Summary
近红外光免疫疗法（NIR-PIT）是一种新兴的癌症治疗策略，利用抗体光吸收剂（IR700Dye）结合光和NIR光来破坏癌细胞。在这里，我们提出了一种方法，评估NIR-PIT的抗肿瘤作用，在小鼠模型的胸膜传播肺癌和恶性胸膜间皮瘤使用生物发光成像。
Abstract
光免疫疗法的疗效可以更准确地评估与矫名小鼠模型比皮下模型。可用于评估肺癌或恶性胸膜间皮瘤等胸内疾病的治疗方法。
近红外光免疫疗法（NIR-PIT）是最近开发的癌症治疗策略，它结合了肿瘤靶向抗体的特异性与光吸收物（IR700Dye）暴露在NIR光下后引起的毒性。NIR-PIT的功效已报告使用各种抗体：然而，只有少数报告在矫名模型中显示了这种策略的治疗效果。在本研究中，我们展示了一个使用NIR-PIT治疗的胸膜传播肺癌模型的疗效评估示例。
Introduction
尽管进行了数十年的研究，癌症仍然是导致死亡的主要原因之一。原因之一是放射治疗和化疗是高侵入性技术，这可能限制其治疗效果。细胞或分子靶向疗法，这是侵入性较小的技术，正受到越来越多的关注。光免疫疗法是一种通过结合免疫治疗和光疗协同提高治疗效果的治疗方法。免疫疗法通过增加肿瘤微环境的免疫原性，减少免疫调节抑制，提高肿瘤免疫力，导致肿瘤在体内的破坏。光疗通过光敏剂和光线的组合破坏原发性肿瘤，从肿瘤细胞中释放出的肿瘤特异性抗原增强肿瘤免疫力。肿瘤可以选择性地使用光敏剂治疗，因为它们是特定和选择性的目标细胞。光疗模式包括光动力疗法（PDT）、光热疗法（PTT）和光化学疗法1。
近红外光免疫疗法（NIR-PIT）是一种最近开发的抗肿瘤光疗方法，结合了光化学疗法和免疫疗法1，2。NIR-PIT 是一种分子靶向疗法，通过将近红外硅邻苯二甲酸酯染料 IRdye 700DX （IR700） 与单克隆抗体 （mAb） 结合，针对特定细胞表面分子。目标细胞的细胞膜在用NIR光（690纳米）3照射时被破坏。
使用靶向光疗法的概念，结合传统的光敏剂和抗体或靶向PDT是超过30年的历史4，5。先前的研究试图通过将常规PDT制剂与抗体结合来瞄准它们。然而，由于光敏剂6，7的疏水性，这些结合体被困在肝脏中，因此成功有限。此外，NIR-PIT的机制与传统的PDT机制完全不同。传统的光敏剂产生氧化应激，这种应激来自能量转换，这种能量转换吸收光能，脱位到兴奋状态，过渡到地面状态，并导致凋亡。然而，NIR-PIT通过光化学反应8将光敏剂聚合在膜上，直接破坏细胞膜，从而导致快速坏死。NIR-PIT 在很多方面优于传统的目标 PDT。传统光敏剂的消亡系数较低，需要将大量光敏剂附着在单个抗体分子上，从而可能降低结合亲和力。大多数传统光敏剂是疏水剂，因此很难将光敏剂与抗体结合，而不影响其免疫反应或体内目标积累。传统光敏剂通常吸收可见范围内的光线，减少组织渗透。
关于NIR-PIT针对内胸肿瘤，如肺癌和恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞的几项研究已经报告了9，10，11，12，13，14，15，16，17。然而，只有少数报告描述了NIR-PIT在胸膜传播MPM或肺癌模型9，10，11，12的疗效。皮下肿瘤异种模型被认为是标准肿瘤模型，目前广泛用于评估新疗法18的抗肿瘤效果。然而，皮下肿瘤微环境是不允许发展一个适当的组织结构或条件，适当地回顾一个真正的恶性表型19，20，21，22。理想情况下，应建立正位疾病模型，以便更精确地评估抗肿瘤效应。
在这里，我们展示了一种在小鼠模型的胸膜传播肺癌，这是使用NIR-PIT治疗的功效评估方法。通过将肿瘤细胞注射到胸腔中，并使用荧光酶发光进行确认，生成胸腔传播小鼠模型。小鼠接受静脉注射，注射与IR700和NIR照射到胸部的mAb。使用荧光酶发光评估治疗效果。
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Protocol
所有活体实验均按照名古屋大学动物护理和使用委员会实验室动物资源的护理和使用指南（批准 #2017-29438，#2018-30096，#2019-31234，#2020-20104）进行。在名古屋大学动物中心购买并饲养了六周大的同源性裸体小鼠。在小鼠进行手术时，他们麻醉时会用异黄素（介绍：4-5%，维持2-3%）：爪子被用钳子压住， 以确认麻醉的深度。
1. IR700 与 mAb 的结合
- 孵化 mAb （1 毫克， 6.8 nmol） 与 IR700 NHS 酯 （66.8 毫克， 34.2 nmol， 5 mmol/L 在 DMSO） 在 0.1 摩尔/L Na2HPO4 （pH 8.6） 在 15-25 °C 1 h.
- 使用列（例如，Sephadex）净化混合物。准备并使用 PBS 清洗柱子。然后，将混合物涂在柱子上并收集滴，该滴子包含纯化的 IR700 结合抗体。这种IR700结合抗体被称为抗体光敏剂结合（APC）。
- 测量 APC 中的蛋白质和 IR700 浓度。
- 使用光谱光度计为蛋白质和 IR700 准备校准曲线。
- 将白蛋白的标准浓度与试剂盒的蛋白质检测套件混合，遵循试剂盒协议（参见材料表，库马西亮蓝色（CBB）蛋白质染色）。测量白蛋白在595纳米波长的吸收量，并绘制蛋白质的校准曲线（线性近似公式）使用以下方程：y = 斧头 + b（x：浓度，y：吸收）。
- 使用相同的程序获得IR700的校准曲线，吸收度为690纳米。建议将 IR700 的标准浓度为 0.1-5 μM（0.1954-9.77 μg/mL）。
- 使用校准曲线 [x = （y-b）/a （x： 浓度， y： 吸收性）测量 APC 中的蛋白质浓度和 IR700 浓度。
- 确定每个 mAb 绑定的 IR700 染料的数量，并确定摩尔浓度的结果。
注：确定每兆阿布分子的IR700分子的最佳结合数非常重要。一般来说，大约三个IR700分子绑在一个单一的mAb分子将有效地在体外和体内。许多IR700绑定每个抗体（例如，6）更容易被困在肝脏在体内实验。抗体与IR700的结合比在1：2-1：4之间。如有必要，IR700的比例已降低。
- 执行二甲基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 作为 APC 形成的确认。使用荧光成像仪在 700 nm 处对凝胶进行成像，并按照套件协议使用蛋白质染色套件染色凝胶中的蛋白质（参见材料表，CBB 蛋白质染色）。
2.胸膜传播模式的生成
- 准备荧光酶表达目标细胞，并在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 100 μL 中暂停 1.0 × 106目标细胞
注意：胸内癌细胞，如肺癌和MPM，适合作为靶向细胞。卢西费拉塞表达细胞是通过荧光酶基因转染制备的，在>10个细胞通道后确认了荧光酶的高表达。细胞在介质中培养，辅以10%的胎儿牛血清和青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100毫克/毫升）。细胞数量根据肿瘤生长速度和治疗时间（1.0.×105-6.0×106细胞/体重）进行调整。 - 准备8-12周大的雌性同源性裸体小鼠，体重最好为19-21克。
- 在手术过程中用异黄素麻醉小鼠（介绍：4-5%，维持2-3%）：用钳子按尾巴，以确认没有反应。
- 用聚苯乙烯泡沫制作塞子，并将塞子连接到 30 G 针上，使尖端保持在 5 mm，以防止肺部损伤。用干净的钳子弯曲针尖，或用 70% EtOH 清洁的硬物压紧针尖，以避免苯甲骨文（图 1）。
注意：小心不要刺穿自己。用钳子弯曲针头。将塞子固定在针头上时，不要抱住它。在将细胞填充到注射器中之前，将塞子粘住更安全。 - 将注射器 （1 mL） 填充目标细胞，并用塞子连接 30G 针头。
- 手术前用 70% 的 Etoh 消毒动物的胸部。
- 通过腹间空间将针刺入老鼠的胸部。由于当时对肋骨的阻力，针尖上下移动。穿过腹间空间后，将注射器按在鼠标上，并注射100微升的目标细胞（图2）。
注意：当针头正确进入胸腔时，鼠标会深呼吸。随着针尖的弯曲，肺气管和不当注射细胞到肺部是可以避免的。
注意：建议右胸壁穿刺，以避免心脏壁穿刺的风险。 - 将鼠标滚动 2-3 次，将细胞扩散到胸腔中。
- 将鼠标放回干净温暖的笼子中，并监视直到流动。手术后，小鼠会从麻醉中醒来，行为正常。
3.生物发光测量
注：用于数据采集的软件列在材料表中。
- 为了确认胸腔传播模型的生成，每天将细胞注入胸腔后评估生物发光图像。
- 麻醉小鼠（步骤2.3），并在腹内注射D-露西弗林（15毫克/毫升，200微升）。
- 确保小鼠在成像前后正常呼吸。如有必要，请使用加热器，以防止麻醉期间体温过低。
- 注射10分钟后，将鼠标设置在生物发光成像（BLI）测量设备中。对于图像采集，打开软件的采集控制面板。选择发光，照片和覆盖（图3）。
- 将曝光时间设置为自动。将宾宁设置为小。
- 将 f/stop 设置为1表示发光，将 8设置为照片;f/stop 控制带电耦合设备探测器接收的光量。
- 将视图场设置为C。
- 鼠标样本准备好成像后，单击"获取"进行成像采集。选择具有足够荧光酶活性的小鼠进行进一步研究。
注：从心室侧面观察时，合适的胸腔传播模型显示胸部扩散部位的强亮。如果 BLI 图像没有扩散到胸腔中，并且仅在注射部位扩散，则肿瘤可能会皮下移植。 - 显示图像后，将显示格式设置为辐射。打开工具调色板面板（图4A）。
- 选择投资回报率工具。我们建议使用圆圈在图像上范围显示生物发光区域。
- 单击测量 ROI以测量表面生物发光强度（图 4B）。
- 使用投资回报率测量面板左侧的配置测量来选择所需的值/信息。将此数据表导出为.csv文件（图4C）。
- 使用总通量值 （p/s）作为.csv文件中的生物发光强度量化。
4.扩散发光成像断层扫描 （DLIT）
注：用于数据采集的软件列在材料表中。
- 打开X 射线武装按钮。
- 麻醉小鼠（步骤2.3），然后将D-黄素（15毫克/毫升，200微升）腹内注射到小鼠体内。要连续拍摄 DLIT 从 3.2 到 3.7，请跳过此步骤。
- 注射十分钟后，将鼠标放入BLI设备中。
- 打开软件的获取控制面板。选择发光，照片， CT，标准一鼠标， 和叠加。其他设置与 3.4-3.6 相同（图5A）。
- 在采集控制面板上选择成像向导。
- 选择生物发光，然后选择DLIT（图5B）。
- 选择萤火把作为测量的波长（图5C）。
- 将成像主体设置为鼠标，将曝光参数设置为自动设置，将视野设置为C-13.4 厘米，将受试高度设置为1.5 厘米（图5D）。
- 将X 射线在通能时进行。收购.
- 打开 CT 顺序图像数据。
- 工具调色板上的开放表面地形。选择显示（图 6A）。
- 调整阈值，因为紫色显示屏只显示身体表面（图6B）。然后，选择主题裸体鼠标并单击生成表面。确保鼠标的轮廓准确绘制（图 6C）。
- 打开工具调色板，DLIT 3D重建属性选项卡。选择组织属性作为鼠标组织和源频谱作为萤火飞（图6D）。接下来，打开分析选项卡并确认每个选定波长数据的数据。最后，单击重建按钮（图 6E）。
- 确认配置的 DLIT 图像中胸腔中是否存在 BLI。
5. NIR-PIT 用于体内胸膜传播模型
- 用功率计测量690纳米波长（NIR）激光器的光剂量，并将输出调整为100mW/cm2。
注：激光与精确的线圈大小相协调：因此，无论距离在50厘米以内，光能几乎不会改变。如果有许多不良事件，如烧伤，减少40mW/cm2范围内的输出。 - 用 70% EtOH 清洁尾部，并在 NIR 辐照前通过尾静脉 24 h 静脉注射 APC （100 μg）。向注射部位施加压力以控制出血。
注：将 APC 的体积调整为 50-200 μL 用于注射。 - 麻醉小鼠（第2.3步），并把它们放在他们的背上。为了避免NIR照射到非目标部位，用铝箔屏蔽其他站点（图7A）。用100 J/cm2的激光照射NIR光：如果肿瘤被传回腹部，NIR光照射剂量可以分为多个方向（图7B）。
注意：根据体外结果和烧伤等不良事件，调整剂量在 30-150 J/cm2。 - 当 NIR 辐照完成，鼠标清醒时，将其放回笼子。
- 观察 BLI 并测量投资回报率（每天）（参见 3.2-3.12）。
- 对于前体内成像，在 APC 注射后 24 小时，在 NIR 照射前用二氧化碳对小鼠实施安乐死。
- 要观察鼠标胸部内部，请取出胸腔并切开肋骨和胸骨。在没有 APC 管理的情况下，在控制旁边捕获荧光图像 （700 nm）。然后，在暴露的胸腔上涂抹 D-滑铁蛋白（150 μg/mL），然后采取 BLI（参考 3.2-3.7）。
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Representative Results
抗多普兰素抗体NZ-1与IR700结合产生NZ-1-IR700。我们确认了 NZ-1 和 IR700 在 SDS-PAGE（图 8）上的绑定。Luciferase表达H2373（H2373-luc）是由通过用荧光酶基因10转染恶性间皮瘤细胞（H2373）来制备的。
我们麻醉了8-12周大的雌性同源性同源性裸鼠，并将1×10个H2373-luc细胞注射到胸腔中。将肿瘤细胞注射到小鼠体内的当天被指示为第1天。
在第4天，在腹腔注射D-luciferin（15毫克/毫升，200微升）后进行了BLI和DLIT手术，并选择胸腔内具有足够荧光酶活性的小鼠进行进一步研究（图9）。通过尾静脉注射100微克NZ-1-IR700（100微升）。对照组注射了PBS（100微升）。
在第5天，两只老鼠被牺牲使用二氧化碳窒息前体内。NZ-1-IR700注射小鼠在胸肿瘤中表现出高IR700荧光和荧光酶活性，表明静脉注射的NZ-1-IR700到达传播的胸膜肿瘤部位（图10）。
为了评估NIR-PIT在全息小鼠模型中的影响，NIR光从两个方向（共30 J/cm2）在40mW/cm2的2个方向上应用，在第5天（NIR光被外部照射），然后是串行BLI。对照组没有受到NIR光的照射。
在对患有NIR-PIT的小鼠进行治疗后，治疗组显示葡萄糖酶活性下降。但是，对照组中的相对光单元呈逐渐增加（*p <0.05 与对照、t 测试）（图11）。
图1：用于细胞移植的简易手工设备。 将用聚苯乙烯泡沫制成的塞子连接到 30G 针上，使尖端保持在 5 mm。针尖应弯曲，以避免苯多角。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：将靶细胞注射到胸腔中。 侧身将鼠标转动，将针刺入小鼠的肺部。由于塞子和针尖弯曲，针进入胸腔而不粘在肺部。注射目标细胞，同时将针头压在小鼠身上。请单击此处查看此图的较大版本。
图3： 收购控制面板。 选择 发光， 照片和 覆盖。将曝光时间设置为 自动，宾宁为 小，f/stop为1为发光，8为照片，视场为 C。鼠标样本准备好成像后，单击 "获取 "进行成像采集。请单击此处查看此图的较大版本。
图4： 测量 （BLI） （A） 工具调色板面板。选择投资回报率工具。我们建议圆环在图像上对生物发光区域进行范围。（B） BLI 量化。在选择每个图像中的 ROI 后，单击 "测量投资回报率 "进行分析。（C） 量化信息。使用投资回报率测量面板左侧的配置测量来选择所需的值/信息。将此数据表导出为.csv文件。请单击此处查看此图的较大版本。
图5： 收购DLIT。 （A） DLIT 的收购控制面板。选择 发光，照片，CT，标准一鼠标和 覆盖。其他设置与 3.4-3.6（图 3）相同。（B） 成像向导面板。选择 生物发光和 DLIT。（C） 选择测量波长。选择波长作为 萤火飞弹。（D） 将成像主体设置为 鼠标，将曝光参数设置为 自动设置，将视野设置为 C-13.4 厘米，将受试高度设置为 1.5 厘米。然后，点击 X光片将产生时，充满活力。获得。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6： DLIT的重建 。 （A） 工具调色板面板。工具调色板上的开放表面地形。选择显示。（B） 调整鼠标表面识别。调整阈值，因为紫色显示屏仅显示身体表面。选择主题裸体鼠标，然后单击生成表面。确保准确绘制鼠标的轮廓。（C） 工具调色板。打开DLIT 3D 重建属性选项卡，选择组织属性作为鼠标组织和源频谱作为萤火飞。（D） 打开分析选项卡，为每个波长的数据选择数据。（E） 单击重建按钮。请单击此处查看此图的较大版本。
图7： NIR辐照。（A ） 用铝箔遮挡腹部，防止尼尔向腹部辐射。（B） 使用 BLI 强度强的激光照射 NIR 光：在某些情况下，NIR 激光被划分为多个方向。请单击此处查看此图的较大版本。
图8： SDS-PAGE。 在 SDS-PAGE 凝胶上成功确认结合的 NZ-1-IR700（左，胶体蓝色染色;右，700 nm 通道的荧光）。稀释的 NZ-1 作为控制。请单击此处查看此图的较大版本。
图9： DLIT。 确认胸腔中表达葡萄糖的肿瘤细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
图10：前体内成像。 NZ-1-IR700 注射后 24 小时的胸膜传播 MPM 模型的特征与 BLI。请单击此处查看此图的较大版本。
图11：NIR-PIT对胸膜传播模型的抗肿瘤效应。 （A） 以波多普兰靶点的NIR-PIT方案以行显示。波多普兰靶点 NIR-PIT 与 NZ-1-IR700 在胸膜传播模型与 H2373-luc 肿瘤.显示了胸膜传播模型的 BLI。（B） 虽然用BLI测量的葡萄糖酶活动在NIR-PIT组中没有增加，但对照组随着肿瘤的生长而逐渐增加。（n 两组≥ 3，t 测试）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们展示了一种测量NIR-PIT对MPM胸膜传播模型的治疗效果的方法。用NIR-PIT进行了高度选择性的细胞杀戮;因此，正常组织几乎没有损坏23，24，25。通过这种选择性细胞杀伤，NIR-PIT在传播的9、26型中被证明是安全的。但是，某些步骤可能采用替代方法。据报道，27、28、29、30型的胸膜传播模式有各种方法。我们选择了注射模型，因为它是一个简单的程序，对小鼠来说最不累人。我们使用BLI来测量NIR-PIT的治疗效果，因为我们可以用活鼠进行定量评估。例如，正电子发射断层扫描/计算机断层扫描 （PET/CT）27可以是评估胸膜传播模型肿瘤体积的替代方法。已报告在其他矫名模型中与 BLI 的 NIR-PIT;NIR-PIT可用于腹部传播模型、肺多转移肿瘤模型和脑肿瘤12、26、31、32、33、34、35、36。即使是小转移性肿瘤 foci 也可以用 BLI 观察到，NIR-PIT 也可以执行11，12。
我们根据初步实验描述了协议的某些部分。首先，从 APC 管理到 NIR 辐照的时间。使用皮下肿瘤模型提前评估了药理动力学。APC在通过使用 mAb的尾静脉干预后 24 小时在肿瘤中达到峰值;NIR辐照可以在APC管理9，10，11，12后24小时进行。其次，NIR-PIT中杀死肿瘤细胞所需的NIR光剂量因抗体和靶细胞线而异，后者使用体外结果进行预测。
这项研究有一些局限性。首先，肿瘤广泛分布在胸腔中，不能精确测量NIR辐照能量。NIR激发光的波长（峰值为690纳米）允许至少2-3英寸渗透到组织37。因此，在小鼠的情况下，NIR光到达胸腔，甚至外部。目前，NIR激光设备用于鼠标胸膜传播模型9，10，11，12。然而，在实际临床使用中，我们打算使用精确的光纤通过胸腔排水管34照射整个胸腔内腔。其次，NIR-辐照剂量是有限的，这取决于mAb的特异性，肿瘤细胞上表达的抗原。APC 的非特定绑定可能会导致意外的器官损伤。
最后，我们提出了一种方法，评估NIR-PIT与BLI在MPM的胸膜传播模型中的治疗效果。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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