Summary
RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.
Abstract
RNA interferentie (RNAi) blijft een krachtige techniek die het mogelijk maakt voor de gerichte vermindering van genexpressie door middel van mRNA afbraak. Deze techniek is van toepassing op een breed scala aan organismen en is zeer efficiënt in de soort-rijke orde Coleoptera (kevers). Hier vatten we de noodzakelijke stappen voor de ontwikkeling van deze techniek in een nieuw organisme samen en illustreren we de toepassing ervan op de verschillende ontwikkelingsstadia van de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus. Doel gen sequenties kunnen kosteneffectief worden verkregen door de assemblage van transcriptomen tegen een naast familielid met bekende genomics of de novo. Kandidaat-gen klonen maakt gebruik van een specifieke klonen vector (de pCR4-TOPO plasmid), die het mogelijk maakt de synthese van dubbelstrengs RNA (dsRNA) voor elk gen met het gebruik van een gemeenschappelijke primer. Het gesynthetiseerde dsRNA kan in embryo's worden geïnjecteerd voor vroege ontwikkelingsprocessen of larven voor latere ontwikkelingsprocessen. Vervolgens illustreren we hoe RNAi kan worden geïnjecteerd in aquatische larven met behulp van immobilisatie in agarose. Om de techniek aan te tonen, geven we verschillende voorbeelden van RNAi-experimenten, waarbij we specifieke knockdowns genereren met voorspelde fenotypes. Specifiek, RNAi voor de looien gen laccase2 leidt tot cuticula verlichting in zowel larven en volwassenen, en RNAi voor het oog pigmentatie gen wit produceert een bliksem / gebrek aan pigmentatie in oogbuizen. Bovendien leidt het knockdown van een belangrijk lenseiwit tot larven met optische tekortkomingen en een verminderd vermogen om op prooien te jagen. Gecombineerd illustreren deze resultaten de kracht van RNAi als een hulpmiddel voor het onderzoeken van zowel morfologische patronen als gedragskenmerken in organismen met alleen transcriptomische databases.
Introduction
De vraag hoe specifieke genen bijdragen aan de evolutie van diverse eigenschappen is een spannend onderwerp in de biologie. In de afgelopen decennia is er veel vooruitgang geboekt met betrekking tot het ontleden van de genetische onderbouwing van ontwikkelingsprocessen in een paar modelorganismen, zoals de nematode Caenorhabditis elegans, de fruitvlieg Drosophila melanogaster, en de huismuis Mus musculus1. Meer recent, de uitvinding van krachtige gen-editing technieken zoals geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPR)/Cas92 heeft de mogelijkheid om de genetische code van niet-model organismen te veranderen (bijvoorbeeld zie3,4). Als gevolg hiervan is er een toename van genetische studies op een verscheidenheid van organismen die niet eerder was benaderd door middel van moleculaire technieken. Gezien de enorme diversiteit van ons dierenrijk, met veel interessante eigenschappen of karaktertrekvarianties die alleen in specifieke soorten worden vertegenwoordigd, heeft deze vooruitgang het een opwindende tijd gemaakt voor evolutionair-ontwikkelingsbiologie ("evo-devo") gerelateerd werk. Genoombewerkingstechnieken die beschikbaar zijn voor niet-modelorganismen zijn echter relatief beperkt met betrekking tot de ontwikkelingstijdpunten waarop ze kunnen worden toegepast, waardoor het een uitdaging is om de temporele eigenschappen te onderscheiden die verband houden met de rol die specifieke genen spelen in elke eigenschap. Bovendien zijn transgene technieken vaak beperkt tot genen die niet essentieel zijn om te overleven (d.w.z. waarvan de knock-out niet leidt tot letaliteit). Daarom, terwijl gen-editing technieken zijn begonnen om populair te worden, blijft er behoefte aan effectieve technieken die van toepassing zijn op een verscheidenheid van verschillende organismen op specifieke ontwikkelingstijdpunten en vergemakkelijken gedeeltelijke knockdowns (in plaats van volledige verlies-van-functie). Hier vestigen we de aandacht op RNA interferentie (RNAi), een enigszins gedateerde maar krachtige gen knockdown techniek5 die bijzonder waardevol is als een synergetische benadering van genbewerking. Specifiek ontwikkelden we procedures die het mogelijk maken om RNAi toe te passen op aquatische duikkevers als een voorbeeld dat de implementatie van deze techniek illustreert, van de verwerving van de noodzakelijke moleculaire sequenties tot de succesvolle injectie van dubbelstrengs RNA (dsRNA) in eieren en larven.
RNAi-gebaseerde gen knockdown maakt gebruik van een aangeboren afweermechanisme van organismen, waarin dsRNA moleculen vergemakkelijken het uitschakelen van nucleïnezuur sequenties, zoals virussen en transposons6. Kortom, dsRNA wordt opgenomen in de cel, waar het wordt gesneden in 20-25 nucleotide stukken door de Dicer enzym. Deze stukken activeren vervolgens de vorming van het RNA-geïnduceerde het-uitschakelen complex (RISC), dat het beoogde mRNA remt door het op specifieke plaatsen te binden met behulp van de geleidingstreng. Dit proces leidt uiteindelijk tot mRNA afbraak en interfereert dus met de vertaling van mRNA in het respectievelijke eiwit6. De RNAi-gebaseerde gen knockdown techniek die hier wordt gepresenteerd is daarom afhankelijk van de injectie van dsRNA. Voor diermodellen werd deze techniek oorspronkelijk ontwikkeld in C. elegans7 en D. melanogaster8, maar is sindsdien naar voren gekomen als een krachtig functioneel genetisch instrument in niet-modelorganismen9,10. Vanwege het zeer effectieve karakter bij sommige insecten kan RNAi zelfs worden toegepast in ongediertebestrijding11.
Als onderzoeksinstrument is RNAi gebruikt om te onderzoeken hoe belangrijke moleculair-ontwikkelingstrajecten functioneren in niet-traditionele insectenmodellen. Bijvoorbeeld, RNAi in de bloem kever Tribolium castaneum castaneum is instrumenteel geweest bij het bepalen hoe diep geconserveerde genen bijdragen aan specifieke eigenschappen in die kever, zoals geïllustreerd voor de ontwikkeling van specifiek gevormde vleugels12,13,14 en ogen15,16. De technieken die ten grondslag liggen aan de manipulaties in T. castaneum zijn goed beschreven17 en vertrouwen op het vermogen om relatief droge eieren en larven te immobiliseren op een kleverig oppervlak. Een dergelijke immobilisatie is echter niet mogelijk voor de natte ontwikkelingsvormen van aquatische organismen zoals de Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Zoals het geval is voor veel niet-traditionele modelorganismen, ontbreekt het aan een geannoteerd genoom. Om genexpressie in een organisme te manipuleren zonder genoom, is een redelijke en kostenefficiënte eerste stap het genereren van transcriptomen en het identificeren van de vermeende nucleotidesequenties van de uitgedrukte genen van belang op basis van sequentiegelijkiteit met verwante maar meer gevestigde modelorganismen, in dit geval voornamelijk Tribolium (Coleoptera) en Drphilosoa-genen.
Om hier aan te tonen hoe RNAi kan worden gebruikt op een aquatisch organisme, bespreken we eerst protocollen en software voor RNA-extractie en transcriptomegeneratie en assemblage, die het mogelijk maken specifieke gerichte gensequenties te identificeren. Vervolgens vatten we de noodzakelijke stappen samen voor het synthetiseren van genspecifiek dsRNA. Vervolgens illustreren we hoe eieren kunnen worden geïnjecteerd in een aquatisch milieu en demonstreren we incubatieprotocollen voor het kweken van embryo's. Daarnaast laten we zien hoe agarose gel kan worden gebruikt om larven volledig te immobiliseren tijdens het injectieproces, een techniek die over het algemeen nuttig is tijdens verschillende procedures en kan worden toegepast op een verscheidenheid aan geleedpotigen. Om aan te tonen hoe RNAi kan worden toegepast op verschillende ontwikkelingsstadia, nemen white we een voorbeeld op waarin we het oogpigmentatiegenwit in embryo's het zwijgen oplegden. Daarnaast beschrijven we een voorbeeld waarin het looien gen laccase2(lac2) werd het zwijgen opgelegd tijdens zowel de tweede larve instar (om larven van de derde larve instar te beïnvloeden) als de derde larve instar (om volwassenen te beïnvloeden). Ten slotte tonen we aan dat de injectie van een lagere concentratie van dsRNA leidt tot gedeeltelijke knockdown, waaruit blijkt dat deze techniek ook kan worden toegepast op genen waarvan bekend is dat functieverlies dodelijk is.
Protocol
1. RNA isolatie en de novo transcriptome assemblage
- Voer totale RNA isolatie uit van laat stadium derde instar duiken kever larven revalideren oogbuizen en volwassen kevers met behulp van een RNA isolatie kit (zie Table of Materials)die is ontworpen voor lipide-rijk weefsel. Isoleer het totale RNA van T. marmoratus en volg het volgens eerder beschreven methoden18.
- De novo transcriptome assembly
LET OP: Om het transcriptome de novo te monteren, kunnen verschillende bioinformaticaplatforms worden gebruikt (zie Tabel van materialen). Deze platforms zijn commercieel beschikbaar en bestaan in sommige gevallen als Unix-gebaseerde command line scripts. Aangezien de assemblage de novo is, wordt het aanbevolen om de transcripties onafhankelijk op twee platforms samen te stellen en de resultaten te vergelijken om valse positieven of valse negatieven uit te sluiten.- Upload de ruwe leest op het desbetreffende bioinformaticaplatform om te beginnen met het samenstellen van de transcripties.
OPMERKING: Deze bestanden worden meestal gecomprimeerd en in het formaat FASTQSANGER. Gz. Het is niet nodig om de bestanden te decomprimeren, omdat dit formaat in de volgende stap wordt geaccepteerd. - Met de opdrachtregel Trimmomatic knipt u de ruwe leest om adaptersequenties of korte reads te verwijderen die onder de standaarddrempel vallen. Decomprimeren van de bijgesneden ruwe leest; de bestanden zullen nu in het FASTQ-formaat zijn. Concatenate de FASTQ raw leest voor elk monster om bestanden die klaar zijn voor de novo montage te verkrijgen.
- Assembleer de samengevoegde ruwe leest de novo met behulp van een command line script dat transcriptomes de novo kan assembleren. Sla het geassembleerde transcriptoom, dat nu een lijst met aaneengesloten met hun respectieve sequenties, als een FASTA-bestand zal hebben. Om de dekking van de assemblage te vergroten, combineer en verzamel je meerdere transcriptomen voor dezelfde soort.
OPMERKING: Dit proces verhoogt de kans op het genereren van meer nauwkeurige aaneengesloten en is vooral belangrijk als lage kopie nummer genen zijn van belang. - Beoordeel het transcriptoom op volledigheid door dekkingsscores te berekenen (informatiebeoordelingssoftware is vrij beschikbaar, zie Tabel van materialen).
OPMERKING: Een transcriptoom met een dekkingsscore >75% wordt als goed beschouwd. De relevantie van deze score hangt echter af van de reden voor het genereren van transcriptome. Als het transcriptoom bijvoorbeeld wordt gebruikt om genen met een laag kopieernummer te identificeren, is een score >85% beter, omdat dit een grotere dekking betekent. - Annoteren de de novo geassembleerde transcriptoom met behulp van een fundamentele lokale uitlijning search tool (BLAST; zie tabel van materialen).
OPMERKING: Voor dit experiment werd het transcriptoom voornamelijk geannoteerd tegen een database van bekende Drosophila-eiwitten en een database van bekende kevereiwitten. De lijst met annotaties kan worden gedownload als een spreadsheetbestand en aaneengesloten/aaneengesloten stoffen die sequentiegelijkendheid met de eiwitten van andere organismen aangeven, kan worden gedownload als een FASTA-bestand. - Identificeer het aaneengesloten aantal/getallen van het eiwit van belang en haal de nucleotidesequenties eruit. Gebruik BLAST om te bepalen of eiwitspecifieke geconserveerde gebieden (zoals homeoboxdomeinen) aanwezig zijn in de geannoteerde nucleotide-reeks van belang. Controleer andere aaneengesloten met dezelfde annotatie voor nucleotide sequentie overlapt om de volgorde van een gen-specifieke transcript te genereren.
OPMERKING: Het identificeren van aaneengesloten met sequentie overlap is meestal niet mogelijk voor alle genen, vooral voor lage kopie nummer genen. - Als de volledige lengte sequentie van het gen nodig is, beginnen met de aaneengesloten die de hoogste sequentie gelijkenis als een initiatiepunt voor het identificeren van de nucleotide sequentie van de hele volwassen transcript met behulp van technieken zoals 3 ' en 5 ' snelle versterking van cDNA eindigt (RACE19).
- Annoteren van de montage verkregen van het tweede platform na stappen 1.2.4–1.2.7.
OPMERKING: Idealiter moeten de resultaten vergelijkbaar zijn voor de eiwitten van belang; de dekking kan echter tot op zekere hoogte verschillen tussen platforms. - Gebruik het geassembleerde transcriptoom om soortspecifieke dsRNA te synthetiseren zoals beschreven in sectie 2.
- Upload de ruwe leest op het desbetreffende bioinformaticaplatform om te beginnen met het samenstellen van de transcripties.
2. Klonen en genspecifieke dsRNA-synthese
OPMERKING: Genspecifiek klonen en dsRNA-synthese zijn in detail beschreven voor T. castaneum20,21,22. De volgende stappen zijn een kort overzicht.
- Klonen, bacteriële transformatie en plasmide sequencing
- Isoleer het totale RNA van het organisme (zoals beschreven in stap 1.1) en maak aanvullend DNA (cDNA) met behulp van een omgekeerde transcriptiekit (zie Tabel van Materialen). Identificeer een of twee 100-1000 bp nucleotide sequenties van aaneengesloten die specifiek zijn voor de genen van belang.
- Ontwerp primerpars die het gehele geïdentificeerde stuk nucleotiden overspannen en versterken de volgorde door middel van een polymerase kettingreactie (PCR). Voeg een extra 30 min stap aan het einde om 3 ' adenine overhangen in het versterkte DNA-product te creëren. Zuiver dit product met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie Tabel van materialen).
- Kloon het gezuiverde product in een pCR4-TOPO plasmidevector (zie Tabel van materialen)volgens het protocol van de leverancier dat is meegeleverd met de kloonkit. Met behulp van warmte-shock behandeling zet de gekloonde plasmiden in bevoegde bacteriële cellen (stam: E.coli DH10B) volgens het protocol van de leverancier voor bevoegde cellen (zie tabel van materialen),en scherm voor met succes getransformeerde cellen.
OPMERKING: Platen met kolonies kunnen worden verpakt in paraffinefilm om vocht vast te houden en maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard. - Kies kolonies getransformeerde cellen met behulp van een 10 μL pipetpunt en cultuur in lysogeny bouillon (LB) met ampicilline (50 μg/mL) in een shaker-incubator bij 37 °C en 200 rpm voor 24 uur.
OPMERKING: Voor langdurige opslag kunnen gekweekte cellen 1:1 worden verdund met 100% glycerol en bevroren bij -80 °C als glycerolvoorraden. - Isolaat plasmiden met het gen van belang uit deze cultuur met behulp van een miniprep isolatie kit (zie Tabel van materialen). Bewaar de geïsoleerde plasmiden (minipreps) bij -20 °C na beoordeling van de opbrengstspectrofotometrisch. Meet met name de monsterabsorptie op 260 nm, 280 nm en 230 nm. Bereken de ratio's A260/A280 voor het kwantificeren van DNA en A260/A230 voor het kwantificeren van DNA-zuiverheid.
OPMERKING: Een verhouding van 260/280 van 1,8 wordt algemeen aanvaard als voldoende zuiver DNA, ratio's lager dan 1,5 geven de aanwezigheid van restextractierensia zoals fenol aan. De verhouding 260/230 moet groter zijn dan of gelijk zijn aan de verhouding 260/280. Lagere ratio's duiden op restreagensbesmetting. De opbrengst varieert meestal van 100 tot 500 ng/μL. - Sequentie van de geïsoleerde minipreps om te bevestigen dat het gen-specifieke fragment is met succes geïntegreerd, wordt geflankeerd tussen 5 ' T7 en 3′ T3 promotor regio's in de plasmid; dit kan worden gedaan met behulp van universele T7 en T3 sequencing primers22. Gebruik de minipreps met de genspecifieke sequentie van belang voor dsRNA-voorbereiding.
- Isoleer het totale RNA van het organisme (zoals beschreven in stap 1.1) en maak aanvullend DNA (cDNA) met behulp van een omgekeerde transcriptiekit (zie Tabel van Materialen). Identificeer een of twee 100-1000 bp nucleotide sequenties van aaneengesloten die specifiek zijn voor de genen van belang.
- PCR-versterking en in vitro dsRNA-synthese
- PCR-versterking en productzuivering
- Ontwerp plasmid-specifieke of gen-specifieke primers die de T7 promotor sequentie op hun 5 'kanten (zie referentie22 voor details) om een lineair fragment van het ingevoegde gen te versterken. Optimaliseer de opbrengst door ten minste 10 reacties van 20 μL per stuk in te stellen.
LET OP: Het resulterende product wordt geflankeerd door twee 20 bp T7 polymerasebindingsplaatsen. - Zuiver het PCR-product met behulp van een PCR-productzuiveringskit (zie Tabel van materialen),volgens het op kolom gebaseerde elutieprotocol van de leverancier. Om de opbrengst te verhogen, herhaalt u de laatste elutie stap tot 3 keer met dezelfde eluent. Beoordeel de opbrengst spectrofotometrisch.
LET OP: De opbrengst varieert meestal van 100 tot 700 ng/μL. Dit gezuiverde product kan tot verder gebruik bij -20 °C worden bewaard.
- Ontwerp plasmid-specifieke of gen-specifieke primers die de T7 promotor sequentie op hun 5 'kanten (zie referentie22 voor details) om een lineair fragment van het ingevoegde gen te versterken. Optimaliseer de opbrengst door ten minste 10 reacties van 20 μL per stuk in te stellen.
- In vitro dsRNA synthese en zuivering
- Gebruik het genspecifieke PCR gezuiverde product om dsRNA in vitro te synthetiseren volgens het protocol van een dsRNA synthese kit naar keuze. Verleng indien nodig de incubatietijd voor een verhoogde dsRNA-productie.
- Beoordeel de progressie van de reactie op basis van de dekking van het reactiemengsel (hoe groter de hoeveelheid van het dsRNA-product, hoe hoger de troebelheid). Aan het einde van de incubatie, stop de reactie met behulp van een DNase behandeling. Voeg hiervoor 1 μL uit een voorraad van 2 U/ μL toe aan het reactiemengsel. Breid deze behandeling uit tot 1-2 uur om de optimale afbraak van het sjabloon-DNA te garanderen.
- Zuiver de dsRNA met een zuiveringskit of via de volgende stappen.
- Verdun het resulterende product met 115 μL nucleasevrij water en voeg 15 μL natriumacetaat toe. Voeg 2 volumes ijskoude 100% ethanol toe aan dit reactiemengsel en stort het dsRNA 's nachts neer bij -20 °C.
OPMERKING: Op dit punt kunnen monsters veilig worden opgeslagen zonder de uiteindelijke opbrengst te beïnvloeden. - Centrifugeren het neerslag op 0 °C gedurende 20 min bij 9000 x g en gooi het supernatant weg. Was het product één keer met ijskoude 70% ethanol en centrifuge gedurende 15 minuten op 13000 x g.
- Verwijder de supernatant en de lucht droog de pellet gedurende 5-15 min. Resuspend de pellet in maximaal 40 μL nuclease-vrij water (dit volume kan worden aangepast op basis van de geïsoleerde pelletgrootte) en beoordeel de opbrengst en zuiverheid spectrofotometrisch, zoals beschreven in punt 2.1.4.
- Bewaar het gezuiverde dsRNA bij -20 °C tot verder gebruik. Gebruik het gezuiverde dsRNA voor injectie in de gewenste ontwikkelingsfase.
- Verdun het resulterende product met 115 μL nucleasevrij water en voeg 15 μL natriumacetaat toe. Voeg 2 volumes ijskoude 100% ethanol toe aan dit reactiemengsel en stort het dsRNA 's nachts neer bij -20 °C.
- PCR-versterking en productzuivering
3. Inzameling en bereiding van embryo's in een vroeg stadium T. marmoratus voor dsRNA-injecties
- Bereid een agaroseplaat voor op de incubatie van T. marmoratus embryo's.
- Los eerst 20 mg laag smeltend agarosepoeder op in 100 mL autoclaved gedestilleerd water (2% agarose) en kook dit mengsel vervolgens in een magnetron tot een duidelijke oplossing is verkregen. Pas op met de hete oplossing, want luchtbellen kunnen ervoor zorgen dat deze overloopt.
- Doe deze oplossing in een klein petrischaaltje. Om groeven (die de embryo's zal houden) op het oppervlak van de agaroseplaat te maken, plaats drie 1-2 mm brede plastic buizen (zoals de uiteinden van plastic overdracht pipetten) op het oppervlak van de vloeibare agarose voordat het stolt.
- Zodra de agarose stolt, gebruik maken van een paar stompe tangen om deze buizen te verwijderen. Voeg 500 μL autoclaved gedestilleerd water toe met behulp van een P1000 micropipet om deze inkepingen in de agarose te bedekken.
- Met behulp van een fijne natuurlijke haarborstel, verzamelen T. marmoratus embryo's die 5-8 uur oud zijn van de kever nestplaatsen in een glazen holte schotel gevuld met autoclaved gedestilleerd water. Controleer de nestplaatsen regelmatig om ervoor te zorgen dat de verkregen eieren van de juiste leeftijd zijn.
- Dechorionate de embryo's onder een stereomicroscoop met behulp van fijne dissectie forceps. Om dit te doen, visualiseer de chorion onder de microscoop (bij de gewenste vergroting) door de lichtbron onder een juiste hoek te plaatsen, pak vervolgens het chorion van twee kanten met scherpe tangen, scheur het open en schuif het embryo voorzichtig naar buiten. Aangezien er twee lagen zijn, moet u ervoor zorgen dat beide worden verwijderd.
- Breng met behulp van een fijne natuurlijke haarborstel de embryo's voorzichtig over van de glazen holteschaal naar de agaroseplaat en schik ze in de groeven onder een stereomicroscoop. Zorg goed voor dit proces, want gedechorioneerde embryo's zijn erg kwetsbaar. Gebruik de bereide embryo's voor dsRNA-injecties.
OPMERKING: Het iets dikkere uiteinde is de zijkant van het embryo waarin het hoofd zich zal ontwikkelen.
4. dsRNA-micro-injecties in het vroege stadium T. marmoratus embryo's
- Om embryo's in een vroeg stadium met genspecifiek dsRNA te injecteren, bereidt u microinjectienaalden voor met behulp van een microinjectienaaldtrekker (zie Tabel van materialen). Terwijl het visualiseren van de naald tip onder een stereomicroscoop, gebruik maken van een paar fijne tangen om de naald tip te breken, het creëren van een scherpe rand. In het ideale instantie breekt u de naaldpunt diagonaal, zodat een scherpere rand aan één kant blijft, waardoor het embryo kan worden binnengelaten terwijl het minimale letsel veroorzaakt.
- Ontdooi de gezuiverde voorraad dsRNA-oplossing op ijs, voeg 1 μL van de 10x injectiebuffer toe en maak deze af met dubbel gedestilleerd water, om 10 μL injectieoplossing te maken. Voor injecties is een dsRNA-concentratie van 1 μg/μL meestal geschikt, maar kan worden aangepast aan de fenotypische ernst van de resulterende dieren).
OPMERKING: Bereid 1 mL 10x injectiebuffer22 voor door 10 μL natriumfosfaatbuffer van 0,1 M toe te voegen (gemaakt door 8,5 mL van 1 M Na2HPO4 en 1,5 mL van 1 M NaH2PO4 aangepast aan een pH 7,6 bij 25 °C met 100 μL van 0,5 M KCl), 100 μL voedselkleurstof en 790 μL dubbelgedestilleerd water.- Vul met een P10 pipet de microinjectienaald opnieuw in met de werkende dsRNA-oplossing. Zodra de oplossing de punt van de naald heeft gevuld, bevestig deze aan een microneedle houder aangesloten op een micro-injectiesysteem dat gebruik maakt van drukuitwerptechnologie (zie Tabel van materialen).
- Zet het microinjectiesysteem en de luchttoevoer onder druk aan. Stel met behulp van het microklepsysteem de injectiedruk aan op 15 psi. Pas de injectieduur aan met de tijdverstellingsknop (stel deze in op 'Seconden').
- Aangezien de injectieduur afhankelijk is van het vereiste injectievolume, past u deze parameter indien nodig aan op het microinjectiesysteem vóór elke injectie. Gebruik een injectievolume van 1-2 nL voor vroege t. marmoratus embryo's.
OPMERKING: Hogere injectievolumes hebben de neiging om de overlevingskans van het embryo te verstoren.
- Aangezien de injectieduur afhankelijk is van het vereiste injectievolume, past u deze parameter indien nodig aan op het microinjectiesysteem vóór elke injectie. Gebruik een injectievolume van 1-2 nL voor vroege t. marmoratus embryo's.
- Om het volume van de injectievloeistof te meten dat wordt afgegeven door het microinjectiesysteem, kalibreer u de injectienaald door het volume van de vloeistofbel te beoordelen dat aan het uiteinde van de naald wordt gevormd wanneer het in de lucht wordt geïnjecteerd. Gebruik voor T. marmoratus embryo's een optimale bellengrootte van 100-200 μm. De injectienaald is van goede kwaliteit als dit kan worden bereikt bij 15 psi met een injectieduur van ~3 s.
- Lijn de naald en de agaroseplaat met de embryo's onder een stereomicroscoop uit, zodat de naald de embryo's onder een hoek tussen 45° en 60° nadert.
- Met behulp van de micromanipulator, beweeg de microneedle langzaam terwijl het toezicht op de voortgang door de stereomicroscoop. Zodra de punt van de naald het oppervlak van een embryo raakt, beweegt u de naald voorzichtig naar voren totdat het het oppervlak van het embryo doorboort. Perforeer het embryo niet diep met de naaldpunt, omdat dit de overleving van het embryo kan beïnvloeden. Om de variabiliteit te verminderen, moet u de injectie in het midden van het embryo leveren.
- Zodra de naald zich in het embryo bevindt, drukt u voorzichtig op de injectieknop van de micro-injector om de dosis dsRNA aan het embryo te leveren. Na het injecteren van 1-2 nL dsRNA trekt u de naald langzaam uit het embryo, zodat het embryo niet scheurt.
- Injecteer de andere embryo's op een vergelijkbare manier. Als de microinjectienaald tijdens de procedure wordt geblokkeerd, deblokker deze door de injectiedruk en duur te verhogen. Identificeer visueel geïnjecteerde embryo's door de aanwezigheid van een gekleurde plek op de plaats van de injectie (aangezien de injectiebuffer kleurstof bevat).
- Plaats de schotel voorzichtig met geïnjecteerde embryo's in een vochtigheidskamer.
- Om een dergelijke kamer te bouwen, neem elke plastic doos met een deksel, steriliseren met 70% ethanol, laat het drogen, en plaats weefsel gedrenkt in autoclaved water op de bodem om een vochtige omgeving te bieden. Plaats deze vochtigheidskamer in een couveuse met een geschikte temperatuur (in dit geval 25 °C) en lichtcyclus van 14 uur licht en 10 uur donker.
- Laat geïnjecteerde embryo's zich ontwikkelen tot eerste instarlarven, wat 4-5 dagen vereist. Monitor dagelijks de voortgang van de embryoontwikkeling met behulp van een stereomicroscoop om morfologisch zichtbare knockdown fenotypes te identificeren zoals afgebeeld in figuur 2.
- Documenteer deze voortgang door digitale foto's te maken met een camera met hoge resolutie. Verwijder dode embryo's en vul het water op de agaroseplaat dagelijks aan om uitdroging en de mogelijke verspreiding van microbiële besmetting naar andere overlevende embryo's tijdens de incubatieperiode te voorkomen.
- Voer passende controles uit voor dsRNA-injecties, inclusief bufferinjecties, injecties van dsRNA gesynthetiseerd tegen de zinstreng van het gen van belang, en injecties van dsRNA gesynthetiseerd tegen sequenties die niet bestaan binnen het doelorganisme. Bevestig RNAi knockdown met behulp van aanvullende moleculaire methoden22.
5. Bereiding van T. marmoratuslarven voor dsRNA-injecties
OPMERKING: In tegenstelling tot embryo's in een vroeg stadium zijn T. marmoratuslarven relatief stevig en kunnen ze met grotere volumes worden geïnjecteerd. Tweede insterren kunnen bijvoorbeeld worden geïnjecteerd met maximaal 2 μL dsRNA-werkoplossing en derde instars met ten minste 3 μL zonder merkbare negatieve effecten op de overlevingskans. Om dsRNA te injecteren, is het nuttig om larven te immobiliseren door ze in te bedden in agarose.
- Smelt voor het verzamelen van de larven 2% en bewaar het in een waterbad op 60-70 °C om het in vloeibare vorm te behouden. Bereid een immobilisatie schotel door gieten gesmolten 2% agarose in een kleine petrischaal en vervolgens afkoelen tot gestold. Gebruik stompe tangen om een ondiepe groef in de agaroseplaat te maken (ongeveer de grootte van de geleedpotigen die moeten worden ingebed) voor elk dier dat zal worden geïnjecteerd.
- Verzamel jonge larven in het juiste ontwikkelingsstadium (een fase voorafgaand aan het gewenste stadium voor analyse). Om dit te doen, haal het water voorzichtig uit de kweekbekers met de larven en volg de onderstaande stappen.
- Verdoving op ijs (haal de larve voorzichtig uit de waterbeker en leg hem zachtjes op ijs) totdat de larve geen opmerkelijke bewegingen vertoont. Gebruik stompe, zachte tangen om de larve voorzichtig uit het ijs te tillen en deze op het immobilisatiestadium te plaatsen met zijn nek en lichaam in de groef, maar de staart boven het agaroseoppervlak, zodat deze niet bedekt wordt, waardoor de larve door zijn staartspracles kan blijven ademen.
- Bedek de larve met een dikke laag agarose die nog steeds vloeibaar is, maar niet gevaarlijk heet. Als het per ongeluk was bedekt, gebruik dan de tangen om de staart en de twee segmenten eronder te bevrijden van de agarose. Zodra de agarose stolt, gebruik de larve voor dsRNA injecties.
6. dsRNA-micro-injecties bij T. marmoratuslarven
- Bereid en vul een microinjectienaald met de gewenste hoeveelheid genspecifieke dsRNA-werkoplossing (zoals beschreven in stappen 4.1–4.2). Bevestig de naald aan een naaldhouder die is aangesloten op een handmatig geregelde microinjectiespuit. Voordat u de naald bevestigt, trekt u de spuitzuiger helemaal naar buiten om te voorkomen dat de injectiedruk halverwege de procedure opraakt.
- Plaats de geïmmobiliseerde larve zodanig dat de injectieplaats, die zich dorsaal tussen de derde en vierde lichaamsplaatsegmenten bevindt, in een relatief vlakke hoek (bijna parallel aan het stadium) is afgestemd op de baan van de microinjectienaald.
OPMERKING: Het hengelen van de naald en de larve in deze positie is belangrijk, omdat het het pad van de minste weerstand biedt voor de naaldpunt om de larven te perforeren met minimale schade. - Zodra de naald en de larve zijn geplaatst, voorzichtig verplaatsen van de naald tip in de larve met behulp van de micromanipulator tijdens het toezicht op de voortgang door middel van een stereomicroscoop.
- Na de tip perforeert het weefsel, langzaam en zorgvuldig druk uitoefenen op de spuit. Pas de injectiedruk aan door de beweging van de gekleurde injectievloeistof in de naald onder de microscoop te observeren.
- Trek de naald na de injectie voorzichtig in. Gebruik zachte tangen om weg te pellen en dus de larve te bevrijden van de agarose. Breng de larve terug in een container met water (bij kamertemperatuur) en laat het zich verder ontwikkelen in een couveuse of kweekruimte op 25\u201228 °C en een lichtcyclus van 14 uur licht en 10 uur donker.
- Gebruik de juiste controle-injecties en knockdown kwantificeringen, zoals beschreven in stap 4.10.
Representative Results
Met behulp van het hierboven beschreven protocol hebben we drie verschillende genen neergehaald, namelijk wit, laccase2 (lac2) en Lens3 (tabel 1),in verschillende ontwikkelingsstadia van de Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. We voerden RNAi uit in T. marmoratus door dsRNA in een zeer vroeg stadium te injecteren tijdens embryogenese(figuur 1A). Omdat sommige embryo's het proces niet overleven en necrotisch worden(figuur 1B),moeten ze worden verwijderd om de resterende embryo's gezond te houden. Hier worden de injecties van dsRNA tegen het witte gen geïllustreerd. Dit gen is in Drosophila bekend als een van de drie ATP-bindende cassette (ABC) transporteurs die betrokken zijn bij de opname en opslag van de precursoren van oogpigment23. Het functieverlies resulteert dan ook in een unpigmented, white-eye fenotype. Onze resultaten tonen aan dat de injecties van dsRNA gericht op het orthologeuze witte gen in T. marmoratus embryo's leidt tot het verlies van oogpigmentatie bij nieuw opkomende larven. In dit geval worden wildtypelarven gekenmerkt door zwaar gepigmenteerde ogen, en de RNAi knockdown van wit leidt tot verschillende niveaus van vermindering en zelfs volledige eliminatie van oogpigment. Over het algemeen zagen we ten minste een afname van de oogkleuring in 34% van de overlevende embryo's (n = 35). Figuur 2A vergelijkt een controlepersoon en een individu met een iets lichtere oogkleur. Figuur 2B illustreert een ernstigere knockdown in een individu, waarbij de meer ventrale ogen (Ogen 2–5) van de cluster volledig ongepiigmenteerd zijn, terwijl de rugogen nog steeds wat pigmentatie vertonen. Deze verschillen benadrukken hoe de efficiëntie van de knockdown regionaal kan variëren, wat mogelijk gerelateerd is aan verschillen in de werkzaamheid van dsRNA-penetratie in dicht weefsel. Een ander individu toont in wezen volledig pigmentverlies in alle ogen(figuur 2C).
Om te onderzoeken hoe goed RNAi werkt in het larvestadium van T. marmoratus,injecteerden we dsRNA gericht op de tannine gen lac2 in de tweede instar larven een paar dagen voordat ze te wijten waren aan vervellen in derde insterren(Figuur 3) en evalueerden het effect op de cuticulaire kleur van derde instar larven. Lac2 is een soort fenoloxidase die oxidatieve eiwitten vervoedigt om ze onoplosbaar, harder en donkerder te maken. Knockdown in de bloem kever T. castaneum is aangetoond dat leiden tot lichter gekleurde personen in lage doses, maar wordt beschouwd als dodelijk in hoge doses24. Figuur 4 illustreert dat deze behandeling ook leidt tot lichtergekleurde Sunburst Diving Beetle larven. Specifiek, in dit experiment, had 75% van de overlevende geïnjecteerde larven (n = 12) verminderde pigmentatie (vergeleken met 0% in de controlegroep). Figuur 4A toont een individu met een relatief milde depigmentatie, terwijl figuur 4C het hoofd illustreert van een T. marmoratuslarve waarin de donkere kleur van de cuticula bijna afwezig is. Depigmentatie was vooral duidelijk voor de centrale donkere patronen die kenmerkend zijn voor deze larven, terwijl dit patroon duidelijk zichtbaar bleef in een door de controle geïnjecteerd individu(figuur 4B). Bovendien werd een verlichting van de staartpijpbeen waargenomen, zoals afgebeeld in figuur 4D. In het geval dat lac2 dsRNA in derde instarlarven werd geïnjecteerd, werden lichtere volwassen individuen verkregen (figuur 5). Merk op dat de vleugels van de knockdown kever zijn enigszins vervormd, waarschijnlijk te wijten aan de ongewone zachtheid.
Naast het veranderen van morfologische eigenschappen, is het mogelijk om RNAi te gebruiken om genen te targeten die gedrag beïnvloeden. Om dit aan te tonen, voerden we RNAi uit tegen een key lens eiwit codering gen, Lens318, en geïnjecteerd in de tweede instar larven om de optische eigenschappen van derde instar larve ogen beïnvloeden. Eventuele effecten op de lens hier waargenomen zijn waarschijnlijk omdat de ogen van T. marmoratus larven ondergaan grote groei van de ogen bij deze overgang, die ook grote optische veranderingen van de lens25impliceert . RNAi knockdown in dit experiment was zeer efficiënt. Verificatie via qPCR toonde een 100% slagingspercentage; van de 13 geteste personen, 12 werden neergehaald tot minder dan 10% van het expressieniveau van de controle individuen, met de resterende persoon met een expressieniveau van 17% van het controleniveau (ongepubliceerde observatie). Op fenotypisch niveau waren slechts enkele individuen ernstig gehandicapt of niet in staat om prooi te vangen, zoals blijkt uit figuur 6 voor een individu dat herhaaldelijk zijn prooi van een zeer korte afstand benaderde, maar consequent overschoot.
Tabel 1: Primer sequenties en amplicons voor witte, lac2- en Lens3-eiwitten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Illustratie van embryo-injecties. (A) Gedechorioneerde embryo's opgesteld op een agarose plaat en geïnjecteerd in de buurt van hun centrum met behulp van een micro-injectie naald gevuld met dsRNA en voedsel-kleurstof-bevattende injectie buffer. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (B) Een persoon met een meer ernstige knockdown. Geïnjecteerde embryo's worden bewaard in een vochtigheidskamer en dagelijks gecontroleerd om fenotypes te scoren en dode individuen te verwijderen (die bruin worden). De schaalbalk vertegenwoordigt 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van volledig ontwikkelde embryo's die met dsRNA tegen wit werden geïnjecteerd. (A) Vergelijking van een individu met een vermindering van de oogpigmentatie (links) en een door de controle geïnjecteerde persoon (rechts). E1–E6 verwijst naar Ogen 1–6. (B) Een persoon met een ernstiger knockdown fenotype, waaruit blijkt dat sommige ogen in het cluster soms ernstiger worden aangetast door de knockdown dan anderen. (C) Individueel met een bijna volledig verlies van oogpigmentatie. De schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm; De panelen B en C zijn op dezelfde schaal vertegenwoordigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van larve injecties. (A) Verschillende larven geïmmobiliseerd door inbedding in 2% agarose met hun staart spiracles links duidelijk van een agarose. (B) Microelectrode met de injectieoplossing die zo is geplaatst dat de punt het fijne membraan tussen twee segmenten kan binnendringen. (C) Blauwe injectiekleurstof zichtbaar op de injectieplaats na de injectie. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: RNAi voor laccase2 toegepast op tweede instar larven wat resulteert in verminderde cuticula kleuring in de derde instar larven. (A) Relatief mild verlies van kleuring in een lac2 RNAi individu (bodem) in vergelijking met een controle-geïnjecteerde individu (boven). De schaalbalk vertegenwoordigt 5 mm. (B) Hoofd van een controle individu met de karakteristieke donker gekleurde patroon in het midden van het hoofd. (C) Relatief ernstige knockdown van lac2 leidt tot een bijna volledig verlies van centrale kleur van het hoofd. (D) Verlies van kleuring in de belangrijkste staart cuticula van een lac2 RNAi individu (bodem) in vergelijking met een controle-geïnjecteerde individu (top). Schaalbalken in B\u2012D vertegenwoordigen 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: RNAi voor laccase2 toegepast op een derde instar larve wat resulteert in verminderde cuticula kleuring bij een volwassene. De knockdown individu (links) wordt ook gekenmerkt door zeer zachte elytra in vergelijking met de controle (rechts). De schaalbalk vertegenwoordigt 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Knockdown van een belangrijk lenseiwit dat leidt tot tekortkomingen in het vangen van prooien. (A-C). Drie voorbeelden waarin een Sunburst Diving Beetle larve, waarin optische tekorten werden veroorzaakt door RNAi, niet in staat was om prooien (muggenlarven) te vangen. Representatieve stilstaande beelden werden geselecteerd uit een video-opname van karakteristieke prooiopnames. (D) Controle larve vangen prooi. Alle schaal balken vertegenwoordigen 2 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Ons doel is dat deze compilatie van methoden RNAi op grote schaal beschikbaar zal maken, vooral omdat deze tool een krachtige synergetische techniek blijft voor CRISPR/Cas9-gebaseerde genbewerking, met als voordeel dat het kan worden toegepast op de gewenste ontwikkelingsstadia van bestudeerde organismen. Om deze kracht te illustreren, injecteerden we dsRNA in embryo's en in verschillende larvestadia. Injecties in eieren beïnvloedden de ontwikkeling van embryo's (figuur 2), injecties in het tweede larvestadium hadden zichtbare effecten op het derde larvestadium (figuur 4 en figuur 6), en injecties in het derde larval stadium vertoonden effecten bij de volwassenen (figuur 5). Hoewel de exacte timing experimenteel moet worden vastgesteld, worden injecties over het algemeen binnen een paar dagen van kracht. Het succes van dit proces kan worden beïnvloed door de lengte van de dsRNA-sequentie. Hier presenteerden we voorbeelden met behulp van iets meer dan 200 bp tot meer dan 800 bp. In het algemeen hebben sequenties tussen 100 en 600 basispunten de voorkeur om off-target effecten te beperken, maar sequenties tot 1000 bp leveren goede resultaten op22. Een vraag met betrekking tot RNAi is de duur van knockdown die kan worden bereikt door middel van deze techniek. Aangezien de fenotypes in elke fase terminaal waren, kunnen we op basis van onze gepresenteerde resultaten geen commentaar geven op deze kwestie. Eerder werd echter opgemerkt dat RNAi-effecten over het algemeen relatief lang leven en dat hogere concentraties leiden tot duurzamere knockdowns20.
Een beperking van deze techniek is dat het beter werkt voor sommige organismen dan voor anderen, en er lijkt geen directe manier om te voorspellen hoe goed het zal werken a priori. Toch blijkt het goed te werken voor een groot aantal verschillende organismen. Binnen geleedpotigen omvat dit spinachtigen26, schaaldieren27en een verscheidenheid aan insecten, met bijzonder hoge slagingspercentages bij kevers28. Een andere complicatie is dat verschillen in fenotype ernst vaak optreden tussen individuen, ondanks de toepassing van dezelfde hoeveelheid dsRNA. Zoals geïllustreerd in figuur 2B,variatie kan zelfs optreden binnen een individu. In onze RNAi-studies gericht op verschillende genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van larven van T. marmoratus, hebben we vaak vastgesteld dat sommige ogen ernstiger worden aangetast dan andere. Dit fenomeen kan worden gerelateerd aan het relatief dichte weefsel van de oogcluster, met de dsRNA beter in staat om een aantal van de eenheden te bereiken.
Voor de succesvolle uitvoering van RNAi experimenten is het van cruciaal belang dat verschillende parameters geoptimaliseerd zijn voor het doelgen. Zo kunnen bijvoorbeeld de concentratie van het dsRNA en de lengte van het beoogde gen de uitkomst20sterk beïnvloeden. Een andere kritische parameter is hoe de injecties worden uitgevoerd, omdat dit proces de overlevingskans sterk kan beïnvloeden. Voor embryo's behaalden we de beste resultaten door ons te richten op het centrum van het embryo. Een goed aangelegde plaat zorgt voor de injectie van 100 of meer embryo's in één sessie. Voor larven is het van cruciaal belang om de injectienaald tussen de segmenten te plaatsen. Deze injecties vereisen meer dsRNA, en op basis van de beschikbaarheid van larven bestonden onze injectiesets hier meestal slechts uit een paar dieren tegelijk. Voor alle injecties is het van cruciaal belang om te voorkomen dat er lucht in het organisme komt.
In sommige gevallen kunnen de feedbacklussen van een genregulerend netwerk en genetische redundantie de penetrantie van RNAi-fenotypes beïnvloeden, ondanks consistente knockdowns. Dit lijkt het geval te zijn voor onze gedragsobservaties van larven met zeer succesvolle knockdowns van een prominent lenseiwit, Lens318. Hoewel we de hoge efficiëntie van deze knockdowns geverifieerd door middel van qPCR, aanzienlijke variatie werd waargenomen in de bijbehorende fenotypes. Dit resultaat benadrukt de noodzaak van een behoorlijke kwantificering RNAi knockdowns (voor meer informatie over opties zie22). Als er geen duidelijke a priori verwachting met betrekking tot de resulterende fenotypes, een goede manier van controle voor de off-target effecten van RNAi is om hetzelfde gen te richten met twee niet-overlappende sequenties van dsRNA en om de resultaten voor gemeenschappelijke fenotypes te evalueren.
In tegenstelling tot genbewerkingstechnieken is RNAi ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van dodelijke genen, en er zijn twee manieren om dit te doen. Als men bijvoorbeeld geïnteresseerd is in de functionele bijdrage van een gen waarvan bekend is dat het verlies van functie vroeg in ontwikkeling dodelijk is, kan een functioneel onderzoek naar een dergelijk gen worden bereikt door het dier gewoon normaal te laten ontwikkelen en het gen later in ontwikkeling (d.w.z. bij de volwassene) te laten neerhalen. Als alternatief kan een gen waarvan bekend is dat volledig functieverlies dodelijk is, worden onderzocht door middel van een gedeeltelijke knockdown, die kan worden bereikt door een reeks dsRNA-concentraties te injecteren. Sommige van onze resultaten tonen knockdowns van lac2, waarvan bekend is dat ze dodelijk zijn als de cuticula bij insecten te zacht wordt24. Zelfs de lac2 RNAi kever afgebeeld in figuur 5 zou waarschijnlijk niet buiten laboratoriumomstandigheden overleven. Een ander dodelijk gen is gesneden,die codes voor een transcriptie factor die fundamenteel is voor cel-lot specificatie in verschillende orgaansystemen in geleedpotigen en is gekoppeld aan glia ontwikkeling in de Drosophila visuele systeem29. Op basis van onze ervaring met gesneden RNAi in T. marmoratus embryo's, kunnen we informatieve oogfenotypes oproepen in embryo's die in staat zijn om hun embryonale oogontwikkeling (ongepubliceerde waarnemingen) te voltooien. Hier, hogere doseringen lijken te leiden tot hogere letaliteit tarieven, terwijl lagere doses resulteren in waarneembare en informatieve fenotypes.
Ons protocol bevat niet alleen de noodzakelijke stappen voor een onderzoeker om RNAi-experimenten op T. marmoratusvoort te zetten, zoals geïllustreerd, maar is ook algemeen toepasbaar op andere organismen, met name aquatische organismen. Onder aquatische organismen, zijn er al verschillende voorbeelden binnen schaaldieren, zoals het water vlooien Daphnia30 en garnalen (voor een recente herziening, zie referentie31). Er zijn voldoende mogelijkheden onder aquatische insecten, omdat ze naar schatting ongeveer 6% van alle insectendiversiteit omvatten, met waarschijnlijk meer dan 200.000 soorten32. Bovendien is RNAi al uitgevoerd op water striders die de neiging hebben om het oppervlak van aquatische omgevingen bewonen33. Als er geen genoom aanwezig is, kan een transcriptoom de novo worden geassembleerd. Zolang dit proces aaneengesloten van een paar honderd nucleotiden onthult, kan dsRNA tegen specifieke genen worden ontworpen. Ons protocol voor het immobiliseren van insecten bij agarose zal waarschijnlijk ook nuttig zijn voor andere procedures, vooral voor zachte, kneedbare en aquatische organismen. Samen blijft RNAi een krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in een diverse groep organismen, zelfs als er geen andere moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dr Josh Benoit bedanken voor zijn hulp bij bioinformatica Hailey Tobler voor haar hulp bij het verhogen van Sunburst Diving Kevers en Tamara Pace voor redactionele hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation in het kader van subsidies IOS-1456757 en IOS-1856341 aan EKB en IOS1557936 aan YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
