.
- Embriyoyu hafifçe aşağı yukarı keserek ayrıştırmak için el yapımı mikromanipülasyon pipetveya ağız pipeti kullanın.
- Hücreler tüm embriyodan ayrışmaya başlayacak. Embriyo tripsin toplam 10 dakika kuluçkaya yatırılanakadar daha küçük çaplı pipet ucu veya ağız pipetini kullanarak embriyoyu nazikçe ve tekrar tekrar aspire etmeye devam edin.
9. Tek hücre seçimi ve örnek toplama
- Minimal tripsin ile, herhangi bir hücre kaybetmemek için bakım ile bakım ile embriyo kültürü yağı altında 20 μL PBS + 0.1% polivinilpyrrolidone (PVP) üç yıkama damla ile ayrışmış hücreleri hareket ettirin.
- Hücreleri yıkadıktan sonra, bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın. Tek hücreyi pbs+%0,1 PVP hacmien az olan steril 0,2 mL düşük bağlamalı bir tüpe dikkatlice pipetlayın.
- Tek hücreleri sıvı nitrojende (LN2)tutturun ve ileride kullanım için -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilediler (Şekil 2B). Anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar (Şekil 2C). Deneyimlerimize göre embriyoların yaklaşık %75'i 48 saat le fibronektin kaplı kabın altına bağlanmış ve ek kültürde 72 saat ile yaklaşık %90'a yükselmiştir. Embriyo eki başarısı büyük ölçüde blastosistlerin ilk kalitesinden etkilenebilir. 72 saat bağlı olmayan embriyolar büyük olasılıkla hayatta olmayacaktır.
D8 sonrası döllenmede (D3 genişletilmiş kültür), embriyolarda çoğu hücre trofoplast belirteci GATA3(Şekil 3A)için pozitif olan CTB idi. Sitotrophoblastlar embriyonun çevresinde çok çekirdekli STB'ye farklılaşmaya başlamıştır(Şekil 2B, sol panel, noktalı çizgi). Bu STB bir levha gibi bir görünümvardı ve insan koryonik gonadotropin alt birim beta için pozitif lekeli (hCGB; Şekil 3A, merkez paneli). Embriyolar hızla büyüdü, D8 ve D10 arasında, bu dönemde CTB hızlı bir hücre çoğalması düşündüren. D10'da CGB pozitif MTB oluşumu maksimum düzeydeydi ve bu da şu anda hCG üretiminin artmasıyla doğrulanabilirdi(Şekil 3B). Göçmen trofoblastlar da ortaya çıkmaya ve embriyo gövdesinden uzaklara göç etmeye başlamış lar ve EVT belirteci HLA-G(Şekil 3A, sağ panel) için pozitif boyanmıştır. D12 ile STB farklılaşması azaldı ve MTB üretimi daha belirgin hale geldi ve bu da D10'daki hormon üretiminden D12'deki hücre göçüne kadar bir vurgu değişimi olduğunu düşündürdü. Bu değişiklikler bu peri-implantasyon döneminde elde edilen hızlandırılmış video ile gözlenmiştir(Film 1). Tek hücreli RNA sıralama verilerimiz hücre işlevindeki bu tür dinamik değişiklikleri de yansıtıyor. Birlikte, bu veriler erken trofoblast farklılaşması nı ve erken plasentanın ortaya çıkmasının embriyonun başarılı implantasyon elde etmek için çok özel leşmiş hücre fonksiyonlarını çok özel zaman noktalarında ön planda tevkif edebileceği dinamik bir süreç olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Genişletilmiş kültürün ve tek hücreli örneklem toplamanın usul şeması.
Isınma vitrifiye embriyoların iş akışı, zona pellucida kaldırma, genişletilmiş embriyo kültürü, enzimatik sindirim, ve sitotrophoblast izolasyon (CTB), syncytiotrophoblast (STB), ve göçmen trofoblast (MTB). Bu rakam West ve ark.12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Genişletilmiş kültür sırasında trofoblast hücrelerinin ve embriyoların morfolojileri.
(A) Tripsin ile enzimatik sindirim sonrası farklı trofoblast hücre tiplerinin temsili görüntüleri. Solda küçük CTB, ortada büyük STB ve sağda MTB. (B) D8 (solda), D10 (orta) ve D12 'de (sağda) sağlıklı embriyoların temsili görüntüleri. Sol panelana sındaki kesik çizgiler muhtemelen proliferatif CTB popülasyonu, noktalı çizgi ise düzleştirilmiş STB'yi özetler. Sağ paneldeki pembe daireler, embriyodan uzaktan bulunan MTB'yi ana hatlar. (C) D8 (solda), D10 (ortada) ve D12'de (sağda) geri çekilmeye ve parçalanmaya başlayan anormal embriyoların temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. Bazı görüntüler West ve ark.12'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Genişletilmiş kültür de trofoblast marker ekspresyonu ve hCG üretiminin temsili görüntüleri.
(A) D10'da CTB belirteci GATA3 ifadesini gösteren embriyoların (solda), D10'da STB marker CGB'sini gösteren (ortada) ve D12'de MTB marker HLA-G'nin (sağda) temsili immünofloresan görüntüleri. Ölçek çubukları= 200 μm. (B) D8'den D12'ye kadar uzatılmış kültür boyunca temsili hCG konsantrasyonu (mIU/mL) (ortalama± SEM, n = 3). İstatistiksel analiz tek yönlü ANOVA ile yapıldı ve ardından Tukey testi (P < 0.05) yapıldı. Bu görüntüler West ve ark.12'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: D8'den D12'ye kadar geniş kültürde bir insan embriyosu hızlandırılmış video. Video blastokokin çöküşünü, STB oluşumunu (yeşil daireler tarafından gösterilir) ve daha sonra nihai farklılaşma ve MTB göç (turuncu daireler ile gösterilir) göstermektedir. Bu West ve ark.12uyarlanmıştır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implantasyon yoluyla kültür insan embriyoları için protokolün geliştirilmesi bilim adamları geliştirme daha önce keşfedilmemiş bir zaman keşfetmek için izin verdi8,9. Burada, insan embriyolarını kültürlendirmek ve villous plasenta oluşumundan önce erken trofoblast farklılaşmasını incelemek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanıyoruz. Burada açıklanan yöntemler, tek hücreli alt akış analizinde kullanılmak üzere farklı TB alt tanımlarını toplamamıza olanak sağlar. Bu çalışma, bilim camiasına insan gelişimindeki bu kritik ve esrarengiz dönemi anlama şansı verir ve düşük veya pre-eklampsi gibi diğer plasental patolojiler için tedavi edici tedaviler için yeni fırsatlar açabilir ve erken insan gelişimi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.
Bu protokol, embriyo ısınması sırasında embriyoların hızlı bir şekilde manipüle edilmesi, zona çıkarılması ve uzun kültürden önce embriyo stresini en aza indirmek için kaplama becerileri gerektirir. Ortam buharlaşmasını ve dolayısıyla ortam değişimi sırasında maruz kalma süresini sınırlandırarak orta osmolalitede bir artış en aza indirmek esastır. Orta ve hareketli bulaşıkları değiştirirken uygun aseptik tekniğikullanmaya özen söylemek kontaminasyonu en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Embriyolar bağlandıktan sonra herhangi bir mekanik rahatsızlığı en aza indirmek için kullanımda çanak stabilize etmek de önemlidir. Stresli hale embriyolar onların senytial projeksiyonlar geri almaya başlayacak ve apoptoz başlar. Kültür medyasının menisküsünün embriyoyüzeyine dokunmasına izin vermemek ve kuyularda yağ ları en aza indirmek de önemlidir. Bu senaryolardan biri embriyoyu yok edebilir.
Blastosist evresinin ötesinde insan embriyolarının kültüre sokulmak hızla gelişen bir alandır. Yakın zamanda yapılan bir çalışma13, hücre dışı matriks protein karışımının %10'unu içeren ve sodyum pirülüat, laktat ve rho-associate protein kiyaz (ROCK) inhibitörü takviyesi ile bir ortam içeren yeni bir kültür sisteminin, vivo 3D embriyonik mimarilerin modellemesinde avantajlı olduğunu ve burada açıklanan genişletilmiş kültür sistemine kıyasla genişletilmiş kültürün daha sonraki evresinde önemli ölçüde daha canlı embriyolar verdiğini göstermiştir. Bu yeni sistemin tekrarlanabilirliğini göstermek için doğrulanması gerekecektir. Burada açıklanan prosedürlerin bu yeni 3B sisteme küçük değişikliklerle uyarlanabileceğine ve bu nedenle bu alandaki metodolojideki ilerlemeye fayda sağbileceğine inanıyoruz.
Bu protokol, IVF kültürü medya optimizasyonu nun araştırılmasına olanak sağlayacak şekilde de uyarlanabilir. Biz son zamanlarda fare, genişletilmiş kültür sırasında embriyo gelişimi embriyo transferi18sonra fetal gelişimin başarısını tahmin edebilir göstermiştir. Anormal döllenmiş ve atılır insan zigotlar ile 3 pronuclei (PN) daha sonra genişletilmiş kültür sırasında gelişimini etkileyebilir farklı koşullarda D5 blastosistler için kültürlü olabilir. Bağışlanan D5 insan blastosistleri, performans değerlendirmesi için genişletilmiş kültür sistemine yerleştirilmeden önce yeni koşullarda 48 saat kültürlenebilir. Epiblast hücre sayısı, toplam hücre sayısı, büyüme alanı ve hCG'nin rutin ölçümleri, laboratuarımızın farklı kültür ortam koşullarının insan öncesi implantasyon embriyo gelişimini nasıl daha iyi destekleyebileceğini ve implantasyon sonrası başarılarını nasıl daha iyi etkileyebileceğini daha iyi anlamamızı sağlamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Colorado Üreme Tıbbı Merkezi'ndeki (CCRM) embriyolarını nazikçe araştırma için bağışlayan birçok hastaya teşekkür etmek istiyoruz. Biz de Karen Maruniak ve CCRM klinik laboratuvar hCG örnekleri işleme yardımları için teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Sue McCormick ve CCRM onun klinik IVF embriyoloji ekibi embriyo toplama, depolama, izleme ve bağış ile yardım için. Finansman ccrm tarafından dahili olarak sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
