Summary
Hier tonen we het gebruik van traditionele donkerveldmicroscopie om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op celmembraan te monitoren. De locatie en oriëntatie van enkele AuNR's worden gedetecteerd met behulp van ImageJ en MATLAB, en de diffusieve toestanden van AuNR's worden gekenmerkt door analyse van het volgen van afzonderlijke deeltjes.
Abstract
Het analyseren van de diffusionele dynamiek van nanodeeltjes op het celmembraan speelt een belangrijke rol bij een beter begrip van het cellulaire opnameproces en biedt een theoretische basis voor het rationele ontwerp van de levering van nanogeneeskunde. Single particle tracking (SPT) analyse kan de positie en oriëntatie van individuele nanodeeltjes op celmembraan onderzoeken en hun translationele en rotatietoestanden onthullen. Hier laten we zien hoe we traditionele donkerveldmicroscopie kunnen gebruiken om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op levend celmembraan te monitoren. We laten ook zien hoe u de locatie en oriëntatie van AuNRs extraheren met Behulp van ImageJ en MATLAB, en hoe u de diffusieve statussen van AuNRs karakteriseren. Statistische analyse van honderden deeltjes toont aan dat enkele AuNRs Browniaanse beweging uitvoeren op het oppervlak van U87 MG celmembraan. Individuele longtrajectanalyses tonen echter aan dat AuNR's twee duidelijk verschillende soorten bewegingstoestanden op het membraan hebben, namelijk langeafstandstransport en opsluiting met een beperkt oppervlak. Onze SPT-methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de oppervlakte- of intracellulaire deeltjesdiffusie in verschillende biologische cellen te bestuderen en kunnen een krachtig hulpmiddel worden voor onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen.
Introduction
De dynamiek van nanodeeltjes (NPs) op het membraan is nauw verbonden met het cellulaire opnameproces, wat essentieel is voor het begrip van celfuncties, virale of bacteriële infecties en de ontwikkeling van kunstmatige nanomedische toedieningssystemen1,2. Single particle tracking (SPT) techniek is een robuust hulpmiddel voor het karakteriseren van het heterogene gedrag van NPs3,4. Over het algemeen is celmembraan vloeibaar, wat betekent dat de componenten zoals eiwitten en lipiden zijdelings kunnen bewegen in het plasmamembraanvlak5,6,7. De spatiotemporale complexiteit van membraanorganisatie en -structuur kan leiden tot spatiotemporale heterogeniteit van de interactie tussen NPs en membraan. Daarom vereist directe visualisatie van de beweging van NPs op het membraan zowel een hoge ruimtelijke als temporele resolutie.
Single particle tracking microscopie die de lokalisatie van individuele deeltjes in levende cellen monitort met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers en een tijdsresolutie van milliseconden is goed ontwikkeld om de NPs of membraanmoleculendynamica8,9te bestuderen . Fluorescentie-gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn waardevolle instrumenten geworden voor het observeren van NPs/moleculen in de leefomgeving9,10,11,12. Bijvoorbeeld, totale interne reflectie fluorescentie microscopie, die dunne lagen (~ 100 nm) van het monster op de substraat / oplossingsinterface met een hoge spatiotemporale resolutie in beeldbrengen,is veel gebruikt in studies naar membraanmoleculendynamiek13,14. De inherente nadelen van enkele fluorforen, zoals lage intensiteit en snelle onomkeerbare fotobleaching, verminderen echter de nauwkeurigheid en duur van tracking13. Daarom hebben niet-fluorescerende plasmonische NPs, die de fluorescerende sondes vervangen, steeds meer aandacht getrokken in langetermijnbeeldvormingsstudies vanwege hun unieke optische kenmerken15. Op basis van de verstrooiingssignalen van plasmonische NP-sondes zijn verschillende soorten optische microscopische beeldvormingstechnologieën gebruikt om het mechanisme van biologische processen te bestuderen, zoals donkerveldmicroscopie (DFM)16,interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie17 en differentiële interferentiecontrastmicroscopie (DICM)18. Bovendien kan de bewegings - en rotatiedynamiek van AuNRs worden verkregen met behulp van DFM en DICM18,19,20,21,22. Meestal wordt in een SPT-experiment de beweging van het object geregistreerd door de optische microscoop en vervolgens geanalyseerd door SPT-analysemethoden3. De tijdgeopgeleerde trajecten en oriëntatiehoeken die door individuele NPs worden gegenereerd, zijn normaal stochastisch en heterogeen, dus het is noodzakelijk om overvloedige dynamische informatie te presenteren met verschillende analysemethoden.
Hier bieden we een geïntegreerd protocol dat de dynamiek van AuNR's op celmembraan bewaakt met behulp van DFM, de locatie en oriëntatie van AuNR's extraheert met ImageJ en MATLAB en de verspreiding van AuNR's karakteriseert met SPT-analysemethoden. Als demonstratie laten we hier zien hoe we het SPT-protocol kunnen gebruiken om de dynamiek van ongewijzigde AuNR's (CTAB-AuNRs, gesynthetiseerd door cetyltrimethylammonium ammoniumbromidemolecuul als beschermend middel) op U87 MG-celmembraan te visualiseren. Er is aangetoond dat CTAB-AuNRs eiwitten in biologische omgeving kunnen adsorberen, op celmembraan kunnen bewegen en vervolgens cellen2,20,22kunnen binnendringen . U87 MG-cel is de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel en de membraanreceptoren worden abnormaal uitgedrukt. De membraanreceptoren kunnen interageren met eiwitten op AuNR's, die de dynamiek van AuNR's beïnvloeden. Ons protocol is algemeen toepasbaar op andere SPT experimenten op het gebied van biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur
- Bereid het volledige medium voor U87 MG-cellen voor door foetaal runderserum toe te voegen (eindconcentratie 10%) en penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) tot het minimum essentiële medium (MEM). Gebruik plastic cel kweek schotel voor cellen subcultuur.
- Passagecellen 2 tot 3 keer per week.
- Verwijder het kweekmedium en spoel de cellaag af met dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) 2 ~3 keer bij samenvloeiing (80%~90%).
- Voeg 1,0 tot 2,0 ml Trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal en observeer cellen onder een omgekeerde microscoop totdat cellen rond worden (3 ~ 5 min).
- Voeg 3,0 ml voorbereid compleet medium toe en verspreid de cellen door voorzichtig te pipetten.
- Voeg celsuspensie (1 ml) toe aan een nieuwe kweekschaal met vers celmedium (3 ml) en resuspendeer de cellen.
- Houd de cellen op 37 °C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer.
2. Microscoop dia voorbereiding
OPMERKING: U87 MG-cellen van de derde tot tiende generatie met hoge activiteit worden gebruikt in NBP-experimenten.
- Steriliseer 22 mm × 22 mm coverslips die al zijn gereinigd met Piranha-oplossing door onder te dompelen in ethanol (99,9%).
- Gebruik een tang om de afdekslip uit de ethanoloplossing (stap 2.1) te halen en steriliseren door ethanol op de vlam te verbranden. Zodra alle ethanol is verbrand, plaatst u coverslips in een plastic celkweekschaal (35 x 10 mm) gevuld met 2 ml celmedium (geen fenolrood).
- Voeg 50 μL van de celsuspensie van stap 1.2.3 toe aan de deklip en duw de schaal voorzichtig heen en weer en links en rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats het in een vochtige atmosfeer.
- Wanneer U87 MG-cellen op de coverslip 20%-40% confluency (~12 h) bereiken, voeg dan 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) toe aan de schaal en verspreid. Incubeer gedurende 5 minuten in de vochtige atmosfeer.
- Voeg in stap 2.4 100 μL van het kweekmedium (geen fenolrood) van de schaal toe aan de groef van de gegroefde glazen glijbaan(figuur 1),die is voorgecleaned met Piranha-oplossing.
- Haal de coverslip uit de schaal en omgekeerd aan de bovenkant van de groef van de glazen dia van de microscoop (figuur 1). Sluit af met nagellak, laat het drogen en plaats het op het podium om SPT-experimenten uit te voeren.
3. Het uitvoeren van experimenten voor het volgen van enkelvoudige deeltjes met darkfieldmicroscopie (figuur 1).
- Plaats een druppel olie op de met olie ondergedompelde darkfieldcondensor (NA 1.43-1.20) en draai aan de knop om de condensor in contact te laten komen met de glazen schuif.
- Leg een druppel olie op de bovenkant van het afdekglas en draai aan de scherpstelknop om de 60x olie-onderdompelingsdoelstelling (NA 0,7–1,25) de olie te laten raken.
- Schakel de lichtbron in en draai lichtjes aan de scherpstelknop om het beeldvlak scherp te stellen.
OPMERKING: In het gezichtsveld is de achtergrond zwart, de cellen helder en de CTAB-AuNRs (beeldverhouding ~ 2:1, figuur 2)zijn kleine gekleurde (rode, gele of groene) verstrooiingsvlekken. - Leg voorbeeldverstrooiingslicht vast met een CMOS-kleurencamera. Klik op "Camerapictogram" in de software om TIFF-indeling op te nemen en te exporteren om afbeeldingen op te slaan.
4. Gegevensverwerving
- Eén langetermijntraject extraheren
- Werk zoals beschreven in figuur 3 om de donkere veldafbeeldingen uit de tijdreeks om te zetten van de modus "RGB-kleur" naar de modus "8 bits". Klik in afbeelding J op Afbeelding | Type | 8 bit. Als u het contrast wilt aanpassen, klikt u op Afbeelding | | aanpassen Helderheid | Contrast , contrast.
- Selecteer een doeldeeltje en snijd de achtergronden van de tijdreeks af door te boksen en de achtergrond te verwijderen met "Ctrl +X".
- Open het venster deeltjesdetectie en deeltjeskoppeling door op de "Plug-ins | Particle Tracker Klassieke | Deeltjestracker".
- Stel Radius in op 6, Cutoff op 0 en Percentiel op 0,01%.
OPMERKING: Om het deeltje te detecteren, past u boven drie parameters aan met behulp van Preview. Zorg ervoor dat de straal iets groter is dan het beoogde deeltje en kleiner is dan de kleinste interdeeltjesscheiding. Percentiel is de ondergrens van intensiteitsverdeling die kandidaatdeeltjes zijn. - Stel het koppelingsbereik in op 5 en Verplaatsing op 10.
OPMERKING: Als u het deeltje wilt koppelen aan opeenvolgende aangrenzende frames, past u de bovenstaande twee parameters aan. Verplaatsing is de maximale pixels die een deeltje kan verplaatsen tussen twee volgende frames, en Link Range is het aantal opeenvolgende frames waarmee rekening moet worden gehouden bij het bepalen van de beste overeenkomende overeenkomst. - Klik op "OK" om het venster ParticleTracker-resultaten te openen om de resultaten te zien.
- Klik op "Visualiseer alle trajecten" om de gegenereerde trajecten te inspecteren.
- Klik bovenaan op het menu "Deeltjes opnieuw koppelen" om de gedetecteerde deeltjes opnieuw te koppelen aan verschillende linkbereik- en percentielparameters, als het door software gegenereerde traject niet overeenkomt met het bewegende traject van de AuNR.
- Klikop" Volledig rapport opslaan " om resultaten op te slaan als het door software gegenereerde traject en het bewegende traject van de AuNR overeenkomen.
OPMERKING: Een voorbeeld van het extraheren van één langetermijntraject met afbeelding J wordt weergegeven in figuur 4.
- Multi-trajecten extraheren
OPMERKING: Een voorbeeld van het extraheren van meerdere trajecten met Fiji is weergegeven in figuur 5. Er zijn verschillende fasen en elke fase vormt een stap in het trackingproces. Het resultaat van elke stap wordt onmiddellijk weergegeven, waardoor de gebruiker terug kan gaan naar het aanpassen van instellingen wanneer de uitvoer onbevredigend is.- Werk zoals beschreven in figuur 3 om de donkere veldafbeeldingen uit de tijdreeks om te zetten van de modus "RGB-kleur" naar de modus "8 bits". Klik in het image J-pad op "Afbeelding | Type | 8 bit". Klik op " Afbeelding | om hun contrast aan te passen | aanpassen Helderheid | Contrast".
- Open het startpaneel door te klikken op "Plug-ins | | volgen TrackMate". Klik op "Volgende".
- Kies de "LoG detector" in het vervolgkeuzemenu en klik op "Volgende".
- Parameters van het configuratiepaneel van de detector aanpassen. Stel de geschatte BLOB-diameter in op 10, stel Drempel in op 0 en selecteer "Subpixellokalisatiedoen ".
- Klikop" Volgende " om het eerste steunfilterpaneel te openen.
OPMERKING: Verschillende parameters kunnen worden aangepast om de doelpunten verder te optimaliseren. In dit voorbeeld zijn geen andere parameters aangepast. - Klik op "Volgende" en selecteer "HyperStack displayer" in het vervolgkeuzemenu.
- Klikop" Volgende " om het filterpaneel Van de steun te openen. Stel de kwaliteit in boven 1,88, X boven 38,86, Y boven 56,54.
- Klik op "Volgende" en selecteer "Simple LAP tracker" in het vervolgkeuzemenu. Configureer de eenvoudige LAP-tracker door drie parameters aan te passen, dat wil zijn de Linking max distance = 15, Gap-closing max distance = 15 en Gap-closing max frame gap = 5.
OPMERKING: Linking-max afstand is de maximale verplaatsing van een punt tussen twee frames. Gap-closing max distance is de maximale verplaatsing van twee segmenten. Gap-closing max frame gap is het grootste frame tussen twee te overbruggen punten. - Klikop" Volgende " om bij te houden. Als u klaar bent, klikt u verder op "Volgende".
- Stel filters in op tracks, zoals het instellen van het aantal plekken in het spoor boven de 300.
- Blijf op "Volgende" klikken totdat het laatste opslagpaneel is geopend. Selecteer "Tracks exporteren naar XML-bestand" in het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op "Uitvoeren" om op te slaan in csv-indeling.
- R/G-waarden
OPMERKING: Verstrooiingsintensiteiten van gerichte AuNR's in de R- en G-kanalen worden verkregen uit kleuren darkfield-afbeeldingen met behulp van een code die is geschreven in MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), en het extractieprincipe wordt weergegeven in figuur 6.- Gebruik de functie van xycördinatie.m om de middelste pixelcoördinaat van de AuNR in elk frame te vinden volgens de x-y-coördinaat (geëxtraheerd door ImageJ/Fiji).
- Gebruik de functie van RGextractie.m om een matrix van 3 x 3 pixels af te bakeden, de 9 scattering-intensiteitswaarden van R- of G-kanalen te extraheren en een gemiddelde waarde (μ, gedefinieerd als R of G) te berekenen.
OPMERKING: De matrix van 3 x 3 pixels is gecentreerd op de pixelcoördinaten die zijn verkregen uit stap 4.3.1.
- Polaire hoek
OPMERKING: De polaire hoek is de hoek tussen de lengtegraad van de AuNR en de optische as (zoals weergegeven in figuur 1),die de ruimtelijke (Z-as) rotatiedynamiek van de AuNR kan weerspiegelen.- Gebruik de functie van polarangle.m om de polaire hoeken (θ) te berekenen met de dual-channel differentiële methode22,
.
- Gebruik de functie van polarangle.m om de polaire hoeken (θ) te berekenen met de dual-channel differentiële methode22,
.5. Data-analyse
OPMERKING: Een systematisch en robuust kader voor gegevensanalyse is essentieel voor de prestaties en efficiëntie van SPT-analysemethoden. De aangepaste software geschreven in MATLAB wordt gebruikt (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). Voor het tekenen van de percelen wordt een grafiek- en analysesoftware (zie Tabel met materialen)gebruikt.
- Analyseparameters
- Gebruik scripts van csv_data_extract_dis_vel_ss.m en csv_data_MSD.m om dynamische parameters te berekenen volgens formules in tabel 1.
OPMERKING: Deze parameters worden gebruikt om de dynamiek van AuNR's te analyseren en bestaan uit drie delen. (1) Trajectgerelateerde parameters: verplaatsing, stapgrootte, snelheid, gyratiestraal (Rg)en draaihoek (Ta); (2) MSD-parameters: diffusiecoëfficiënt (Dt) en abnormale diffusie-exponent (α); en (3) Rotatiegerelateerde parameters: polaire hoek en rotatie-lability (σ).
- Gebruik scripts van csv_data_extract_dis_vel_ss.m en csv_data_MSD.m om dynamische parameters te berekenen volgens formules in tabel 1.
| Maatregelen | Definitie | Fysieke betekenis | |
| Verplaatsing |  |
Wijzigingen in de positie van objecten | |
| Stapgrootte |  |
Afstand tussen twee aangrenzende punten | |
| Snelheid |  |
Snelheid van objecten beweging | |
| Rg |  |
Bereik van objecten verplaatsen in een specifiek tijdsinterval | |
| Ta |  |
Bewegingsrichting van objecten tussen twee aangrenzende punten | |
| Msd |  |
Gemiddelde bewegende afstand van objecten in een bepaald tijdsinterval | |
| Dt |  |
Diffusievermogen van objecten | |
| Α | |
Normale diffusie (α~1) | |
| Polaire hoek |  |
3D-oriëntatie-informatie van objecten | |
| Σ |  |
Mate van dispersie van de polaire hoekgegevensset | |
Tabel 1: Drie soorten parameters die voor analyse worden gebruikt. Deze omvatten trajectgerelateerde parameters (verplaatsing, stapgrootte, snelheid, Rg en Ta),MSD-parameters (MSD, Dt en α) en rotatiegerelateerde parameters (polaire hoek en rotatie-lability).
- Visuele analyse van traject
OPMERKING: Trajectvisualisatie kan intuïtief de spatiotemporale heterogeniteit van deeltjesbeweging en de trajectverdeling (coördinaten) van dynamische parameters presenteren, zoals tijdmappingstraject, Rg- en Dt-mapping traject, en polaire hoek mapping traject. Kaarttrajecten werden getekend met behulp van de grafiek- en analysesoftware.- Stel x coördinaat in als X, y coördinaat als Y en tijd (Rg,Dt, polaire hoek) als Z.
- Klik op "Plot | Plotverstrooiing | Kleurtoewijzingsplot".
- Voeg de kleurbalk toe.
- MSD-analyse
OPMERKING: Bewegingsactiviteit en bewegingsmodus van de deeltjes kunnen worden verkregen door MSD-analyse23. Hoe groter de Dt,hoe actiever de diffusiebeweging van de deeltjes. wanneer α ~ 1, deeltjes doen normale diffusiebeweging, anders voeren ze abnormale diffusiebeweging uit.- MSD-τ cijfers
- Stel tijdsinterval (τ) in als X, MSD-gegevens als Y.
- Klik op "Plot | Spreidingsplot"
- Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Niet-lineaire curve fitting (Functie: Allometricl)".
- MSD-τ dubbel-logaritmisch cijfer
OPMERKING: MSD-τ dubbele logaritmische figuur, waarvan de helling is α en onderscheppen is Dt,kan intuïtief deeltjesbeweging presenteren.- Stel logaritmisch tijdsinterval in als X en logaritmische MSD als Y.
- Klik op "Plot | Verstrooi plot".
- Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Lineaire curve fitting".
- D-τ-cijfer (MSD/4t)
OPMERKING: D=MSD/4τ, is een functie van tijd τ en anomaliefactor α, en de D-τ-figuur toont direct de verandering van diffusiecoëfficiënt met de tijd. Wanneer D met de tijd toeneemt, is α groter dan 1 en doen deeltjes superdiffusiebeweging.- Stel logaritmisch tijdsinterval (τ) in als X en logaritmisch D als Y.
- Klik op "Plot | Verstrooi plot".
- Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Niet-lineaire curvefitting (Functie: "Allometricl")".
OPMERKING: Hoe korter de trajecten, hoe hoger de onnauwkeurigheid van de diffusieschattingen. Over het algemeen werden Dt en α door middel van MSD-τ-analyse van de lange intervaltijd (> 30 t) verkregen. Een eenvoudige en ruwe montage zal echter de bewegingsdetails gladstrijken. Daarom moet msd-τ-analyse van korte intervaltijd (< 10 τ) worden uitgevoerd om het bewegingsgedrag van deeltjes in korte tijd te analyseren.
- MSD-τ cijfers
- Statistische analyse
- Statistische analyse van meerdere deeltjes
OPMERKING: Statistische analyse van meerdere deeltjes kan de bewegingstoestand van deeltjes in een ruimtelijk gebied weerspiegelen, wat indirect wijst op de ruimtelijke heterogeniteitsomgeving. Als het histogram van Dt bijvoorbeeld een grootschalige verdeling of multipiekenverdeling vertoont, betekent dit dat de bewegingsactiviteiten van deeltjes heterogeen zijn.- Stel dynamische parameters (zoals Dt,Rg,max displacement) in als Y.
- Klik op "Plot | Histogram".
- Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
- Statistische analyse met één deeltje
OPMERKING: De statistische analyse van enkele deeltjes kan het bewegingsgedrag van individuele deeltjes laten zien, wat ook indirect de spatiotemporale heterogeniteit van de omgeving weerspiegelt.- Meerdere frames
- Bereken dynamische parameters (zoals Ta,stapgrootte, polaire hoek) van alle frames van één lange baan en kopieer naar de Origin-tabel en stel in als Y.
- Klik op "Plot | Histogram".
- Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
OPMERKING: Als zowel Ta als stapgrootte een kleine waardeverdeling vertonen, doen de deeltjes een superdiffusiebeweging in kleine stappen.
- Vensters verplaatsen
- Bereken dynamische parameters (zoals Rg,Dt) van alle frames met één lange baan via de methode bewegende vensters (11 frames) en kopieer naar de origin-tabel en stel in als Y.
- Klik op "Plot | Histogram".
- Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
- Meerdere frames
- Statistische analyse van meerdere deeltjes
- Tijdreeksanalyse
OPMERKING: Statistische analyse kan de bewegingsstatus van NPs onthullen en tijdreeksanalyse kan het bewegingsgedrag als een aanvulling presenteren. Door verschillende tijdreeksparameters te combineren, kan het het bewegingsgedrag van NPs op temporeel en ruimtelijk niveau discrimineren.- Stel de tijd in als X, tijdreeksparameters als Y (zoals verplaatsing, polaire hoek en Rg).
- Klik op "Plot | Diagram met meerdere deelvensters | Gestapelde plot | Lijn + Symbool".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het protocol werden de ongewijzigde 40 x 85 nm CTAB-AuNRs gebruikt. Zoals weergegeven in figuur 2B, is het longitudinale plasmonische maximum op ~650 nm (rood gebied) en transversale resonantie op 520 nm (groen gebied). Eerdere literatuur heeft aangetoond dat de optische eigenschappen (zoals LSPR-intensiteit) van plasmonische AuNRs aanzienlijk zullen veranderen met hun diameter20,22. In figuur 2Ctoonde de strooiintensiteit van CTAB-AuNRs op U87-celmembraan een typische Gaussiaanse verdeling met smalle breedte en was consistent met die van CTAB-AuNRs op glas, wat aangeeft dat CTAB-AuNRs die in dit experiment werden bijgehouden, goed gemonodispergeerd waren.
De dynamiek van CTAB-AuNRs op membraan werd gecontroleerd door DFM (12 fps). Zoals weergegeven in figuur 7zijn meer dan 500 trajecten (de baanlengte overschrijdt 300 frames) verkregen. Daarnaast kunnen ongeveer 40 trajecten per cel worden gegenereerd. De Rg van alle 500 trajecten vertoonde een kleine waardeverdeling, de gemiddelde Rg was 0,5 μm (SD=0,6 μm), en de maximale verplaatsing was ook meer verdeeld bij kleine waarden (figuur 8). Alle 500 trajecten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen: diffusie over lange afstand (Rg>0,5 μm, zwarte trajecten) en beperkte diffusie (Rg<0,5 μm, rode trajecten).
Afhankelijk van positie en oriëntatie van CTAB-AuNRs worden verschillende parameters berekend voor data-analyse. Er zijn veel mays om parameters te analyseren en te presenteren tijdens SPT-analyse. Uit de gemiddelde MSD-analyse in figuur 9A blijkt dat CTAB-AuNR's normaal gesproken diffuus zijn met α~1. De dichtheidsverdeling van Dt-α, verkregen uit alle trajecten, toont echter aan dat de dynamiek van AuNR's een heterogene verdeling vertoonde met superdifusiebeweging, Browniaanse beweging en subdiffusiebeweging (figuur 9B).
Naast statistische analyse van meerdere deeltjes werd ook statistische analyse met één deeltje (multiframes) uitgevoerd. Figuur 10 toont twee representatieve langetermijntrajecten: beperkt (Rg=0,34 μm) en bewegend (Rg=1,48 μm). De polar-mapping baan toonde aan dat zowel het bewegingsbereik als de polaire hoek van beperkte AuNR's kleiner waren dan die van bewegende AuNR's, wat betekent dat sterker de interactie tussen AuNR's en membraan, hoe meer dienen de opsluiting van zijn translationele en rotatiedynamiek. Dienovereenkomstig vertoonden de histogrammen van Ta en polaire hoek van de twee AuNR's verschillende modi.
Om het bewegingsgedrag van AuNR's verder te bestuderen, werden de tijdreeksparameters geanalyseerd, waaronder baan, verplaatsing, polaire hoek en Rg. Zoals blijkt uit figuur 11,werden in de loop van de tijd verschillende patronen gepresenteerd. In vergelijking met de langeafstandsdiffusie AuNR was de rotatie van de beperkte AuNR relatief beperkt en waren de polaire hoeken geconcentreerder, verdeeld over het bereik van 10 ° ~ 40 °. Hoewel de totale Rg van de bewegende AuNR groter was dan de totale Rg van beperkte AuNR, was de tijdreeks Rg van bewegende AuNR kleiner. Door de tijdreeksverdeling van trajectpunten en verplaatsing te combineren, kan worden afgeleid dat beperkte AuNR in een beperkt gebied beweegt, maar het bewegingsbereik in korte tijd is groter dan dat van de bewegende AuNR die op het membraan is beperkt. Over het algemeen wordt de spatiotemporale heterogene verdeling van translationele en rotatiedynamiek veroorzaakt door de ruimtelijke en temporele complexiteit van membraanorganisatie en -structuur.
Figuur 1: Schematisch diagram van het optische pad van darkfieldmicroscopie, microscoopdiavoorbereiding en de dual-channel verschilmethode voor het berekenen van polaire hoek (θ) van AuNRs. Schaalbalk in afbeelding is 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van CTAB-AuNRs. (A) TEM-afbeeldingen van CTAB@AuNRs. (B) LSPR-spectrums van CTAB@AuNRs. (C) Verdeling van de intensiteit van één deeltje: CTAB@AuNRs op glas (linkerpaneel), CTAB@AuNRs op plasmonmembraan (rechterpaneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbehandeling van darkfieldbeelden. Kleurenafbeeldingen uit de tijdreeks werden geconverteerd naar de modus "8 bits" en hun contrast werd aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Extractie van enkelvoudig langetermijntraject met ImageJ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Extractie van multi-trajecten met Fiji. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Extractie van R/G-waarden van AuNR's met MATLAB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Alle 527 trajecten van CTAB@AuNRs op U87 MG celmembraan gevolgd met Fiji. Er waren twee groepen: rode banen (Rg<0,5 μm) en zwarte trajecten (Rg>0,5 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Statistische analyse van multideeltjes van alle 527 trajecten. Verdeling van Rg (A) en maximale verplaatsing (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: MSD-analyse van alle 527 trajecten. (A) Plot van ensemble-time gemiddelde MSD versus τ. (B) Density plot in de α – log (Dt) vlak. De kleurcode vertegenwoordigt de lokale dichtheid van trajecten tussen 0 (blauw) en 1 (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Statistische analyse met één deeltje. (A-B) Twee representatieve lange termijn polar-mapping trajecten die werden gevolgd met ImageJ. De kleurcode vertegenwoordigt de polaire hoekwaarde tussen 0 (groen) en 90 (rood). Verdeling van draaihoek (C-D) en polaire hoek (E-F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Tijdreeksanalyse. (A,C) Time-mapping trajecten. De kleur van rood naar blauw vertegenwoordigt de richting van de tijd. (B,D) Tijdreeks van parameters: verplaatsing (blauw), polaire hoek (groen) en straal van gyratie (Rg, rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de dynamiek van AuNR's op celmembraan te bestuderen. Het protocol bestaat uit vier delen, waaronder microscopische beeldvorming, gegevensextractie, dynamische parametersberekening en data-analysemethoden, en elk onderdeel is flexibel en universeel. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassingen, bijvoorbeeld het bestuderen van de beweging van NP-gekoppelde membraanmoleculen op membraan, endocytosedynamiek van NP-gelabelde receptoren, dynamische analyse van intracellulaire NPs en vesicle-gecoate NPs-transport langs microtubuli, enzovoort.
De basisstap is om DFM te gebruiken om de beweging van AuNR's op het celmembraan in beeld te brengen. Momenteel zijn veel beeldvormingstechnologieën ontwikkeld voor de analyse van celmembraandynamiek, waarvan fluorescentiemicroscopie veel is gebruikt24. De fotobleaching-eigenschappen van fluorescerende sondes leiden echter tot het onvermogen om deeltjesdynamiek gedurende lange tijd te volgen. Hier werden lichtstabiele plasmonische AuNRs gebruikt. Er zijn verschillende beeldvormingstechnieken ontwikkeld op basis van de verstrooiingskenmerken van plasmonische NPs15. Met name DFM met schuine verlichtingsmodus verzamelt alleen verspreid licht van de monsters, waardoor het een hoge signaal-ruisverhouding heeft.
Zowel de translationele als de rotatiedynamiek van AuNR's worden verkregen en geanalyseerd. De meeste studies richten zich op het onderzoeken van de positionele fluctuaties van de NPs op het membraan en het negeren van de effecten van oriëntatieveranderingen25. Bovendien zijn het celmembraanvlak en het beeldvlak (x-y-vlak) in de meeste gevallen grotendeels hetzelfde en is het verschil in de interactie tussen de AuNR en het celmembraan opmerkelijker in de z-richting. Daarom is zelfs zonder azimuthoeken de polaire hoek waardevol voor de analyse van de interactie tussen de AuNR's en het celmembraan. Op basis van DFM en unieke optische eigenschappen van AuNR's wordt dual-channel polarisatie DFM gebruikt om de oriëntatie-informatie van AuNR's te verkrijgen (I1 + I2 
zonde2θ)19,26. Niettemin wordt de berekeningsnauwkeurigheid van polaire hoeken beïnvloed door de maximale en minimale detectie-intensiteiten die sterk worden beïnvloed door de omgeving. Daarom moeten er enkele wijzigingen worden aangebracht. Hier werd (R-G) gebruikt om de polaire hoek te berekenen, en de G-waarde die als interne referentie diende, kon de systematische fouten efficiënt verminderen en de meetnauwkeurigheid verhogen.
De kritieke stappen zijn gegevensextractie en dynamische parameterberekening, wat essentieel is voor het analyseren van de dynamiek van NP op het membraan. De trajecten van AuNRs op membraan worden geëxtraheerd met hoge ruimtelijke resolutie27,28 uit sequentieanalyse met behulp van ImageJ/Fiji. De R\G-waarden en polaire hoeken worden berekend met MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020). Verschillende parameters worden op dezelfde manier berekend met behulp van MATLAB op basis van posities en polaire hoeken (tabel 1). In SPT-analyse zijn er veel manieren om parametersanalyse en weergave uit te voeren. Daarom is het noodzakelijk om zoveel mogelijk analysemethoden en visualisatietools te gebruiken om de dynamiek van NP te analyseren en vervolgens een nieuw standpunt uit veel analyseresultaten samen te vatten en te extraheren. Normaal gesproken zijn er altijd wat afwegingen te maken, wat geen gemakkelijk werk is.
Het dynamische status- en bewegingsgedrag van NPs kan systematisch van boven naar beneden worden geanalyseerd en gepresenteerd met behulp van uitgebreide analysemethoden en multivariate presentatiemethoden. Met behulp van statistische analyse van meerdere deeltjes kunnen we de ensemblebewegingstoestand van NPs over het hele celmembraanvlak verkrijgen. De dynamische studies naar individuele NPs/moleculen op basis van fluorescentiebeeldvorming29 maken meestal gebruik van deze algemene statistische methode omdat slechts een groot aantal kortdurende trajecten kan worden gevolgd. De ensemblemiddelingsmethode zal echter individuele details gladstrijken en negeren. Als aanvulling wordt de statistische analyse met één deeltje gebruikt om kwantitatief de dynamische toestand van individuele NPs te presenteren. Ondertussen is het belangrijk om tijdreeksparameteranalyses uit te voeren van individuele of segmenttrajecten, die bewegingsgedrag van NPs kunnen bieden als functie van de tijd.
Samenvattend stellen we een geïntegreerd protocol voor voor het bestuderen van de diffusiedynamiek van AuNR's op levend celmembraan met SPT-methode. De dynamiek van AuNRs werd gemonitord met DFM met één nanodeeltje, geëxtraheerd met Behulp van ImageJ en MATLAB, en gekenmerkt door uitgebreide analytische methoden. AuNRs deden abnormale diffusiebeweging op U87 MG celmembraan, en de beweging toont spatiotemporale heterogeniteit. Dit protocol kan mogelijk worden gebruikt voor de studies van andere soorten complexe biologische systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China met subsidienummers van 21425519, 91853105 en 21621003.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J.
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
