Summary
Her beskriver vi en metode til opvarmning af forglasificerede menneskelige blastocysts, der dyrker dem gennem implantationsperioden in vitro, fordøjer dem i enkelte celler og indsamler tidlige trophoblastceller til yderligere undersøgelse.
Abstract
Menneskelig implantation, apposition og vedhæftning til livmoderoverfladen epithelia og efterfølgende invasion af blastocyst i moderen decidua, er en kritisk endnu gådefuld biologisk begivenhed, der har været historisk vanskeligt at studere på grund af tekniske og etiske begrænsninger. Implantation er initieret ved udvikling af trophectoderm til tidlig trophoblast og efterfølgende differentiering i forskellige trophoblast underlinjer. Afvigende tidlig trophoblast differentiering kan føre til implantation fiasko, placenta patologier, føtale abnormiteter, og abort. For nylig er der udviklet metoder til at tillade menneskelige embryoner at vokse indtil dag 13 efter befrugtning in vitro i mangel af maternel væv, en periode, der omfatter implantationsperioden hos mennesker. Dette har givet forskerne mulighed for at undersøge menneskelig implantation og opsummere dynamikken i trophoblast differentiering i denne kritiske periode uden at forvirre moderens påvirkninger og undgå iboende hindringer for at studere tidlige embryo differentiering begivenheder in vivo. For at karakterisere forskellige trophoblast-underlinjer under implantation har vi vedtaget eksisterende todimensionelle (2D) udvidede dyrkningsmetoder og udviklet en procedure til enzymatisk fordøje og isolere forskellige typer trophoblastceller til downstream-analyser. Embryoner dyrket under 2D-forhold har en relativt fladfræt morfologi og kan være suboptimale i modellering in vivo tre-dimensionelle (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast-differentiering synes imidlertid at være mindre påvirket, som det fremgår af forventede ændringer i morfologien og genekspressionen i løbet af den udvidede kultur. Forskellige trophoblast underlinjer, herunder cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og vandrende trophoblast kan adskilles efter størrelse, placering, og tidsmæssige fremkomst, og bruges til yderligere karakterisering eller eksperimenter. Undersøgelse af disse tidlige trophoblast celler kan være medvirkende til at forstå menneskelig implantation, behandling af fælles placenta patologier, og afbøde forekomsten af graviditet tab.
Introduction
Human implantation og fremkomsten af den tidlige moderkagen er historisk vanskelige at undersøge og forbliver stort set ukendt, fordi humane væv er utilgængelige på dette tidspunkt, hvor graviditet er klinisk målbart. Dyremodeller er utilstrækkelige, da menneskelig placentisering har sine egne unikke egenskaber i forhold til andre euteriske pattedyr. For eksempel, menneskelige placenta invaderer dybt ind i decidua med nogle trophoblast celler nå mindst den indre tredjedel af livmoderen myometrium, mens andre celler omforme livmoderen spiral arterier. Selv vores nærmeste evolutionære forfædre, de ikke-menneskelige primater, viser forskelle i placenta morfologi og trophoblast interaktioner med moderensafgørende væv 1,,2,,3. Opnåelse af præimplantatation menneskelige embryoner in vitro var ikke muligt, før i 1980'erne, da klinisk human in vitro befrugtning (IVF) startede som en rutinemæssig praksis til behandling af infertilitet4. Nu kan menneskelige blastocyster dyrkes in vitro for at give mulighed for udvælgelse af mere levedygtige embryoner til overførsel, samt muliggøre sikker genetisk testning. Forbedring i embryo kultur teknikker, samt den stigende brug af IVF har givet mange overskydende blastocyster, som forbliver efter patientens behandling cykler er afsluttet. Med patientens samtykke, IRB godkendelse, og med visse restriktioner, disse blastocysts kan anvendes til forskningsundersøgelser. De er blevet en uvurderligressource,der blev brugt til afledning af menneskelige embryonale stamceller5, forståelse af overgangen af indre cellemasse til embryonale stamceller6,7, ogfor nylig, er blevet med succes dyrket indtil dag (D) 13 til remodel human implantation8,9. Ved at udnytte nyligt udviklede enkeltcelleomics tilgange, adgang til disse implantation fase menneskelige embryo væv har tilbudt unikke muligheder for at beskrive de molekylære mekanismer, der regulerer denne meget dynamisk celle differentiering proces, som tidligere var umuligt atudforske 10,11,12,13.
Her beskriver vi de metoder, der anvendes i vores seneste publikation, der karakteriserer dynamikken i trophoblast differentiering under menneskelig implantation12. Denne protokol omfatter opvarmning af forglasset blastocyster, udvidet embryokultur op til D12 post IVF, enzymatisk nedbrydning af embryonet i enkelte celler og celleindsamling til downstream-analyser (figur 1). Dette udvidede kultursystem understøtter peri-implantation fase menneskelige embryo udvikling uden moderens input og opsummerer trophoblast differentiering, der synes i overensstemmelse med observationer fra histologiske prøver mange årsiden 14,15,16,17. Under implantationen består trofoblastpopulationen af mindst to celletyper: den mononukleerede progenitorlignende cytotrophoblast (CTB) og den terminalt differentierede, flerkernede syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøjelse, CTB er små, runde celler, der er morfologisk umulig at skelne fra andre celle slægter(Figur 2A,venstre panel). Adskillelse af CTB fra andre celle slægter, såsom epiblast og primitive endoderm, kan opnås ved deres særskilte transskriptive profiler afsløret ved enkeltcelle RNA sekventering. Syncytiotrophoblast celler kan let identificeres som uregelmæssige formede strukturer, der er betydeligt større end de andre celletyper og hovedsagelig placeret i periferien af fosteret (Figur 2A, midterste panel; Figur 2B, venstre panel). Migrerende trophoblast celler (MTB) er en anden trophoblast underlinje findes under embryo udvidet kultur og kan anerkendes som tilsyneladende bevæger sig væk fra hoveddelen af fosteret (Figur 2A, højre panel, Figur 2B, højre panel). Migrationstrophoblast bør, selv om den udtrykker mange af de samme markører som ekstra villous trophoblast (EVT), ikke betegnes som evt, da de villous strukturer i moderkagen ikke er opstået på dette meget tidlige udviklingsstadyd.
Eksperimentelt, vi var i stand til at indsamle små CTB og store STB, der er let skelnes efter embryoner er fordøjet i enkelte celler på D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Træktrophoblaster opstår på de senere stadier af den udvidede embryokultur og kan indsamles i D12, før hele fosterets enzymatiske fordøjelse (figur 2A,B). Ved fænopypisk at adskille disse tre trophoblast-underlinjer før enkeltcelleanalyse kan vi identificere specifikke transskriptionomiske markører og definere den biologiske rolle for hver celletype. Cytotrophoblast er meget proliferative og fungerer som progenitor celler i at levere STB og MTB differentieret slægter10,11,12,13. Syncytiotrophoblast er involveret i produktionen af placentahormoner for at opretholde graviditeten og kan også være ansvarlig for embryoner gravende ind i endometrium10,,11,,12,13. Vandrende trophoblast har endnu stærkere træk ved en invasiv, vandrende fænotype og er sandsynligvis ansvarlig for dybere og mere omfattende kolonisering af livmoderen endometrium10,11,12,13. Efter at have defineret den transskriptiske signatur for hver celletype har klyngeanalyser også afsløret yderligere to undergrupper af celler, der var morfologisk umulig at skelne fra CTB og havde transkriptiker med funktioner i STB og MTB,henholdsvis 12. Disse mellemliggende fase celler er sandsynligvis i færd med at differentiere fra CTB til enten MTB eller STB underlinjer og ville have været overset, hvis embryoner var blindt fordøjet og celler blev adskilt af transcriptome alene.
Den protokol, der er beskrevet her, anvender et todimensionelt (2D) kultursystem og er muligvis ikke optimal til at understøtte den tredimensionale (3D) strukturelle udvikling, som foreslået af en nylig publikation, der beskriver et nyudviklet 3D-kultursystem13. Ikke desto mindre synes differentieringen af tidlig trophoblast i dette 2D-system at være i overensstemmelse med observationer foretaget af in vivo-prøverne14,15,16,17. Denne protokol kan også let tilpasses til brug i det nyligt beskrevne 3D-kultursystem13 med minimale ændringer. Alle trin udføres med en håndholdt mikromanipulationpipette med kommercielt tilgængelige engangsspidser eller en mundpipette fra en finttrukket glaspipette fastgjort til gummislanger, et filter og et mundstykke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige embryoner er blevet doneret med samtykke til brug i forskning. Protokollerne for udvidet menneskelig embryokultur er blevet godkendt af Western Institutional Review Board (undersøgelse nr. 1179872) og følger internationale retningslinjer. Enhver anvendelse af menneskelige embryoner skal gennemgås af de relevante etiske og styrende organer, der er tilknyttet forskningsinstitutionen ved hjælp af denne protokol.
1. Forberedelse
- Forbered medier og nyttiggørelse plader en dag før embryo opvarmning i en steril laminar flow hætte.
- Forbered 2 ml blastocystkulturmedier (BM) med 10% v/v serumproteinerstatning (SPS).
BEMÆRK: Blastocyst kultur medier kan eller ikke kan indeholde tilsat protein. Her brugte vi et medie, der skal suppleres med 10% af det angivne albuminprotein. Se producentens vejledning for variation i dette tilskud. Alle medier skal filtreres med et sterilt 0,22 μM-filter, der er fastgjort til en steril sprøjte før ækvilibrering. - Fyld to center-brønd orgel kultur vaske op med 500 μL BM med 10% v / v SPS dækket med 500 μL af embryo kultur grade olie.
- I en 60 mm vævskulturskål skal lag 8 ml embryokulturolie forankres og derefter forankres 20 μL dråber BM med 10% v/v SPS til bunden af kulturpladen. Lav 1 dråbe for hvert foster opvarmet.
BEMÆRK: Der kan foretages flere medier, dråber og vaskeskåle efter behov. Dråber kan også tilsættes til fadet, før olien er lagdelt. Forankring dråber under olien vil bidrage til at reducere fordampning og eventuelle efterfølgende ændringer i osmolalitet. - Jævnvægt BM med 10% v/v SPS vaske op og genvindingsplade i en inkubator ved 37 °C, 6% CO2, 5% O2 i mindst 4 timer.
- Optø et hætteglas af det første trin i udvidede kulturmedier (IVC1) i 4 °C eller på bordpladen.
- Der klargøres med en vaskeskål på 500 μL IVC1 uden olieoverlejring. Aliquot ca. 4 ml IVC1 i et 5 ml snap cap rør.
- Ligevægt IVC1 vaskeskål og lille snap cap rør af IVC1 i 37 °C, 6% CO2, og atmosfærisk O2 i mindst 4 timer.
- Forbered 2 ml blastocystkulturmedier (BM) med 10% v/v serumproteinerstatning (SPS).
- Forbered udvidede kulturplader en dag før embryoopvarmning i en steril laminar flow hætte.
- Fortyndet fibronectin fra humant serum i fosfatbufferet saltvand (PBS) til 30 μg/ml. 250 μL af 30 μg/ml fibronectin pr. embryo vil være nødvendig for at belægge kamrene.
- Åbn den 8 godt chambered coverslip pakke under kølerhjelmen, mens du skal passe på ikke at røre brøndene. Pipetter forsigtigt 250 μL 30 μg/ml fibronectin i hver brønd.
- Låget sættes på den 20-24 timer store dækslet og sættes i 4 °C.
- Forbered udvidet kultur plade om morgenen af embryo opvarmning.
- Hent den chambered coverslip med fibronectin og sted i laminar flow hætte. Fjern fibronectinblandingen med en 1 ml pipette, og kassér den i affaldsbeholderen.
- Hent opvarmede, ligevægtede IVC1-medier fra lille 5 ml snap cap rør.
- Pipette 300 μL ækvivalens IVC1 i hver brønd. Pas på ikke at lade væske røre ved låget, da dette vil øge risikoen for forurening.
- Den chamberede dækslips returneres med IVC1 for at inkubere i 37 °C, 6% CO2 og atmosfærisk O2, indtil zona pellucida fjernes i trin 4.
2. Opvarmning forglasset D5 menneskelige embryoner
BEMÆRK: Andre producenter kan have lidt forskellige protokoller i henhold til deres egen vitrificeringsteknologi. Se producentens brugsanvisning, når det er relevant.
- Varm 3,0 ml optøningsopløsning (TS) i 35 mm skål til 37 °C. Der bringes 300 μL fortyndingsopløsning (DS) og to brønde af 300 μL vaskeopløsning (WS) i en 6 brøndplade til stuetemperatur.
- Brug hændeglas, fjern forsigtigt kryoanordningens ærme, samtidig med at det sikres, at det forglassede embryo altid forbliver under flydende nitrogen.
- Flyt hurtigt kryoanordningen fra flydende nitrogen, og spidsen af kryoanordningen i TS ved 37 °C. Indstil en timer i 1 min og hold kryoenheden nedsænket, indtil fosteret løsner sig i TS.
BEMÆRK: Varme embryoner en ad gangen for at holde styr på embryoidentiteter, da de kan vedrøre patientens demografiske oplysninger i downstream-analysen. - Under 1 min inkubation i TS fjernes kryoanordningen forsigtigt, og embryonet skal forsigtigt afhentes, og der flyttes til den modsatte side af TS-skålen.
BEMÆRK: Hvis der dyrkes flere embryoner, skal du være omhyggelig med at holde embryoner adskilt for at sikre, at de korrekte identiteter bevares. - Efter 1 min, forsigtigt afhente fosteret med en lille mængde TS, ca 2 μL. Flyt embryonet til bunden af 300 μL DS brønden, mens embryonet dækker i et tyndt lag TS fra pipetten. Indstil en timer i 3 min og placer 6-brøndpladen på bænken øverst ved stuetemperatur.
- Efter 3 min, afhentes embryonet med en lille mængde DS, ca. 2 μL, og embryonet flyttes til bunden af den næste brønd, der indeholder 300 μL WS. Igen, forsigtigt lag en lille mængde DS fra pipetten over fosteret. Indstil en timer i 5 min og vend tilbage til bænken.
- Efter 5 min, afhente embryo med minimal volumen af WS og flytte til toppen af den endelige brønd på 300 μL WS. Embryoet vil langsomt falde og vaske gennem WS til bunden. Udvis eventuelle tilbageholdte WS fra pipetten til en tom brønd.
- Opfang fosteret med minimal volumen og vende tilbage til toppen af den samme 300 μL brønd WS. Embryoet vil igen falde til bunden af brønden. Indstil en timer i 1 min og sæt 6-brøndpladen tilbage til bænken.
3. Genvinding af opvarmede embryoner
- En ad gangen, flytte varmede embryoner i en center-brønd organvæv fad, der indeholder 500 μL ækvibreret BM med 10% v / v SPS under 500 μL af ækvibribrede embryo kultur grade olie.
- Vask embryoner ved at afhente hvert foster og flytte dem rundt til flere områder i skålen, mens blæser ud gamle medier mellem bevæger sig. Oppøm fosteret op, og flyt det til et individuelt 20 μL dyrkt dyrdt dyrfald af ligevægtsbm med 10% v/v SPS under olie.
- Lad de opvarmede embryoner komme sig i 2 timer i en inkubator ved 37 °C, 6% CO2, 5% O2.
4. Zona fjernelse
- Efter en 2 timers genvinding skal embryonerne vurderes med henblik på genudvidelse og tage billeder af hvert embryon.
- Flyt embryoner individuelt i 500 μL af et 3-(N-morolino)-propansulfonsyre (MOPS)-buffered håndteringsmedium med 5% (v/v) føtal kalveserum (FCS) før behandling med sur tyridopløsning.
- Flyt et foster hurtigt gennem 300 μL af opvarmet sur tyrodopløsning, mens du aktivt ser gennem mikroskopet. Den zona pellucida vil visuelt begynde at opløse. Dette vil tage ca. 5 s.
- Flyt straks fosteret med opløsning af zona i 300 μL opvarmet MOPS-buffermedium for at slukke syren Tyrodes opløsning.
- Embryoet med minimal mængde MOPS-buffermedium flyttes ind i en centerbjnende organvævsskål, der indeholder 500 μL ækvivalens BM med 10% v/v SPS under 500 μL ækvibribiberede embryokulturkvalitetsolie at vaske.
- Embryonet sættes tilbage til genvindingsfaldet på 20 μL fra trin 3.2.
BEMÆRK: Ved visuel undersøgelse efter fjernelse af zona kan embryoner med bevaret zona pellucidae om nødvendigt behandles yderligere med sur tyrids opløsning ved at gentage trin 4.2-4.6. Minimering af eksponeringen for Tyrodens løsning ønskes.
5. Blastocyst udvidet kultur
- Flyt embryonerne individuelt til vaskeskålen med ekvilibrerede IVC1-medier fra trin 1.1.6. Flyt forsigtigt et embryon til en brønd af den kammerdæksletæbe med ligevægts IVC1 og vedligehold embryoidentifikationen.
BEMÆRK: Dette trin skal være færdigt så hurtigt som muligt for at minimere medium fordampning. - Retur chambered coverslip til en inkubator indstillet til 37 °C, 6% CO2, atmosfærisk O2 i 2 dage.
BEMÆRK: Sørg for at tø og ligevægtsmedier i 37 °C, 6% CO2, atmosfærisk O2 for mediebørsen 4 timer i forvejen. - Ved udvækst D2 (D7 efter befrugtning), omhyggeligt undersøge fastgørelse af embryoner under mikroskopet og udføre medieudveksling.
- Bemærk, hvilket embryo der er fastgjort til skålen, før mediet udskiftes. Bank forsigtigt på pladen, og undersøg, om et foster er fastgjort sikkert til pladen under mikroskopet.
- Tag låget af og fjern forsigtigt 150 μL IVC1, og kassér det fastgjorte foster, uden at det påsatte embryo forstyrres. Hvis et embryon endnu ikke er fastgjort til pladen, må mediet ikke udskiftes, da serummet i IVC1 vil hjælpe med embryontilbehør.
- Pipette 150 μL ækviibyleret udvidet kulturmedie, IVC2, langsomt ind i hver brønd og sæt låget på den kammererede dækslet.
BEMÆRK: Sørg for, at låget fjernes fra den kammererede dækslet, så det undgås, at der fordampes mellem.
- Returner forsigtigt den kammerdækslet på inkubatoren uden at sprøjte medier på låget. Gentag medieudveksling og kontrol af vedhæftede filer hver dag med udvidet kultur, indtil embryoner er klar til fiksering eller en enkeltcellefordybelse.
6. Valgfri indsamling af brugte medier
- Du kan eventuelt indsamle brugte medier under udveksling af kulturmedier efter D7 eller en hvilken som helst dag derefter. Under trin 5.3.2, i stedet for at kassere medium snap-fryse 150 μL af fjernet IVC1 i en steril, lav-binde 0,5 ml rør til fremtidig analyse.
7. Valgfri fiksering for immunfluorescens
- Brug en 200 μL pipette til at vaske embryoner med 1/2 medieudvekslinger af PBS i 3x før fiksering for at fjerne ekstracellulære rester. Vask væk overskydende snavs og protein vil bidrage til at optimere klarhed og reducere baggrunden i billeder opnået med immunfluorescens.
- Fjern alle medier og tilsæt langsomt 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS til brønden. Fosteret vil ønske at holde sig til overfladen af væsken. Flere 150 μL vasker med 4% PFA, før du fjerner al væske, vil bidrage til at minimere eventuelle skader på embryonet.
- Inkuber embryonerne i 4% PFA i 20 min til fiksering.
- Embryonerne vaskes 3x i 10 min. pr. vask med 200 μL på 0,1 % v/v polysorbat 20 i frisk PBS.
- Fast embryoner opbevares i 0,1 % v/v polysorbat 20 i PBS ved 4 °C, før du fortsætter med immunofluorescensprotokollen.
8. Enkeltcellefordøjelse med Trypsin
BEMÆRK: Friske (ikke faste) embryoner anvendes til enkeltcellefordøjelse.
- Embryoet vaskes én gang med 200 μL PBS, og der tilsættes 200 μL trypsinopløsning til hver brønd. Den kammererede dækslæd til rugemaskinen i 5 min.
- Fjern den kammerdækde dækslæd fra inkubatoren og undersøg embryonerne under et stereoanlæg. Celler i embryonets periferi vil begynde at trække sig tilbage, og MTB bør stadig fastgøres til pladen, hvor de er fjernt placeret fra embryonet.
- Brug en lille pipette eller fint trukket mund pipette til at afhente individuelle MTB før bryde fra hinanden hele fosteret. Spring frem til trin 9.1 for at gemme MTB og vende tilbage til trin 8.4 efter trin 9.3.
- Brug en håndholdt mikromanipulationpipette eller mundpipette til forsigtigt at adskille embryonet ved at aspirere op og ned.
- Celler vil begynde at adskille fra hele fosteret. Fortsæt med at aspirere fosteret forsigtigt og gentagne gange ved hjælp af en pipettespids eller mundpipette med en mindre diameter, indtil embryonet er blevet inkuberet i alt 10 min. i trypsin.
9. Udvælgelse af enkeltceller og stikprøver
- Med minimal trypsin, flytte dissocierede celler gennem tre vaske dråber på 20 μL PBS + 0,1% polyvinylpyrolidon (PVP) under embryo kultur olie med omhu for ikke at miste nogen celler.
- Efter vask af cellerne, skal du bruge en fint trukket glas pipette til at vælge en celle. Pipetter forsigtigt enkeltcellen i et sterilt 0,2 ml lavbindingsrør med minimal volumen PBS+0,1% PVP.
- Fastgør enkelte celler i flydende nitrogen (LN2), og opbevares i -80 °C til fremtidig brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunde embryoner udviste fortsat spredning i løbet af den udvidede kultur (figur 2B). Unormale embryoner begyndte at trække sig tilbage fra deres ydre kanter og opløses (Figur 2C). Fra vores erfaring, ca 75% af embryoner blev fastgjort til bunden af fibronectin belagt fad på 48 h og fastgørelse steg til ca 90% med 72 h i kultur. Succesen af embryo vedhæftet fil kan i vid udstrækning påvirket af den oprindelige kvalitet af blastocyster. Embryoner, der ikke er fastgjort med 72 timer, vil sandsynligvis ikke overleve.
På D8 efter befrugtning (D3 af udvidet kultur), de fleste celler i embryoner var CTB, der var positive for trophoblast markør GATA3 (Figur 3A). Cytotrophoblaster var allerede begyndt at differentiere sig i flerkernet STB i periferien af embryonet (Figur 2B,venstre panel, stiplet linje). Disse STB havde et ark-lignende udseende og var farves positiv for den menneskelige chorioniske gonadotropin underenhed beta (hCGB; Figur 3A,midterpanel). Embryonerne voksede hurtigt, mellem D8 og D10, hvilket tyder på en hurtig cellespredning af CTB i denne periode. Ved D10 var dannelsen af CGB-positiv MTB på et maksimum, hvilket kunne bekræftes ved en stigning i produktionen af hCG på dette tidspunkt (figur 3B). Migrerende trophoblaster begyndte også at dukke op og migreret væk fra embryon kroppen og blev farves positiv for EVT markør, HLA-G(Figur 3A, højre panel). Ved D12 var STB-differentiering i tilbagegang, og MTB-produktionen blev mere fremtrædende, hvilket tyder på et skift i fokus fra hormonproduktion på D10 til cellemigration på D12. Disse ændringer blev observeret ved time-lapse video opnået i løbet af denne peri-implantation periode (Movie 1). Vores enkeltcelle RNA-sekventeringsdata afspejlede også sådanne dynamiske ændringer i cellefunktionen. Sammen tyder disse data på tidlig trophoblastdifferentiering, og fremkomsten af den tidlige moderkage er en dynamisk proces, hvor embryonet kan prioritere højt specialiserede cellefunktioner på meget specifikke tidspunkter for at opnå en vellykket implantation.
Figur 1: Procedureskema af udvidet kultur og indsamling af enkeltcelleprøver.
Workflow af opvarmning forglasset embryoner, zona pellucida fjernelse, udvidet embryo kultur, enzymatisk fordøjelse, og isolering af cytotrophoblast (CTB), syncytiotrophoblast (STB), og vandrende trophoblast (MTB). Dette tal er blevet ændret fra Vest et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Morfologier af trophoblast celler og embryoner under udvidet kultur.
(A)Repræsentative billeder af forskellige trophoblast celletyper efter enzymatisk fordøjelse med trypsin. Lille CTB til venstre, stor STB i midten, og MTB til højre. bB) Repræsentative billeder af sunde embryoner ved D8 (venstre), D10 (i midten) og D12 (til højre). Stiplede linjer i venstre panel kontur formentlig proliferative CTB befolkning, mens stiplet linje skitserer fladtrykt STB. Pink cirkler i højre panel skitsere MTB, der var fjernt placeret fra fosteret. cC) Repræsentative billeder af unormale embryoner, der begynder at trække sig tilbage og opløses ved D8 (til venstre), D10 (i midten) og D12 (til højre). Skalastænger = 200 μm. Nogle billeder er blevet tilpasset fra West et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af trophoblast markør udtryk og hCG produktion under udvidet kultur.
a)Repræsentativeimmunofluorescensbilleder af embryoner, der viser udtryk for en CTB-markør GATA3 ved D10 (til venstre), STB-markør CGB ved D10 (i midten) og MTB-markør HLA-G ved D12 (til højre). Skalastænger= 200 μm.(B) Repræsentativ hCG-koncentration (mIU/ml) i løbet af den udvidede kultur fra D8 til D12 (gennemsnitlig± SEM, n = 3). Statistisk analyse blev udført med One-Way ANOVA efterfulgt af Tukey's test (P < 0,05). Disse billeder er blevet tilpasset fra West et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Time-lapse video af et menneskeligt foster i udvidet kultur fra D8 til D12. Videoen viser sammenbruddet af blastocoel, dannelsen af STB (angivet af de grønne cirkler), og derefter eventuel differentiering og migration af MTB (angivet af de orange cirkler). Dette er blevet tilpasset fra West et al.12. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af protokollen til kultur menneskelige embryoner gennem implantation har gjort det muligt for forskere at udforske en tidligere ukendt tid i udvikling8,9. Her bruger vi et udvidet kultursystem til at dyrke menneskelige embryoner og studere tidlig trophoblast differentiering før dannelsen af villous placenta. De metoder, der er beskrevet her, giver os mulighed for at indsamle forskellige TB-underlinjer til brug i downstream-enkeltcelleanalyse. Dette arbejde giver det videnskabelige samfund en chance for at forstå denne kritiske og gådefulde periode i den menneskelige udvikling, og kan åbne nye muligheder for terapeutiske behandlinger for abort eller andre placenta patologier såsom præ-eklampsi, samt give nye indsigter om tidlig menneskelig udvikling.
Denne protokol kræver færdigheder i hurtigt at manipulere embryoner under embryoopvarmning, zona fjernelse og plating at minimere embryo stress forud for udvidet kultur. Minimering af mediefordampning og dermed en stigning i medium osmolalitet ved at begrænse eksponeringstiden under medieudveksling er afgørende. At passe på at bruge korrekt aseptisk teknik, når der udveksles medium og bevægelige retter vil bidrage til at minimere forurening. Stabilisering af skålen, når den er i brug for at minimere eventuelle mekaniske forstyrrelser, når embryoner har tilsluttet, er også vigtigt. Embryoner, der bliver stressede, vil begynde at trække deres synkrone fremskrivninger tilbage og begynde at apoptose. Det er også vigtigt at undgå at lade menisken af kulturmediet røre overfladen af fosteret, og for at minimere enhver olie i brøndene. Et af disse scenarier kan ødelægge embryonet.
Dyrkning af menneskelige embryoner ud over blastocyst fase er et område i hastig udvikling. En nylig undersøgelse13 viste, at en ny kultur system, der indeholder 10% af en ekstracellulær matrix protein blanding og et medium med yderligere tilskud af natriumpyruvat, laktat, og rho-associeret protein kinase (ROCK) hæmmer er fordelagtig i modellering i vivo 3D embryonale arkitekturer og gav betydeligt mere levedygtige embryoner på et senere tidspunkt i udvidet kultur i forhold til den udvidede kultur system beskrevet her. Det vil være nødvendigt at validere dette nye system for at påvise dets reproducerbarhed. Vi mener, at de procedurer, der er beskrevet her, kan tilpasses dette nye 3D-system med mindre ændringer og kan derfor gavne udviklingen i metodologien på dette område.
Denne protokol kan også tilpasses for at muliggøre undersøgelse af IVF kultur medier optimering. Vi har for nylig vist, at i mus, embryo udvikling i den udvidede kultur kan forudsige succes fostrets udvikling efter embryo overførsel18. Unormalt befrugtede og kasserede menneskelige zygotes med 3 pronuclei (PN) kan dyrkes til blastocysts på D5 under forskellige forhold, som derefter kan påvirke deres udvikling under udvidet kultur. Donerede D5-menneskelige blastocysts kan dyrkes i 48 timer under nye forhold, før de placeres i det udvidede kultursystem til evaluering af ydeevnen. Rutinemæssige målinger af epiblast cellenummer, samlede celletal, udvækst område, og hCG har gjort det muligt for vores laboratorium til bedre at forstå, hvordan forskellige kultur medieforhold bedre kan støtte menneskelige præ-implantation embryo udvikling og påvirke deres post-implantation succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende de mange patienter på Colorado Center for Reproduktiv Medicin (CCRM), der har allernådigst doneret deres embryoner til forskning. Vi vil også gerne takke Karen Maruniak og det kliniske laboratorium på CCRM for deres hjælp til behandling af hCG prøver, samt Sue McCormick og hendes kliniske IVF embryologi team på CCRM for deres hjælp med embryo indsamling, opbevaring, sporing og donation. Finansieringen blev ydet internt af CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
