Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/61477
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 2Department of Biology, Miami University, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

Summary

RNA干渉は、特定の発生段階で遺伝子発現を操作するための広く適用可能で強力な技術です。ここでは、この手法を、遺伝子配列の獲得から、構造や行動に影響を与える遺伝子のノックダウンまで、水生潜用カブトムシ の熱NECTTus marmoratusに実装するために必要なステップを説明する。

Abstract

RNA干渉(RNAi)は、mRNA分解による遺伝子発現の標的化低減を可能にする強力な技術であり続けています。この技術は、多種多様な生物に適用され、種が豊富なコレオプテラ(カブトムシ)で非常に効率的です。ここでは、この技術を新しい生物で開発するために必要なステップを要約し、水生潜水カブトムシ サーネクトゥス・マルモラトゥス の異なる発達段階への応用を説明する。標的遺伝子配列は、既知のゲノミクスまたはデノボとの近親的な親戚に対する転写体の組み立てを通じて、費用対効果の高い方法で得ることができる。遺伝子クローニング候補は、特定のクローニングベクター(pCR4-TOPOプラスミド)を利用し、単一の共通プライマーを使用して任意の遺伝子に対して二本鎖RNA(dsRNA)を合成することを可能にする。合成されたdsRNAは、早期発達過程のために胚に注入するか、後の発達過程のために幼虫に注入することができる。次に、アガロースでの固定化を用いて水生幼虫にRNAiを注入する方法を説明する。この手法を実証するために、RNAi実験のいくつかの例を提供し、予測された型を用いて特定のノックダウンを生成する。具体的には、日焼け遺伝子 ラッカゼ2 用RNAiは、幼虫と成人の両方でキューティクルの明るさを引き起こし、眼色素沈着遺伝子 白 に対するRNAiは眼管における色素沈着の明るさ/欠如を生じる。さらに、主要なレンズタンパク質のノックダウンは、光学的欠陥と獲物を狩る能力の低下を伴う幼虫につながります。これらの結果を組み合わせることで、転写データベースのみを有する生物における形態学的パターニングおよび行動特性の両方を調査するためのツールとしてRNAiの力を例示する。

Introduction

特定の遺伝子が多様な形質の進化にどのように寄与するのかという問題は、生物学におけるエキサイティングなトピックです。過去数十年の間に、線虫カエノールハブディティスエレガンス、フルーツフライショウジョウバエメラノガスター、ハウスマウスムスクルス1など、いくつかのモデル生物の発達過程の遺伝的基盤を解剖することに関して多くの進歩が見られました。最近では、クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas92のような強力な遺伝子編集技術の発明は、非モデル生物の遺伝コードを変更する能力を提供してきた(例えば33,44参照)。その結果、これまで分子技術を通じてアプローチされていなかった様々な生物の遺伝学的研究が急増しています。私たちの動物界の巨大な多様性を考えると、特定の種にのみ表現される多くの興味深い形質や形質の差異を持つこの進歩は、進化進化生物学(「evo-devo」)関連する研究のためのエキサイティングな時間となっています。しかし、非モデル生物が利用できるゲノム編集技術は、それらが適用できる発達時のポイントに関して比較的制限されており、特定の遺伝子がどのような形質において果たす役割に関連する時間的特性を見分けることは困難である。さらに、トランスジェニック技術は、生存に不可欠でない遺伝子(すなわちノックアウトが致死性をもたらさない)に限定されることが多い。したがって、遺伝子編集技術が普及し始めている一方で、特定の発達時の様々な生物に適用可能で、部分的なノックダウンを促進する効果的な技術が依然として必要とされている(機能の完全な損失ではなく)。ここでは、遺伝子編集に対する相乗的なアプローチとして特に価値のある、やや時代遅れでありながら強力な遺伝子ノックダウン技術5であるRNA干渉(RNAi)に注目を集める。具体的には、必要な分子配列の獲得から卵や幼虫への二本鎖RNA(dsRNA)の注入に成功することまで、この技術の実施を例に示す例として、水生潜水カブトムシへのRNAiの適用を可能にする手順を開発しました。

RNAiベースの遺伝子ノックダウンは、生物の先天的防御機構を利用し、dsRNA分子がウイルスやトランスポゾンなどの核酸配列のサイレンシングを促進する6。簡単に言うと、dsRNAは細胞に取り込み、そこでDicer酵素によって20〜25ヌクレオチドに切断されます。これらの断片は、次に、ガイド鎖を使用して特定の部位で特異的な部位に結合することによって標的mRNAを阻害するRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)の形成を活性化する。このプロセスは最終的にmRNA分解を招き、したがって、それぞれのタンパク質6へのmRNAの翻訳を妨げる。ここで提示されるRNAiベースの遺伝子ノックダウン技術は、したがって、dsRNAの注入に依存しています。動物モデルの場合、この技術はもともとC.エレガンス7とD.メラノガスター8で開発されたが、それ以来、非モデル生物99、1010の強力な機能遺伝ツールとして浮上している。昆虫の中では非常に効果的な性質のため、RNAiは害虫管理11にも適用できる。

RNAiは研究ツールとして、非伝統的な昆虫モデルにおける主要な分子発達経路の機能を調べるために使用されてきました。例えば、小麦粉カブトムシトリボリウムカスタネウム中のRNAiは、特に形状の翼,,12、13、14および目1415、16の発達のために例示されるように、そのカブトムシにおける特定の形質にどれだけ深く保存された遺伝子が寄与するかを決定するのに役立っている。,1316T.カスタネウムの操作の根本となる技術は17でよく説明されており、粘着性のある表面に比較的乾燥した卵と幼虫を固定化する能力に依存しています。しかし、このような固定化は、サンバーストダイビングビートル熱NECNECtus marmoratusのような水生生物の湿った発達形態には不可能である。多くの非伝統的なモデル生物の場合と同様に、それはアノノーテドゲノムを欠いている。ゲノムを持たない生物の遺伝子発現を操作するために、合理的かつ費用対効果の高い第一歩は、トランスクリプトームを生成し、関連するが確立されたモデル生物(この場合は主にトリボリウム(Coleoptera)およびショウジョウバエ遺伝子との配列類似性に基づいて、目的の発現遺伝子の推定ヌクレオチド配列を同定することです。

ここでは、水生生物に対するRNAiの使用方法を実証するために、まず、特定の標的遺伝子配列の同定を可能にするRNA抽出およびトランスクリプトーム生成および集合体のためのプロトコルおよびソフトウェアについて議論する。次に、遺伝子特異的dsRNAを合成するために必要なステップを要約する。続いて、水生環境で卵を注入する方法を説明し、胚の発達を培養するためのインキュベーションプロトコルを実証する。また、アガロースゲルを使用して、注射工程中に幼虫を完全に固定化する方法を示し、様々な手順で一般的に有用であり、様々な節足動物に適用できる技術を示しています。RNAiを異なる発達段階に適用する方法を実証するために、胚中の眼色素沈着遺伝子を 白く 沈黙させた例を挙げる。また、日焼け遺伝子 ラクケース2(lac2)が 第2の幼虫インスター(第3幼虫インスターの幼虫に影響を与える)と第3の幼虫インスター(成人に影響を与える)の両方で沈黙した例を説明する。最後に、dsRNAの濃度が低い注射が部分的なノックダウンにつながることを実証し、これはこの技術が機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子にも適用できることを示している。

Protocol

1. RNAの単離およびデノボのトランスクリプトームアセンブリ

  1. 脂質が豊富な組織用に設計されたRNA分離キット( 材料表を参照)を使用して、第3段階の第3段階の潜水カブトムバル眼管および成虫カブトムシから完全なRNA分離を行います。 T. marmoratus から全RNAを分離し、前に説明した方法18に従って配列する。
  2. デノボトランスクリプトームアセンブリ
    注:トランスクリプトーム・デ・ノボを組み立てるには、様々なバイオインフォマティクスプラットフォームを使用できます( 資料表を参照)。これらのプラットフォームは市販されており、場合によっては Unix ベースのコマンドラインスクリプトとして存在します。アセンブリは de novo であるため、2 つのプラットフォームで独立してトランスクリプトームを組み立て、結果を比較して偽陽性または偽陰性を除外することをお勧めします。
    1. トランスクリプトームの組み立てを開始するには、それぞれのバイオインフォマティクスプラットフォームで生読み取りをアップロードします。
      注:これらのファイルは、通常、圧縮され、FASTQSANGERの形式で行われます。Gz。この形式は次のステップで受け入れられるので、ファイルを解凍する必要はありません。
    2. Trimmomatic コマンド ラインを使用して、生の読み取りをトリムして、既定のしきい値を下回るアダプター シーケンスまたは短い読み取りを削除します。トリミングされた生の読み取りを解凍します。ファイルは FASTQ 形式になります。各サンプルの FASTQ の生読み取りを連結して、de novo アセンブリの準備ができているファイルを取得します。
    3. トランスクリプトーム・デ・ノボを組み立てることができるコマンドラインスクリプトを使用して、連結された生の読み取りを組み立てます。組み立てられたトランスクリプトームを保存しますが、それぞれのシーケンスを持つコンティグのリストが FASTA ファイルとして作成されます。アセンブリのカバレッジを増やすには、同じ種の複数のトランスクリプトームを組み合わせて組み立てます。
      注: このプロセスは、より正確なコンティグを生成する可能性を高め、低コピー数の遺伝子が関心がある場合に特に重要です。
    4. 組み立てたら、カバレッジスコアを計算してトランスクリプトームの完全性を評価します(カバレッジ評価ソフトウェアは自由に利用できます、 資料表を参照)。
      注: カバレッジ スコアが 75% のトランスクリプトームは良好と見なされます。しかし、このスコアの関連性は、トランスクリプトーム生成の理由に依存する。たとえば、トランスクリプトームが低コピー数の遺伝子を識別するために使用されている場合、より大きなカバレッジを意味するので、スコア>85%が優れています。
    5. 基本的なローカルアライメント検索ツールを使用して、デノボアセンブルトランスクリプトームにアノセンティブを付けます (BLAST; 資料一覧を参照)。
      注:この実験では、トランスクリプトームは、主に既知の ショウジョウバエ タンパク質のデータベースと既知のカブトムシタンパク質のデータベースに対して注釈を付けました。注釈のリストは、スプレッドシートファイルとしてダウンロードすることができ、他の生物のタンパク質とのシーケンスの類似性を示すコンティグ/コンティグは、FASTAファイルとしてダウンロードすることができます。
    6. 目的のタンパク質のコンティグ数/数を特定し、ヌクレオチド配列を抽出します。BLASTを使用して、タンパク質特異的保存領域(ホメオボックスドメインなど)が、対象のアノケン化されたヌクレオチド配列に存在しているかどうかを特定します。ヌクレオチド配列の重複について同じアノテーションを持つ他のコンティグをチェックして、遺伝子特異的転写物の配列を生成します。
      注:シーケンスの重複を持つコンティグを特定することは、通常、すべての遺伝子、特に低コピー数遺伝子では不可能です。
    7. 遺伝子の全長配列が必要な場合は、cDNA末端の3′および5′急速増幅などの技術を用いて成熟した転写物全体の塩基配列を同定するための開始点として最も高い配列類似性を有するコンティグから始める(RACE19)。
    8. 手順 1.2.4 – 1.2.7 に従って、2 番目のプラットフォームから取得したアセンブリにアセトします。
      注: 理想的には、結果は、目的のタンパク質に類似している必要があります。ただし、カバレッジはプラットフォームによってある程度異なる場合があります。
    9. 組み立てたトランスクリプトームを使用して、セクション2で概説されているように種特異的dsRNAを合成する。

2. クローニングと遺伝子特異的dsRNA合成

注: 遺伝子特異的クローニングおよびdsRNA合成は、T.カスタネウム20、21、2221,22について詳細に説明されています。20以下の手順は、簡単な概要です。

  1. クローニング、細菌変換、プラスミドシーケンシング
    1. 全RNAを生物から分離し(ステップ1.1で説明)、逆転写キットを使用して相補的DNA(cDNA)を作成する( 材料表を参照)。対象の遺伝子に特異的なコンティグから1つまたは2つの100〜1000 bpのヌクレオチド配列を同定します。
      1. 同定されたヌクレオチドのストレッチ全体にまたがるプライマーペアを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して配列を増幅します。最後に30分のステップを追加して、増幅されたDNA製品に3′アデニンオーバーハングを作成します。PCR精製キットを使用してこの製品を精製します( 材料表を参照)。
    2. クローニングキットに付属するベンダーのプロトコルに従って、精製した製品をpCR4-TOPOプラスミドベクター( 資料表を参照)にクローン化します。熱ショック処理を使用すると、クローン化されたプラスミドを有能な細菌細胞(株: 大腸菌 DH10B)に変換し、有能な細胞のベンダーのプロトコル( 材料表を参照)、正常に変換された細胞をスクリーニングします。
      注:コロニーを持つプレートは、水分を保持するためにパラフィンフィルムに包み、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
    3. 37°Cのシェーカーインキュベーターでアンピシリン(50μg/mL)を含むリソジニーブロス(LB)で10μLピペットチップと培養を使用して形質転換細胞のコロニーを摘み取り、24時間で200rpmを培養します。
      注:長期保存のために、培養細胞は100%グリセロールで1:1希釈し、グリセロールストックとして-80°Cで凍結することができます。
    4. ミニプレップ分離キットを使用して、この培養物から目的の遺伝子を含むプラスミドを分離します (材料表を参照)。分光光度を評価した後、-20°Cで分離プラスミド(minipreps)を保管します。具体的には、260 nm、280 nmおよび230nmでのサンプル吸光度を測定する。DNAを定量する比率A 260/A280、DNA純度を定量するA260/A230を計算します。260280 230
      注:260/280比1.8は一般に十分に純粋なDNAとして受け入れられ、1.5より低い比率はフェノールなどの残留抽出試薬の存在を示す。260/230 の比率は 260/280 の比率以上である必要があります。低い比率は、残留試薬汚染を示します。収率は通常100から500 ng/μLの範囲です。
    5. 分離されたminiprepsを配列して、遺伝子特異的断片が正常に統合され、プラスミド内の5′T7と3′T3プロモーター領域の間に横たわっていることを確認する。これは、ユニバーサルT7とT3シーケンシングプライマー22を使用して行うことができます。dsRNA調製物に関心のある遺伝子特異的配列を用いてミニプレップを使用してください。
  2. PCR増幅とインビトロdsRNA合成
    1. PCR増幅と製品精製
      1. 5'側にT7プロモーター配列を持つプラスミド特異的または遺伝子特異的プライマーを設計し(詳細については参照22 を参照)、挿入された遺伝子の直線的な断片を増幅する。20 μLの反応を少なくとも10回設定して、収率を最適化します。
        注:結果として得られる製品は、2つの20 bp T7ポリメラーゼ結合部位によって横に並んでいます。
      2. ベンダーのカラムベース溶出プロトコルに従って、PCR製品精製キット( 材料表を参照)を使用してPCR製品を精製します。収率を上げるには、最終溶出ステップを同じ溶出で3回まで繰り返します。分光光度の収率を評価する。
        注:収率は通常100から700 ng /μLの範囲です。この精製物は、さらに使用されるまで-20°Cで保存することができる。
    2. インビトロdsRNAの合成と精製
      1. 遺伝子特異的PCR精製産物を使用して、選択したdsRNA合成キットのプロトコルに従ってインビトロでdsRNAを合成します。必要に応じて、dsRNA産生を増加するためのインキュベーション時間を延長する。
      2. 反応混合物の不透明度に基づいて反応の進行を評価する(dsRNA生成物の量が多いほど、濁度が高くなる)。インキュベーションの終了時に、DNase処理を用いて反応を停止する。これを行うには、2 U / μLのストックから1μLを加え、反応混合物に加えます。この処理を1~2時間まで延長し、テンプレートDNAの最適な分解を確実にします。
      3. 精製キットまたは以下の手順でdsRNAを精製します。
        1. 得られた製品をヌクレアーゼを含まない水を115μLで希釈し、3M酢酸ナトリウムの15μLを加えます。この反応混合物に2量の氷冷100%エタノールを加え、-20°Cで一晩dsRNAを沈殿させる。
          注: この時点で、サンプルは最終歩留めに影響を与えることなく安全に保存できます。
        2. 9000 x g で0°Cで沈殿を20分間遠心し、上清を捨てます。氷冷70%エタノールと遠心分離機で1回13000xgで15分間洗浄 してください。
        3. 上清を取り除き、ペレットを5〜15分間乾燥させ、最大40μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁し(この体積は単離ペレットサイズに基づいて調整可能)、2.1.4に記載されているように分光光度と収率を評価します。
        4. 精製したdsRNAを-20°Cで保管し、さらに使用するまで保管してください。精製されたdsRNAを使用して、所望の現像段階で注射を行います。

3. dsRNA注射用初期T. マルモラトゥス 胚の収集と調製

  1. T.マルモラトゥス胚のインキュベーションのためにアガロースプレートを準備します。
    1. まず、100mLのオートクレーブ蒸留水(2%アガロース)に低融解アガロース粉末20mgを溶解し、次いで透明な溶液が得られるまで電子レンジで沸騰させます。気泡が溢れる可能性がありますので、熱い溶液に注意してください。
    2. この溶液を小さなペトリ皿に分配します。アガロースプレートの表面に溝(胚を保持する)を作るためには、液体アガロースの表面に3つの1〜2mm幅のプラスチックチューブ(プラスチック転写ピペットの先端など)を固める前に置きます。
    3. アガロースが固まったら、これらのチューブを取り除くために鈍い鉗子のペアを使用してください。P1000マイクロピペットを使用して500μLのオートクレーブ蒸留水を加え、アガロースのこれらのインデントをカバーします。
  2. 細かい天然毛の絵筆を使って、オートクレーブ蒸留水で満たされたガラスの空洞皿のカブトムシの巣から5〜8時間の古い T.マルモラトゥ ス胚を集めます。入れ子サイトを頻繁に監視して、得られた卵が適切な年齢であることを確認します。
  3. 微細解剖鉗子を用いて、実体顕微鏡下で胚をデコリオネートする。そのためには、光源を適切な角度に配置して顕微鏡下で(所望の倍率で)絨毛を視覚化し、鋭い鉗子で両側から絨毛を掴み、開き、そして、胚をそっと引き出します。2 つのレイヤーがあるので、両方とも削除されていることを確認します。
  4. 細かい天然毛のペイントブラシを使用して、慎重にガラスキャビティ皿からアガロースプレートに胚を転送し、実体顕微鏡の下で溝にそれらを配置します。デコリオネート胚は非常に壊れやすいので、このプロセス中に細心の注意を払ってください。dsRNA注射のために準備された胚を使用してください。
    注:少し厚い端は、頭部が発達する胚の側面です。

4. 初期 T.marmoratus 胚におけるdsRNAマイクロインジェクション

  1. 初期段階の胚に遺伝子特異的なdsRNAを注入するには、マイクロインジェクションニードルプーラーを使用してマイクロインジェクションニードルを準備します( 材料表を参照)。実体顕微鏡で針先を視覚化しながら、細かい鉗子を使って針先を壊し、鋭いエッジを作り出します。理想的には、針先を斜めに破って、より鋭いエッジが片側に残り、最小限の損傷を引き起こしながら胚に入ることができるようにします。
  2. 精製されたストックdsRNA溶液を氷の上に解凍し、10x注入バッファーの1μLを加え、二重蒸留水で上に置き、10 μLの注入溶液を作ります。注射の場合、dsRNA濃度は通常1μg/μLに適していますが、得られた動物の表向きの重症度に応じて調整することができます)。
    注:0.1 Mリン酸ナトリウムバッファーの10 μLを加えて10x注入バッファー22 の1mLを準備します(1 M Na2HPO4の8.5 mLと1.5 mLの1 M Naの混合によって作られました H2PO4は、100 μL 0.5 M KCl、100 μLの食品染料、790 μLの二重蒸留水で、25°CでpH 7.6に調整しました。
    1. P10ピペットを使用して、マイクロインジェクションニードルに働くdsRNA溶液をバックフィルします。溶液が針の先端を満たしたら、圧力放出技術を利用するマイクロインジェクションシステムに接続されたマイクロニードルホルダーに取り付けます( 材料表を参照)。
  3. マイクロインジェクションシステムと加圧空気供給をオンにします。マイクロインジェクションシステムのマイクロバルブを使用して、射出圧力を15 psiに調整します。時間調整ノブを使用して射出時間を調整します("秒"に設定)。
    1. 射出時間は必要な注入量に依存するので、必要に応じて、各注入の前にマイクロインジェクションシステムでこのパラメータを調整します。初期の T. marmoratus 胚に対して 1 - 2 nL の射出体積を使用します。
      注:より高い注入量は、胚生存率を妨げる傾向があります。
  4. マイクロインジェクションシステムによって分配される注入液の体積を測定するために、空気中に注入するとき針の先端に形成される液体の気泡の容積を査定することによって注入針を較正する。 T.marmoratus 胚の場合は、最適なバブルサイズ100~200μmを使用してください。注射針は、〜3 sの注射時間で15 psiで達成できる場合は良質である。
  5. 針が45°と60°の間の角度で胚に近づくような、実体顕微鏡下で胚を含む針とアガロースプレートを合わせます。
  6. マイクロマニピュレーターを使用して、顕微鏡を通して進捗を監視しながらマイクロニードルをゆっくりと動かします。針の先端が胚の表面に触れたら、慎重に針を前に動かし、胚の表面に突き刺さる。これは胚の生存に影響を与える可能性があるため、針先で胚を深く穿穿しないでください。変動を減らすために、胚の真ん中に注射を送出する。
  7. 針が胚の中に入ったら、マイクロインジェクターの注射ボタンを慎重に押して、dsRNAの用量を胚に送達する。1-2 nLのdsRNAを注入した後、ゆっくりと胚から針を引き込み、胚が破裂しないようにする。
    1. 同様の方法で他の胚を注入します。処置中にマイクロインジェクション針がブロックされた場合は、注射圧と持続時間を増やしてブロックを解除します。注射部位に着色スポットが存在することにより、正常に注入された胚を視覚的に識別する(注射バッファーには食品着色が含まれているため)。
  8. 慎重に注入された胚で皿を湿度室に置きます。
    1. このようなチャンバーを構築するには、蓋付きのプラスチック製の箱を取り、70%エタノールで殺菌し、乾燥させ、下部のオートクレーブ水に浸した組織を置いて湿った環境を提供します。適切な温度(この場合は25°C)と14時間光と10時間暗の光サイクルで、この湿度チャンバーをインキュベーターに入れます。
  9. 注射された胚が最初のインスター幼虫に発達することを可能にし、4〜5日を要する。 図2に示すように、組織学的に目に見えるノックダウン表現型を同定するために、実体顕微鏡を用いて、胚発生の進捗状況を毎日監視する。
  10. 高解像度カメラを使用してデジタル画像を撮影して、この進行状況を文書化します。死んだ胚を取り除き、毎日アガロースプレートの水を補充して、潜水期間中に他の生き残った胚への乾燥および微生物汚染の可能性を避けます。
  11. dsRNA注射に対して適切な制御を行い、バッファー注射、目的の遺伝子のセンス鎖に対して合成されたdsRNAの注射、および標的生物内に存在しない配列に対して合成されたdsRNAの注射を行う。追加の分子法22を用いてRNAiノックダウンを確認する。

5. dsRNA注射用 のT.マルモラス 幼虫の調製

注:初期の胚とは異なり 、T.マルモラス 幼虫は比較的頑丈であり、より大きな体積で注入することができます。例えば、第2のインスターは、生存率に顕著なマイナスの影響を及ぼすことなく、最大2μLのdsRNA作業溶液および3μL以上の3番目のインスターを注入することができる。dsRNAを注入するには、幼虫をアガロースに埋め込むことで幼虫を固定化することが有用である。

  1. 幼虫を採取する前に、2%アガロースを溶かし、60~70°Cの水浴に入れ、液体状に保ちます。溶かした2%のアガロースを小さなペトリ皿に注ぎ、固まるまで冷却して固定化皿を準備します。注射される動物ごとに、アガロースプレート(埋め込まれる節足動物の大きさ)に浅い溝を作るために鈍い鉗子を使用してください。
  2. 適切な発達段階(分析に必要な段階の1段階前)に若い幼虫を集める。これを行うには、幼虫を含む培養カップから慎重に水を排出し、以下の手順に従ってください。
  3. 幼虫が顕著な動きを見せないように氷の上で麻酔(慎重に水カップから幼虫を取り出し、氷の上にそっと置く)鈍い柔らかい鉗子を使用して、慎重に氷から幼虫を持ち上げ、首と体を溝に入れた固定化段階に置きますが、その尾はアガロース表面の上に位置し、幼虫が尾のスパイクルを通して呼吸を続けることができるようにします。
  4. まだ液体であるが、危険なほど熱くないアガロースの厚い層で幼虫を覆います。誤って覆われた場合は、鉗子を使用して尾部と、その下の2つのセグメントをアガロースから解放します。アガロースが固まったら、dsRNA注射に幼虫を使用する。

6. Marmoratus幼虫におけるdsRNAマイクロインジェクション

  1. マイクロインジェクションニードルに遺伝子特異的dsRNA作業溶液の所望量を準備し、バックフィルします(ステップ4.1~4.2で説明します)。手動で制御されたマイクロインジェクション注射器に接続された針ホルダーに針を取り付けます。針を取り付ける前に、注射器プランジャーをずっと引っ張って、注入圧力の中途半端な手順を使い果たさないようにします。
  2. 固定化された幼虫を固定化した幼虫の位置は、第3および第4のボディプレートセグメントの間に後ろ方向に位置する注射部位が、比較的平坦な角度(ステージとほぼ平行)でマイクロインジェクション針の軌跡と一致するようにする。
    注:針と幼虫をこの位置に釣り合うことは、針先が幼虫を最小の損傷で穿孔するための最小抵抗の経路を提供するので重要です。
  3. 針と幼虫を配置したら、顕微鏡で進捗をモニタリングしながら、マイクロマニピュレーターを使用して針先を幼虫に入れ込みます。
  4. 先端が組織を穿穿した後、ゆっくりと慎重に注射器に圧力をかける。顕微鏡下で針の着色注入液の動きを観察して射出圧力を調整します。
  5. 注射後は慎重に針を引っ込みます。柔らかい鉗子を使って剥がし、幼虫をアガロースから解放する。幼虫を水(室温)の容器に戻し、25\u201228°Cの培養器または培養室でさらに発達し、14時間光と10時間の暗さの光サイクルを可能にします。
  6. ステップ 4.10 で概説されているように、適切な制御注入とノックダウン定量を使用します。

Representative Results

上述のプロトコルを用いて、サンバーストダイビングビートルT.marmoratusのさまざまな発達段階lac2で、白、ラクケース2、Lens3(表1)という3つの異なる遺伝子を倒しました。 Lens3胚発生の非常に初期の段階でdsRNAを注入することによってT.marmoratusでRNAiを行った(図1A)。一部の胚はプロセスを生き残らず壊死性(図1B)に変わるので、残りの胚を健康に保つために除去する必要があります。ここで例示されるのは、白色遺伝子に対するdsRNAの注射である。この遺伝子は、眼顔料23の前駆体の取り込みおよび保存に関与する3種のATP結合カセット(ABC)トランスポーターの1つとしてショウジョウバエによく知られている。したがって、その機能の喪失は、未色素体の白目表現型をもたらす。我々の結果は、T.マルモラトゥス胚における直交白遺伝子を標的としたdsRNAの注射が、新たに出現した幼虫における眼色素沈着の喪失につながることを示している。この場合、野生型の幼虫は大きく色素化された眼が特徴であり、白色のRNAiノックダウンは様々なレベルの減少、さらには眼色素の完全な排除につながる。全体として、生存した胚の34%において少なくとも眼の着色がいくらか減少することを観察した(n=35)。図2Aは、対照個人と個人をわずかに明るい眼色と比較する。図2Bは、より多くの腹側の目(Eyes 2–5)が完全に色素していないのに対し、後眼はまだ色素沈着を示す個体におけるより深刻なノックダウンを示している。これらの違いは、ノックダウンの効率が地域的にどのように変化するかを強調し、おそらく緻密な組織におけるdsRNA浸透の有効性の違いに関連している。別の個体は、全眼における本質的に完全な顔料損失を示す(図2C)。

T.marmoratusの幼虫期でRNAiがどの程度うまく機能するかを調べるため、3番目の星に溶け込む数日前にタンニック遺伝子lac2を標的としたdsRNAを第2のインスター幼虫に注入し、第3インスター幼虫の切り口着色に及ぼす影響を評価した。Lac2は、タンパク質を酸化的にコンジュゲートして不溶性、硬く、暗くするフェロロキシダーゼの一種です。小麦粉カブトムシT.カスタネウムのノックダウンは、低用量で明るい色の個体につながることを示しているが、高用量24で致死的であると考えられている。図4は、この治療が明るい色のサンバーストダイビングカブトムシの幼虫にもつながることを示しています。具体的には、この実験では、生き残った注射幼虫(n=12)の75%が色素沈着を減少させた(対照群の0%と比較)。図4Aは比較的軽度の脱色症を有する個体を示し、図4Cは、キューティクルの暗い着色がほとんど存在しないT.マルモラトゥス幼虫の頭部を示している。これらの幼虫に典型的な中心暗いパターン形成に対しては特に色素沈着が顕著であったが、このパターンは対照注入された個体ではっきりと見えるままであった(図4B)。また、図4Dに示すように、尾気管の明るさが観察された。第3のインスター幼虫にlac2 dsRNAを注入した場合、より軽い成人個体が得られた(図5)。ノックダウンカブトムシの翼は、その異常な柔らかさのために、やや変形していることに注意してください。

形態形質の変化に加えて、RNAiを使用して行動に影響を与える遺伝子を標的にすることが可能である。これを実証するために、主要レンズタンパク質コード遺伝子 Lens318に対してRNAiを行い、それを第2のインスター幼虫に注入して、第3のインスター幼虫の目の光学特性に影響を与えた。ここで観察されるレンズに対する影響は、この転移で T.marmoratus 幼虫の目が大きな眼の成長を受け、レンズ25の大きな光学的変化も伴うためである可能性が高い。この実験におけるRNAiノックダウンは高効率であった。qPCR による検証は、成功率が 100% でした。試験された13人の個体のうち、12人は制御個人の発現レベルの10%未満に倒され、残りの個体は制御レベルの17%の発現レベルを有する(未発表の観察)。表現型レベルでは、非常に近い距離から獲物に繰り返し接近したが、一貫してオーバーショットした個人の場合、 図6 に示すように、重度の障害を持つ個人または獲物捕獲ができない個体は一部しかいなかった。

表1:白、lac2、およびLens3タンパク質のプライマー配列およびアンプリコン。こちらの表をダウンロードしてください。

Figure 1
図1:胚注射の図。(A)デコリオネート胚がアガロースプレートに並び、dsRNAと食品染料含有注射緩衝液を充填したマイクロ注射針を使用して中心付近に注入した。スケールバーは500 μmを表します。(B) より厳しいノックダウンを持つ個人。注入された胚は湿度室に保管され、毎日モニタリングされて表型を採点し、死んだ個体(茶色に変わる)を取り除く。スケールバーは5 mmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:白に対してdsRNAを注射した完全に発達した胚の例。 (A)眼色素沈着の減少を伴う個体(左)とコントロール注入個体(右)の比較。E1–E6は目1~6を参照する。(B) より深刻なノックダウン表現型を持つ個人で、クラスター内の目の一部が他のものよりもノックダウンによって深刻な影響を受ける場合があることを示している。(C) 眼色素沈着のほぼ完全な喪失を有する個人。スケールバーは200 μmを表します。パネル B と C は同じスケールで表されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:幼虫注射の図。(A)2%アガロースに埋め込んで、尾の尖塔を透明にして固定化した幼虫が何匹かいた。(B)注射液を含むマイクロ電極は、その先端が2つのセグメント間の微細膜を貫通できるように配置した。(C)注射後の注射部位で見える青色注射染料。スケールバーは1cmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:ラクケース2用RNAiを第2のインスター幼虫に適用し、第3のインスター幼虫におけるキューティクル着色を減少させる。(A) 対照注入個体(上)と比較した場合のlac2 RNAi個体(下)における着色の比較的軽度の損失。スケールバーは、ヘッドの中心にB特徴的な暗い色のパターンを示すコントロール個人の5mm.(B)ヘッドを表します。(C) lac2の比較的厳しいノックダウンにより、頭部の中心色付けがほぼ完全に失われる。(D) 対照注入個体(上)と比較した場合のLAC2 RNAi個体(下)の主要尾翼の着色の損失。B\u2012D の縮尺バーは 1 mm を表します。

Figure 5
図5: ラクケース2 用RNAiを第3のインスター幼虫に適用し、成人におけるキューティクル着色を減少させる。ノックダウン個人(左)は、コントロール(右)と比較すると非常に柔らかいエリトラも特徴です。スケールバーは5 mmを表 します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:獲物捕獲の欠乏につながる主要なレンズタンパク質のノックダウン。(A -C)RNAiを通じて光学的な欠陥が誘発されたサンバーストダイビングビートル幼虫が獲物(蚊の幼虫)を捕獲できなかった3つの例。代表的な静止画は、特徴的な獲物捕獲のビデオ録画から選択された。(D) コントロール幼虫捕食。すべてのスケールバーは2 cmを表します。

Discussion

我々の目標は、この方法のコンパイルは、特にこのツールがCRISPR / Cas9ベースの遺伝子編集に対する強力な相乗技術であり、研究された生物の所望の発達段階に適用できるという利点を持つため、RNAiを広く利用可能にすることです。この強さを例示するために、我々は胚および異なる幼虫段階にdsRNAを注入した。卵への注射は胚の発生に影響を及ぼす(図2)、第2幼虫段階への注射は第3の幼虫段階(図4 および 図6)に明らかな影響を及ぼす(図4および図6)、そして第3幼虫段階への注射は成人に効果を示した(図5)。正確なタイミングは実験的に確立されなければならないが、一般的に、注射は数日以内に有効になる。このプロセスの成功は、dsRNA配列の長さによって影響を受ける可能性があります。ここでは、200 bp以上800bp以上を用いた例を紹介した。原則として、100~600bpの間のシーケンスは、オフターゲット効果を制限することが好ましいが、1000bpまでのシーケンスは良好な結果を22に生じる。RNAiに関する1つの質問は、この技術を通じて達成できるノックダウンの持続時間です。各段階での現象は終点であったため、この問題について、提示された結果に基づいてコメントすることはできません。しかし、RNAi効果は一般的に比較的長生きしており、濃度が高いほど長持ちするノックダウン20につながることが以前に指摘されている。

この技術の1つの制限は、それが他の生物よりも一部の生物のためにより良く働くということです、そして、それがどれだけうまく機能するかを予測する直接的な方法はないようです。それにもかかわらず、さまざまな生物の広い範囲のためにうまく働くことがわかった。節足動物の中には、くも膜26、甲殻類27、およびカブトムシ28の成功率が特に高い様々な昆虫が含まれる。さらに複雑なのは、同量のdsRNAを適用したにもかかわらず、表現型重症度の差が個体間でしばしば起こることである。 図2Bに示すように、変動は個人内でも起こり得る。 T.マルモラトゥス 幼虫眼の発達に関与する異なる遺伝子を標的としたRNAi研究では、一部の眼が他の眼よりも深刻な影響を受けていることが頻繁にわかりました。この現象は、眼クラスターの比較的密度の高い組織に関連している可能性があり、dsRNAはユニットの一部に到達する可能性が高い。

RNAi実験を成功させるためには、標的遺伝子に対して複数のパラメータを最適化することが重要です。例えば、dsRNAの濃度および標的遺伝子の長さは、結果20に強く影響を与えることができる。もう一つの重要なパラメータは、このプロセスが生存率に大きな影響を与える可能性があるとして、注射がどのように実行されるかである。胚の場合、胚の中心を標的にすることで最良の結果を得た。十分にレイアウトされたプレートは、1回のセッションで100個以上の胚を注入することを可能にする。幼虫の場合、セグメント間に注射針を挿入することが重要です。これらの注射はより多くのdsRNAを必要とし、幼虫の可用性に基づいて、ここでの注射セットは通常、一度に数匹の動物で構成されていました。すべての注射のために、空気が生物に入るのを防ぐことが重要です。

場合によっては、遺伝子調節ネットワークのフィードバックループと遺伝的冗長性は、一貫したノックダウンにもかかわらず、RNAiのフェノタイプの浸透に影響を与える可能性があります。これは、著名なレンズタンパク質Lens318の非常に成功したノックダウンを伴う幼虫の行動観察に当てはまるようです。qPCRを通じてこれらのノックダウンの高効率を検証したが、関連する型においてかなりの変動が認められた。この結果は、RNAiノックダウンを適切に定量化する必要性を強調しています(オプションの詳細については22を参照してください)。得られたフェノタイプに関する明らかな先行予測がない場合、RNAiのオフターゲット効果を制御する良い方法は、dsRNAの2つの非重複配列を有する同じ遺伝子を標的とし、一般的な型の結果を評価することです。

遺伝子編集技術とは対照的に、RNAiは致死的な遺伝子を研究するための強力なツールでもあり、そうする方法は2つあります。例えば、開発初期の機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子の機能的寄与に興味がある場合、そのような遺伝子の機能的調査は、動物が正常に発達し、その後開発中にRNAiを介して遺伝子をノックダウンすることによって達成することができる(すなわち、成人で)。あるいは、完全な機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子は、部分的なノックダウンを通じて調べることができ、これはdsRNA濃度の範囲を注入することによって達成することができる。我々の結果のいくつかは、昆虫のキューティクルが過度に柔らかくなると致死的であることが知られているlac2のノックダウンを示しています24.図5に示すlac2 RNAiカブトムシでさえ、実験室外の状態では生き残ることはまずありません。別の致死性遺伝子は、節足動物における様々な器官系における細胞運命指定の基本であり、ショウジョウバエ視覚系29におけるグリアの発達にリンクされている転写因子のコードをカットする。T.マルモラトゥス胚における切断RNAiの経験に基づいて、胚の目の発達(未発表の観察)を完了することができる胚の有益な眼の現象型を呼び起こすことができます。ここで、高用量は、より高い致死率につながるように見えます, 低用量は、観察可能で有益な型をもたらす一方で.

我々のプロトコルは、研究者が図示されているように 、T.marmoratusに関するRNAi実験を追求するために必要なステップをリストアップするだけでなく、一般的に他の生物、特に水生生物にも適用可能である。水生生物の中には、水ノミ のダフニア30 やエビなどの甲殻類内にすでにいくつかの例があります(最近のレビューについては、参照31参照)。水生昆虫の間には、すべての昆虫の多様性の約6%を占めると推定されており、200,000種以上の32種を含むと推定されているため、十分な機会があります。さらに、RNAiは、水生環境33の表面に生息する傾向があるウォーターストライダーに対して既に行われている。ゲノムが存在しない場合は、トランスクリプトームをノボに組み立てることができます。このプロセスが数百ヌクレオチドのコンティグを明らかにしている限り、特定の遺伝子に対するdsRNAを設計することができます。アガロース中の昆虫を固定化するための私たちのプロトコルは、特に柔らかく、可鍛性、水生生物のために、他の手順にも有用であろう。一緒に考えて、RNAiは、他の分子および遺伝的ツールが利用できない場合でも、多様な生物群の遺伝子発現を操作するための強力な技術であり続けています。

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

ジョシュ・ブノイ博士のバイオインフォマティクス・ヘイリー・トブラーの支援に感謝します。この研究は、IOS-1456757とIOS-1856341をEKBに、IOS1557936をYTに付与下で国立科学財団によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly
liquid nitrogen University Stockroom Typically locally available at research institutions
pipette tips Fisher Scientific size dependent Products from other vendors would work equally well
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) Qiagen 74804 Detailed specific protocol is provided with the kit
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
1.2. De novo transcriptome assembly.
BUSCO.v3 https://busco.ezlab.org/ Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.
CLC Genomics workbench Qiagen 832021 Other equivalent software packages are also available
Galaxy workbench https://usegalaxy.org/ An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline
NCBI BLASTx https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx An open source online alignment and annotation pipeline
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation
ampicillin sodium salt Gibco 11593-027 Products from other vendors would work equally well
glycerol Fisher Scientific G33-500 Products from other vendors would work equally well
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Products from other vendors would work equally well
Omniscript RT (reverse trasncription) kit Qiagen 205111 Detailed specific protocol is provided with the kit
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010 Detailed specific protocol is provided with the kit
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit ThermoFischer 771471 Detailed specific protocol is provided with the kit
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
shaker-incubator Labnet 211DS Other models would work equally well
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
thermal cycler for PCR BioRad T100 Other models would work equally well
TOPO TA Cloning kit Invitrogen 1845069 Detailed specific protocol is provided with the kit
X-Gal Solution Thermo Scientific R0941 Products from other vendors would work equally well
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis
Centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack Roche 13873432 This kit contains all the reagents necessary for a PCR
MEGAclear Transcriiption clean up kit ThermoFischer AM1908 Detailed specific protocol is provided with the kit
MEGAscript T7 Transcription kit ThermoFischer AM1334 Detailed specific protocol is provided with the kit
nuclease-free water Fisher Scientific AM9932 Products from other vendors would work equally well
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
sodium acetate Fisher Scientific BP333-500 Make 3M working solution
Spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
distilled water Fisher Scientific 9180 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
glass cavity dish (3 well-dish) Fisher Scientific 50-243-43 Products from other vendors would work equally well
microwave Welbilt turn-table Other models would work equally well
natural hair paintbrush Amazon Any fine brush will do
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
transfer pipettes Fisher Scientific 21-200-109 Products from other vendors would work equally well
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos
digital camera Edmund optics (Qimaging) Retiga 2000R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
food dye Kroger Any available food dye should work fine
humidity chamber take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry
incubator Labline 203 Other models would work equally well
injection buffer Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C.
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) Parker 052-0500-900 Currently the model III is available, but older models work also
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micromanipulator Drummond Scientific Company 3-000-024-R Any quality micromanipulator will work
monosodium phosphate Fischer scientific 7558-80-7 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
P10 micro-pipetter Gilson F144802 Other models would work equally well
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
potassium chloride Fischer scientific 7447-40-7 To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.
sodium phosphate buffer (0.1M) To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.
sodium phosphate dibasic Fischer scientific 7558-79-4 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae
injection buffer (10x) See section 4
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
microinjection syringe A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
  2. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  3. Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
  4. Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
  5. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
  6. Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  9. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431, 338-342 (2004).
  10. Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
  11. Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
  12. Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
  13. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  14. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
  15. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
  16. ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
  17. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
  18. Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
  19. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
  20. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
  21. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
  22. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
  23. Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
  24. Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
  25. Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
  26. Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
  27. Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
  28. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
  29. Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
  30. Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
  31. Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
  32. Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
  33. Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).

Tags

環境科学、問題 159、RNA 干渉、二本鎖 RNA、dsRNA、昆虫、機能喪失、カブトムシ
特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathore, S., Hassert, J.,… More

Rathore, S., Hassert, J., Clark-Hachtel, C. M., Stahl, A., Tomoyasu, Y., Bushbeck, E. K. RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points. J. Vis. Exp. (159), e61477, doi:10.3791/61477 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter