Summary
Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.
Abstract
L'impianto umano, l'apposizione e l'adesione all'epitelia della superficie uterina e la successiva invasione della blastocisti nel decidua materno, è un evento biologico critico ma enigmatico che è stato storicamente difficile da studiare a causa di limitazioni tecniche ed etiche. L'impianto è iniziato dallo sviluppo del trophectoderm al trofoblasto precoce e dalla successiva differenziazione in sottolinea trofoblasto distinta. La differenziazione aberrante precoce del trofoblasto può portare a insufficienza di impianto, patologie placentiali, anomalie fetali e aborto spontaneo. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per consentire agli embrioni umani di crescere fino al giorno 13 dopo la fecondazione in vitro in assenza di tessuti materni, un periodo di tempo che comprende il periodo di impianto nell'uomo. Questo ha dato ai ricercatori l'opportunità di studiare l'impianto umano e ricapitolare le dinamiche della differenziazione trofoblasta durante questo periodo critico senza confondere le influenze materne ed evitare ostacoli intrinseci allo studio degli eventi di differenziazione precoce degli embrioni in vivo. Per caratterizzare diverse sottolinea trofoblastiche durante l'impianto, abbiamo adottato metodi di coltura estesi bidimensionali (2D) esistenti e sviluppato una procedura per digerire e isolare in modo esipetino e isolare diversi tipi di cellule trofoblaste per i test a valle. Gli embrioni se nessiti in condizioni 2D hanno una morfologia relativamente appiattita e possono essere non ottimali nella modellazione di architetture embrionali tridimensionali (3D) in vivo. Tuttavia, la differenziazione dei trofoblasti sembra essere meno influenzata, come dimostrato dai cambiamenti previsti della morfologia e dell'espressione genica nel corso della coltura estesa. Diverse sottolinea trofoblas, tra cui citotrophoblast, syncytiotrophoblast e trofoblast migratorio possono essere separati per dimensione, posizione e apparizione temporale, e utilizzati per ulteriore caratterizzazione o sperimentazione. L'analisi di queste cellule trofoblastiche precoci può essere determinante per comprendere l'impianto umano, nel trattamento di comuni patologie place-sina, e mitigare l'incidenza della perdita di gravidanza.
Introduction
L'impianto umano e l'emergere della placenta precoce sono storicamente difficili da indagare e rimangono in gran parte sconosciuti perché i tessuti umani sono inaccessibili in questa fase quando la gravidanza è clinicamente inosservabile. I modelli animali sono inadeguati, in quanto la placentation umana ha le sue caratteristiche uniche rispetto ad altri mammiferi eutermici. Ad esempio, la placenta umana invade profondamente il decidua con alcune cellule trofoblaste che raggiungono almeno il terzo interno del miometrio uterino mentre altre cellule rimodellano le arterie a spirale uterina. Anche i nostri antenati evoluzionari più vicini, i primati non umani, mostrano differenze nella morfologia placenuale e nelle interazioni trofoblastiche con i tessuti decidualimaterni 1,2,3. Ottenere embrioni umani pre-impiantamenti in vitro non è stato possibile fino agli anni '80, quando la fecondazione clinica in vitro umana (IVF) è iniziata come pratica di routine per il trattamento dell'infertilità4. Ora, le blastociti umane possono essere coltivate in vitro per consentire la selezione di embrioni più vitali per il trasferimento, oltre a consentire test genetici sicuri. Il miglioramento delle tecniche di coltura degli embrioni, nonché il crescente uso della fecondazione in vitro hanno prodotto molti blastocici in eccesso che rimangono dopo che i cicli di trattamento del paziente sono stati completati. Con il consenso del paziente, l'approvazione dell'IRB e, con alcune restrizioni, queste blastocici possono essere utilizzate per studi di ricerca. Sono diventati una risorsa inestimabile che sono stati utilizzati per la derivazione delle cellule staminali embrionaliumane 5, comprendendo la transizione della massa cellulare interna alle cellule staminali embrionali6,7, e più recentemente, sono state culturezzate con successo fino al giorno (D) 13 per rimodellare l'impianto umano8,9. Utilizzando approcci omici a singola cellula recentemente sviluppati, l'accesso a questi tessuti embrionali umani in fase di impianto ha offerto opportunità uniche per descrivere i meccanismi molecolari che regolano questo processo di differenziazione cellulare altamente dinamico, che in precedenza eranoimpossibili da esplorare 10,11,12,13.
Qui, descriviamo i metodi utilizzati nella nostra recente pubblicazione caratterizzando la dinamica della differenziazione trofoblasa durante l'impianto umano12. Questo protocollo include il riscaldamento delle blastocità vetrificate, la coltura embrionale estesa fino al D12 dopo la fecondazione in vitro, la digestione ezimatica dell'embrione in singole cellule e la raccolta di cellule per i test a valle (Figura 1). Questo sistema di coltura estesa supporta lo sviluppo dell'embrione umano in fase di peri-impianto senza input materno e ricapitola la differenziazione trofoblasto che appare coerente con le osservazioni fatte da campioni statologici molti anni fa14,15,16,17. Durante l'impianto, la popolazione trofoblasa è costituita da almeno due tipi di cellule: il citotrophoblast mononucleato simile a un progenitore (CTB) e il sintootropoblast (STB) differenziato terminalemente e multinucleato. Al momento della digestione della trypsina, il CTB sono piccole cellule rotonde che sono morfologicamente indistinguibili da altre linee cellulari (Figura 2A, pannello sinistro). La separazione del CTB da altre linee cellulari, come l'epiblast e l'endoderma primitivo, può essere ottenuta con i loro profili trascrittori distinti rivelati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Le cellule sincitiotrofoblast possono essere facilmente identificate come strutture di forma irregolare che sono significativamente più grandi rispetto agli altri tipi di cellule e si trovano principalmente alla periferia dell'embrione (Figura 2A, pannello centrale; Figura 2B, pannello sinistro). Le cellule trofoblaste migratorie (MTB) sono un'altra sottolinea trofoblasa trovata durante la coltura estesa degli embrioni e possono essere riconosciute come apparentemente allontanate dal corpo principale dell'embrione (Figura 2A, pannello a destra, Figura 2B, pannello destro). Il trofoblasto migratorio, pur esprimendo molti degli stessi marcatori del trofoblasto extra villous (EVT), non dovrebbe essere indicato come EVT, poiché le strutture villous nella placenta non sono emerse in questa fase molto precoce dello sviluppo.
Sperimentalmente, siamo stati in grado di raccogliere piccoli CTB e STB di grandi dimensioni che sono facilmente distinguibili dopo che gli embrioni sono stati digeriti in singole cellule a D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). I trofoblasti migratori si presentano nelle fasi successive della coltura embrionale estesa e possono essere raccolti al D12 prima della digestione ezimatica dell'intero embrione (Figura 2A,B). Separando fenotipicamente queste tre sottolinea trofoblaste prima dell'analisi a singola cellula, possiamo identificare specifici marcatori trascrizioniomici e definire il ruolo biologico di ogni tipo di cellula. I citotropoblasti sono altamente prolifertivi e agiscono come cellule progenitrici nella fornitura delle linee differenziate STB e MTB10,11,12,13. I syncytiotrophoblast sono coinvolti nella produzione di ormoni placental per mantenere la gravidanza e possono anche essere responsabili degli embrioni che scavano nell'endometrio10,11,12,13. Il trofoblasto migratorio ha caratteristiche ancora più forti di un fenotipo invasivo e migratorio e sono probabilmente responsabili di una colonizzazione più profonda e più estesa dell'endometriouterino 10,11,12,13. Dopo aver definito la firma trascrittimica di ogni tipo di cellula, le analisi di clustering hanno anche rivelato due sottoinsiemi aggiuntivi di cellule che erano morfologicamente indistinguibili da CTB e avevano trascrittimi con caratteristiche di STB e MTB,rispettivamente 12. Queste cellule dello stadio intermedio sono probabilmente nel processo di differenziazione da CTB alle sottolinea MTB o STB e sarebbero state trascurate se gli embrioni fossero stati digeriti ciecamente e le cellule fossero state separate solo dal trascrimama.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di coltura bidimensionale (2D) e potrebbe non essere ottimale per supportare lo sviluppo strutturale tridimensionale (3D), come suggerito da una recente pubblicazione che descrive un sistema di coltura 3Ddi recente sviluppo 13. Tuttavia, in questo sistema 2D la differenziazione del trofoblasto precoce sembra essere coerente con le osservazioni fatte da esemplari in vivo14,15,16,17. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per l'uso nel sistema di coltura 3D13 recentemente descritto con modifiche minime. Tutti i passaggi vengono eseguiti con una pipetta di micromanipolazione portatile con punte usa e getta disponibili in modo commerciale o una pipetta per bocca da una pipetta di vetro finemente tirata attaccata a tubi di gomma, un filtro e un boccaglio.
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Protocol
Tutti gli embrioni umani sono stati donati con il consenso per l'uso nella ricerca. I protocolli per la coltura estesa degli embrioni umani sono stati approvati dal Western Institutional Review Board (studio n. 1179872) e seguono le linee guida internazionali. Qualsiasi uso di embrioni umani deve essere riesaminato dagli organi etici e di governo competenti associati all'istituto di ricerca che utilizzano il presente protocollo.
1. Preparazione
- Preparare i supporti e le piastre di recupero un giorno prima del riscaldamento degli embrioni in una cappa sterile a flusso laminare.
- Preparare 2 mL di supporti di coltura blastocista (BM) con 10% v/v sostituto della proteina del siero (SPS).
NOTA: i mezzi di coltura di Blastoccyst possono contenere o meno proteine aggiunte. Qui, abbiamo usato un mezzo che deve essere integrato con il 10% della proteina albumina indicata. Controllare le indicazioni del produttore per la variazione in questo completamento. Tutti i supporti devono essere filtrati utilizzando un filtro sterile da 0,22 M attaccato a una siringa sterile prima dell'equilibrio. - Riempire due piatti di coltura dell'organo di centro-bene lavati con 500 L di BM con 10% v/v SPS ricoperti da 500 L di olio di qualità embrionale.
- In un piatto di coltura tissu/tessuto da 60 mm, strato 8 mL di olio di coltura embrionale e quindi ancorare 20 gocce di BM con 10% v/v SPS al fondo della piastra di coltura. Fare 1 goccia per ogni embrione riscaldato.
NOTA: Più supporti, gocce e lavare i piatti possono essere fatti in base alle esigenze. Le gocce possono anche essere aggiunte al piatto prima che l'olio sia strat layerato. Le gocce di ancoraggio sotto l'olio aiuteranno a ridurre l'evaporazione e qualsiasi cambiamento successivo nell'osmolalità. - Equilibrate BM con 10% v/v SPS lavare i piatti e piastra di recupero in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2 per almeno 4 h.
- Scongelare una fiala del primo passo dei mezzi di coltura estesa (IVC1) in 4 gradi centigradi o in panca.
- Preparare un piatto di lavaggio di 500 L di IVC1 senza sovrapposizioni di olio. Aliquot circa 4 mL di IVC1 in un tubo a scatto da 5 mL.
- Equilibrate IVC1 piatto di lavaggio e piccolo tubo a scatto di IVC1 in 37 gradi centigradi, 6% CO2 e atmosferico O2 per almeno 4 h.
- Preparare 2 mL di supporti di coltura blastocista (BM) con 10% v/v sostituto della proteina del siero (SPS).
- Preparare piastre di coltura estese un giorno prima del riscaldamento dell'embrione in una cappa sterile a flusso laminare.
- Diluire la fibronectina dal siero umano nella salina tamponata di fosfato (PBS) a 30 g/mL. Per rivestire le camere saranno necessari 250 lL di 30 g/mL fibronectina per embrione.
- Aprire il pacchetto 8 coperture ben camerate sotto il cofano, facendo attenzione a non toccare i pozzi. Pipetta delicatamente 250 L di 30 g/mL fibronectina in ogni pozzo.
- Riportare il coperchio al coperchio camerato e mettere in 4 gradi centigradi per 20-24 h.
- Preparare piastra di coltura estesa al mattino di riscaldamento embrionale.
- Recuperare il coperture camerato con fibronectin e posto in cappa di flusso laminare. Rimuovere la miscela di fibronectina con una pipetta da 1 mL e scartarlo nel contenitore dei rifiuti.
- Recuperare supporti IVC1 riscaldati ed equilibrati da un piccolo tubo a scatto a scatto da 5 mL.
- Pipette 300 L di IVC1 equilibrato in ogni pozzo. Fare attenzione a non lasciare che qualsiasi fluido tocchi il coperchio in quanto ciò aumenterà il rischio di contaminazione.
- Restituire il coperture camerate con IVC1 per incubare in 37 gradi centigradi, 6% CO2 e atmosferico O2 fino alla rimozione della zona pellucida nel passaggio 4.
2. Riscaldamento degli embrioni umani D5 vetrificati
NOTA: Altri produttori possono avere protocolli leggermente diversi a seconda della propria tecnologia di vitrificazione. Vedere le istruzioni del produttore per l'uso, se applicabile.
- Caldo 3,0 mL di soluzione di scongelamento (TS) in piatto da 35 mm a 37 gradi centigradi. Portare 300 L di soluzione di diluizione (DS) e due pozzetti da 300 L di soluzione di lavaggio (WS) in una piastra da 6 gradi a temperatura ambiente.
- Utilizzando le forcepi, rimuovere con attenzione il manicotto del dispositivo crio, assicurandosi che l'embrione vetrificato rimanga sempre sotto azoto liquido.
- Spostare rapidamente il dispositivo crio da azoto liquido e immergere la punta del dispositivo crio in TS a 37 gradi centigradi. Impostare un timer per 1 min e mantenere il dispositivo crioco immerso fino a quando l'embrione si stacca nel TS.
NOTA: embrioni caldi uno alla volta per tenere traccia delle identità degli embrioni in quanto possono essere correlati alle informazioni demografiche del paziente nell'analisi a valle. - Durante l'incubazione di 1 min in TS, rimuovere con attenzione il dispositivo di crio e raccogliere delicatamente l'embrione e spostarsi sul lato opposto del piatto TS.
NOTA: Se si curano più embrioni, essere diligenti nel tenere separati gli embrioni per garantire che le identità corrette siano mantenute. - Dopo 1 min, raccogliere delicatamente l'embrione con una piccola quantità di TS, circa 2 L. Spostare l'embrione sul fondo del pozzo DS 300 lL coprendo l'embrione in un sottile strato di TS dalla pipetta. Impostare un timer per 3 min e posizionare la piastra a 6 po 'sul panca a temperatura ambiente.
- Dopo 3 minuti, raccogliere l'embrione con una piccola quantità di DS, circa 2 L, e spostare l'embrione sul fondo del pozzo successivo contenente 300 L di WS. Ancora una volta, strato delicatamente una piccola quantità di DS dalla pipetta sopra l'embrione. Impostare un timer per 5 min e tornare alla panca.
- Dopo 5 minuti, raccogliere l'embrione con un volume minimo di WS e passare alla parte superiore del pozzo finale di 300 WS. L'embrione cadrà lentamente e lavare attraverso il WS verso il basso. Espellere qualsiasi WS trattenuto dalla pipetta in un pozzo vuoto.
- Raccogliere l'embrione con un volume minimo e tornare in cima allo stesso pozzo da 300 L di WS. L'embrione cadrà ancora una volta sul fondo del pozzo. Impostare un timer per 1 min e restituire il piatto 6-well alla panca.
3. Recupero di embrioni riscaldati
- Uno alla volta, spostare gli embrioni riscaldati in un piatto di tessuto d'organo di centro-pozzo contenente 500 L di BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto 500 L di olio di qualità equilibrata della coltura embrionale.
- Lavare gli embrioni raccogliendo ogni embrione e spostandoli in diverse aree del piatto mentre si esendo vecchi supporti tra le mosse. Raccogliere l'embrione e spostarlo in un singolo calo di 20 BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto l'olio.
- Lasciare che gli embrioni riscaldati si riprendano per 2 h in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 6% CO2, 5% O2.
4. Rimozione della zona
- Dopo un recupero di 2 h, valutare gli embrioni per la ri-espansione e scattare foto di ogni embrione.
- Spostare gli embrioni singolarmente in 500 L di un acido propanefono (MOPS)-acido propanesulfonico (MOPS) con il siero del polpaccio fetale (FCS) del 5% (v/v) prima del trattamento con la soluzione acida di Tyrode.
- Spostare rapidamente un embrione attraverso 300 L della soluzione di Tyrode acido riscaldato mentre si osserva attivamente attraverso il microscopio. La zona pellucida inizierà visivamente a dissolversi. Ci vorrà circa 5 s.
- Spostare immediatamente l'embrione con zona di dissoluzione in 300 L di MOPS riscaldato tamponato medio per placare la soluzione dell'acido Tyrode.
- Spostare l'embrione con un volume minimo di supporto tamponato MOPS in una teglia per tessuti di organi di pozzo centrale contenente 500 L di BM equilibrato con 10% v/v SPS sotto i 500 L di olio di coltura embrionale equilibrato da lavare.
- Riportare l'embrione alla goccia di recupero di 20 L dal punto 3.2.
NOTA: Al momento dell'esame visivo successivo alla rimozione della zona, tutti gli embrioni con zona pellucidae trattenuta possono essere ulteriormente trattati con la soluzione acida di Tyrode, se necessario, ripetendo i punti 4.2-4.6. Si desidera ridurre al minimo l'esposizione alla soluzione del Tyrode.
5. Cultura estesa di Blastoccyst
- Spostare gli embrioni singolarmente nel piatto di lavaggio con supporti IVC1 equilibrati dal punto 1.1.6. Spostare con attenzione un embrione in un pozzo del coperture camerate con IVC1 equilibrato e mantenere l'identificazione dell'embrione.
NOTA: Questo passaggio deve essere completato il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'evaporazione media. - Ritorno coperture camerate a un'incubatrice impostata su 37 gradi centigradi, 6% CO2, atmosferica O2 per 2 giorni.
NOTA: Assicurarsi di scongelare ed equilibrare i supporti in 37 gradi centigradi, 6% CO2, atmosferica O2 per lo scambio di supporti 4 h in anticipo. - Alla fine D2 (D7 post fecondazione), esaminare attentamente l'attaccamento degli embrioni al microscopio ed eseguire lo scambio di supporti.
- Si noti quale embrione è attaccato al piatto prima di scambiare i media. Toccare delicatamente la piastra ed esaminare se un embrione è collegato in modo sicuro alla piastra al microscopio.
- Rimuovere il coperchio e rimuovere con cura 150 L di IVC1 e scartare senza disturbare l'embrione allegato. Se un embrione non è ancora attaccato alla piastra, non scambiare i media, poiché il siero in IVC1 aiuterà nell'attaccamento dell'embrione.
- Pipette 150 L di supporti di coltura estesa equilibrati, IVC2, lentamente in ogni pozzo e restituire il coperchio al coperture camerate.
NOTA: Assicurarsi che la rimozione del coperchio dal coperchio camerato sia ridotta al minimo per evitare l'evaporazione media.
- Restituire con cura il coperchio camerato all'incubatrice senza spruzzare alcun supporto sul coperchio. Ripetere lo scambio di supporti e il controllo degli allegati ogni giorno di coltura estesa fino a quando gli embrioni sono pronti per la fissazione o la digestione a singola cellula.
6. Raccolta opzionale di supporti spesi
- Facoltativamente, raccogliere i media spesi durante lo scambio di supporti culturali dopo D7 o qualsiasi giorno successivo. Durante il punto 5.3.2, invece di scartare il fermo a scatto medio, il 150 L di IVC1 rimosso è stato rimosso in un tubo sterile di 0,5 mL a basso legame per un'analisi futura.
7. Fissazione opzionale per immunofluorescenza
- Utilizzare una pipetta da 200 L per lavare gli embrioni con 1/2 scambi di supporti di PBS per 3x prima della fissazione per rimuovere eventuali detriti extracellulari. Lavare via i detriti in eccesso e le proteine aiuterà a ottimizzare la chiarezza e ridurre lo sfondo nelle immagini ottenute con immunofluorescenza.
- Rimuovere tutti i supporti e aggiungere lentamente 200 L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS al pozzo. L'embrione vuole attaccarsi alla superficie del fluido. Più lavaggi da 150 L con 4% di PFA prima di rimuovere tutto il fluido aiuteranno a ridurre al minimo i danni all'embrione.
- Incubare gli embrioni in 4% PFA per 20 minuti per la fissazione.
- Lavare gli embrioni 3x per 10 min per lavaggio con 200 L dello 0,1% v/v polisorbate 20 in PBS fresco.
- Conservare gli embrioni fissi in polisorbitenti 20 v/v in PBS a 4 gradi centigradi prima di procedere con il protocollo di immunofluorescenza.
8. Digestione a singola cellula con trypsin
NOTA: Gli embrioni freschi (non fissi) vengono utilizzati per la digestione a singola cellula.
- Lavare l'embrione una volta con 200 L di PBS e aggiungere 200 L di soluzione di trypsina ad ogni pozzo. Restituire il coperture camerato all'incubatrice per 5 minuti.
- Rimuovere il coperture camerato dall'incubatrice ed esaminare gli embrioni sotto uno stereoscopio. Le cellule alla periferia dell'embrione inizieranno a ritrarsi e la MTB dovrebbe ancora essere attaccata alla piastra in cui si trovano a distanza dall'embrione.
- Utilizzare una piccola pipetta o una pipetta bocca finemente tirata per raccogliere singoli MTB prima di rompere l'intero embrione. Passare al passaggio 9.1 per salvare MTB e tornare al passaggio 8.4 dopo il passaggio 9.3.
- Utilizzare una pipetta di micromanipolazione portatile o una pipetta della bocca per dissociare delicatamente l'embrione aspirando su e giù.
- Le cellule inizieranno a dissociarsi dall'intero embrione. Continuare ad aspirare l'embrione delicatamente e ripetutamente utilizzando una punta di pipetta di diametro più piccolo o una pipetta della bocca fino a quando l'embrione non è stato incubato per un totale di 10 min in trypsin.
9. Selezione di celle singole e raccolta di campioni
- Con la metapsina minima, spostare le cellule dissociate attraverso tre gocce di lavaggio di 20 PBS di 20 L - 0,1% di polivinylpyrrolidone (PVP) sotto l'olio di coltura embrionale con la cura di non perdere alcuna cella.
- Dopo aver lavato le celle, utilizzare una pipetta di vetro finemente tirata per selezionare una cella. Pipettare con cura la singola cellula in un tubo sterile a basso legame di 0,2 mL con un volume minimo di PBS-0,1% PVP.
- Agganciare le singole celle in azoto liquido (LN2) e conservare in -80 gradi centigradi per un uso futuro.
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Representative Results
Gli embrioni sani hanno mostrato una proliferazione continua nel corso della coltura estesa (Figura 2B). Gli embrioni anomali cominciarono a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi (Figura 2C). Dalla nostra esperienza, circa il 75% degli embrioni è stato attaccato al fondo del piatto rivestito di fibronectina a 48 h e l'attaccamento è aumentato a circa il 90% da 72 h in coltura. Il successo dell'attaccamento degli embrioni può essere ampiamente influenzato dalla qualità iniziale dei blastocati. Gli embrioni non attaccati da 72 h probabilmente non sopravviveranno.
Al D8 post fecondazione (D3 di coltura estesa), la maggior parte delle cellule negli embrioni erano CTB che erano positivi per il marcatore trofoblasto GATA3 (Figura 3A). I citotropoblasti avevano già cominciato a differenziarsi in STB multinucleato alla periferia dell'embrione (Figura 2B, pannello sinistro, linea tratteggiata). Questi STB avevano un aspetto simile a un foglio e sono stati macchiati positivi per la beta della sottounità di gonadotropina coronica umana (hCGB; Figura 3A, pannello centrale). Gli embrioni sono cresciuti rapidamente, tra D8 e D10, suggerendo una rapida proliferazione cellulare di CTB durante questo periodo. A D10, la formazione di CGB positivo MTB era ad un massimo, che potrebbe essere confermato dalla recrudescenza della produzione di hCG in questo momento (Figura 3B). Anche i trofoblasti migratori cominciarono ad emergere e migrarono lontano dal corpo embrionale e furono macchiati positivi per il marcatore EVT, HLA-G (Figura 3A, pannello destro). Con D12, la differenziazione STB era in declino e la produzione di MTB divenne più prominente, suggerendo uno spostamento di enfasi dalla produzione di ormoni su D10 alla migrazione cellulare su D12. Questi cambiamenti sono stati osservati dal video time-lapse ottenuto durante questo periodo di peri-impianto (Film 1). I nostri dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula riflettevano anche tali cambiamenti dinamici nella funzione cellulare. Insieme, questi dati suggeriscono che la differenziazione precoce dei trofoblasti e l'emergere della placenta precoce è un processo dinamico, durante il quale l'embrione può dare priorità a funzioni cellulari altamente specializzate in punti di tempo molto specifici per ottenere un impianto di successo.
Figura 1: schema procedurale delle impostazioni cultura estese e della raccolta di campioni a cella singola.
Flusso di lavoro di riscaldamento degli embrioni vetrificati, rimozione della zona pellucida, coltura embrionale estesa, digestione ezimatica e isolamento del citotrophoblast (CTB), sincrotrofoblasta (STB) e trofoblasto migratorio (MTB). Questa cifra è stata modificata da West et al.12. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Morfologie di cellule e embrioni trofoblasti durante la coltura estesa.
(A) Immagini rappresentative di diversi tipi di cellule trofoblaste dopo la digestione ezimatica con la trypsina. Piccolo CTB a sinistra, grande STB al centro e MTB a destra. (B) Immagini rappresentative di embrioni sani a D8 (sinistra), D10 (al centro) e D12 (a destra). Linee tratteggiate nel contorno del pannello sinistro presumibilmente proliferative CTB popolazione mentre linea tratteggiata delinea la STB appiattito. Cerchi rosa nel pannello destro delineano MTB che sono stati individuati a distanza dall'embrione. (C) Immagini rappresentative di embrioni anomali che iniziano a ritrarsi e disintegrarsi a D8 (sinistra), D10 (al centro) e D12 (a destra). Barre di scala: 200 m. Alcune immagini sono state adattate da West etal. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative dell'espressione del marcatore trofoblasto e della produzione hCG durante la coltura estesa.
(A) Immagini rappresentative di immunofluorescenza degli embrioni che mostrano l'espressione di un marcatore CTB GATA3 a D10 (a sinistra), marcatore STB CGB a D10 (al centro) e marcatore MTB HLA-G a D12 (a destra). Scale bars ( B ) RappresentantehCGconcentrazione (mIU/mL) nel corso di coltura estesa da D8 a D12 (media SEM, n - 3). L'analisi statistica è stata eseguita con One-Way ANOVA seguito dal test di Tukey (P < 0.05). Queste immagini sono state adattate da West etal. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato 1: Video time-lapse di un embrione umano in coltura estesa da D8 a D12. Il video mostra il collasso del blastocoel, la formazione della STB (indicata dai cerchi verdi), e poi l'eventuale differenziazione e migrazione di MTB (indicata dai cerchi arancioni). Questo è stato adattato da West et al.12. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Lo sviluppo del protocollo per la coltura degli embrioni umani attraverso l'impianto ha permesso agli scienziati di esplorare un tempo precedentemente inesplorate nellosviluppo 8,9. Qui, usiamo un sistema di coltura esteso per colturare gli embrioni umani e studiare la differenziazione trofoblasto precoce prima della formazione della placenta villous. I metodi descritti qui ci permettono di raccogliere diverse sottolinea TB da utilizzare nell'analisi a cella singola a valle. Questo lavoro permette alla comunità scientifica di comprendere questo periodo critico ed enigmatico nello sviluppo umano, e può aprire nuove opportunità per trattamenti terapeutici per aborto spontaneo o altre patologie placenazionali come la pre-eclampsia, oltre a fornire nuove intuizioni sullo sviluppo umano precoce.
Questo protocollo richiede competenze nella manipolazione rapida degli embrioni durante il riscaldamento degli embrioni, la rimozione delle zone e la placcatura per ridurre al minimo lo stress embrionale prima della coltura estesa. È essenziale ridurre al minimo l'evaporazione dei supporti e quindi un aumento dell'osmolalità media limitando il tempo di esposizione durante lo scambio dei media. Fare attenzione a utilizzare una tecnica asettica adeguata quando si scambiano piatti medi e in movimento aiuterà a ridurre al minimo la contaminazione. Anche la stabilizzazione del piatto quando è in uso per ridurre al minimo qualsiasi disturbo meccanico una volta che gli embrioni si sono attaccati è importante. Gli embrioni che diventano stressati inizieranno ad allontanare le loro proiezioni si sincronizzali e inizieranno ad apoptose. È inoltre fondamentale evitare di permettere al menisco dei mezzi di coltura di toccare la superficie dell'embrione e di ridurre al minimo l'olio nei pozzi. Uno di questi scenari può distruggere l'embrione.
La tastiva degli embrioni umani oltre lo stadio della blastocisti è un campo in rapida evoluzione. Un recente studio13 ha dimostrato che un nuovo sistema di coltura che contiene il 10% di una miscela di proteine a matrice extracellulare e un mezzo con completamento aggiuntivo di piruvato di sodio, lattato e inibitore della proteina associata rho (ROCK) è vantaggioso nella modellazione in vivo di architetture embrionali 3D e ha prodotto embrioni significativamente più vitali nella fase successiva della coltura estesa rispetto al sistema di coltura estesa descritto qui. Sarà necessaria la convalida di questo nuovo sistema per dimostrare la sua riproducibilità. Riteniamo che le procedure qui descritte possano essere adattate a questo nuovo sistema 3D con piccole modifiche e possono, pertanto, avvantaggiare l'avanzamento della metodologia in questo campo.
Questo protocollo può anche essere adattato per consentire l'analisi dell'ottimizzazione dei supporti di coltura DELLA fecondazione in vitro. Recentemente abbiamo dimostrato che nel topo, lo sviluppo di embrioni durante la coltura estesa può prevedere il successo dello sviluppo fetale dopo il trasferimento dell'embrione18. Gli zigoti umani anormalmente fecondati e scartati con 3 pronuclei (PN) possono essere ricolmati in blastocisti su D5 in diverse condizioni che possono quindi influenzare il loro sviluppo durante la cultura estesa. I blastocatisti umani D5 donati possono essere sevati per 48 h in nuove condizioni prima di essere inseriti nel sistema di coltura esteso per la valutazione delle prestazioni. Misurazioni di routine del numero di cellule epiblast, numero totale di cellule, area di crescita e hCG hanno permesso al nostro laboratorio di comprendere meglio come le diverse condizioni dei media di coltura possano sostenere meglio lo sviluppo dell'embrione pre-impianto umano e influenzare il loro successo post-impianto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere i molti pazienti del Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) che hanno gentilmente donato i loro embrioni per la ricerca. Vorremmo anche ringraziare Karen Maruniak e il laboratorio clinico di CCRM per il loro aiuto nell'elaborazione di campioni di hCG, così come Sue McCormick e il suo team clinico di embriologia in fecondazione in vitro presso CCRM per il loro aiuto nella raccolta, stoccaggio, monitoraggio e donazione degli embrioni. Il finanziamento è stato fornito internamente da CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
