Billeddannelse og kvantificering af området for hurtige mikrobobler ved hjælp af et højhastighedskamera og billedanalyse

Summary

Kavitation mikrobobler er afbildet ved hjælp af en high-speed kamera knyttet til et zoomobjektiv. Den eksperimentelle opsætning forklares, og billedanalyse bruges til at beregne kavitationsområdet. Billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ.

Abstract

En eksperimentel og billedanalyse teknik præsenteres for billeddiagnostiske kavitation bobler og beregning af deres område. Den højhastigheds-imaging eksperimentel teknik og billede analyse protokol præsenteret her kan også anvendes til billeddannelse mikroskopiske bobler i andre områder af forskning; derfor har det en bred vifte af applikationer. Vi anvender dette til billedkavitation omkring tand ultralydsskaller. Det er vigtigt at billedet kavitation at karakterisere det og til at forstå, hvordan det kan udnyttes til forskellige applikationer. Kavitation forekommer omkring dental ultralyd scalers kan bruges som en ny metode til fjernelse af plak, hvilket ville være mere effektiv og forårsage mindre skade end de nuværende parodontale terapi teknikker. Vi præsenterer en metode til billeddannelse kavitation boble skyer forekommer omkring dental ultralyd scaler tips ved hjælp af en high-speed kamera og et zoomobjektiv. Vi beregner også området kavitation ved hjælp af machine learning billedanalyse. Open source-software bruges til billedanalyse. Billedet analyse præsenteret er let at replikere, kræver ikke programmering erfaring, og kan ændres let, så de passer til anvendelsen af brugeren.

Introduction

Imaging bevægelsen af bobler er vigtigt for forskellige applikationer, fordi det styrer hydrodynamik af et system. Der er mange anvendelser, hvor dette kan være nyttigt: i fluidiserede seng^{reaktorer 1,2,}eller til rengøring med kavitation bobler^3,4. Formålet med billeddannelse bobler er at forstå mere om boble dynamik eller om retningen og bevægelsen af en sky af bobler. Dette kan gøres ved at observere strukturer afbildet og også ved hjælp af billedanalyse for at opnå kvantitative oplysninger, såsom størrelsen af boblerne.

Kavitationsbobler er gas- eller dampenheder, der opstår i en væske, når trykket falder til under den mættede trykværdi⁵. De kan forekomme, når et akustisk felt påføres en væske ved ultralydsfrekvenser. De gentagne gange vokse og kollapse, og ved sammenbrud kan frigive energi i form af højhastigheds-mikro-jetfly og chokbølger^6,7. Disse kan løsne partikler på en overflade gennem forskydningskræfter og forårsage overfladerensning⁸. Kavitationsbobler undersøges for overfladerensning i forskellige brancher, såsom for halvledere, fødevarer og sårrensning^9,10,,11,12. De kan også bruges til at rense plak fra tænder og biomaterialer såsom tandimplantater^12,,13. Kavitation sker omkring i øjeblikket anvendes dental instrumenter såsom ultralyd scalers og endodontiske filer og viser potentiale som en ekstra rengøringsproces med disse instrumenter¹⁴.

Svingningen af kavitationsbobler forekommer over et par mikrosekunder, og derfor er et højhastighedskamera forpligtet til at fange deres bevægelse ved billeddannelse med tusindvis af billeder pr.^{sekund 8}. Vi demonstrerer en metode til billeddannelse mikrobubble kavitation omkring dental ultralyd scalers. Målet er at forstå, hvordan kavitation varierer omkring forskellige ultralydsskaller, så det kan optimeres som en ny måde at rengøre plak.

Tidligere metoder, der anvendes til at undersøge kavitationen omfatter sonochemiluminesens, som bruger luminol til at opdage, hvor kavitation har^{fundet sted 15,16}. Men dette er en indirekte teknik, og det er ikke i stand til at visualisere kavitation bobler i realtid. Derfor er det ikke i stand til præcist at bestemme præcis, hvor det sker på instrumentet, og ingen oplysninger kan opnås på boblen dynamik, medmindre det er kombineret med andre billeddannelse teknikker¹⁷. High-speed imaging kan billedet ikke kun kavitation bobler vokser og kollapser, men også den type kavitation forekommende: kavitation skyer, mikrostrømper^ogmikro-jets⁶,^7,18. Disse giver flere oplysninger om, hvordan kavitationen kan rense overflader.

Vi præsenterer en metode til billeddannelse kavitation mikrobobler ved hjælp af en high-speed kamera og beregning af det gennemsnitlige område af kavitation forekommende. Denne metode er demonstreret ved hjælp af et eksempel på kavitation forekommer omkring forskellige dental ultralyd scaler tips, selv om de eksperimentelle og billedanalyse trin kan bruges til andre applikationer, såsom til billeddannelse andre makro og mikrobobler.

Protocol

1. Opsætning af instrument

1. Vælg det instrument eller objekt, der skal afbildes. I dette eksperiment blev der afbildet en ultralydsvægter. Kavitationsbobler opstår omkring spidsen af ultralydsskaller i vand.
2. Vælg en mikropositioneringsfase for det instrument, der skal afbildes med XYZ-oversættelse og rotation. Placer på et laboratorium jack. Fastgør instrumenthåndtaget til mikropositioneringsfasen
3. Vælg en optisk gennemsigtig vandbeholder til billedbehandling. Den beholder, der anvendes i disse eksperimenter blev skabt med glas mikroskop dias.
4. Vælg en XY-fase med en rotationsplatform. Placer på et laboratorium jack. Placer vandbeholderen på scenen og fyld med filtreret vand (omvendt osmose eller destilleret).

2. Opsætning af højhastighedskamera

1. Vælg et højhastighedskamera med den ønskede billedhastighed og opløsning og en højintensitetslyskilde med en fiberlysguide.
2. Fastgør en mikropositionerende skydeplade til højhastighedskamerahuset, og tilslut den til et stativstand.
3. Vælg en linse med den ønskede opløsning og brændvidde og fastgør dette til kameraet. Til dette eksperiment blev der anvendt et zoomobjektiv med en opløsning på 8,4 μm/pixel.
4. Fyld billedtanken med vand, og placer spidsen af det instrument, der skal afbildes i vandtanken, i den ønskede retning.
5. Når du har tilslutttttt kameraet og indlæst live view i softwaren, skal du bruge lav forstørrelse til at fokusere på spidsen af ultralydsvægteren og om nødvendigt flytte lyskilden. Placer instrumentet og lyskilden foran kameraet, og fokuser. Juster til den ønskede billedhastighed og lysstyrke.
   BEMÆRK: Der kræves en højere lysintensitet til billedbehandling ved høje rammer, korte lukkertider og/eller høje forstørrelser. Belysningen kan leveres i refleksionstilstand eller transmissionstilstand. I denne protokol leveres belysningen i transmissionstilstand (lyst felt) ved hjælp af en højintensitets koldbelysningsanordning.
6. Indstil en optimal billedhastighed og lukkertid for højhastighedskameraet. I dette eksperiment var billedhastigheden 6400 fps med en lukkerhastighed på 262 nanosekunder. En kort lukkertid er nødvendig for hurtigt bevægende bobler såsom kavitation bobler for at sikre, at de er i fokus.
7. Juster zoomobjektivets forstørrelse og lyskildens intensitet, så baggrunden er hvid uden at blive overeksponeret.

3. Kalibrering

1. Optag spidsens position (rotation i x-y-trin, instrumentets rotationsvinkel for reproducerbarhed).
2. Hvis du vil sikre, at synsfeltet er ensartet for hver gentagelse, skal du vælge et referencepunkt og notere koordinaterne ned. I dette tilfælde var referencepunktet spidsen af ultralydsvægteren. Den kan derefter flyttes i fremtidige eksperimenter på samme sted inden for synsfeltet.
3. Hvis pixelstørrelsen er ukendt, skal du afbilde en graticule med 10 μm-markeringer ved den indstillede forstørrelse og bruge billedanalysesoftware som f.eks.

4. Videooptagelse med høj hastighed

1. Billede af instrumentet uden kavitation. Dette vil blive trukket fra kavitation billeder i billedanalyse ved beregning af arealet af kavitation bobler. Gem videoerne i et format som TIFF, så ingen billedkvalitet går tabt.
2. Billede af instrumentet, der arbejder med kavitation. Sørg for, at der er tilstrækkelige rammer til nøjagtig analyse, for eksempel 5 gentagelser med 500 rammer hver.

5. Billedbehandling

1. Download Fiji¹⁹ fra ImageJ hjemmeside (https://imagej.net/Fiji). En ImageJ makro kode er blevet leveret som automatisk gør billedet analyse trin beskrevet nedenfor, og kan også ændres, så de passer til ansøgningen. De enkelte trin i makroen er beskrevet i trin 5.3-5.5.
2. Beskær billedet for at fjerne mørkere områder, der skyldes ujævn belysning, hvis det er nødvendigt. Sørg for, at alle billeder beskæres til samme størrelse og på det samme punkt i billedet.
3. Konverter billederne til binære ved automatisk at gå til ved hjælp af en af de automatiske tærskler. I dette eksempel bruges den mindste automatiske grænse.
4. Kør kommandoen fyldhuller for at fjerne sorte pixel inde fra boblerne, som fejlagtigt er segmenteret.
5. Beregn stakkens histogram for at vise det antal pixel, der svarer til skaleren og kavitationen i hver ramme.
6. I dette tilfælde er de pixel, der svarer til boblerne, hvide og har værdi 255. Gem disse målinger.
7. Gentag trin 5.3-5.6 for video af instrumentet, der fungerer uden boblerne.
8. Beregn kun det gennemsnitlige område af ultralydskrumredspidsen ud fra resultaterne af histogrammet.
9. Træk instrumentets gennemsnitsområde fra hvert af de områder, der beregnes ud fra videoerne af boblerne omkring skalaen. Det område af boblerne er overladt til at måle.
10. Visualiser ved at trække det binære billede af skaleren fra skalaens binære billede med bobler ved hjælp af billedberegneren i Fiji.
11. Beregne middelværdien og standardafvigelsen for boblernes areal.
12. Konverter værdierne fra antal pixel til område (i dette tilfælde μm²) ved at gange med pixelstørrelsen kvadreret. Beregn størrelsen af hver pixel ved at afbilde en graticule med højhastighedskameraet med samme forstørrelse, som blev brugt til billedbehandling, og brug ImageJ til at indstille skalaen.
13. Afbild dataene. Det er også muligt at foretage statistiske analyser for at vise nogen signifikant forskel på bobleområdet, hvis man sammenligner forskellige betingelser.

6. ImageJ makro

1. Gå til Plugins > Ny > Makro imenuen ImageJ/Fiji . Kontroller, at IJ1 Macro er markeret under sprogmenuen, og kopier og indsæt følgende kode. Klik på Kør for at udføre makroen (supplerende fil).

Representative Results

Billedanalysetrinnene kan ses i figur 1 for en af de testede ultralydsvægterespidser. En FSI 1000 spids og en 10P spids blev afbildet inde i en vandtank med kølevandet slukket (Figur 2). Kavitation opstod nær spidsens bøjning FSI 1000 ved maksimal effekt og nær den frie ende i spidsen 10P (Figur 3 og Figur 4). Det gennemsnitlige kavitationsområde var 0,1 ± 0,07 mm² for FSI 1000 spidsen og 0,50 ± 0,25 mm² for 10P spidsen (Figur 5).

Figur 1: Opsætning af højhastighedsbilleddannelse og billedanalysetrin (a) Skematisk af den opsætning af højhastighedsbilleddannelse, der anvendes i undersøgelsen. b) Skematisk af de billedanalysetrin, der anvendes i undersøgelsen, og som kun viser de rå billeder til venstre for skalaspidsen og med kavitation, som derefter blev binariseret og fratrukket hinanden for at beregne kavitationsskyernes areal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Sammenligning mellem forskellige tips High-speed billede stillbilleder viser kavitation forekommer omkring de to ultralyd scaler tips testet (a) FSI 1000 (b) 10P. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Tip 10P højhastighedsbilleder: Billeder med høj hastighed af tip 10P, fra en video taget med 6400 billeder pr. sekund. Kavitation kan ses omkring den frie ende af spidsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Tip FSI1000 højhastighedsbilleder: Højhastighedsbilleder af tip FSI 1000, fra en video taget med 6400 billeder i sekundet. Kavitation kan ses omkring midten af spidsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Resultater af analyse af billeder i kavitationsområdet. Det gennemsnitlige område af kavitation, der forekommer omkring FSI 1000 og 10P ultralydsvægterspidser beregnet ved hjælp af den beskrevne billedanalyseteknik. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den teknik, der er beskrevet i dette papir, muliggør billeddannelse af hurtige mikrobobler med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Det kan potentielt gavne en bred vifte af videnskabelige discipliner såsom kemiteknik, tandpleje og medicin. Tekniske anvendelser omfatter billeddannelse kavitation bobler til rengøring overflader, eller for billeddannelse bobler i fluidiserede seng reaktorer. Biomedicinske anvendelser omfatter billeddannelse kavitation omkring medicinske og dental instrumenter og billeddiagnostiske biofilm debridement fra hårdt og blødt væv ved hjælp af kavitation bobler. I denne undersøgelse demonstrerede vi teknikken ved billeddannelse kavitation omkring to forskellige dental ultralyd scaler tips. Mængden af kavitation varierer mellem de to tips testet i denne undersøgelse, med flere kavitation skyer observeret omkring den frie ende af spidsen 10P. Dette har tidligere været forbundet med vibrationsforlydne²⁰. Højhastighedsvideoerne viser, at FSI 1000 spidsen har mindre vibration, hvilket sandsynligvis er grunden til, at der er mindre kavitation omkring denne spids.

En begrænsning af billedanalysemetoden er, at billedet subtraktion teknik til at fjerne det område af skalaen er ikke helt nøjagtig, fordi skalaen er oscillerende og derfor subtraktion kan efterlade nogle områder af skalaen fejlagtigt segmenteret som bobler. Dette er imidlertid blevet taget i betragtning ved at beregne gennemsnittet af arealet fra et stort antal rammer (n=2000). Dette ville ikke være et problem for applikationer, hvor objektet, der skal trækkes, er stationært. For undersøgelser, hvor det bevægelige objekt, der skal trækkes fra, har en meget højere varians, anbefaler vi, at bevægelserne i begge videoer synkroniseres, før du trækker fra, så der vises nøjagtige resultater. I den aktuelle undersøgelse synkroniserede vi ikke svingningerne, men da vibrationerne var lave, kan vi antage, at svingningerne svarer godt til hinanden i disse to målinger.

Billedtærsklen er nøjagtig, fordi belysningen af det lyse felt giver en ensartet baggrund med god kontrast. Det er afgørende at sikre, at baggrunden er ensartet og ikke indeholder andre objekter, der kan være falsk segmenteret. Tærskelmetoden kan ændres ved hjælp af andre automatiske tærskler, der passer til applikationen. Manuel tærskelværdi, hvor brugeren angiver tærskelværdien, er også mulig, men anbefales ikke, da det reducerer resultaternes reproducerbarhed, da forskellige brugere vælger forskellige tærskelværdier.

Billedanalyse er blevet brugt til mange andre boblebilleddannelsesundersøgelser. Disse bruger også en lignende metode til baggrundsbelysning for at få optimal kontrast mellem boblerne og baggrunden, og tærskel for at segmentere boblerne^21,22,23,24. Den metode, der er vist i den aktuelle undersøgelse, kan også generaliseres til at blive brugt til mange forskellige boblebilledapplikationer, som ikke er begrænset til kun højhastighedsbilleddannelse. High-speed imaging er blevet brugt til kavitation bobler genereret i vand og også omkring instrumenter såsom endodontiske filer og ultralydsskaller^{12,25,,26,27,28}. For eksempel Rivas et al. og Macedo et al. brugt en high-speed kamera fastgjort til et mikroskop, med belysning fra en kold lyskilde til billedrensning med kavitation, og til billedet kavitation omkring en endodontisk fil^17,29. Lys feltbelysning giver større kontrast mellem baggrunden og boblerne, hvilket gør det muligt at anvende enkle segmenteringsteknikker såsom tærskelbehandling, som det fremgår af Rivas et al. til billeddannelse og kvantificering af kavitation erosion og rengøring over tid²⁹. Belysning af mørkt felt gør det vanskeligere at gå ned på grund af den højere variation i^{gråskala 4,30}. Billedanalyse er blevet brugt i andre undersøgelser til at indsamle flere oplysninger om^{bobler 1,2}. Vyas et al. brugte en maskinel indlæringstilgang til segmentkavitationsbobler omkring en ultralydsvægter²⁰. Den metode, der er beskrevet i det aktuelle papir, er hurtigere, fordi den bruger simpel tærskel, så den er mindre beregningsintensiv, og bobler, der forekommer over og under skaleren, kan analyseres. Den tærskelmetode, der anvendes i det aktuelle papir, er dog kun nøjagtig, hvis baggrunden er ensartet. Hvis det ikke er muligt at opnå en ensartet baggrund under billedbehandling, kan andre billedbehandlingsteknikker anvendes, såsom brug af baggrundsindtraktion ved hjælp af en rullende kugleradius til at korrigere for ujævn belysning, filtrering ved hjælp af median- eller gaussiske filtre for at fjerne støj eller også ved hjælp af maskinindlæringsbaserede^{teknikker 20,31}.

Afslutningsvis præsenterer vi en højhastighedsbilleddannelses- og analyseprotokol for at afbilde og beregne arealet af et mikroskopisk bevægeligt objekt. Vi har demonstreret denne metode ved billeddannelse kavitation bobler omkring en ultralyd scaler. Det kan bruges til billeddannelse kavitation omkring andre dental instrumenter såsom endodontiske filer, og det kan nemt tilpasses til andre ikke-dental boble imaging applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25x attachment	Navitar	1-50011
12x with 12mm fine focus Long distance microscope zoom lens	Navitar	1-50486
2x adaptor with f mount	Navitar	1-62922
Cavitron Plus Ultrasonic Scaler	Dentsply Sirona	8184003
Cavitron Ultrasonic Insert FSI 1000FSI 1000	Dentsply Sirona	UCAFTHD
Fibre light guide. 8mm fibre bundle 1500mm length. Focussing lens assembly for Hayashi light, 1/4"-20 tripod thread for mounting.	Hayashi	LGC1- 8L1500
Geared head	Manfrotto	MN405	7.5kg load capacity
HDF7010 High-Power LED Endoscope light source. 150W LED provides cold output equivalent to 250W Xenon.	Hayashi	LA-HDF710
Heavy weight Tripod	Manfrotto	MN475B	Geared centre column, 12kg load capacity
High Speed Camera	Photron	103526	FASTCAM Mini AX200 900K M3 (16GB memory)
High-Precision Rotation Stage	Thorlabs	PR01/M
Laboratory jacks	Camlab	1194083
Micropositioning sliding plate	Manfrotto	SKU 454
Micropositioning stage 3D	Thorlabs	PT3/M
Micropositioning stage rotation	Thorlabs	OCT-XYR1/M	OCT-XYR1/M - XY Stage with Solid Top Plate
NEWTRON P5 XS Ultrasonic Scaler	Acteon	F62118
Ultrasonic Insert 10P	Acteon	F00253