Summary
РНК-интерференция является широко применимым, мощным методом манипулирования экспрессией генов на конкретных стадиях развития. Здесь мы описываем необходимые шаги для реализации этой техники в водном дайвинге жука Thermonectus marmoratus, от приобретения последовательностей генов до нокдауна генов, которые влияют на структуру или поведение.
Abstract
РНК-интерференция (РНК) остается мощным методом, позволяющим целенаправленное снижение экспрессии генов за счет деградации мРНК. Этот метод применим к широкому кругу организмов и является высокоэффективным в богатом видами порядке Coleoptera (жуки). Здесь мы обобщаем необходимые шаги для развития этой техники в новом организме и иллюстрируем ее применение на различных стадиях развития водного водолазного жука Thermonectus marmoratus. Целевые последовательности генов могут быть получены экономически эффективно через сборку транскриптомов против близкого родственника с известной геномикой или de novo. Кандидат клонирования гена использует специфический вектор клонирования (pCR4-TOPO плазмиды), которая позволяет синтез двухцепочечную РНК (dsRNA) для любого гена с использованием одного общего грунта. Синтезированная дстрНК может быть введена в эмбрионы для ранних процессов развития или личинок для последующих процессов развития. Затем мы иллюстрируем, как РНК можно вводить в водные личинки с помощью иммобилизации в агарозе. Чтобы продемонстрировать технику, мы привносим несколько примеров экспериментов РНК, генерирующих конкретные нокдауны с прогнозируемыми фенотипами. В частности, РНК для загара гена laccase2 приводит к кутикуле осветления в личинках и взрослых, и РНК для глаз пигментации гена белый производит осветление / отсутствие пигментации в глазных трубках. Кроме того, нокдаун белка ключевого объектива приводит к личинкам с оптическими недостатками и снижением способности охотиться на добычу. В совокупности эти результаты иллюстрируют силу РНК как инструмента для исследования как морфологических узоров, так и поведенческих признаков в организмах только с транскриптомными базами данных.
Introduction
Вопрос о том, как конкретные гены способствуют эволюции различных черт является захватывающей темой в биологии. За последние несколько десятилетий, большой прогресс был достигнут в отношении вскрытия генетических основ процессов развития в нескольких модельных организмов, таких как нематод Caenorhabditis elegans, плодовая муха Drosophila melanogaster, и дом мыши Mus musculus1. Совсем недавно изобретение мощных методов редактирования генов, таких как регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR)/Cas92, дало возможность изменять генетический код немодельных организмов (например,см. 3,4). В результате, наблюдается всплеск генетических исследований на различных организмах, которые ранее не подходили с помощью молекулярных методов. Учитывая огромное разнообразие нашего животного царства, со многими интересными чертами или различиями черт, которые представлены только в конкретных видах, этот прогресс сделал его захватывающим временем для эволюционно-развития биологии ("Эво-дево"), связанных работ. Тем не менее, методы редактирования генома, которые доступны для немодельных организмов, относительно ограничены в отношении временных точек развития, к которым они могут быть применены, что затрудняет распознавание временных свойств, связанных с ролью, которую играют конкретные гены в любой черте. Кроме того, трансгенные методы часто ограничиваются генами, которые несущественны для выживания (т.е., чей нокаут не приводит к летальности). Поэтому, в то время как методы редактирования генов начали становиться популярными, по-прежнему существует необходимость в эффективных методах, которые применимы к различным организмам в конкретных точках времени развития и облегчают частичные нокдауны (а не полную потерю функции). Здесь мы обращаем внимание на РНК-интерференции (RNAi), несколько от еще мощный ген нокдаун техники5, что особенно ценно как синергетический подход к редактированию генов. В частности, мы разработали процедуры, которые позволяют применять РНК для водных водолазных жуков в качестве примера, который иллюстрирует внедрение этого метода, от приобретения необходимых молекулярных последовательностей до успешного введения двуцепоченной РНК (dsRNA) в яйца и личинки.
РНК-ген нокдаун использует врожденный защитный механизм организмов, в котором молекулы dsRNA облегчают замалчивание вторжения нуклеиновой кислоты последовательностей, таких как вирусы и транспозоны6. Короче говоря, dsRNA берется в клетку, где она разрезается на 20-25 нуклеотидных частей фермента Dicer. Эти части затем активировать формирование РНК-индуцированного глушительного комплекса (RISC), который подавляет целевых мРНК путем связывания с ним на конкретных участках с помощью направляющей нити. Этот процесс в конечном счете приводит к деградации мРНК и, следовательно, препятствует переводу мРНК в соответствующий белок6. Рнк основе гена нокдаун метод, представленный здесь поэтому опирается на инъекцию dsRNA. Для моделей животных, этот метод был первоначально разработан в C. elegans7 и D. melanogaster8, но с тех пор стал мощным функциональным генетическим инструментом в немоделянных организмов9,10. Благодаря своей высокоэффективной природе у некоторых насекомых, РНК может быть даже применен в борьбе с вредителями11.
В качестве исследовательского инструмента, РНК был использован для изучения того, как ключевые молекулярно-развития пути функции в нетрадиционных моделей насекомых. Например, РНК в муке жука Tribolium castaneum сыграл важную роль в определении того, насколько глубоко сохранены гены способствуют конкретные черты в том, что жук, как свидетельствует о развитии специально сформированных крыльев12,13,14 и глаза15,16. Методы, лежащие в основе манипуляций в T. castaneum были хорошо описаны17 и полагаться на способность обездвиживать относительно сухие яйца и личинки на липкой поверхности. Такая иммобилизация, однако, не представляется возможным для влажного развития форм водных организмов, таких как Sunburst Дайвинг жук Thermonectus marmoratus. Как и в случае многих нетрадиционных модельных организмов, ему не хватает аннотированного генома. Для манипулирования экспрессией генов в любом организме без генома, разумным и экономически эффективным первым шагом является создание транскриптомов и выявление ставить нуклеотидных последовательностей выраженных генов, представляющих интерес на основе последовательности сходства с родственными, но более установленных модельных организмов, в данном случае, в первую очередь триболий (Coleoptera) и дрозофилы генов.
Здесь, чтобы продемонстрировать, как РНК могут быть использованы на водном организме, мы сначала обсудим протоколы и программное обеспечение для извлечения РНК и транскрипции генерации и сборки, которые позволяют для идентификации конкретных целевых последовательностей генов. Затем мы обобщаем необходимые шаги для синтеза генно-специфической dsRNA. Впоследствии мы иллюстрируем, как яйца могут быть введены в водной среде и продемонстрировать инкубационные протоколы для культивирования развивающихся эмбрионов. Кроме того, мы показываем, как гель агарозы может быть использован для полного обездвиживания личинок во время процесса инъекции, техника, которая, как правило, полезна во время различных процедур и может быть применена к различным членистоногих. Чтобы продемонстрировать, как РНК могут быть применены к различным стадиям развития, мы включаем пример, в котором мы замолчали гена пигментации глаз белый в эмбрионах. Кроме того, мы описываем пример, в котором загар гена laccase2(lac2) был замолчать во время как второй личинки instar (чтобы повлиять на личинки третьего личинки instar) и третий личинки instar (чтобы повлиять на взрослых). Наконец, мы демонстрируем, что инъекция более низкой концентрации dsRNA приводит к частичному нокдауну, который показывает, что этот метод также может быть применен к генам, где потеря функции, как известно, смертельна.
Protocol
1. ИЗОЛЯЦИя РНК и сборка транскриптома de novo
- Выполните полную изоляцию РНК от поздней стадии третьего instar дайвинг жука личиночных глазных трубок и взрослых жуков с помощью набора изоляции РНК (см. Таблица материалов), который предназначен для липидов богатых тканей. Изолировать общую РНК от T. marmoratus и последовательность его следующие ранее описанные методы18.
- Де Ново транскриптомная сборка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сборки транскриптома де Ново, различные платформы биоинформатики могут быть использованы (см. Таблицу материалов). Эти платформы доступны на коммерческой основе и в некоторых случаях существуют как скрипты командных строк на базе Unix. Так как сборка de novo, рекомендуется самостоятельно собирать транскриптомы на двух платформах и сравнивать результаты, чтобы исключить ложные срабатывания или ложные негативы.- Чтобы начать сборку транскриптомов, загрузите необработанные считывания на соответствующую платформу биоинформатики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти файлы, как правило, сжаты и в формате FAST-SANGER. Gz. Нет необходимости декомпрессировать файлы, поскольку этот формат принимается на следующем этапе. - Используя командную строку Trimmomatic, обрежьте необработанные считывая, чтобы удалить последовательности адаптеров или короткие считывая, которые опускаются ниже порога по умолчанию. Декомпрессия обрезанные сырые читает; теперь файлы будут находиться в формате FAST. Конкатенате сырое считывает для каждого образца для получения файлов, готовых к сборке de novo.
- Соберите конпатированный сырой читает de novo с помощью любого сценария командной строки, который может собирать транскриптомы de novo. Сохранить собранный транскриптом, который теперь будет иметь список contigs с их соответствующими последовательностями, как файл FASTA. Для увеличения охвата сборки, объединить и собрать несколько транскриптомов для одного и того же вида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс увеличивает шансы генерации более точных contigs и особенно важно, если низкий номер копии генов представляют интерес. - После сборки, оценить транскриптом для полноты путем расчета оценки покрытия (программное обеспечение оценки покрытия находится в свободном доступе, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Транскриптом с охватом оценка Однако актуальность этого показателя зависит от причины генерации транскриптомов. Например, если транскриптом используется для выявления генов с низким числом копий, то оценка , 85% лучше, так как это означает больший охват. - Аннотация де Ново собранный транскриптом с помощью основного локального инструмента поиска выравнивания (BLAST; см. Таблица Материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента, транскриптом был аннотирован в первую очередь против базы данных известных белков Drosophila и базы данных известных белков жука. Список аннотаций можно загрузить в виде файла электронной таблицы, а контиги, указывающие на сходство последовательности с белками других организмов, можно загрузить как файл FASTA. - Определите число/число нотыга интересующего белка и извлекайте нуклеотидные последовательности. Используйте BLAST, чтобы определить, присутствуют ли в аннотированной нуклеотидной последовательности белковых регионов (таких как домены гомеобокса). Проверьте другие контиги с той же аннотацией для нуклеотидных перекрытий последовательности для создания последовательности ген-специфической стенограммы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выявление контигов с перекрытием последовательности обычно невозможно для всех генов, особенно для генов с низким числом копий. - Если необходима полнометражная последовательность гена, начните с контига, который имеет самую высокую последовательность сходства в качестве точки инициации для определения нуклеотидной последовательности всей зрелой стенограммы с использованием таких методов, как 3 "и 5" быстрое усиление кДНК заканчивается (RACE19).
- Аннотация сборки, полученной со второй платформы, следующими шагами 1.2.4-1.2.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, результаты должны быть одинаковыми для белков, представляющих интерес; однако охват может в некоторой степени отличаться между платформами. - Используйте собранный транскриптом для синтеза видов-специфических dsRNA, как указано в разделе 2.
- Чтобы начать сборку транскриптомов, загрузите необработанные считывания на соответствующую платформу биоинформатики.
2. Клонирование и генно-специфический синтез дстрНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Ген-специфическое клонирование и синтез DsRNA были подробно описаны для T. castaneum20,21,22. Следующие шаги представляют собой краткий обзор.
- Клонирование, бактериальная трансформация и плазмидная секвенирование
- Изолировать полную РНК от организма (как описано в шаге 1.1) и создать дополнительную ДНК (cDNA) с помощью набора обратной транскрипции (см. Таблицу Материалов). Определите одну или две последовательности нуклеотида 100-1000 bp из контигов, которые специфичны для генов, представляющих интерес.
- Дизайн праймер пары, охватывающие весь выявленный участок нуклеотидов и усилить последовательность через полимеразной цепной реакции (PCR). Добавьте дополнительный 30-минутный шаг в конце, чтобы создать 3 "адениновые свесы в усиленном продукте ДНК. Очистите этот продукт с помощью комплекта очистки ПЦР (см. Таблицу Материалов).
- Клонировать очищенный продукт в вектор плазмиды pCR4-TOPO (см. Таблицу материалов)в соответствии с протоколом поставщика, предоставленным комплектом клонирования. Использование тепло-шоковой обработки трансформирует клонированные плазмиды в компетентные бактериальные клетки (напряжение: E.coli DH10B) в соответствии с протоколом поставщика для компетентных клеток (см. Таблицу материалов),и экран для успешно преобразованных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты с колониями можно завернуть в парафиновую пленку для удержания влаги и хранить при 4 градусах Цельсия до одного месяца. - Выберите колонии преобразованных клеток с помощью наконечника пипетки 10 мл и культуры в бульоне лисогени (LB), содержащем ампициллин (50 мкг/мл) в шейкер-инкубаторе при 37 градусах и 200 об/мин на 24 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения, культивируемые клетки могут быть разбавлены 1:1 со 100% глицерол и заморожены при -80 градусов по Цельсию, как глицерол запасов. - Изолировать плазмиды, содержащие ген, представляющий интерес от этой культуры, используя комплект изоляции miniprep (см. Таблицу Материалов). Храните изолированные плазмиды (минипрепы) при -20 градусов по Цельсию после оценки урожайности спектротометрически. В частности, измерьте абсорбции образца на 260 нм, 280 нм и 230 нм. Рассчитайте соотношения A260/A280 для количественной оценки ДНК и A260/A230 для количественной оценки чистоты ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение 260/280 1,8, как правило, считается достаточно чистой ДНК, коэффициенты ниже 1,5 указывают на наличие остаточного реагента экстракции, таких как фенол. Соотношение 260/230 должно быть больше или равно соотношению 260/280. Более низкие коэффициенты указывают на остаточное загрязнение реагентами. Урожайность обычно колеблется от 100 до 500 нг/л. - Последовательность изолированных minipreps, чтобы подтвердить, что ген-специфический фрагмент был успешно интегрирован, будучи в окружении между 5 "T7 и 3" T3 промоутер регионов в плазмиде; это может быть сделано с помощью универсальных T7 и T3 секвенированиягрунтовки 22. Используйте минипрепы с последовательностью, относящейся к генно-специфической для подготовки dsRNA.
- Изолировать полную РНК от организма (как описано в шаге 1.1) и создать дополнительную ДНК (cDNA) с помощью набора обратной транскрипции (см. Таблицу Материалов). Определите одну или две последовательности нуклеотида 100-1000 bp из контигов, которые специфичны для генов, представляющих интерес.
- Усиление ПЦР и синтез дзрпорной дзрХР
- Усиление ПЦР и очистка продукции
- Дизайн плазмид-специфических или ген-специфических грунтовок, которые имеют последовательность T7 промоутер на их 5 'стороны (см. ссылку22 для деталей), чтобы усилить линейный фрагмент вставленного гена. Оптимизация урожайности путем настройки не менее 10 реакций по 20 мл каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный продукт окружен двумя полимеразными участками полимеразы 20 bp T7. - Очистите продукт PCR с помощью комплекта очистки продукта PCR (см. Таблицу материалов),следуя протоколу elution на основе колонки поставщика. Чтобы увеличить урожайность, повторите окончательный шаг elution до 3 раз с тем же eluent. Оцените урожайность спектрофотометрически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Урожайность обычно колеблется от 100 до 700 нг/л. Этот очищенный продукт может храниться при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
- Дизайн плазмид-специфических или ген-специфических грунтовок, которые имеют последовательность T7 промоутер на их 5 'стороны (см. ссылку22 для деталей), чтобы усилить линейный фрагмент вставленного гена. Оптимизация урожайности путем настройки не менее 10 реакций по 20 мл каждая.
- Синтез и очистка дструнк в пробирке
- Используйте генно-специфический продукт ПЦР для синтеза dsRNA in vitro в соответствии с протоколом набора синтеза dsRNA выбора. При необходимости продлите время инкубации для увеличения производства dsRNA.
- Оцените прогрессирование реакции на основе непрозрачности реакционой смеси (чем больше количество дстрянк-продукта, тем выше мутность). В конце инкубации, остановить реакцию с помощью лечения DNase. Для этого добавьте 1 мл из запаса 2 U/ хл, к реакции смеси. Продлите это лечение до 1-2 ч, чтобы обеспечить оптимальную деградацию ДНК шаблона.
- Очистите dsRNA с комплектом очистки или через следующие шаги.
- Разбавить полученный продукт 115 мл нуклеазной воды и добавьте 15 мл 3 М ацетата натрия. Добавьте 2 тома ледяного 100% этанола в эту реакциочную смесь и осаждать дструнк на ночь при температуре -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент образцы могут храниться безопасно, не влияя на конечный урожай. - Центрифуга осадок при 0 градусов по Цельсию в течение 20 минут при 9000 х г и отбросить супернатант. Вымойте продукт один раз с ледяной 70% этанола и центрифуги в течение 15 мин при 13000 х г.
- Удалите супернатант и высушите воздух гранулы в течение 5-15 мин. Резаспендировал гранулы до 40 мл воды без нуклеазы (этот объем можно скорректировать на основе изолированного размера гранул) и оценить урожайность и чистоту спектрофотометрически, как описано в 2.1.4.
- Храните очищенную dsRNA при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. Используйте очищенную dsRNA для инъекций на желаемой стадии развития.
- Разбавить полученный продукт 115 мл нуклеазной воды и добавьте 15 мл 3 М ацетата натрия. Добавьте 2 тома ледяного 100% этанола в эту реакциочную смесь и осаждать дструнк на ночь при температуре -20 градусов по Цельсию.
- Усиление ПЦР и очистка продукции
3. Сбор и подготовка эмбрионов Т. Мармората ранней стадии для инъекций дстрНК
- Подготовьте пластину агарозы для инкубации эмбрионов T. marmoratus.
- Сначала растворите 20 мг низкоплавяющейся порошок агарозы в 100 мл автоклаведированной дистиллированной воды (2% агарозы), а затем варите эту смесь в микроволновой печи до получения четкого раствора. Позаботьтесь с горячим раствором, так как пузырьки воздуха могут привести к его переполнению.
- Распределите это решение в небольшую чашку Петри. Чтобы сделать канавки (которые будут держать эмбрионы) на поверхности пластины агарозы, поместите три 1-2 мм шириной пластиковых труб (таких как кончики пластиковых трубчатых передач) на поверхности жидкой агарозы, прежде чем она затвердеет.
- Как только агарозы затвердевает, используйте пару тупых щипцов, чтобы удалить эти трубки. Добавьте 500 мл автоклаведированной дистиллированной воды с помощью микропивта P1000 для покрытия этих отступов в агарозе.
- Используя тонкую натуральную волосяную кисть, соберите эмбрионы T. marmoratus, которые 5-8 ч лет от места гнездования жука в стеклянной полости блюдо заполнены автоклаведомной дистиллированной водой. Мониторинг места гнездования часто, чтобы гарантировать, что полученные яйца имеют надлежащий возраст.
- Дечорионат эмбрионов под стереомикроскоп с использованием тонкого щипцов вскрытия. Для этого визуализируйте хорион под микроскопом (при желаемом увеличении), позиционируя источник света под соответствующим углом, затем хватай хорион с двух сторон острыми щипцами, рву его открытым и аккуратно выскользнивайте эмбрион. Поскольку существует два слоя, убедитесь, что оба удаляются.
- Используя тонкую натуральную волосяную кисть, тщательно перенесите эмбрионы из стеклянной полости в тарелку агарозы и расположите их в канавках под стереомикроскопом. Позаботьтесь о том, что в ходе этого процесса они находятся в очень хрупком процессе, так как дехорионированные эмбрионы очень хрупкие. Используйте подготовленные эмбрионы для инъекций дстрНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немного толще конец стороне эмбриона, в котором голова будет развиваться.
4. микроинкекционы dsRNA на ранней стадии эмбрионов T. marmoratus
- Чтобы ввести эмбрионы ранней стадии с генной специфической dsRNA, подготовить микроинъекционные иглы с помощью микроинъекционной иглы шкив (см. Таблицу материалов). При визуализации наконечника иглы под стереомикроскопом, используйте пару тонких щипцов, чтобы сломать кончик иглы, создавая острый край. В идеале, разорвать кончик иглы по диагонали так, что острее края остается на одной стороне, что позволит ему войти в эмбрион, вызывая минимальные травмы.
- Оттепель очищенный запас dsRNA раствор на льду, добавить 1 л из 10x буфера инъекции и довершение его с двойной дистиллированной воды, чтобы сделать 10 МЛ раствора инъекции. Для инъекций, концентрация dsRNA 1 мкг/Л обычно подходит, но может быть скорректирована в соответствии с фенотипической тяжести результирующего животных).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 1 мл 10x буфера инъекции22, добавив 10 мл 0,1 М фосфата натрия (сделано путем смешивания 8,5 мл 1 M Na2HPO4 и 1,5 мл 1 M NaH2PO4 скорректирована до рН 7,6 при 25 градусов по Цельсию с 100 мл 0,5 М ККл), 100 мл пищевого красителя и 790 мл двойной дистиллированной воды.- Используя пипетки P10, заполните иглу микроинъекционной с работающим раствором dsRNA. После того, как раствор заполнил кончик иглы, прикрепите его к держатель микроиглы, подключенный к системе микроинъекционного процесса, использующую технологию выброса давления (см. таблицу материалов).
- Включите систему микроинъекционной системы и подачу воздуха под давлением. Используя микровалент на системе микроинъекционной системы, отрегулируйте давление впрыска до 15 пси. Отрегулируйте продолжительность впрыска с помощью ручки регулировки времени (установите ее на "Seconds").
- Так как продолжительность инъекции зависит от требуемого объема инъекций, при необходимости отрегулируйте этот параметр на системе микроинъекционной перед каждой инъекцией. Используйте объем инъекций 1-2 nL для эмбрионов Т. Мармората на ранней стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие объемы инъекций, как правило, мешают выживаемости эмбрионов.
- Так как продолжительность инъекции зависит от требуемого объема инъекций, при необходимости отрегулируйте этот параметр на системе микроинъекционной перед каждой инъекцией. Используйте объем инъекций 1-2 nL для эмбрионов Т. Мармората на ранней стадии.
- Для измерения объема инъекционной жидкости, которая распределяется по системе микроинъекционной системы, калибруйте иглу инъекции, оценивая объем пузыря жидкости, который образуется на кончике иглы при инъекциях в воздух. Для эмбрионов T. marmoratus используйте оптимальный размер пузыря размером 100–200 мкм. Инъекционная игла хорошего качества, если это может быть достигнуто на 15 пси с продолжительностью инъекций 3 с.
- Выровняйте иглу и пластину агарозы, содержащую эмбрионы под стереомикроскопом, таким образом, что игла приближается к эмбрионам под углом между 45 и 60 градусами.
- Используя микроманипулятор, медленно перемещайте микроиглы, отслеживая прогресс через стереомикроскоп. После того, как кончик иглы касается поверхности эмбриона, осторожно двигайте иглу вперед, пока она не пронзает поверхность эмбриона. Не перфорировать эмбрион глубоко кончиком иглы, так как это может повлиять на выживание эмбриона. Чтобы уменьшить изменчивость, доставить инъекцию в середине эмбриона.
- Как только игла находится внутри эмбриона, осторожно нажмите кнопку инъекций микро-инжектора, чтобы доставить дозу дстрНК в эмбрион. После введения 1-2 nL dsRNA, медленно втягивайте иглу из эмбриона, так что это не вызывает разрыв эмбриона.
- Вводить другие эмбрионы аналогичным образом. Если микроинъекционная игла блокируется во время процедуры, разблокируйте ее, увеличивая давление и продолжительность инъекций. Визуально идентифицируют успешно вводимые эмбрионы наличием цветного пятна в месте инъекции (так как буфер инъекций содержит пищевую окраску).
- Аккуратно поместите блюдо с впрыском эмбрионами в камеру влажности.
- Чтобы построить такую камеру, возьмите любую пластиковую коробку с крышкой, стерилизуйте ее 70% этанолом, дайте ей высохнуть и поместите ткань, пропитанную автоматической водой, на дно, чтобы обеспечить влажную окружающую среду. Поместите эту камеру влажности в инкубатор с соответствующей температурой (в данном случае, 25 градусов по Цельсию) и легким циклом 14 ч света и 10 ч темной.
- Разрешить инъекционные эмбрионы развиваться в первые личинки звезды, которая требует 4-5 дней. Мониторинг хода развития эмбриона ежедневно с помощью стереомикроскопа для выявления морфологически видимых нокдаун фенотипов, как показано на рисунке 2.
- Документируйте этот прогресс, принимая цифровые изображения с помощью камеры высокого разрешения. Удалить мертвые эмбрионы и пополнить воду на пластине агарозы ежедневно, чтобы избежать высыхания и возможного распространения микробного загрязнения на другие выжившие эмбрионы в инкубационный период.
- Выполните соответствующие элементы управления для инъекций dsRNA, включая инъекции буфера, инъекции dsRNA синтезированные против нити чувства гена интереса, и инъекции dsRNA синтезированных против последовательностей, которые не существуют в организме-мишени. Подтвердите нокдаун RNAi с помощью дополнительных молекулярных методов22.
5. Приготовление личинок T. marmoratus для инъекций дстрНК
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от эмбрионов ранней стадии, личинки T. marmoratus относительно прочны и могут быть введены с большими объемами. Например, второй instars может быть введена с до 2 л DSRNA рабочего решения и третий instars, по крайней мере 3 МЛ без заметных негативных последствий для выживаемости. Для введения dsRNA, полезно обездвижить личинок путем встраивания их в агарозу.
- Перед сбором личинок, растопить 2% агарозы и держать его в водяной бане при 60-70 градусов по Цельсию, чтобы сохранить его в жидком виде. Подготовка иммобилизации блюдо путем заливки расплавленной 2% агарозы в небольшой чашке Петри, а затем охлаждения до затвердевания. Используйте тупые щипцы, чтобы сделать неглубокий паз в пластине агарозы (примерно размер членистоногих, чтобы быть встроенным) для каждого животного, которое будет введено.
- Собирайте молодых личинок на соответствующем этапе развития (один этап до стадии, желаемой для анализа). Для этого осторожно слейте воду из культурных чашек, содержащих личинки, и следуйте следующим шагам, упомянутым ниже.
- Анестезировать на льду (тщательно выберите личинку из стакана воды и аккуратно поместите ее на лед) до тех пор, пока личинка не покажет никаких заметных движений. Используйте тупые, мягкие щипцы, чтобы тщательно поднять личинку со льда и поместить его на этапе иммобилизации с его шеей и телом в паз, но хвост расположен над поверхностью агарозы, так что он не будет покрыт, что позволяет личинке продолжать дышать через его хвостовой spiracles.
- Обложка личинки с толстым слоем агарозы, которая по-прежнему жидкости, но не опасно жарко. Если он был случайно покрыт, используйте щипцы, чтобы освободить хвост и два сегмента под ним от агарозы. Как только агароза затвердевает, используйте личинку для инъекций DSRNA.
6. микроинкекционы dsRNA у личинок T. marmoratus
- Подготовка и заправка микроинкъекционной иглы с желаемым количеством генно-специфического дстрНК рабочего раствора (как описано в шагах 4.1-4.2). Прикрепите иглу к держателю иглы, подключенному к контролируемому вручную шприцу микроинкекции. Перед присоединением иглы, потяните шприц поршень весь путь, чтобы избежать запуска из инъекционного давления середине процедуры.
- Расположите обездвиженную личинку таким образом, чтобы участок инъекции, расположенный спинно между третьим и четвертым сегментами пластин тела, выравнивается с траекторией микроинкекции иглы под относительно плоским углом (почти параллельно сцене).
ПРИМЕЧАНИЕ: Angling иглы и личинки в этом положении имеет важное значение, так как она обеспечивает путь наименьшего сопротивления для иглы отзыв перфорировать личинок с минимальным ущербом. - После того, как игла и личинка были расположены, тщательно переместить кончик иглы в личинку с помощью микроманипулятора при мониторинге прогресса через стереомикроскоп.
- После кончика перфорирует ткань, медленно и осторожно надавите на шприц. Отрегулируйте давление инъекций, наблюдая за движением цветной инъекционной жидкости в игле под микроскопом.
- Тщательно втягивайте иглу после инъекции. Используйте мягкие щипцы, чтобы очистить от и, следовательно, освободить личинки от агарозы. Перенесите личинку обратно в контейнер с водой (при комнатной температуре) и дайте ей развиваться дальше в инкубаторе или комнате культуры при температуре 25х2228 градусов по Цельсию и световом циклу 14 ч света и 10 ч темной.
- Используйте соответствующие инъекции контроля и нокдаун количественной оценки, как указано в шаге 4.10.
Representative Results
Используя протокол, описанный выше, мы сбили три различных гена, а именно: белый, laccase2 (lac2),и Lens3 (Таблица 1), на различных стадиях развития Sunburst Дайвинг Beetle T. marmoratus. Мы выполнили РНК в T. marmoratus путем введения dsRNA на очень ранней стадии во время эмбриогенеза(Рисунок 1A). Поскольку некоторые эмбрионы не выживают в процессе и превращаются в некротические(рисунок 1B),они должны быть удалены, чтобы сохранить оставшиеся эмбрионы здоровыми. Примером здесь являются инъекции dsRNA против белого гена. Этот ген хорошо известен в Drosophila как один из трех АТФ-связывающих кассеты (ABC) транспортеров, участвующих в поглощении и хранении прекурсоров пигментаглаз 23. Соответственно, его потеря функции приводит к непигментированности, фенотипу с белым глазом. Наши результаты показывают, что инъекции дстрНК, нацеленные на ортопедический белый ген в эмбрионах T. marmoratus, приводят к потере пигментации глаз у новых личинок. В этом случае личинки дикого типа характеризуются сильно пигментными глазами, а нокдаун РНК белого приводит к различным уровням сокращения и даже полной ликвидации пигмента глаз. В целом, мы наблюдали по крайней мере некоторое снижение окраски глаз в 34% выживших эмбрионов (n No 35). Рисунок 2A сравнивает человека управления и человека с немного более светлым цветом глаз. Рисунок 2B иллюстрирует более серьезный нокдаун в человеке, в котором более брюшной глаза (глаза 2-5) кластера полностью unpigmented, в то время как спинные глаза по-прежнему показывают некоторые пигментации. Эти различия подчеркивают, как эффективность нокдауна может варьироваться на региональном уровне, что, возможно, связано с различиями в эффективности проникновения dsRNA в плотные ткани. Другой человек показывает существенно полную потерю пигмента во всех глазах (Рисунок 2C).
Чтобы исследовать, насколько хорошо РНК работает на личиночной стадии T. marmoratus, мы ввели dsRNA ориентации дубильного гена lac2 во второй личинки звезды за несколько дней до того, как они были из-за линять в третий instars (Рисунок 3) и оценили влияние на кутикулярности третьей личинки звезды. Lac2 является одним из видов фенолоксиазы, что окислительно конъюгирует белки, чтобы сделать их нерастворимыми, труднее и темнее. Нокдаун в муке жука T. castaneum было показано, что привести к светлым цветным лицам в низких дозах, но считается смертельным в высоких дозах24. Рисунок 4 иллюстрирует, что это лечение также приводит к более светлым цветным личинкам Sunburst Дайвинг жука. В частности, в этом эксперименте 75% выживших инъекционных личинок (n No 12) имели пониженную пигментацию (по сравнению с 0% в контрольной группе). Рисунок 4A показывает человека с относительно мягким депигментацией, в то время как рисунок 4C иллюстрирует голову личинки T. marmoratus, в которой темная окраска кутикулы почти отсутствует. Депигментация была особенно очевидна для центрального темного узора, который характерен для этих личинок, в то время как эта закономерность оставалась отчетливо видимой в интролизменте (Рисунок 4B). Кроме того, наблюдалось осветление хвостовой трахеи, как показано на рисунке 4D. В случае, когда lac2 dsRNA был введен в третью личинку звезды, были получены более легкие взрослые особи(рисунок 5). Отметим, что крылья нокдауна-жука несколько деформированы, вероятно, из-за его необычной мягкости.
В дополнение к изменению морфологических черт, можно использовать РНК для целевых генов, которые влияют на поведение. Чтобы продемонстрировать это, мы выполнили РНК против ключевого гена белка объектива, Lens318, и ввели его во вторую личинку звезды, чтобы повлиять на оптические свойства третьих личинок в звездных личинок. Любое воздействие на линзы наблюдается здесь, вероятно, потому что глаза T. marmoratus личинки проходят значительный рост глаз в этот переход, который также включает в себя крупные оптические изменения объектива25. RNAi нокдаун в этом эксперименте был весьма эффективным. Проверка через qPCR показала 100% успех; из 13 проверенных лиц 12 были сбиты до менее чем 10% от уровня выражения лиц контроля, а у оставшегося человека уровень выражения составляет 17% от контрольного уровня (неопубликованное наблюдение). На фенотипического уровне только некоторые люди были серьезно инвалидами или неспособными к захвату добычи, о чем свидетельствует рисунок 6 для человека, который неоднократно приближался к своей добыче с очень близкого расстояния, но постоянно перестрелил ее.
Таблица 1: Праймер последовательности и ампликоны для белых, lac2, и Lens3 белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1: Иллюстрация инъекций эмбриона. ()Dechorionated эмбрионов выстроились на пластине агарозы и вводили рядом с их центром с помощью микроинъекционной иглы заполнены dsRNA и пищевой краситель-содержащих инъекции буфера. Шкала бар представляет 500 мкм. (B) Человек с более серьезным нокдауном. Инъекционные эмбрионы хранятся в камере влажности и ежедневно контролируются для оценки фенотипов и удаления мертвых особей (которые становятся коричневыми). Бар масштаба представляет 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пример полностью развитых эмбрионов, которые были введены с dsRNA против белого. (A) Сравнение человека с уменьшением пигментации глаз (слева) и контролю-впрыснутого человека (справа). E1-E6 относятся к глазам 1-6. (B) Человек с более серьезным нокдаун фенотип, который иллюстрирует, что, порой, некоторые из глаз в кластере более серьезно пострадали от нокдауна, чем другие. (C) Индивидуальный с почти полной потерей пигментации глаз. Шкала бар представляет 200 мкм; Панели B и C представлены в одном масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иллюстрация личинок инъекций. (A) Несколько личинок обездвижены путем встраивания в 2% агарозы с их хвостом spiracles слева от любого агарозы. (B) Microelectrode содержащие инъекционные раствор размещены так, что его кончик может проникать в тонкую мембрану между двумя сегментами. (C) Синий инъекционный краситель, видимый в месте инъекции после инъекции. Масштабные бары представляют 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: РНК для laccase2 применяется ко второй личинки звезды в результате сокращения окраски кутикулы в третьей личинки в звезде. (A) Относительно мягкая потеря окраски в lac2 RNAi отдельных (внизу) по сравнению с контролем вводили человека (вверху). Масштабная планка представляет собой 5 мм.(B) Головка человека управления, показывающая характерный темный цветной узор в центре головы. (C) Относительно серьезный нокдаун lac2 приводит к почти полной потере центральной окраски головы. (D) Потеря окраски в основной кутикулы хвоста lac2 РНК отдельных (внизу) по сравнению с контролем вводили человека (вверху). Масштабные бары в B'u2012D представляют 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Рисунок 5: РНК для laccasecase2 применяется к третьей личинки instar в результате сокращения окраски кутикулы у взрослых. Нокдаун человека (слева) также характеризуется очень мягкой elytra по сравнению с контролем (справа). Бар масштаба представляет 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Нокдаун крупного белка объектива, что приводит к недостаткам в захвате добычи. (A-C). Три примера, в которых Sunburst Дайвинг жук личинки, в которых оптические дефициты были вызваны через РНК, не смог захватить добычу (личинки комаров). Представитель неподвижные изображения были выбраны из видеозаписи характерных захватов добычи. (D) Контроль личинки ловли добычи. Все бары масштаба представляют 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Наша цель состоит в том, что эта подборка методов сделает РНК широко доступным, тем более, что этот инструмент остается мощным синергетическим методом для редактирования генов на основе CRISPR/Cas9, с тем преимуществом, что он может быть применен к желаемым стадиям развития изученных организмов. Чтобы иллюстрировать эту силу, мы вводили дструнк в эмбрионы и в различные личиночной стадии. Инъекции в яйцеклетки повлияли на развитие эмбрионов(рисунок 2),инъекции во вторую личиночную стадию оказали явное влияние на третью личиночную стадию(рисунок 4 и рисунок 6),а инъекции в третью личиночную стадию показали эффекты у взрослых(рисунок 5). Хотя точное время должно быть установлено экспериментально, как правило, инъекции вступят в силу в течение нескольких дней. На успех этого процесса может влиять длина последовательности dsRNA. Здесь мы представили примеры, используя чуть более 200 bp до более чем 800 bp. Как правило, последовательности между 100 и 600 bp предпочитают ограничивать внецелевые эффекты, но последовательности до 1000 bp дают хорошие результаты22. Один вопрос в отношении RNAi является продолжительность нокдауна, которые могут быть достигнуты с помощью этой техники. Поскольку фенотипы были неизлечимыми на каждом этапе, мы не можем комментировать этот вопрос на основе представленных результатов. Тем не менее, ранее было отмечено, что RNAi эффекты, как правило, относительно долго жил, и что более высокие концентрации приводят к более длительным нокдауны20.
Одним из ограничений этого метода является то, что он работает лучше для некоторых организмов, чем для других, и, кажется, нет прямого способа предсказать, насколько хорошо он будет работать априори. Тем не менее, было установлено, хорошо работать для широкого круга различных организмов. В членистоногих, это включает в себя паукообразных26, ракообразных27, и различные насекомые, с особенно высокими показателями успеха у жуков28. Еще одним осложнением является то, что различия в тяжести фенотипа часто возникают между людьми, несмотря на применение того же количества дстрНК. Как показано на рисунке 2B,изменение может даже произойти в пределах человека. В наших исследованиях РНК ориентации различных генов, участвующих в T. marmoratus личинок глаз развития, мы часто обнаружили, что некоторые глаза страдают более серьезно, чем другие. Это явление может быть связано с относительно плотной ткани глазного скопления, с dsRNA лучше достичь некоторых единиц.
Для успешного выполнения экспериментов РНК очень важно, чтобы несколько параметров были оптимизированы для гена-цели. Например, концентрация dsRNA и длина целевого гена может сильно повлиять на исход20. Другим важным параметром является то, как выполняются инъекции, так как этот процесс может значительно повлиять на выживаемость. Для эмбрионов мы достигли наилучших результатов, ориентируясь на центр эмбриона. Хорошо выложенная пластина позволяет впрыскить 100 или более эмбрионов за один сеанс. Для личинок очень важно вставить инъекционную иглу между сегментами. Эти инъекции требуют больше dsRNA, и на основе наличия личинок, наши наборы инъекций здесь, как правило, только состоял из нескольких животных за один раз. Для всех инъекций, очень важно, чтобы предотвратить попадание воздуха в организм.
В некоторых случаях циклы обратной связи сети регулирующих генов и генетической избыточности могут влиять на проницаемость фенотипов РНК, несмотря на последовательные нокдауны. Это, кажется, дело для наших поведенческих наблюдений личинок с весьма успешным нокдауны видных белка объектива, Lens318. Хотя мы проверили высокую эффективность этих нокдаунов с помощью qPCR, значительные изменения наблюдались в связанных фенотипах. Этот результат подчеркивает необходимость правильной количественной оценки RNAi нокдауны (подробная информация о вариантахсм. 22). Если нет четкого априори ожидания в отношении результирующих фенотипов, хороший способ контроля за внецелевыми эффектами РНК является цель одного и того же гена с двумя не перекрывающимися последовательностями dsRNA и для оценки результатов для общих фенотипов.
В отличие от методов редактирования генов, РНК также является мощным инструментом для изучения смертоносных генов, и есть два способа сделать это. Например, если кто-то заинтересован в функциональном вкладе гена, где потеря функции на ранних стадиях развития, как известно, является смертельной, функциональное исследование такого гена может быть достигнуто путем простого разрешения животному нормально развиваться, а затем сбить ген через РНК позже в развитии (т.е. у взрослого). Кроме того, ген, в котором полная потеря функции, как известно, является смертельной может быть исследована через частичный нокдаун, который может быть достигнут путем введения диапазона концентраций dsRNA. Некоторые из наших результатов показывают нокдауны lac2, которые, как известно, смертельно, если кутикула у насекомых становится слишком мягким24. Даже лак2 жука РНК, изображенный на рисунке 5, вряд ли выживет вне лабораторных условий. Другой смертельный ген вырезать, который коды для транскрипции фактор, который имеет основополагающее значение для клеточной судьбы спецификации в различных системах органа в членистоногих и был связан с глией развития в Дрозофила зрительной системы29. Основываясь на нашем опыте с разрезом РНК в эмбрионах T. marmoratus, мы можем вызвать информативные фенотипы глаз в эмбрионах, которые способны завершить их эмбриональное развитие глаз (неопубликованные наблюдения). Здесь более высокие дозы, как представляется, приводят к более высоким показателям летальности, в то время как более низкие дозы приводят к наблюдаемым и информативным фенотипов.
Наш протокол не только перечисляет необходимые шаги для исследователя для проведения экспериментов РНК на T. marmoratus, как показано, но и, как правило, применимы к другим организмам, особенно водным организмам. Среди водных организмов, Есть уже несколько примеров в ракообразных, таких как вода блох Дафния30 и креветки (для недавнего обзора, см. справку31). Есть широкие возможности среди водных насекомых, так как они, по оценкам, составляют около 6% от всего разнообразия насекомых, с вероятностью более 200000 видов32. Кроме того, РНК уже выполнена на водных стори, которые, как правило, обитают на поверхности водной среды33. Если генома нет, то транскриптом может быть собран де Ново. До тех пор, как этот процесс показывает contigs из нескольких сотен нуклеотидов, dsRNA против конкретных генов могут быть разработаны. Наш протокол для обездвиживания насекомых в агарозе, вероятно, также будет полезен для других процедур, особенно для мягких, податливых и водных организмов. Взятые вместе, РНК остается мощным методом для манипулирования экспрессией генов в разнообразной группе организмов, даже если нет других молекулярных и генетических инструментов.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джоша Бенуа за помощь в биоинформатике Хейли Тоблер за ее помощь в повышении Sunburst Дайвинг жуков и Тамара Пейс для редакционной помощи. Это исследование было поддержано Национальным научным фондом в рамках грантов IOS-1456757 и IOS-1856341 EKB и IOS1557936 в YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
