Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

פרדיגמת מיזוג פחד פבלובית חדשנית ללימוד הקפאה והתנהגות טיסה

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61536
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychology, Tulane University, 2Tulane Brain Institute, Tulane University

Summary

תגובות התנהגותיות הגנתיות מותנות בעוצמת האיום, בסמיכות ובהקשר החשיפה. בהתבסס על גורמים אלה, פיתחנו פרדיגמת מיזוג קלאסית המעוררת מעברים ברורים בין הקפאה מותנית להתנהגות טיסה בתוך נושאים בודדים. מודל זה חיוני להבנת הפתולוגיות הכרוכות בחרדה, פאניקה והפרעות דחק פוסט-טראומטיות.

Abstract

התנהגויות הקשורות לפחד וחרדה תורמות באופן משמעותי להישרדות האורגניזם. עם זאת, תגובות הגנתיות מוגזמות לאיום הנתפס אופייניות להפרעות חרדה שונות, שהן הצורה הנפוצה ביותר של מחלת נפש בארצות הברית. גילוי המנגנונים הנוירוביולוגיים האחראים להתנהגויות הגנתיות יסייע בפיתוח התערבויות טיפוליות חדשניות. מיזוג פחד פבלובי הוא פרדיגמה מעבדה בשימוש נרחב ללמוד למידה וזיכרון הקשורים לפחד. מגבלה מרכזית של פרדיגמות מסורתיות של מיזוג פחד פבלובית היא שהקפאה היא ההתנהגות ההגנתית היחידה המנוטרת. לאחרונה פיתחנו פרדיגמת מיזוג פחד פבלובית שונה המאפשרת לנו ללמוד הן הקפאה מותנית והן התנהגות טיסה (הידועה גם בשם בריחה) בתוך נושאים בודדים. מודל זה משתמש בעוצמת רגליים בעוצמה גבוהה יותר ומספר גדול יותר של זיווגים בין הגירוי המותנה לבין גירוי ללא תנאים. בנוסף, פרדיגמת טיסה מותנית זו משתמשת בהצגה סדרתית של טון טהור וגירויים שמיעתיים של רעש לבן כגירוי המותנה. בעקבות התניה בפרדיגמה זו, עכברים מפגינים התנהגות קפואה בתגובה לגירוי הטון, ותגובות טיסה במהלך הרעש הלבן. מודל התניה זה יכול להיות מיושם על המחקר של מעברים מהירים וגמישים בין תגובות התנהגותיות הדרושות להישרדות.

Introduction

פחד הוא תגובה הסתגלותית שמורה מבחינה אבולוציונית לאיום מיידי1,2. בעוד אורגניזמים להחזיק תגובות הגנתיות מולדות לאיום, אסוציאציות מלומדות חיוניות כדי לעורר תגובות הגנתיות מתאימות לגירויים המנבאים סכנה3. Dysregulation במעגלי המוח שליטה בתגובות הגנתיות עשוי לתרום לתגובות לא מתאימות הקשורות להפרעות חרדה מתישה מרובות, כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD), הפרעת פאניקה4, ופוביות ספציפיות5,6. שיעור השכיחות בארצות הברית עבור הפרעות חרדה הוא 19.1% למבוגרים ו 31.9% אצל מתבגרים7,8. הנטל של מחלות אלה הוא גבוה מאוד על שגרת היומיום של אנשים ומשפיע לרעה על איכות חייהם.

במהלך העשורים האחרונים, מיזוג פחד פבלובי שימש כמערכת מודל רבת עוצמה כדי לקבל תובנה עצומה לתוך המנגנונים העצביים שבבסיס למידה וזיכרון הקשורים לפחד9,10,11. מיזוג פחד פבלובי כרוך זיווג גירוי מותנה (CS, כגון גירוי שמיעתי) עם גירוי מרתיע ללא תנאי (ארה"ב; למשל, footshock חשמלי)12. מכיוון שהקפאה היא ההתנהגות הדומיננטית המעוררת ונמדדת בפרדיגמות מיזוג פבלוביות סטנדרטיות, מנגנוני הבקרה העצביים של צורות פעילות של התנהגות הגנתית כגון תגובות בריחה /טיסה עדיין לא נחקרו ברובם. מחקרים קודמים מראים כי צורות שונות של התנהגות הגנתית, כגון טיסה, מתעוררות בהתאם לעוצמת האיום, הקרבה וההקשר13,14. לימוד האופן שבו המוח שולט בסוגים שונים של התנהגות הגנתית עשוי לתרום באופן משמעותי להבנת התהליכים העצביים המופרזים בהפרעות פחד וחרדה.

כדי לענות על צורך קריטי זה, פיתחנו פרדיגמת מיזוג פבלובית שונה המעוררת קפיצות טיסה ובריחה, בנוסף להקפאה15. בפרדיגמה זו, עכברים מותנים בגירוי תרכובת סדרתי (SCS) המורכב מטון טהור ואחריו רעש לבן. לאחר יומיים של זיווג SCS עם רגל חשמלית חזקה, עכברים מפגינים הקפאה בתגובה לרכיב הטון וטיסה במהלך הרעש הלבן. מתגים התנהגותיים בין הקפאה מותנית להתנהגות טיסה הם מהירים ועקביים. מעניין, עכברים להפגין התנהגות טיסה רק כאשר CS רעש לבן מוצג באותו הקשר כמו footshock שנמסר בעבר (הקשר מיזוג) אבל לא בהקשר ניטרלי. במקום זאת, תגובות הקפאה שולטות בהקשר ניטרלי זה, עם רמות גבוהות משמעותית של הקפאה בתגובה לרעש הלבן בהשוואה לטון. זה עולה בקנה אחד עם תפקיד ההקשר בהסתעפות עוצמת התגובה ההגנתית ועם התפקיד הרגולטורי של מידע הקשרי בלמידה וזיכרון הקשורים לפחד שנמצאו בפרדיגמות מיזוג האיומים המסורתיות16,17. מודל זה מאפשר השוואות ישירות בתוך הנושא של התנהגויות הגנתיות מרובות באופן ספציפי להקשר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השלבים/נהלים הבאים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טוליין.

1. הכנת עכברים

  1. יש להשתמש בעכברים בוגרים זכר ו/או נקבה בגילאי 3-5 חודשים. במחקר הנוכחי, השתמשנו בעכברי C57BL/6J זכרים שהתקבלו ממעבדת ג'קסון, אך ניתן להשתמש בכל זן עכבר מספק מכובד.
  2. לפחות שבוע לפני הניסוי, לשכן את כל העכברים בנפרד על מחזור 12:12 שעות אור / כהה לאורך כל המחקר. ספק לעכברים גישה לליביטום למזון ומים.
  3. בצע את כל הניסויים ההתנהגותיים במהלך מחזור האור. בצע את כל ההפעלות בו-זמנית ביום בתוך קבוצת פעולות בודדת. לדוגמה, אם התחלת הניסוי בשעה 9 בבוקר ביום 1, המשך להתחיל באותו זמן עד להשלמת הניסוי.

2. הכנת חומרי לימוד

  1. הקשרי לימוד
    1. בחר שני הקשרים שונים לביצוע הניסויים.
    2. השתמש בתא גלילי המורכב פרספקס ברור (קוטר 30 ס"מ) כהקשר A, עם רצפת פרספקס חלקה. גובה התא צריך להספיק כדי למנוע בריחה (לפחות 30 ס"מ גובה).
    3. עבור הקשר B להשתמש במארז מלבני (25 ס"מ x 30 ס"מ) עם רצפת רשת חשמל המשמשת להעברת footshocks הנוכחי לסירוגין. הגובה של תא זה חשוב מאוד צריך להיות לפחות 35 ס"מ. גבוה. לחלופין, השתמש בגג שקוף (ודא שניתן להקליט וידאו באמצעות חומר זה).
      הערה: השתמש בתא עם משטחי קיר חלקים שניתן לנקות בקלות.
    4. השתמש בפתרון ניקוי אחר כדי לנקות את ההקשרים. לדוגמה, הקשר נקי A עם 1% חומצה אצטית והקשר B עם 70% אתנול. נקה את ההקשרים לפני תחילת הפגישה הראשונה, בין בדיקת עכברים בודדים ולאחר השלמת המפגשים של היום. זה חיוני כדי להסיר את רמזי הריח מעכברים קודמים. ניקוי יסודי יסייע גם במניעת קנה מידה של שתן על רשת ההלם, אשר יסכן מפגשי מיזוג.
      הערה: פתרונות הניקוי משמשים גם כסימן חוש הריח, ולכן משתמשים באותו נוזל ניקוי להקשר מסוים.
    5. מקם הקשר A או הקשר ב' בתיבה עם הנחתת קול במהלך מפגשי לימוד בהתאמה.
  2. מחולל שמע
    1. הר רמקול תקורה מעל ההקשרים כדי לספק גירויים שמיעתיים ב 75 dB.
    2. השתמש במחולל שמע ניתן לתכנות כדי ליצור גירויים שמיעתיים בלוח זמנים מוגדר מראש. הטון הטהור של 7.5 kHz הוא צליל עם צורת גל סינוסואידית, ואילו הרעש הלבן הוא אות אקראי בעל עוצמה שווה בתדרים שונים, החל מ- 1-20,000 הרץ.
    3. השתמש בפולסים TTL כדי לספק גירויים שמיעתיים אותות הלם עם דיוק זמני.
      הערה: לפני תחילת הניסויים, מדוד את פלט עוצמת הקול מהרמקול המותקן בכל תא באמצעות מד dB.
  3. מזעזע: חבר את ההלם עם רצפת רשת החשמל המשמשת להעברת הלם AC של 0.9 mA. הגדר את התדירות, ההתחלה ומשך הזמן של זעזועים בתוכנית מחשב. לספק כל גירוי הלם בסוף כל SCS למשך 1 s, בהיקף של חמישה SCS-הלם זיווגים לכל הפעלת מיזוג.

3. הכנת תוכנות מחשב ומעקב וידאו

  1. צור פרוטוקולים התנהגותיים באמצעות קידוד בתוכנה.
  2. בתוכנית, להגדיר את הגירוי תרכובת סדרתית SCS. גירוי זה הוא מצגת סדרתית של צליל טהור של 10 שניות (כל פיפס מוצג עבור 500 אלפיות השנייה, בתדר של 7.5 kHz וקצב של 1 הרץ) ורעש לבן של 10 (500 אלפיות השנייה ב- 1 הרץ).
  3. הגדר את מרווחי הניסיון הבין-ניסיון (ITI) המוצגים לאחר כל ניסיון, באופן מדומה.
  4. במהלך המחקר, להקליט את כל התנהגות העכבר וידאו לניתוח הבא.
    הערה: לא ניתן להגדיר תיבות מיזוג פחד הזמינות מסחרית כדי לתעד את אופני הפעולה באמצעות המצלמה המותקנת בחלק העליון. זה חשוב מאוד שכן הסרטון המוקלט משמש לחישוב תנועה אופקית, מהירות ומרחק כולל שנסע בעל החיים.
  5. להגדרת מעקב התוכנה, הנח עכבר בדיקה בכל הקשר רלוונטי, התאם את רגישות המעקב אחר קווי המתאר והגדר את מרכז הכובד. פעולה זו תבטיח רכישת נתונים אמינים על מיקום יחסי. בנוסף, הגדר את כל אזור ההקשר הנגיש לנושא.
    הערה: ההתאמה של גודל מיתאר עבור שני ההקשרים חשובה מכיוון שהשינוי בבהירות בהקשרים שונים ישנה את גודל קווי המתאר.
  6. קבע מקדם כיול באמצעות הגדלים הידועים של התאים ומידות הפיקסלים של המצלמה שניתן להשתמש בהן לחישוב מהירות (cm/s).
  7. סנכרן את אירועי חותמת הזמן של מחשב רכישת הנתונים למופעים בזמן אמת שלהם.

4. ניסוי התנהגותי

  1. הפעל את כל הציוד: מחשבים, בקר תיבת מיזוג פחד, מזעזע, ותוכנת הקלטת וידאו וחותמת זמן. ודא שהמכשירים מופעלים בסדר המתאים.
  2. בדוק את כל הפונקציות כולל צליל, רעש לבן ומסירה זעזועים, והגדר את המערכת לרכישת הנתונים.
  3. העבירו את בעלי החיים מחדר האחסון שלהם לחדר המיזוג. אפשר להם להתאקלם שם לפחות 10 דקות.
  4. מוציאים את החיה מהכלוב הביתי, מניחים אותה בעדינות בהקשר המתאים, ומיד מפעילים את המחשבים.
    הערה: ניתן לסנכרן הן את האתחול של מערכת מיזוג הפחד והן של תוכנת איסוף נתונים (חותמות זמן, מעקב עכברים והקלטת וידאו) בכל פעם באמצעות הפעלות מתווכות של פעימות TTL.
  5. טרום מיזוג/חשיפה מוקדמת
    1. ביום הראשון, מקם את הנושא בהקשר A (הקשר ניטרלי). אפשר לו להתאקלם בתא למשך 3 דקות (התקופה הבסיסית), ולאחר מכן חשוף אותו ל- 4 ניסויים של SCS של משך כולל של 20 שניות (איור 1A-1B).
    2. שמור על ITI מדומה ממוצע של 90 שניות (טווח 80-100 שניות). משך הזמן הכולל של כל מפגש טרום חשיפה הוא 590 s.
  6. מיזוג פחד
    1. ביום השני וביום השלישי, מקם את הנושא בהקשר ב'. לאחר תקופה בסיסית של 3 דקות, חשוף את הנושא לחמישה זיווגים של סיום משותף של SCS עם 1 s, 0.9 mA AC footshock.
    2. שמור על ITI מדומה ממוצע של 120 שניות (טווח 90-150 שניות). יש כל מפגש מיזוג אחרון עבור 820 שניות בסך הכל (איור 1A).
    3. בהתאם למטרה של הניסוי, עכברי נושא ביום 4 לבדיקת החזרה (ראה שלב 4.7) או כדי לחשוש מהכחדה (ראה שלב 4.8).
  7. החזרה לפחד (לבדיקת תלות בהקשר)
    1. ביום 4, מקם את הנושא בהקשר א'. לאחר 3 דקות תקופת הבסיס, להציג אותו עם 4 ניסויים של SCS ללא footshock, מעל 590 s.
    2. שמור על ITI מדומה ממוצע של 90 שניות (טווח 80-100 שניות).
  8. הכחדת פחד
    1. ביום 4, מקם את הנושא בהקשר ב'. לאחר 3 דקות תקופת הבסיס, להציג 16 ניסויים של SCS ללא footshock, מעל 1910 s.
    2. שמור על ITI מדומה ממוצע של 90 שניות (טווח 60-120 שניות).
  9. החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה וחזרו על ההליך לכל בעלי החיים.

5. כימות ההתנהגות

  1. יש צופה עיוור ציון הניסוי קטעי וידאו מוקלטים להתנהגות הקפאה באמצעות סף גלאי הקפאה אוטומטי ואחריו ניתוח מסגרת אחר מסגרת של שינויי פיקסל.
    הערה: חבילות תוכנה אחרות יכולות לשמש גם לחישוב הקפאה אוטומטית באמצעות מערכת 2 מצלמות. זה גם אפשרי עבור משקיף באופן ידני ציון התנהגות הקפאה.
  2. הגדר הקפאה כהפסקה מוחלטת של תנועות הגוף, למעט אלה הנדרשים להנשמה, לפחות 1 s.
  3. הציון קופץ כאשר כל 4 כפות הרגליים לעזוב את הרצפה, וכתוצאה מכך תנועה אנכית ו / או אופקית.
  4. יצא את הקובץ המסומן עם סמני הקפאה, קפיצה ואירוע.
  5. לחלץ אירועים רלוונטיים (הקפאה וקפיצות) מתקופות זמן מוגדרות (למשל, משך של 10 של טרום SCS, טון ורעש לבן, עבור כל ניסיון).
  6. באמצעות משכי ההתחלה-עצירה שחולצו של אירועים בקובץ גיליון אלקטרוני, חשב את משך ההקפאה (ב- s) על-ידי הפחתה של שעת ההתחלה מזמן הסיום, מתקופות הניסיון המתאימות.
  7. ייצג נתונים אלה מבחינת ניסיון או מבחינת יום, על-ידי סיכום משך ההקפאה מכל הניסויים.
    הערה: בהתאם למטרת המחקר, ניתן להבקיע ולחשב את התנהגויות הטיסה או ההקפאה מכל ניסיון/משך זמן ממפגש המחקר.
  8. סכם את המספר הכולל של קפיצות ממשך ניסיון מסוים.
  9. לחלץ את הקובץ שנוצר על ידי קואורדינטות מעקב אחר העכבר ממסגרת אחר מסגרת X-Y תנועת ציר של מרכז הכובד של העכבר ולחשב את המהירות של העכבר (ס"מ / ים).
    הערה: נתוני המהירות עשויים להיות קיימים בתבנית cm/s או בפיקסל/s. המר את יחידת הפיקסל/s לס"מ/ים באמצעות ערך אינץ' או ס"מ/פיקסל שהוגדר בסרטון עבור הקשר בדיקה זה (ראה סעיף 3.6).
  10. לאחר חילוץ נתוני מהירות לתנועת מסגרת אחר מסגרת של החיה, בהתבסס על קצב הפריימים של הסרטון (רצוי 30 פריימים/ים), חשב את המהירות הממוצעת של החיה בסוגר מספר מסגרת ספציפי (הכפל את זמני ההתחלה והסיום ב- s ב- 30 כדי לקבל את מספר מסגרת ההתחלה והסיום).
  11. לחשב את ציוני הטיסה על ידי חלוקת המהירות הממוצעת במהלך כל SCS על ידי המהירות הממוצעת במהלך 10 s טרום SCS (בסיסי, BL) ולאחר מכן הוספת 1 נקודה עבור כל קפיצת בריחה (speedCS / speedBL + # של קפיצות). לפיכך, ציון טיסה של 1 מציין שאין שינוי בהתנהגות הטיסה מתקופת טרום ה-SCS.
  12. באופן אופציונלי, ניקוד קטעי וידאו באופן ידני עבור התנהגויות אחרות כגון גידול וטיפוח.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. נתח נתונים עבור מובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. עבור כל הבדיקות, ההגדרה של מובהקות סטטיסטית היא P<0.05.
  2. בדוק את הנתונים עבור התפלגות נורמלית באמצעות בדיקת הנורמליות שפירו-וילק (α = 0.05).
  3. כדי לבדוק את ההשפעה של רמזים, בצע את ההשוואות הזוגיות באמצעות מבחן פרמטרי מתאים (מבחן t מזווג) או לא פרמטרי (מבחן דרגה חתומה של וילקוקסון).
  4. כדי להעריך את האינטראקציה הדו-כיוונית של גורמים (משפט Cue X), בצע ANOVA דו-כיווני ואחריו בדיקות שלאחר הוק (למשל, מבחן ההשוואה המרובות של Bonferroni / המבחן של Tukey).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כמתואר בתרשים (איור 1A),ההפעלה מתחילה בחשיפה מוקדמת (יום 1), ולאחר מכן בהתניה של פחד (ימים 2 ו- 3), ולאחר מכן בהכחדה או באחזור (יום 4).

מצגות של ה-SCS במפגש טרום החשיפה (יום 1) לא עוררו תגובה של טיסה או הקפאה בעכברים (איור 2A-2B). ניתוח התנהגותי במהלך ההתניה (ימים 2 ו-3) גילה כי רכיב הטון של ה-SCS שיפר באופן משמעותי את ההקפאה בהשוואה להקפאה במהלך ה-SCS(איור 2B,2E). ציוני הטיסות השתנו באופן משמעותי במפגשים (יום 1 עד יום 3, n = 20; איור 2A). עכברים הראו מהירות גבוהה יותר וקפיצות נוספות, וכך ציוני טיסה גדולים יותר, לסימן הרעש הלבן בהשוואה לטון(איור 2C-2D). עכברים הראו מעבר ברור של התנהגות הגנתית - הצגת ציוני טיסה נמוכים יותר במהלך הטון ואחריו ציוני טיסה גבוהים יותר במהלך רעש לבן (איור 2F) ולהיפך לתגובות הקפאה (איור 2G).

כדי לבדוק את ההשפעה של קרבת איומים והקשר בטיסה מותנית, עכברים חולקו לשתי קבוצות: קבוצה אחת עברה אימוני הכחדה בהקשר ההתניה (איור 3A-3B),וקבוצה אחרת נבדקה לזכר זיכרון הפחד על ידי חשיפתם ל- SCS בהקשר ניטרלי (איור 3C-3D). עכברים שנחשפו ל-16 ניסויים של אימוני הכחדה הראו הכחדה מהירה של טיסה מותנית (n = 12). ציוני הטיסות בבלוק הראשון של ארבעה ניסויים היו גבוהים יותר במהלך רעש לבן בהשוואה לטון (איור 3A). התנהגות הטיסה כבר לא עוררה אף אחד מהסימנים בסוף פגישת ההכחדה. חלה ירידה כוללת בהקפאה הנגרמת על ידי טון ועלייה בהקפאה בתיווך רעש לבן במהלך מפגש ההכחדה. ההקפאה לבלוק הראשון של ארבעה ניסויים הייתה גבוהה משמעותית מהטון בהשוואה לרעש הלבן (איור 3B). הדבר מצביע על כך שהאיום חיוני לתגובת הטיסה.

תגובת הטיסה פחתה באופן תלוי הקשר. החשיפה לרעש הלבן בהקשר הניטרלי לא עוררה טיסה (n = 8). במקום זאת, מצגות רעש לבן בהקשר הניטרלי עוררו תגובות הקפאה שהיו גבוהות מאלה שעורר הטון (איור 3C-3D). זה ממחיש את החשיבות של ההקשר בהסתעפות התגובה ההגנתית.

Figure 1
איור 1: תכנון מחקר להערכת הקפאה ופרדיגמה של טיסה.
A) דיאגרמה של הפעלות התנהגותיות. ב)תרשים המפרט את הרכב הגירוי המורכב הסדרתי (SCS), כמו גם את העיתוי של ארה"ב. ג) הקשר A - שימש כהקשר ניטרלי, ושימש במהלך הפעלות טרום חשיפה ואחזור. ד)הקשר ב' – משמש להתניה של פחד. נתון זה שונה מ Fadok ואח '. 2017. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תגובת טיסה מותנית.
A) השוואה של ציוני טיסה ממוצעים מבחינת ניסיון (n = 20) לאחר הצגת הטון והרעש הלבן בימים 1-3. צוין שינוי משמעותי בציוני הטיסה במפגשים (יום 1 עד יום 3; אמצעים דו-כיווניים חוזרים ונשנים ANOVA, קיו × אינטראקציה עם ניסוי, F (13, 266) = 5.795; P<0.0001). מבחן ההשוואה המרובות של בונפרוני לאחר הוק מגלה הבדל משמעותי בין הטון לרעש לבן המושרה ציוני טיסה ביום מיזוג הפחד 1 (ניסיון 4, P < 0.05) ויום 2 (ניסויים 2-5, P < 0.001). ב)השוואה של ממוצע ניסיון חכם % הקפאה במהלך הטון ותקופות רעש לבן על פני ימים 1-3. שים לב לשינוי מובהק סטטיסטית בהקפאת % על-פני המפגשים (יום 1 עד יום 3, n = 20; ANOVA דו-כיווני חוזר,cue × אינטראקציית ניסיון, F (13, 266) = 20.81; P < 0.001; איור 2B). מבחן ההשוואה המרובות של פוסט-הוק בונפרוני מגלה הבדל משמעותי בין הטון לרעש הלבן הנגרם להקפאה ביום מיזוג הפחד 1 (משפט 4 ו-5, P < 0.001) ויום 2 (כל הניסויים, P < 0.001). ג)השוואה בין מספר תגובות הבריחה בקפיצה במהלך תקופות טרום SCS, טון, רעש לבן והלם ביום 3. ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Bonferroni הראו כי קפיצות בריחה היו גבוהות משמעותית במהלך רעש לבן והלם בהשוואה לתקופת הטון (P < 0.01 ו- P < 0.001, בהתאמה). ד)השוואת ציוני הטיסה במהלך הצגת הטון והרעש הלבן ביום השלישי. שים לב ציוני טיסה גבוהים משמעותית ביום 3 במהלך תקופת רעש לבן (P < 0.001, וילקוקסון תאם זוגות חתום מבחן דרגה). ה)השוואה של % הקפאה במהלך טרום SCS, טון, ורעש לבן ביום 3. התנהגות הקפאה ביום 3 חושפת השפעה משמעותית של טון ורעש לבן (צעדים חוזרים בכיוון אחד ANOVA, F = 56.82, P<0.01). בדיקת ההשוואות המרובות של Bonferroni הראתה כי הצגת הטון מגדילה באופן משמעותי את משך ההקפאה לעומת משך טרום SCS (P < 0.01), ואילו הקפאת % הופחתה באופן משמעותי בהשוואה לתקופות טרום SCS וטון (הן P < 0.001). הנתונים הייצוגיים מבחינת הניסוי מראים מעברים של טיסה (F) והקפאה (G) התנהגות בעקבות הצגת הטון ורעש לבן בעכבר ביום 3. הערכים המיוצגים הם ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. טרום חשיפה, טרום חשיפה. לוחות A-E משתנים מ Fadok ואח ', 2017. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכחדה והחזרה לאחר מיזוג הטיסה (יום 4).
A) השוואה של ציוני הטיסה במהלך אימון הכחדה הראתה הכחדה מהירה של טיסה מותנית (n = 12; 16 ניסויים, דו כיווני חוזר-אמצעים ANOVA, אות × אינטראקציה ניסיון, F(15,165) = 3.05, P < 0.01). ציוני הטיסה מהבלוק הראשון של ארבעה ניסויים (ניסיון 1-4) של הכחדה נצפו גבוהים משמעותית עבור רעש לבן בהשוואה לטון (P < 0.05, וילקוקסון תאם זוגות מבחן כיתה חתומה). ב)השוואת ההקפאה הראתה השפעה מובהקת סטטיסטית על ההקפאה (%) בעקבות רעש לבן (n = 12; 16 ניסויים, דו-כיווני חוזר-אמצעים ANOVA, אות × אינטראקציה ניסיון, F(15,165) = 3.55, P < 0.01). ההקפאה עבור הבלוק הראשון של ארבעה ניסויים (ניסוי 1-4) במהלך ההכחדה נמצאה נמוכה משמעותית במהלך תקופת הרעש הלבן בהשוואה לטון (מבחן t מזווג, P < 0.01). ג)שינויים בהקשר משפיעים באופן משמעותי על ציוני הטיסה (n = 8; 4 ניסויים, ANOVA דו-כיווני חוזר,cue × אינטראקציית ניסיון, F(1,7) = 27.44, P < 0.01). ציוני הטיסה הצטמצמו באופן משמעותי במהלך רעש לבן בהשוואה לתקופת הטון בהקשר הניטרלי (מבחן t מזווג דו-זנבי, P < 0.01) D). הקפאת תגובות על פני ניסויים במהלך אחזור היו גם משמעותיים (n = 8, 4 ניסויים, דו כיווני חוזר-אמצעים ANOVA, ההשפעה של אות F(1,7) = 27.67, P < 0.01). חשיפה של WN בהקשר ניטרלי הגדילה באופן משמעותי את תגובות ההקפאה בהשוואה לטון (מבחן t מזווג דו-זנבי, P < 0.001). הערכים המיוצגים הם ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001. לוחות A-D משתנים מ Fadok ואח '. 2017. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרמטרים המתוארים של צליל והלם הם מרכיבים חשובים בפרוטוקול זה. זה קריטי, אם כן, כדי לבדוק את משרעת ההלם ואת רמת הלחץ קול לפני תחילת הניסויים. מחקרי מיזוג פחד משתמשים בדרך כלל ברמות לחץ קול של 70-80 dB ובעוצמת זעזועים של 0.1-1 mA18; לפיכך, הפרמטרים המתוארים נמצאים בגבולות פרדיגמות מיזוג הפחד המסורתיות. בניסוי שליטה קודם של CS בלבד (ללא רגליים), לא ראינו תגובות טיסה או הקפאה בעכברים, מה שמצביע על כך שהגירויים השמיעתיים אינם מרתיעים כאשר הם מוצגים כמתואר15. הגדלת רמת dB של הרעש הלבן מעל 80 dB עלולה לגרום לסלידה מולדת. עם זאת, גירויי רעש המוצגים ב 75 dB אינם מעוררים מתח בצורה של פעילות התנהגותית מודחקת בעכברים19.

יש לבחור בקפידה את הגירויים השמיעתיים המרכיבים את ה- SCS. במחקר הקודם שלנו, קבענו כי מיזוג חד-מערכתי עם רעש לבן גורם לציוני טיסה גבוהים יותר מאשר התניה בטון טהור15. זה ממחיש את החשיבות של גירוי בולט בפרוטוקול זה20. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי התניה עם היפוך של רצף SCS (רעש לבן-טון) תוצאות טיסה אל הטון והקפאה לרעשהלבן 21. נתונים אלה מאשרים כי הקשר הזמני המלומד של הרמזים הוא גם גורם חשוב.

מכיוון ששינויים בכלוב הם מקור פוטנציאלי ללחץ, מומלץ להתחיל להתנות לפחות יומיים לאחר שינוי הכלוב האחרון. כדי למזער עוד יותר את ההשפעה של מתח בעכברים העוברים מחקר, יש לנקוט טיפול הולם כדי להפחית את רמזי הריח שנותרו מנבדקים קודמים, כולל ריח של צואה ושתן. לכן, ניקוי התא לפני ואחרי כל עכבר הוא חיוני. כדי למנוע מקורות פוטנציאליים אחרים של הפרעה, עדיף לנהל פרוטוקול זה בחדר מופרד מכל ניסויים מתמשכים אחרים. עכברים צריכים להפגין הקפאה בסיסית נמוכה מאוד15. כדי לבדוק את תנאי הניסוי, כל מעבדה צריכה לערוך ניסוי פיילוט לבדיקת הקפאה בסיסית בכל הקשר.

מלבד C57BL/6J וקווים מהונדסים אחרים המשמשים את Fadok et al. (2017)15, שיטה זו צריכה להיות מתאימה להתאמה לזנים אחרים של עכברים וחולדות20,21. נתונים עדכניים (Borkar et al. 2020)22 מצביעים על כך שעכברים זכריים ונקביים כאחד מראים תגובות טיסה דומות, ולכן הפרדיגמה מתאימה לשני המינים. כפי שהוזכר בשלב 2.1.2, בתגובה לזעזועים בעוצמה גבוהה, עכברים קופצים גבוה מאוד, ובכך בוחרים בזהירות את גובה התא כדי למנוע מהעכברים לברוח מההקשר. חשוב גם להבטיח את התזמון העקבי והמדויק של רמזים וגירויי הלם. זעזועים AC ו DC יעילים; עם זאת, בעת שימוש זעזועים DC, ייתכן שיהיה צורך להגביר את עוצמת footshock כדי להגיע ציוני טיסה דומים לזה של זעזועים AC. מכיוון שלזעזועים ב-DC יש השפעה פחות מזיקה על הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, השימוש בהלם DC מומלץ למחקרים הדורשים נתוני אלקטרופיזיולוגיה. חשוב לציין כי הפחתת עוצמת ה-footshock עשויה להקטין את עוצמת תגובת הטיסה.

כפי שמציין בפרוטוקול, ציוני הטיסה מחושבים על-ידי נרמול נתוני המהירות במהלך הטון והרעש הלבן על-ידי חלוקתם בערכי מהירות קדם-SCS של ניסויים בודדים. עם זאת, אם עכבר מציג רמות גבוהות מאוד של הקפאה במהלך טרום SCS, ציוני הטיסה וכתוצאה מכך עשויים להיות גבוהים מאוד, ובכך להגדיל את שונות הנתונים. ניתן לעקוף זאת באמצעות מדידה בסיסית שונה, כגון נתוני מהירות ממוצעת מתקופת התוכנית הבסיסית של 3 דקות בתחילת ההפעלה או באמצעות המהירות הממוצעת של קדם-SCS הכולל (ממוצע של 5 ניסויים), במקום ערכי קדם-SCS של ניסיון בודד.

הסתגלות התנהגותית גמישה ומהירה לאיום חיונית להישרדות. רוב פרוטוקולי מיזוג הפחד הקלאסיים משתמשים בתנאים הגורמים להקפאה כגורם מכריע בלבד בלמידה לפחד. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לימוד של מעברי מצב הגנתי מורכבים בתוך נושאים. בעבר, מודל זה שימש כדי לגלות כי מעברים התנהגותיים מעובדים על ידי מעגלים מעכבים חוזרים מקומיים באמיגדלה המרכזית15,23. פרדיגמה זו אפשרה גם לחוקרים להבהיר מעגלים קורטיקו-טלאמיים לבחירת התנהגות הגנתית21. מחקרים אלה מראים כי שיטה זו תאפשר מחקרים החוקרים שליטה במעגל העצבי של מעברים מהירים בין התנהגויות הגנתיות בתוך נושא. זה יש יישומים פוטנציאליים לפיתוח הבנה טובה יותר של היסודות הנוירוביולוגיים של חרדה, הפרעת פאניקה, או PTSD24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המנהלים של לואיזיאנה באמצעות קרן התמיכה של מועצת המנהלים (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) והמכון הלאומי לבריאות הנפש של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R01MH122561. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral context Plexiglass cylinder 30 X 30 cm 
Fear conditioning box Med Associates, Inc. VFC-008 25 X 30 X 35 cm dimentions
Audio generator  Med Associates, Inc. ANL-926 
Shocker Med Associates Inc. ENV-414S Stainless steel grid
Speaker Med Associates, Inc. ENV-224AM Suitable for pure tone and white noise 
C57/BL6J mice Jackson laboratory, USA 664 Aged 3-5 month
Cineplex software (Editor/ studio) Plexon CinePlex Studio v3.8.0 For video tracking and behavioral scoring analysis
MedPC software V Med Associates, Inc. SOF-736
Neuroexplorer Plexon Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc. Version 8 Statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
  2. LeDoux, J. Rethinking the Emotional Brain. Neuron. , (2012).
  3. Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).
  4. Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
  5. Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
  6. Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
  7. Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
  8. National Institute of Mental Health. Generalized anxiety disorder. National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).
  9. Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
  10. Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
  11. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
  12. Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
  13. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. Blanchard, D. C. , Elsevier Academic Press. 63-79 (2008).
  14. Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
  15. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
  16. Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
  17. Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
  18. Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2009).
  19. Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. Noise avoidance in the C57BL/6J mouse. Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).
  20. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
  21. Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
  22. Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
  23. Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
  24. Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
  25. Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).

Tags

התנהגות גיליון 167 מיזוג פחד הקפאה טיסה חרדה פחד פאניקה התנהגות הגנתית
פרדיגמת מיזוג פחד פבלובית חדשנית ללימוד הקפאה והתנהגות טיסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borkar, C. D., Fadok, J. P. A Novel… More

Borkar, C. D., Fadok, J. P. A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior. J. Vis. Exp. (167), e61536, doi:10.3791/61536 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter