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Behavior

Chronischer Stress verschiebt aufwandsbezogenes Wahlverhalten in einer Y-Maze Barriere-Aufgabe bei Mäusen

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61548
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Psychology, Behavioral and Systems Neuroscience Area, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Neuroscience, Rutgers, The State University of New Jersey

Summary

Die Y-Maze Barriere-Aufgabe ist ein Verhaltenstest, der die Motivation untersucht, Anstrengungen zur Belohnung zu verschwenden. Hier diskutieren wir das Testen mehrerer gut validierter chronischer Stressoren, einschließlich chronischer Corticosteron- und sozialer Niederlagenstress, sowie den neuartigen chronischen nichtdiskriminierenden sozialen Niederlagenstress (CNSDS), der bei Frauen wirksam ist.

Abstract

Stimmungsstörungen, einschließlich schwerer depressiver Störungen, können durch chronischen Stress ausgefällt werden. Die Y-Maze Barriere-Aufgabe ist ein aufwandsbezogener Auswahltest, der die Motivation misst, Umaufwand zu erzielen und Belohnungen zu erhalten. Bei Mäusen wirkt sich die chronische Stressexposition signifikant auf die Motivation aus, für eine höhere Belohnung zu arbeiten, wenn eine Belohnung mit geringerem Wert im Vergleich zu unbelasteten Mäusen frei verfügbar ist. Hier beschreiben wir das chronische Corticosteron-Verwaltungsparadigma, das eine Verschiebung der mühsamen Reaktion in der Y-Maze-Barriereaufgabe erzeugt. In der Y-Maze-Aufgabe enthält ein Arm 4 Futterpellets, während der andere Arm nur 2 Pellets enthält. Nachdem Mäuse lernen, den High-Reward-Arm auszuwählen, werden Barrieren mit immer größerer Höhe über mehrere Testsitzungen in den Hohen Belohnungsarm eingeführt. Leider wurden die meisten chronischen Stressparadigmen (einschließlich Corticosteron und soziale Niederlage) bei männlichen Mäusen entwickelt und sind bei weiblichen Mäusen weniger wirksam. Daher diskutieren wir auch chronischen nichtdiskriminierenden sozialen Niederlagenstress (CNSDS), ein Stressparadigma, das wir entwickelt haben und das sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen wirksam ist. Wiederholte Ergebnisse mit mehreren ausgeprägten chronischen Stressoren bei männlichen und weiblichen Mäusen in Kombination mit erhöhter Nutzung von translational relevanten Verhaltensaufgaben werden dazu beitragen, das Verständnis dafür zu verbessern, wie chronischer Stress affektive Störungen auslösen kann.

Introduction

Stimmungsstörungen wie Depressionen und Angstzustände sind in der heutigen Gesellschaft weit verbreitet. Jahrzehntelange Arbeit hat kontinuierlich nach verbesserten Behandlungen und relevanten Nagetiermodellen gesucht, um diese komplexen Erkrankungen zu untersuchen1. Chronischer Stress ist ein Faktor für affektive Störungen wie Depression2. Daher wurden chronische Stressparadigmen wie chronischer sozialer Niederlagenstress (SDS) und chronische Corticosteron-Administration (CORT) bei männlichen Mäusen entwickelt und sind heute weit verbreitet, um die neurobiologischen und verhaltensbedingten Auswirkungen chronischer Stressexposition zu bewerten. Die am häufigsten verwendeten Verhaltenstests zur Bewertung chronischer Stresseffekte umfassen Aufgaben im Zusammenhang mit Deminsivierungsverhalten, wie z. B. erhöhtes Plus-Labyrinth, offenes Feld und neuheitsunterdrückte Fütterung oder mit antidepressiver Wirksamkeit, wie z. B. erzwungener Schwimmtest. Allerdings fehlt es diesen Verhaltensweisen bei Nagetieren wohl an Gesichts- und, was noch wichtiger ist, an prädiktiver Gültigkeit und translationaler Relevanz für menschliche Störungen wie Depressionen.

Ein beliebtes chronisches Stressparadigma, chronisch unvorhersehbarer milder Stress (CUMS), wurde ausgiebig mit Verhaltensweisen wie Saccharosepräferenz3validiert. CUMS reduziert die Präferenz für eine 1% Saccharoselösung im Vergleich zu Wasser und wird historisch als Anhedonia-bezogenes Verhalteninterpretiert 4,5. Jedoch, Diese Verringerung der Saccharose-Präferenz wird nicht bei Menschen mit schweren depressiven Störung beobachtet6,7. Darüber hinaus erlaubt Saccharose-Präferenz nicht für das Studium der mühsamen Belohnung Motivation.

Kürzlich hat einige Forschung den Fokus auf andere Verhaltensweisen im Zusammenhang mit Motivation und Belohnung8,9verschoben. Diese Aufgaben haben einen vielversprechenden Translationswert, da relativ ähnliche Verhaltensbeurteilungen sowohl bei Menschen als auch bei Nagetieren durchgeführt werden können. Hier beschreiben wir die CORT- und SDS-Paradigmen und ihre Auswirkungen in einer Y-Maze-Barriere-Verhaltensaufgabe, die die Motivation misst, sich um Belohnung zu bemühen. Wir diskutieren dann ein neues chronisches Stressparadigma, das wir entwickelt haben, chronische nantizipierten sozialen Niederlagenstress (CNSDS), das sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen wirksam ist.

Chronische Corticosteron-Administration (CORT) ist ein Paradigma entwickelt, um chronischen Stress ohne tatsächliche Stress-Exposition zu imitieren. Die Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse durch Stress führt zur endogenen Freisetzung des Nebennierensteroids Cortisol beim Menschen10,11,12 und Corticosteron bei Mäusen13,14. Die Lieferung von Corticosteron durch das Trinkwasser von erwachsenen männlichen Mäusen für mindestens 4 Wochen führt zu maladaptiven Verhaltensreaktionen bei Vermeidungsaufgaben wie offenem Feld, erhöhtem Plus-Labyrinth und Neuheit unterdrücktFütterung10,11,12,13,14,15,16. Interessanterweise wirkt sich CORT auch auf die Belohnungsverarbeitung bei instrumentalen Aufgaben16,17,18,19aus. Das hier beschriebene CORT-Paradigma erzeugt eine konsistente Serumkonzentration von unter 100 ng/ml CORT, was mehr als fünfmal geringer ist als die von einem akuten Stressor wie Erzwungenschwimmen15erzeugte. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die chronische CORT-Verabreichung hypercortisolemia verursacht. Während chronische CORT ist nur bei männlichen Mäusenwirksam 20, wir vor kurzem gezeigt, dass es eine robuste Verschiebung in der mühsamen Reaktion in der Y-Maze Barriere Aufgabeproduziert 21. Unserer Kenntnis nach war dies eine der ersten Studien, die die Auswirkungen von chronischem Stress auf ein anstrengungsbedingtes Wahlverhalten bei männlichen Mäusen untersuchte21. Eine frühere Studie zeigte zunächst die Auswirkungen akuter Zurückhaltungsstress auf die aufwandsorientierte Entscheidungsfindung bei Ratten22. In aufwandsbezogenen Wahlverhalten entscheidet sich ein Tier, entweder Anstrengungen für eine hochwertige Belohnung zu unternehmen oder eine Belohnung mit geringerem Wert anzunehmen, die freier verfügbar ist. Beim Menschen ist der Aufwand für Belohnungen Aufgabe (EEfRT), ist ein Computerspiel entwickelt, um analog zu aufwandsbezogenen Auswahlaufgaben bei Mäusen23. Depression führt zu fehladaptiven Reaktionen in EEfRT (verringerte Wahrscheinlichkeit, schwierige Aufgaben für hochwertige Belohnungen zu wählen). Daher sind aufwandsbezogene Auswahlaufgaben bei Nagetieren aufgrund ihrer translationalen Relevanz besonders interessant.

Chronischer sozialer Niederlagenstress (SDS) ist eines der am weitesten verbreiteten präklinischen Stressmodelle bei männlichen Mäusen. Es ist ein 10-Tage-Protokoll, in dem große, aggressive pensionierte Züchter CD-1 Männchen experimentelle Mäuse angreifen, in der Regel C57BL/6J, in 5 min täglichen Sitzungen24. Dies führt zu einem robusten maladaptiven Verhaltensphänotyp in einer Teilmenge von experimentellen Mäusen. Ein sozialer Interaktionstest wird verwendet, um Mäuse in widerstandsfähige oder anfällige Populationen für den Verluststress zu schichten, und mehrere Studien haben diese einzigartige Eigenschaft von SDS verwendet, um die molekularen und neuronalen Schaltkreismechanismen zu untersuchen, die der Stressabhängigkeit und -anfälligkeit zugrunde liegen. Hier beschreiben wir die Details des CORT-Paradigmas und dessen Implementierung für die Y-Maze-Barriere-Verhaltensaufgabe. Wir diskutieren auch SDS-Effekte in der Y-Maze Barriere-Aufgabe. Die Y-Maze Barriere Aufgabe basiert auf der T-Maze Barriere Aufgabe, die in erster Linie in Ratten verwendet wird, um Motivation zu messen, um Anstrengungen für hohe oder niedrige Belohnungen in den beiden Armen desLabyrinths 8,9,25zu verbrauchen. Diese Aufgabe wurde auch implementiert, um mühsame Reaktion bei Mäusen verabreicht Koffein oder Dopamin-Antagonisten bei Mäusen26zu studieren. Nagetiere können entweder größere Anstrengungen aufwenden, indem sie Barrieren von fortschreitender Höhe in einem Arm des Labyrinths für einen höheren Belohnungswert erklimmen, in der Regel 4 Belohnungpellets, oder deutlich weniger Aufwand im anderen Arm des Labyrinths aufwenden, um nur 2 Belohnungpellets zu erhalten9. 10-Tage-Paradigmen der sozialen Niederlage produzieren einen robusten maladaptiven Phänotyp bei anfälligen Mäusen, der etwa 30 Tage dauert, also haben wir die Y-Maze-Barriereaufgabe modifiziert, um Tiere schneller auszubilden und zu testen, um alle Experimente innerhalb dieses 30-Tage-Zeitrahmens24abzuschließen. Daher beschreiben wir hier auch ein Y-Maze-Barriere-Verhaltens-Task-Protokoll, das verdichtete Trainingseinheiten und Einzelbarriere-Testsitzungen enthält, um die Motivation zu messen, um Anstrengungen zur Belohnung bei chronisch stressexponierten Mäusen zu verschwenden.

Leider wurden sowohl chronisches Corticosteron als auch chronischer sozialer Niederlagenstress bei männlichen Mäusen entwickelt und sind bei weiblichen Mäusen weniger wirksam. Dies ist sehr problematisch, da Frauen eher als Männer mit affemoodten Störungen wie Depression diagnostiziert werden1. Clevere Anpassungen an SDS haben den Einsatz bei weiblichen Mäusen erlaubt, erfordern aber schwierige Operationen oder mühsame Urinsammlung26,27. Wir haben vor kurzem eine einfache Änderung des SDS-Paradigmas beschrieben, die als chronischer nichtdiskriminierender sozialer Niederlagenstress (CNSDS) bezeichnet wird. CNSDS ermöglicht anfällige und belastbare Schichtung sowohl von experimentellen männlichen als auch weiblichen Mäusen28. Sowohl weibliche als auch männliche anfällige Mäuse, die CNSDS ausgesetzt sind, zeigen eine erhöhte Vermeidung offener Arme im Hoch-Plus-Labyrinth und des Zentrums im offenen Feld und zeigen eine erhöhte Latenz, um bei neuheitunterdrückter Fütterung zu essen. CNSDS ist auch effizienter als andere Modifikationen an SDS, da beide Geschlechter in Niederlagensitzungen kombiniert werden. Dies führt zu einer erhöhten Ausbeute von Versuchsmäusen ohne damit verbundene Erhöhung der Zeit und des Aufwands, die erforderlich ist, um das Protokoll abzuschließen. Daher schließen wir dieses Manuskript mit einer ausführlichen Darstellung dieses kürzlich entwickelten chronischen Stressparadigmas ab.

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Protocol

Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Leitlinien für die Tierpflege im Labor durchgeführt und vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Rutgers University genehmigt.

1. Chronisches Corticosteron (CORT)

  1. Ordnen Sie Mäuse zufällig Behandlungsgruppen zu. Teilen Sie erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Fahrzeug- und Corticosteron-Gruppen (CORT) auf.
    1. Haus Fahrzeugmäuse in verschiedenen Käfigen und CORT-Mäuse in anderen, da ihre Behandlung über die Wasserflasche des Käfigs geliefert wird.
    2. Etikettieren Sie spezielle Wasserkarten, die in den Käfig gebracht werden, um das Tierpflegepersonal darüber zu benachlässigen, dass die Wasserflaschen Lösungen enthalten, die für das Experiment notwendig sind.
  2. Machen Sie eine Fahrzeuglösung, indem Sie 3,375 g Beta-Cyclodextrin in 750 ml Leitungswasser in einem Schraubglasbehälter der Größe 1 L auflösen.
    1. Füllen Sie Fahrzeugkäfig Wasserflaschen mit dieser Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Flasche nicht ausläuft, um den Flüssigkeitsverbrauch zu messen.
    2. Den Behälter beschriften und bei Raumtemperatur im Regal im Labor lagern. Verwenden Sie die Fahrzeuglösung, um Käfigflaschen für ca. 1 Woche zu füllen.
    3. Nachfüllen von Fahrzeugflaschen während der woche. Nachfüllen Von Käfigflaschen 1x-2x unter der Woche nach Bedarf. Wechseln Sie auf eine frische Flasche 1x pro Woche entweder zu Beginn oder am Ende der Woche.
      HINWEIS: Nach einer Woche beginnt das Beta-Cyclodextrin, das Innere der Wasserflasche zu beschichten und macht die Lösung trüb.
    4. Überwachen Sie die Menge der Flüssigkeit, die zweimal pro Woche verbraucht wird, und zeichnen Sie sie auf. Wiegen Sie jede flasche und aufzeichnen, achten Sie darauf, keine Flüssigkeit zu verschütten. Nachfüllen und jede Flasche zurückgeben.
      HINWEIS: Ein Käfig von 5 Mäusen wird 80-120 ml Flüssigkeit in 3-4 Tagen trinken.
  3. Machen Sie die CORT-Lösung, indem Sie zunächst 3,375 g Beta-Cyclodextrin in 750 ml Leitungswasser in einem Schraubglasbehälter der Größe 1 L auflösen. Dann fügen Sie 26,25 mg Corticosteron.
    1. Sonicate CORT-Lösung, um CORT in das Wasser aufzulösen. Legen Sie den Behälter in ein Ultraschall-Reiniger-Wasserbad. Beschallen Bei 40 kHz für ca. 30 min oder bis Corticosteron aufgelöst ist und Flüssigkeit klar erscheint.
      HINWEIS: Ultraschall-Homogenisatoren (Tip-Style) sind auch wirksam zum Auflösen von CORT.
    2. Füllen Sie Wasserflaschen für alle CORT Käfige mit Lösung. Etikettenbehälter und Lagern Sie bei Raumtemperatur im Regal im Labor. CORT-Lösung kann verwendet werden, um Käfigflaschen für etwa 1 Woche zu füllen.
      HINWEIS: Verwenden Sie braune Glaswasserflaschen oder Kunststoff-Opakflaschen, da CORT lichtempfindlich ist.
    3. Überwachen Sie die Menge an Flüssigkeit, die zweimal pro Woche verbraucht wird, und zeichnen Sie sie auf. Wiegen Sie alle Fahrzeug- und CORT-Mäuse wöchentlich, um die verbrauchte Flüssigkeit mit dem Gewicht der Mäuse in jedem Käfig zu vergleichen.
    4. Um das Volumen des verbrauchten Flüssigkeitsverbrauchs (mL/g/Tag) zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
      (Volumenkäfig trank in den letzten 3-4 Tagen) / (Durchschnittliches Körpergewicht von Mäusen im Käfig) X Anzahl der Tage seit der Nachfüllte der Fahrzeug- oder CORT-Flasche)
      HINWEIS: Ein durchschnittlicher Käfig von n=5 erwachsenen männlichen C57BL/6J-Mäusen wird durchschnittlich 0,25 – 0,30 mg/g/Tag verbrauchen, was in der Regel durch Ad libitum und lebensmittelbenachteiligte Zeiträume konsistent bleibt. Diese Konzentrationen führen zu ungefähren Dosen von 24 mg/kg/Tag Beta-Cyclodextrin und 9,5 mg/kg/Tag CORT15,16.
  4. Sozialer Niederlagenstress (SDS)
    1. Verwenden Sie Standardmäßige Soziale Niederlagen-Stressprotokolle, wie sie an anderer Stelle ausführlich beschrieben werden24,29.
  5. Y-Maze Barriereaufgabe
    1. Nahrungsentzug für die Y-Maze-Barriereaufgabe
      1. Am Tag nach Abschluss des sozialen Interaktionstests wiegen Sie alle Kontroll- und Versuchsmäuse. Dies wird ihr frei fütterndes Körpergewicht sein.
        HINWEIS: Hierin verwenden wir "Control" und "Experimental", um sowohl auf SDS Control- als auch SDS-Experimental-Mäuse sowie auf Vehicle- und CORT-verabreichte Mäuse in den jeweiligen SDS- und CORT-Paradigmen zu verweisen.
      2. Um nahrung die Mäuse zu berauben, entfernen Sie nur Labor Chow von der C57BL/6J Seite jedes Käfigs.
      3. Wiegen Sie alle Mäuse, sowie die Menge an Labor Chow, die täglich gegeben wird, um richtig das Körpergewicht bei etwa 90% des frei fütternden Gewichts während der Tests zu halten.
        HINWEIS: Die Menge der Lebensmittel, die im Heimkäfig jeder Maus oder Mäuse geliefert werden, hängt von schwankendem Körpergewicht und der Menge an Belohnungpellets ab, die an jedem Tag des Trainings oder der Tests im Y-Labyrinth verbraucht werden.
      4. Etablieren Sie Vertrautheit mit den Belohnungpellets. Werfen Sie eine kleine Schaufel von 20 mg Getreide-basierte Lebensmittelpellets (Bio-Serv) in den heimischen Käfig. Dies wird vertraut mit den Pellets und motivieren die Mäuse, sie in der Y-Maze in Gewöhnung und erste Trainingseinheiten zu konsumieren.
  6. Y-Maze-Apparat
    1. Konstruieren Sie eine Y-Maze-Struktur aus opakem weißem Plexiglas mit einer Breite von 3/16 Zoll, mit drei Armen von 26 cm Länge, 20 cm Höhe und 7 cm Breite.
    2. Verwenden Sie Trennwände, die zwischen Schlitzen im Y-Labyrinth gleiten, damit ein Forscher die Startbox, in der die Mäuse zuerst platziert werden, schließen oder die Maus in einen der beiden Arme einschließen kann, sobald sie den linken oder rechten Arm des Y-Labyrinths ausgewählt und eingegeben haben.
    3. Erstellen Sie mehrere 10, 15 und 20 cm hohe Y-Maze-Barrieren aus Drahtgeflecht für die vertikale Seite und mit Plexiglas in etwa einem Winkel von 45° auf der hinteren abgewinkelten Seite. Dadurch können C57BL/6J-Mäuse die vertikale Drahtgitterseite jeder Barriere greifen und erklimmen und dann die abgewinkelte Plexiglasseite der Barriere hinunterfahren.
      1. Fügen Sie dünne Schritte auf der abgewinkelten Seite hinzu, um eine größere Traktion zu ermöglichen.
  7. Y-Maze-Gewöhnung
    1. Habituate alle Kontroll- und Versuchsmäuse zum Y-Maze-Apparat.
      1. Am Tag nach der Nahrungsentzug, legen Sie eine große Anzahl von 20 mg Getreide-basierte Lebensmittelpellets (z.B. Bio-Serv) in die Kappe eines 50 ml Zentrifugenrohr und legen Sie an den Enden jedes Arms des Y-Maze. Diese Kappen dienen als kleine Futtergefäße für die Mäuse, und die Mäuse werden leicht lernen, die Futterpellets zu essen.
      2. Platzieren Sie jede Maus in der Startbox des Y-Maze mit dem Startbox-Teiler an Ort und Stelle.
      3. Nach einigen Sekunden entfernen Sie den Teiler, so dass jede Maus das Y-Labyrinth für 15 min erkunden kann. Diese Zeitzeit ermöglicht es der Maus, alle Arme des Labyrinths angemessen zu erkunden und vertraut mit dem Gerät zu etablieren.
        HINWEIS: Einige Mäuse dürfen an diesem ersten Gewöhnungstag keine Futterpellets konsumieren.
    2. Am folgenden Tag, eine zweite 15 min Y-Maze Gewöhnung mit einem identischen Verfahren abzuschließen.
      1. Beachten Sie alle Mäuse, die keine Pellets gegessen haben. Für diese Mäuse werfen Sie eine weitere kleine Kugel Pellets in ihre Hauskäfige.
  8. Y-Maze Erzwungen-Choice-Training
    1. Legen Sie den Arm mit hoher Belohnung (HR) und niedriger Belohnung (LR) für jede Maus fest.
      1. Weisen Sie Mäuse sowohl in Control als auch In Experimental gruppen den linken Arm als hohen Belohnungsarm (HR) und den rechten Arm als niedrigen Belohnungsarm (LR) oder umgekehrt. Somit stehen in jeder Studie im linken, HR-Arm und 2 Pellets im rechten, LR-Arm oder im Gegenteil 4 Pellets zur Verfügung.
      2. Gegengewicht diese bezeichneten LR- und HR-Arme in der Gruppe Control und Experimental, so dass etwa die Hälfte jeder Gruppe den linken Arm als HR-Arm und die Hälfte den rechten Arm als HR-Arm hatte.
    2. Erzwungene Auswahlversuche
      1. Nach den 2 Tagen der Y-Maze Gewöhnung, haben Mäuse 3 Tage von 10 Prüfungen der erzwungenen Wahl Training beginnen.
      2. Legen Sie die Maus für jede erzwungene Auswahlversuch in das Startfeld, und entfernen Sie dann den Teiler, sodass die Maus 60 s entweder in den linken oder rechten Arm eindringt und die verfügbaren Pellets verbraucht. Für jeden erzwungenen Versuch blockieren Sie den gegenüberliegenden Arm mit dem Teiler, wodurch die Maus gezwungen wird, den anderen Arm auszuwählen. Blockieren Sie für eine HR-Zwangswahlprüfung den Zugriff auf den LR-Arm oder umgekehrt.
      3. Entfernen Sie die Maus nach der Studie und füllen Sie die jeweiligen Pellets auf, die gegessen wurden.
      4. Alternative erzwungene Auswahlversuche für jede Maus an jedem Trainingstag, so dass Mäuse 5 HR- und 5 LR-Zwangswahlversuche absolvieren.
        HINWEIS: Zwangswahlversuche trainieren die Mäuse, einen Arm mit der höheren Belohnung und den anderen mit der niedrigeren Belohnung zu assoziieren.
      5. Legen Sie die Maus wieder in ihren Heimkäfig und führen Sie dann nicht mehr als 3-5 nachfolgende Mäuse aus, um ein 5 min Intertrialintervall für jede Maus beizubehalten.
  9. Y-maze Freie Wahl Training
    1. Freie-Wahl-Tests
      1. Beginnen Sie jede freie Wahlsitzung mit einer HR- und LR-Arm-Zwangswahl-Testversion. So werden Mäuse erlebt haben, in jeden Arm gezwungen zu werden, bevor sie 10 freie Wahlversuche beginnen.
      2. Platzieren Sie jede Maus in das Startfeld und entfernen Sie die Trennwand. Sobald die Maus einen Arm ausgewählt und bis zum Ende durchquert hat, wo sich die Tasse mit den Pellets befindet, legen Sie den Armteiler auf dieser Seite auf und verriegeln Sie die Maus, bis sie die Pellets verbraucht hat.
      3. Entfernen Sie die Maus zurück in ihren Heimatkäfig und führen Sie die nachfolgenden 3-5 Mäuse aus, die in diesem Zyklus verwendet werden, um ein 5-min-Inter-Trial-Intervall zu ermöglichen.
    2. Zeichnen Sie die folgenden Daten auf: Latenz, um einen Arm auszuwählen, Armauswahl und Latenz, um Pelletbecher zu erreichen.
      1. Zeichnen Sie auf, welcher Arm die Maus betritt und sich vollständig zum Pelletbecher bewegt. Zeichnen Sie auch die Latenz auf, um diesen Arm auszuwählen und den Pelletbecher zu erreichen.
      2. Betrachten Sie jede Studie, bei der eine Maus einen Arm nicht auswählt oder nicht alle 4 oder 2 Pellets als ausgelassene Studie verbraucht.
    3. 70% Kriterium der freien Wahl
      1. Zeichnen Sie auf, welcher Arm für alle 10 Kostenlosen-Testversionen täglich ausgewählt wird.
      2. Sobald eine Maus den HR-Arm an 7 der 10 Versuche an einem freien Wahltrainingstag ausgewählt hat (70%-Kriterium), bewegen Sie die Maus zu Barrieretests.
        HINWEIS: Setzen Sie das Training zur freien Wahl fort, bis alle Mäuse das 70%-HR-Armkriterium erreichen, um sowohl eine angemessene Diskriminierung der HR- als auch der LR-Arme zu gewährleisten, und dass Mäuse die gleiche Präferenz für den HR-Arm zeigen.
  10. Y-Maze Barriereprüfung
    1. 10 cm Barriere-Testsitzung
      1. Legen Sie die 10 cm Barriere auf halbem Weg den HR-Arm in das Y-Labyrinth.
      2. Beginnen Sie mit mehreren Zwangswahl-Prozessen für beide Arme. Mäuse, die gegen das Erklimmen der Barriere resistent sind, können mit einem langen, dünnen Plexiglasstück veranlasst werden.
        HINWEIS: Aus Erfahrung empfehlen wir mindestens 2 Zwangswahlversuche für HR- und LR-Arme zu Beginn jeder Sitzung in einer neuen Barrierehöhe. Wir empfehlen, Versuche aufzuzeichnen, bei denen es notwendig ist, die Maus aufzufordern, über die Barriere zu klettern, wenn dies notwendig wird. Mäuse lernen in der Regel, über die 10 cm Barriere zu klettern, die nicht so hoch ist, dass sie nicht stehen und darüber sehen können, innerhalb von 1-2 Versuchen. Die Barriere muss auf der anderen Seite für Mäuse mit dem gegnerischen Arm als designiertem HR-Arm platziert werden.
      3. Platzieren Sie jede Maus in der Startbox, entfernen Sie den Teiler, und lassen Sie die Maus das Labyrinth durchqueren und wählen Sie einen Arm für 10 Freie-Wahl-Tests, die die 10 cm Barriere im HR-Arm enthalten.
      4. Wenn die Maus die HR-Seite wählt, klettert sie über die Barriere, um die größere Belohnung, die 4 Pellets, zu erhalten. Andernfalls wählt es den LR-Arm und durchquert einfach den Boden des Labyrinths für die geringere Belohnung, 2 Pellets.
      5. Zeichnen Sie den ausgewählten Arm und die Latenz auf, um einen Arm auszuwählen und den Pelletbecher für alle Versuche zu erreichen. In ähnlicher Weise drehen 4-6 Gesamtmäuse pro Zyklus, um ein 5 min Inter-Trial-Intervall zu halten.
        HINWEIS: Sprühen Sie 70% Ethanol in das Y-Maze und wischen Sie konsequent und zwischen jeder Maus trocken.
    2. 15 cm Barriere-Testsitzung
      1. Am nächsten Tag alle oben aufgeführten Schritte (Schritt 1.10.1) abschließen, jedoch mit der 15 cm hohen Barriere im HR-Arm.
    3. 20 cm Barriere-Testsitzung
      1. Am nächsten Tag alle oben aufgeführten Schritte (Schritt 1.10.1) abschließen, jedoch mit der 20 cm hohen Barriere im HR-Arm.
        HINWEIS: Erfahrungsgemäß verschiebt die Mehrheit der SDS-anfälligen oder CORT-Versuchsmäuse (und sogar mehrere Kontrollmäuse) durch die 20 cm Barrierehöhe ihre Reaktionen auf den LR-Arm, da sie nicht motiviert genug sind, über die hohe 20 cm Barriere zu klettern. Außerdem müssen Plexiglasadapter verwendet werden, um zu verhindern, dass Mäuse von der Spitze dieser Barriere auf die Ränder der Y-Maze-Wände klettern. Wir empfehlen nicht, ein höheres Y-Labyrinth zu bauen, da es für den Experimentator schwieriger wird, die Pellets in jeder Tasse nachzufüllen und die Mäuse nach jeder Studie zu entfernen.
    4. Belohnungs-Diskriminierungstest
      1. Um sicherzustellen, dass sowohl Kontroll- als auch Versuchsmäuse angemessene und ähnliche Hebel der Belohnungsdiskriminierung aufweisen, führen Sie eine Diskriminierungstestsitzung durch.
      2. Folgen Sie allen oben genannten Schritten (Schritt 1.10.1), aber legen Sie eine 10 cm Barriere in den LR-Arm. Jetzt enthalten beide Arme 10 cm Barrieren, und die Mäuse müssen entweder überklettern, um die Belohnung von 4 oder 2 Pellets zu erhalten.
      3. Rekordlatenz und Armauswahl für alle 10 Versuche.
        HINWEIS: Da Mäuse die gleiche Anstrengung aufwenden müssen, um eine der beiden Belohnungen zu erhalten, sollten Mäuse in den meisten Studien den HR-Arm auswählen. Um Latenzen zur Auswahl des HR- und LR-Arms zu untersuchen, berechnen Sie eine mittlere HR-Armlatenz und eine mittlere LR-Armlatenz für jede einzelne Maus. Vergleichen Sie dann die Latenz, um beide Arme mit einer zweiseitig gemischten ANOVA auszuwählen, wobei SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) als Faktor zwischen den Probanden und Arm (HR-Arm, LR-Arm) als Innerhalb-Subjekt-Faktor verwendet werden.

2. Chronischer nichtdiskriminierender sozialer Niederlagenstress (CNSDS)

  1. Bildschirm für aggressives Verhalten bei CD-1-Mäusen
    1. Legen Sie ein Männchen und eine weibliche C57BL/6J-Maus für 180 s in den Heimkäfig jeder CD-1 oder bis die CD-1 beide Mäuse angreift. Diese C57BL6/J-Mäuse müssen nicht naiv sein und werden nicht in weiteren Experimenten verwendet. Während dieser Aggressor-Screening-Phase keine C57BL/6J-Mäuse mit CD-1-Mäusen cohouse.
      1. Aufnahmelatenz, um beide C57BL/6J-Mäuse für jede CD-1 anzugreifen.
      2. Wählen Sie alle CD-1-Aggressoren aus, die sowohl männliche als auch weibliche C57BL/6J-Mäuse innerhalb von 60 Sekunden in aufeinander folgenden Sitzungen angreifen. Andere können für das Mitwohnen in Hauskäfigen verwendet werden.
        HINWEIS: Ein wichtiger Vorbehalt der sozialen Niederlage ist das Vorhandensein von Verwundungen als Folge körperlicher Aggression. Jede Maus in den Screening- und Versuchsphasen sollte auf Wunden überprüft und mit Chlor-Hexan-Desinfektionsmittel behandelt werden, wenn kleine Hautläsionen vorhanden sind. Jede Maus mit einer Wunde größer als 1 cm sollte aus dem Experiment entfernt werden.
  2. Weisen Sie Mäuse der Steuerung und den experimentellen Gruppen zu.
    1. Sammeln Sie alle naiven erwachsenen männlichen und weiblichen C57BL/6J Mäuse, sowie gescreente pensionierte männliche CD-1-Züchter, sowie CD-1-Männchen, die in Co-Housing verwendet werden.
      1. Willkürlich ecmfarbene männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse der Kontrolle oder experimentellen Bedingungen zuzuweisen. Jedes Männchen und jedes Weibchen wird für alle sozialen Niederlagensitzungen in der CNSDS Experimental Gruppe gepaart. Männchen und Weibchen in der CNSDS-Steuerungsgruppe drehen sich jeden Tag.
      2. Weisen Sie CD-1-Männchen zu, die in sozialen Niederlagensitzungen verwendet werden oder nach jeder Sitzung mit den experimentellen Männchen und Weibchen zusammenuntergebracht werden, die sich täglich für jedes Paar männlicher und weiblicher Mäuse von C57BL/6J abwechseln.
  3. Chronischer nichtdiskriminierender sozialer Niederlagenstress (CNSDS)
    1. Bringen Sie alle Mäuse in den dedizierten sozialen Niederlagenraum, einschließlich aller CD-1-Männchen, CNSDS Control-Männchen und -Weibchen C57BL/6J-Mäuse und CNSDS Experimental männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse.
      1. Richten Sie 4-6 Käfige von CD-1 Männchen mit C57BL/6J Männchen und Weibchen mit CD-1 Käfigen in der Vorderseite und C57BL/6J Käfige dahinter aus.
      2. Geben Sie mit Käfig-ID-Tags an, welche Maus angegriffen und dann mit welcher CD-1 zusammengezungen wird, um die Organisation aller Mäuse sicherzustellen.
        HINWEIS: Nach der Initialisierung der Experimente am ersten Tag können Mäuse für verbleibende 9 Niederlagensitzungen gedreht werden, so dass jedes männliche und weibliche Paar C57BL/6J für jede Sitzung um einen Käfig nach links gedreht wird. Dies ermöglicht eine neue Interaktion mit neuartigen CD-1s in jeder Sitzung.
    2. CNSDS-Experimentalgruppenverfahren
      1. Legen Sie ein erwachsenes Männchen und eine erwachsene weibliche C57BL/6J Maus in den Heimkäfig jedes CD-1 Aggressor Männchen für eine 5 min soziale Niederlage Sitzung.
      2. Aufzeichnung der Angriffslatenz und Angriffshäufigkeit für männliche und weibliche experimentelle C57BL/6J-Mäuse.
      3. Nach 5 Minuten entfernen Sie die männliche C57BL/6J-Maus und legen Sie sie in den Käfig des mituntergebrachten CD-1-Männchens, getrennt durch eine klare, perforierte Plexiglasbarriere. Separate angreifende CD-1 und weibliche C57BL/6J Maus mit einer ähnlichen klaren, perforierten Plexiglasbarriere. Alternativ, ob männlich oder weiblich C57BL/6J Maus ist mit dem Aggressor CD-1 jeden Tag untergebracht.
        HINWEIS: Nach jeder täglichen Interaktion von 5 min wird jede Maus auf Verletzungen und Wunden untersucht, die behandelt werden, wenn sie weniger als 1 cm beträgt. Jede Wunde, die größer als 1 cm ist, führt zur Entfernung und sofortigen Euthanasie der Maus. So sind sowohl männliche als auch weibliche Versuchsmäuse 5 Tage lang mit dem CD-1-Aggressor zusammenuntergebracht und mit der neuartigen CD-1, die in der Angriffssitzung für die restlichen 5 Tage nicht verwendet wird. Klare, perforierte Plexiglasbarrieren verhindern physikalische Interaktion, ermöglichen aber sensorischen Kontakt mit CD-1-Aggressoren in den 24 Stunden zwischen den Sitzungen. Vaginale Lavage kann an allen weiblichen Mäusen etwa 30 Minuten nach der Niederlage jeden Tag durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben28.
    3. CNSDS-Kontrollgruppenprozedur
      1. Legen Sie ein Control-Weibchen in den Hauskäfig eines Control-Männchens C57BL/6J-Maus.
      2. Nach 5 min trennen Sie Mäuse und legen Sie einen klaren, perforierten Plexiglasteiler zwischen die Mäuse.
      3. Bringen Sie Mäuse in den Kolonieraum zurück und legen Sie sie als CNSDS-Experimentalkäfige in ein separates Regal. Im Kolonieraum haben wir Regale ausgewiesen, in denen gestresste Mäuse getrennt von anderen Mäusen im Kolonieraum untergebracht sind. Darüber hinaus können Effekte bei den nicht gestressten Mäusen gesehen werden, wenn sie die Aggression beobachteten, wie in den Paradigmen der stellvertretenden sozialen Niederlage30
      4. Beachten Sie jedes Angriffs- oder Montageverhalten während jeder Control-Interaktion.
    4. Kontrollmännliche und weibliche Mäuse werden an den folgenden Tagen in eine neue Konspezife eingeführt, wie dies in traditionellen Social Defeat Stress Control Gruppen geschieht. Schließe 10 aufeinanderfolgende Tage mit CNSDS-Kontroll- und Experimentalsitzungen ab.
      1. Nach Abschluss der10. und letzten Control- oder Experimental CNSDS-Sitzung können Sie alle Mäuse gemeinsam beherbergen und dieses Co-Gehäuse während aller Verhaltenstests beibehalten. Jeder Käfig besteht aus 2 Mäusen, die auf beiden Seiten des Plexiglasteilers getrennt sind, um eine sensorische Belichtung zu ermöglichen. Kontrollmäuse sind mit anderen gegenüberliegenden Geschlechtskontrollmäusen untergebracht, während experimentelle Mäuse mit anderen geschlechtsexperimentellen Mäusen untergebracht sind.
      2. Jedes Control C57BL/6J Weibchen ist mit dem Control C57BL/6J Männchen, mit dem es in der10. Sitzung interagierte, mit einem klaren Plexiglasteiler in den Käfig untergebracht, um die beiden Mäuse zu trennen.
      3. Ungefähr 24 Stunden nach der letzten Defeat Session führen Sie einen Standard-Test für soziale Interaktion durch, um festzustellen, ob CNSDS das Sozialverhalten mit einer neuartigen CD-1-Maus im Vergleich zur Kontrolle reduziert, und um Mäuse "belastbar" oder "anfällig" für den Stress24,29zu schichten.
    5. Testen Sie CNSDS Control und Experimental männliche und weibliche Mäuse in anderen Verhaltensweisen, einschließlich der Y-Maze-Barriereaufgabe, und schichten Sie die CNSDS-Gruppe in CNSDS-Resilient- und CNSDS-anfällige Gruppen auf.
  4. Sozialer Interaktionstest
    1. Ersteinrichtung für Social Interaction Test
      1. 24 Stunden nach der letzten CNSDS-Niederlagesitzung führen Sie einen Social Interaction Test durch.
      2. Nehmen Sie alle paargezädenten Kontroll- und Experimentalmäuse sowie ein neuartiges CD-1-Männchen, das im CNSDS-Paradigma nicht verwendet wird, in einen separaten Verhaltensraum, um einen Social Interaction Test durchzuführen.
      3. Richten Sie eine Standard-Offene Feldkammer (75 cm x 75 cm) unter einer Aufnahmekamera ein, die mit der Verhaltens-Tracking-Software (z. B. EthoVision) verbunden ist, die auf einem dedizierten Computer läuft.
      4. Richten Sie ein neues Experiment mit einer 24 cm x 24 cm sozialen Interaktionszone ein, die einen Interaktionsbehälter umgibt (kleiner, perforierter Plexiglasbehälter mit einer Größe von ca. 10 cm x 10 cm), der die neuartige CD-1 entlang einer Wand des offenen Feldes in der zweiten von 2 aufeinanderfolgenden 2,5-Min-Versuchen beherbergen wird. So umgibt eine 7 cm breite Interaktionszone den Behälter, in dem sich die neuartige CD-1-Maus befindet.
    2. Ausführen einer Maus im Test für soziale Interaktion
      1. Platzieren Sie jede Maus in einer weiten Ecke des offenen Feldes für eine 2,5 min Testversion ohne CD-1 vorhanden und starten Sie das Aufnahmesoftwareprogramm.
        HINWEIS: Beachten Sie, dass der Interaktionscontainer in der Mitte einer Wand des offenen Feldes platziert werden sollte und keine CD-1-Maus für diese erste Testversion enthalten sollte.
      2. Nach 2,5 min entfernen Sie die Maus zurück in den heimischen Käfig. Reinigen Sie das offene Feld mit 70% Ethanol.
      3. Legen Sie den romannischen CD-1-Männchen in einen zweiten perforierten Plexiglaswürfel entlang der Mitte einer Wand des offenen Feldes.
      4. Stellen Sie die Maus erneut in die Ecke des offenen Feldes für eine zweite 2,5-min-Testversion, jetzt mit der CD-1 vorhanden, und starten Sie das Aufnahmesoftwareprogramm.
      5. Entfernen Sie die Maus und legen Sie sie wieder in den heimischen Käfig. Entfernen Sie die CD-1 und legen Sie sie wieder in den heimischen Käfig. Reinigen Sie das offene Feld mit 70% Ethanol.
    3. Führen Sie die verbleibenden CNSDS-Steuerung und Experimentelle Mäuse aus, und berechnen Sie das Interaktionsverhältnis.
      1. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen anderen Mäusen, um die zeitgemäß in der Interaktionszone sowohl in Versuch 1 als auch in Studie 2 für jede CNSDS-Steuerung und Experimentelle Maus zu quantifizieren.
      2. Um ein Interaktionsverhältnis zu berechnen, vergleichen Sie die Zeit, die in der sozialen Interaktionszone in Testversion 2 (CD-1 vorhanden) verbracht wurde, mit der folgenden Gleichung im Vergleich zu Testversion 1 (CD-1 abwesend):
        Wechselwirkungsverhältnis = (Zeit in der Interaktionszone in Versuch 2)/(Zeit in der Interaktionszone in Versuch 1)
    4. Stratify Mäuse als "CNSDS-Resilient" oder "CNSDS-Susceptible". Belastbare Mäuse haben ein Wechselwirkungsverhältnis von > 1,0, während anfällige Mäuse ein Wechselwirkungsverhältnis von <=1,0 aufweisen.
      1. Bei nachfolgenden Verhaltensmaßnahmen wie der Y-Maze-Barriereaufgabe oder anderen Verhaltenstests unterteilen Sie CNSDS-Experimental-Mäuse in diese CNSDS-resistenten und CNSDS-anfälligen Phänotypen.
      2. So können für Frauen einseitige ANOVAs zwischen CNSDS Control, CNSDS Experimental-Resilient und CNSDS Experimental-Susceptible-Gruppen durchgeführt werden, mit Post-hoc-Vergleichen, um gegebenenfalls Unterschiede zwischen Gruppen zu bestimmen.
      3. Für Vergleiche zwischen Den geschlechtsspezifischen Unterschieden führen Sie bidirektionale ANOVAs mit CNSDS (Control, Resilient, Susceptible) und Sex (männlich, weiblich) als Zwischen-Themenfaktoren durch. Verwenden Sie ggf. Post-hoc-Vergleiche.

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Representative Results

Chronische CORT wurde für 4 Wochen verabreicht, gefolgt von Y-Maze Barriere Training und Tests (Abbildung 1A). In einer separaten Kohorte wurde dem 10-Tage-SDS-Paradigma in ähnlicher Weise ein Training und Tests in der Y-Maze-Barriereaufgabe (Abbildung 1C) folgt, um die Wirkung dieser chronischen Stressparadigmen auf das aufwandsbezogene Wahlverhalten bei männlichen Mäusen zu bestimmen. Chronische CORT und SDS reduzierten beide das mittlere Körpergewicht im Vergleich zu Fahrzeugmäusen und SDS-Kontrollmäusen, wie durch t-Testsbestimmt (Tabelle 1). Diese Mäuse konsumierten auch weniger mittlere Hauskäfig Labor Chow während der Tests (Tabelle 1).

In der CORT-Kohorte zeigt eine gemischte ANOVA mit CORT als Zwischen-Themen-Faktor und Woche als innerhalb der Probanden faktor an, dass Fahrzeug- und CORT-verabreichte Mäuse ein ähnliches Flüssigkeitsvolumen über 4 Wochen der Behandlung plus 3 Wochen Verhaltenstests (insgesamt 7 Wochen) konsumierten (Abbildung 1B). In der SDS-Kohorte absolvierten Control- und Experimentalmännchen 10 Tage des SDS-Protokolls und wurden auf Anfälligkeit für das SDS-Protokoll mit hilfe eines sozialen Interaktionstests bewertet, bei dem die Zeit, die für die Interaktion mit einem neuartigen CD-1-Männchen aufgewendet wurde, mit der Zeit in der Interaktionszone ohne die CD-124verglichen wurde. Eine einseitige ANOVA zeigte an, dass SDS bei anfälligen Mäusen einen maladaptiven Phänotyp produziert (60%), verglichen mit widerstandsfähigen Mäusen (40%) oder Kontrollmäuse, die nicht SDS ausgesetzt sind (Abbildung 1D). Insbesondere zeigen SDS-anfällige Mäuse eine Verkürzung der Zeit, die in der Interaktionszone verbracht wird, die eine neuartige CD-1-Maus enthält, im Vergleich zu SDS-Resilient- und Control-Mäusen.

Anschließend trainierten wir sowohl die CORT-Kohorten (Experimental- und Control-Mäuse) als auch SDS (Susceptible and Control) in der Y-Maze-Barriereaufgabe (Abbildung 2A). Wir haben die Anzahl der Versuche gemessen, die Kontroll- und Experimentalmäuse aufwenden würden, um eine Barriere für eine Belohnung von 4 Pellets zu erklimmen, im Gegensatz zur Wahl des anderen Arms des Y-Labyrinths, der nur 2 Pellets enthielt, aber keine Barriere zum Klettern enthielt. Für SDS wurde eine zweiseitig gemischte ANOVA mit SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) als Faktor zwischen den Probanden und Arm (HR-Arm, LR-Arm) als Innerhalb-Subjekt-Faktor verwendet, um das mühsame Reagieren im Y-Maze zu untersuchen. Für chronische CORT, eine zweiseitig gemischte ANOVA, mit CORT-Administration (Vehicle, CORT) als Faktor zwischen den Probanden und Arm (HR, Arm, LR-Arm) als innerhalb der Subjekte Faktor. Sowohl chronische CORT als auch SDS führten zu einer Verschiebung des mühsamen Reagierens, wenn die Barrierehöhe auf 15 cm und auf 20 cm angestiegen ist(Abbildung 2B und Abbildung 2C). Keiner von beiden reagierte, wenn sich nur eine 10 cm Barriere im HR-Arm befand. Darüber hinaus reagierten alle Mäuse in einer Belohnungs-Diskriminierungssitzung nach tests ähnlich auf den HR-Arm, wenn eine 10 cm-Barriere sowohl in HR- als auch in LR-Armen platziert wurde. Schließlich zeigen zweiseitig ANOVAs mit CORT oder SDS als Zwischen-Themenfaktor und HR- oder LR-Arm als Innerhalb-Subjekt-Faktor, dass die HR- und LR-Armlatenz mit der 15-cm-Barriere von der CORT-Verabreichung nicht beeinflusst wurde und für beide Gruppen mit LR- und HR-Armen ähnlich war (Abbildung 3). So verschieben chronische CORT und SDS die mühsame Reaktion in der Y-Maze-Barriereaufgabe bei männlichen Mäusen robust.

Wichtig ist, wenn chronische CORT oder SDS das Erlernen der Y-Maze-Barriereaufgabe beeinträchtigen (Abbildung 4), diese Mäuse können das Kriterium in Schulungen zur freien Wahl nicht erreichen, was sich auf die nachfolgende Interpretation der Barriereergebnisse auswirkt. Daher zeigen wir potenziell negative repräsentative Ergebnisse, die diesen Unterschied anzeigen, bewertet mit separaten unabhängigen Stichproben t-Tests (Abbildung 4).

Das CNSDS-Verfahren erzeugt einen robusten maladaptiven Phänotyp sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen C57BL/6J anfälligen Mäusen (Abbildung 5A). Eine soziale Interaktionsaufgabe wird verwendet, um Mäuse in belastbar zu schichten (38,3%) und anfällig (61,7%) Populationen (Abbildung 5B), die weiter nach Geschlecht unterteilt werden können (Männer: 43,3% belastbar, 56,7% anfällig; Weibchen: 36,7% belastbar, 63,3% anfällig), mit einseitigen ANOVAs zwischen CNSDS Control, CNSDS Experimental-Resilient und CNSDS Experimental-Susceptible Groups. Während dieses modifizierte Paradigma ähnliche maladaptive Effekte wie SDS in Vermeidungsverhalten28erzeugt, muss es noch in Kombination mit translationalrelevanten belohnungs- und motivationsbezogenen Verhaltenstests wie der Y-Maze-Barriereaufgabe implementiert werden. Für zukünftige Studien ist es wichtig, die Auswirkungen von Stressoren wie ZNSDS auf translational relevante Verhaltensweisen wie die Y-Maze-Barriereaufgabe bei Männern und Frauen zu bewerten.

Chronische SCORT Gruppe Körpergewicht (g)   Tägliche Sernahrungsgegeben (g)  
    Bedeuten Sem Bedeuten Sem
Fahrzeug 26.3 0.75 2.8 0.086
Cort 22.4 0.58 2.4 0.065
Sozialer Niederlagenstress
Steuerung 27.5 0.67 2.9 0.088
Sds 23.8 0.66 2.5 0.074

Tabelle 1: Körpergewicht und Menge der täglich bereitgestellten Nahrung. Fahrzeug- und CORT-verabreichte Mäuse sowie Kontroll- und SDS-Mäuse wurden wöchentlich gewogen und die Menge der gegebenen Nahrung wurde aufgezeichnet. Durchschnittliches Körpergewicht (g) bei Y-Maze-Tests und mittlere tägliche Nahrung (g) angegeben.

Figure 1
Abbildung 1: SDS induziert einen depressiven Phänotyp, der durch weniger soziale Interaktion gekennzeichnet ist.
(A) Schematisch, der die Zeitachse für die CORT- und Y-Maze-Barriereprotokolle darstellt. (B) Repräsentative Daten über das verbrauchte Volumen (ml/g/Tag) bei Fahrzeug- und CORT-verabreichten Mäusen. (C) Schematische Darstellung der Zeitachse für die SDS- und Y-Maze-Barriereprotokolle. (D) In einem repräsentativen sozialen Interaktionstest zeigen SDS-anfällige Mäuse eine reduzierte Zeit, die für die Interaktion mit einer neuartigen Maus aufgewendet wurde, verglichen mit SDS Resilient- oder Control-Mäusen. Balken sind mittelwert . SEM. *p < 0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: CORT und SDS verschieben das mühsame Reagieren in einer Y-Maze-Barriereaufgabe.
(A) Zeitleiste der Y-Maze Barriereaufgabe für CORT und SDS. (B) Chronic CORT reduziert die HR-Armauswahl bei 15cm und 20cm Barrierehöhe. Diese Zahl wurde von Dieterich et al. 202021geändert. (C) Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass SDS-anfällige Mäuse die Auswahl des HR-Arms bei 15 cm und 20 cm Barrierehöhe im Vergleich zu Kontroll- oder SDS-Resilient-Mäusen reduzieren. Balken sind mittelwert . SEM. *p < 0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Y-Maze-Latenz wird durch chronische CORT nicht beeinflusst.
Chronische CORT hat keinen Einfluss auf die Latenz, um entweder LR- oder HR-Arme im Y-Maze auszuwählen. Außerdem wählen sowohl Vehicle- als auch CORT-Mäuse LR- oder HR-Arm mit ähnlichen Latenzen. Diese Figur ist aus Dieterich et al. 202021nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Chronische CORT und SDS beeinträchtigen die freie Wahl HR ArmAuswahl.
Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass Mäuse, die entweder chronische CORT oder SDS ausgesetzt sind, die Anzahl der Armauswahlen mit hoher Belohnung im Vergleich zu Kontrollmäusen im Training der freien Wahl reduzieren, was die Interpretation der Ergebnisse erschwert und/oder den Übergang zu Barrieretests verzögert oder verhindert. Balken sind mittelwert . SEM. *p < 0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schichtung von CNSDS-exponierten männlichen und weiblichen Mäusen in anfällige und widerstandsfähige Populationen.
(A) Schematisches CNSDS-Experimental- und Kontrollparadigma. Diese Zahl wird aus Yohn et al. 201928nachgedruckt. (B) CNSDS erzeugt eine robuste Schichtung von CNSDS-Resilient (RES) und CNSDS-Susceptible (SUS) Mäusen. Diese Zahl wird aus Yohn et al. 201928nachgedruckt. Balken sind mittelwert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Während das chronische CORT-Paradigma eine konstante CORT-Dosis im Trinkwasser bietet, kann es erfahrungsgemäß eine gewisse Variabilität in der Menge geben, die von Mäusen verbraucht wird. Darüber hinaus kann der Verbrauch nur für den gesamten Käfig beurteilt werden, und ein Durchschnitt wird auf der Grundlage der Anzahl der Mäuse im Käfig genommen. Darüber hinaus kann es beim Wiegen der Flaschen, beim Übertragen der Mäuse zur Verhaltensprüfung oder beim Wechsel in einen frischen Käfig zu Verschüttungen kommen. Die Verfolgung des Fahrzeug- und CORT-Verbrauchs ist jedoch nach wie vor über Wochen der Behandlung und Verhaltenstests hinweg machbar und genau. Wir empfehlen dringend, einmal pro Woche auf eine frische Flasche umzusteigen, die entweder Fahrzeug oder CORT enthält, sowie die festgelegten Zeiten zum Wiegen und Austauschen von Flaschen beizubehalten. Zum Beispiel kann der Wechsel zu frischen Flaschen beim Wiegen und Nachfüllen der Flaschen montags erfolgen und dann alle Flaschen am Donnerstag oder Freitag wieder wiegen und nachfüllen. Ebenso ist es am besten, alle Mäuse gleichzeitig an einem bestimmten Tag pro Woche zu wiegen. Schließlich ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass dieses CORT-Paradigma die endogene Produktion von Corticosteron durch die HPA-Achse stumpft. Daher müssen Mäuse während der gesamten Verhaltenstests auf CORT bleiben, bis sie geopfert werden. Wenn Mäuse aus CORT genommen werden, dann können sie eine Addisonian-Krise der akuten Nebenniereninsuffizienz leiden. Alternative Verfahren haben eine 2-3 Wochen CORT-Exposition verwendet, gefolgt von einer progressiven Entwöhnung des CORT und dann einem Verhaltenstestfenster von etwa 3-4 Wochen, wenn die endogenen CORT-Werte wieder normal17,19.

In der Y-Maze-Barriereaufgabe ist es wichtig, mit der Maze-Gewöhnung und dem Training unmittelbar nach dem SDS-Protokoll zu beginnen (Abbildung 2A). Ein möglicher Vorbehalt dieser experimentellen Zeitachse ist, dass Mäuse nach der Manipulation und nicht vorher trainiert werden, wo sie je nach Trainingsleistung gleichmäßig aufgeteilt werden könnten. In unserem Erfahrungstraining vor und nach der CORT-Administration wirkt sich dies jedoch nicht wesentlich auf das instrumentale Verhaltenaus 16. Alle Mäuse werden gründlich trainiert und erreichen das Kriterium (>70% HR-Armauswahl in freien Wahlsitzungen), bevor sie zur Barriereprüfung übergehen. Mäuse sollten zuerst richtig in das Labyrinth gewöhnt werden, so wird es ein vertrauter Apparat, wie wir gefunden haben, dies hilft in der folgenden Trainingsphase. Beim Training jeder Maus ist es wichtig, die entworfenen hohen und niedrigen Belohnungarme für jede einzelne Maus zu erhalten, so dass eine Maus keinen Arm durchquert, der 4 Pellets erwartet und 2 findet oder umgekehrt. Wir empfehlen, sowohl Papier- als auch digitale Kopien großer Rohdatendateien aufzubewahren, die auf die ausbalancierten High- und Low-Reward-Arme für alle Control- und SDS-Mäuse hinweisen.

Wir glauben nicht, dass es einen Unterschied in der Labyrinthleistung aufgrund der genauen Spezifikationen der Labyrinthform (Y-Maze versus T-Maze) gibt, und glauben, dass Forscher entweder in aufwandsbezogenen Wahlverhaltensexperimenten verwenden könnten. Außerdem haben wir bereits einen leichten Anstieg der HR-Armauswahl um 15 cm im Vergleich zu 10 cm bei fahrzeugverabreichten Mäusen21gemeldet. Allerdings sollten die Forscher eine ähnliche oder reduzierte HR-Armauswahl erwarten, da die Barrierehöhe über 15 cm ansteigt, da die 20 cm Barrieremäuse selten den HR-Arm21wählen.

Darüber hinaus ist es wichtig, ein 70% Ethanol-Spray zu verwenden, um das Labyrinth zu reinigen und Restgerüche nach jeder Sitzung zu entfernen. Wir empfehlen auch, die Mäuse konsistent zu laufen, so dass es ein relativ konstantes Inter-Trial-Intervall für alle Mäuse gibt. Wir empfehlen, etwa 4-6 Mäuse gleichzeitig zu radeln, was ein Intervall von etwa 5 Minuten ergeben sollte. Schließlich ist es in der letzten Sitzung zur freien Wahl und in allen Barrieretestsitzungen wichtig, die Latenz aufzuzeichnen, um in allen Versuchen einen der beiden Arme auszuwählen. Auch Mäuse schaffen es gelegentlich, an die Spitze der Plexiglaswände zu springen, oder häufiger von der Spitze der Barrieren. Wir empfehlen höhere Plexiglas Wandadapter an den Seiten des Labyrinths, wenn dies geschieht. Dabei kann es sich einfach um rechteckige Plexiglasstücke (Breite 20 cm, Länge 80 cm) handelt. Wir markieren jede Studie, bei der eine Maus einen Arm nicht innerhalb von 60 Sekunden auswählt oder einen Arm auswählt, aber die Futterpellets nicht als ausgelassene Studie isst. Schließlich können sowohl chronische CORT als auch SDS das Körpergewicht verringern, was sich auf die Menge an Lebensmitteln auswirkt, die über Wochen der Prüfung verbraucht werden21. Die Forscher sollten Mäuse regelmäßig wiegen und die Menge der Nahrung im Hauskäfig anpassen, um Mäuse bei etwa 90% ihres frei fütternden Körpergewichts zu halten.

Hier diskutieren wir auch ein kürzlich entwickeltes Paradigma, chronische nantilernichtdiskriminierende soziale Niederlagen (CNSDS) (Abbildung 5A), zur Induzieren von Stress anfällige und widerstandsfähige Populationen bei männlichen und weiblichen Mäusen (Abbildung 5B). Das CNSDS-Paradigma kann von präklinischen Forschern verwendet werden, die an Stress oder affekaffnen Störungen interessiert sind. Im CNSDS-Paradigma ist es wichtig, dass die experimentellen Weibchen mindestens einmal pro Sitzung angegriffen werden. In fast allen sozialen Niederlagensitzungen werden die experimentellen Männchen mehrfach angegriffen. Jeder CD-1-Aggressor muss vor Beginn des CNSDS-Protokolls mit männlichen und weiblichen C57BL/6J-Mäusen streng abgeschirmt werden und alle Angriffe in jeder Sitzung aufzeichnen. Während wir eine Dual-Sex-Kontrollbedingung in der CNSDS-Methodik beschreiben, bei der ein Männchen und ein Weibchen interagieren, kann es für einige angemessen sein, ein zusätzliches Männchen für diese Kontrollinteraktionen aufzunehmen, wodurch die beiden Männchen und ein Weibchen, das im CNSDS-Verfahren verwendet wird, imitiert werden. Dieses alternative Kontrollverfahren hat keinen Einfluss auf das Verhalten von Mäusen im Vermeidungsverhalten28. Darüber hinaus sollte ein sozialer Interaktionstest 24 Stunden nach dem 10-Tägigen Abschaltprotokoll implementiert werden, um sowohl die Wirksamkeit der Methode zu gewährleisten als auch männliche und weibliche Mäuse als widerstandsfähig oder anfällig für CNSDS24zu schichten.

Ein Problem bei der Verwendung des historischen Ansatzes, Mäuse in widerstandsfähige und anfällige Populationen auf der Grundlage des sozialen Interaktionstests zu unterteilen, ist, dass nicht alle Abneigungsverhalten mit Video-Tracking-Software genau gemessen werden können. "Resiliente" Mäuse mit einem Interaktionswert >1 können unterwürfiges Verhalten um den Behälter zeigen, der die CD1-Maus31beherbergt. Es ist wichtig für das Feld, Software zu entwickeln, die solche Mikroverhalten besser verfolgt. Werkzeuge wie einfache Verhaltensanalysen (SimBA32), die vom Golden Lab entwickelt wurden, um Verhaltensklassifikatoren für komplexe soziale Verhaltensweisen bei Nagetieren zu ermöglichen, können sich in dieser Hinsicht als nützlich erweisen.

Während des CNSDS-Protokolls kann eine gewisse Montage erfolgen. Obwohl wir keine Schwangerschaften in diesem Paradigma beobachtet haben, sollten sich die Forscher dieser Möglichkeit bewusst sein.

Eine weitere Einschränkung von Protokollen zu sozialen Niederlagen, einschließlich CNSDS, ist das angeblich begrenzte Zeitfenster, um Stresseffekte auf das Verhalten nach Abschluss der Social Defeat Sessions zu untersuchen. So haben wir bestehende Labyrinth-Barriereprotokolle angepasst, um alle Gewöhnungs-, Trainings- und Testsitzungen in einen 30-Tage-Zeitrahmen zu passen. Dies kann jedoch das Gesamttraining für einige Mäuse beschleunigen, die Schwierigkeiten haben können, das 70%-Kriterium für die Auswahl der Hochbelohnungsarm zu erreichen, das für die freie Wahl erforderlich ist (Abbildung 4). Darüber hinaus stehen begrenzte Tage zur Verfügung, um alle anderen Verhaltenstests ohne ordnungsgemäße Planung abzuschließen. Jüngste Studien deuten jedoch darauf hin, dass sozialer Niederlagenstress dauerhaftere Auswirkungen auf Gehirn und Verhalten haben kann. Studien aus dem Miczek-Labor zeigen, dass 10 Tage sozialer Niederlage Stress den freiwilligen Alkoholkonsum bei Mäusen mit einer Dauer von mindestens 4 Wochen31,33erhöhen kann. Social Defeat Protokolle verwenden Niederlagensitzungen, die überall von 5-10 Minuten dauern. Wir verwenden 5 min Expositionen für CNSDS, um die Wahrscheinlichkeit von Verletzungen bei experimentellen C57BL/6J Mäusen zu verringern28. Das CNSDS-Protokoll liefert bei Frauen vergleichbare Ergebnisse wie das von Newmann und Kollegen entwickelte Sozialabwehrprotokoll, in dem C57BL/6J weibliche Mäuse ansässigen Schweizer Weber-Mäusen ausgesetzt sind28. Ähnlich wie BeizSDS verwendet diese Variante des Social Defeat Protokolls 10 Tage mit 5 min Wechselwirkungen, um einen chronischen Stress-Phänotyp zu induzieren.

Diese Methoden können verwendet werden, um zu untersuchen, wie chronischer Stress die Belohnungsverarbeitung und Motivation bei Mäusen beeinflusst. Sowohl die Belohnungsverarbeitung als auch weibliche Probanden sind historisch unterstudiert im Bereich der präklinischen Stimmungsstörung. Zukünftige Studien sollten die Auswirkungen von chronischem Stress auf die Belohnungsmotivation von Männern und Frauen bestimmen und belastbar gegenüber anfälligen Mäusen schichten (Abbildung 5B). Es wird wertvoll sein zu wissen, ob diese Schichtung unterschiedliche Auswirkungen auf die Y-Maze-Barriereleistung erzeugt, wie sie bei Vermeidungsverhalten wie offenem Feld, Hoch-Plus-Labyrinth und neuheitsunterdrückter Fütterung zu beobachten ist. Zukünftige Studien können diese Methoden mit anderen Techniken kombinieren, wie Optogenetik oder DREADDS-Technologie, um die neuronale Schaltung zu untersuchen, die die Stressreaktion oder Belohnungsmotivation vermittelt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Thomas Grace für den Bau von Y-Mazes, Barrieren und sozialen Niederlagenkäfigen. Die Autoren danken Jay Lee, Karina Stech und Prachi Srivastava für die Unterstützung bei der Datenerfassung. Diese Arbeit wurde von NIMH Grant R01 MH112861 (BAS) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 Clear, 3/16" thick, 24" X 36"
Beta-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4767 500 mg
C57BL/6J Mice Jackson Labs 000664 Adults age 7-8 weeks
Corticosterone Sigma-Aldrich C2505 or C27840 100 or 500 mg
Male CD-1 Mice Charles River 022 "Retired Breeders"
PVC Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 White, 3/16" thick, 48" X 48"
Solidstate Ultrasonic Cleaner Fisher Scientific FS-28 Must reach 40 kHz
Steel Wire Cloth McMaster Carr 9219T143 1 ft X 2 ft

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Verhalten Ausgabe 162 Depression Chronischer Stress Aufwandswahl sozialer Niederlagenstress Corticosteron affektive Störungen Belohnung Geschlechtsunterschiede
Chronischer Stress verschiebt aufwandsbezogenes Wahlverhalten in einer Y-Maze Barriere-Aufgabe bei Mäusen
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Dieterich, A., Yohn, C. N., Samuels, … More

Dieterich, A., Yohn, C. N., Samuels, B. A. Chronic Stress Shifts Effort-Related Choice Behavior in a Y-Maze Barrier Task in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61548, doi:10.3791/61548 (2020).

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