Summary
यह प्रोटोकॉल फाइब्रोटिक स्ट्रोमल डिब्बे के साथ एक 3डी बायोमिमेटिक मॉडल प्रस्तुत करता है। स्ट्रोमल एक्सपेरिलिएलर मैट्रिक्स, सेलुलर इंटरैक्शन, ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस के एक सक्रिय मध्यस्थ के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने वाले अनुपात में शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल के साथ तैयार किया गया।
Abstract
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) क्रोनिक लिवर डिजीज के चलते एक प्राइमरी लिवर ट्यूमर विकसित होता है। क्रोनिक लिवर रोग और सूजन एक फाइब्रोटिक वातावरण की ओर जाता है जो सक्रिय रूप से हेजटोकेसिनोजेनेसिस का समर्थन और ड्राइविंग करता है। ट्यूमर स्ट्रोमा सूक्ष्म पर्यावरण और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया के संदर्भ में हेपेटोकारसिनोजेनेसिस में अंतर्दृष्टि इस प्रकार काफी महत्व की है। त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल वर्तमान इन विट्रो 2डी सेल कल्चर मॉडल और वीवो पशु मॉडलों के बीच लापता लिंक के रूप में प्रस्तावित हैं। हमारा उद्देश्य फाइब्रोटिक स्ट्रोमल कंपार्टमेंट और वैक्यूलेचर के साथ एक उपन्यास 3डी बायोमिमेटिक एचसीसी मॉडल डिजाइन करना था। ट्यूमर ईसीएम के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने के लिए कोलेजन और फाइब्रिनोजेन जैसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल को शामिल किया गया था। इस मॉडल में एक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में एम्बेडेड LX2 और HepG2 कोशिकाओं को उल्टे ट्रांसमेम्ब्रान डालने पर वरीयता प्राप्त किया गया था। HUVEC कोशिकाओं को तब झिल्ली के विपरीत दिशा में वरीयता दी गई थी। कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड ईसीएम-हाइड्रोगेल से मिलकर तीन फॉर्मूलेशन तैयार किए गए थे और बायो-फिजिकल गुणों का निर्धारण रीलॉजी द्वारा किया गया था। सेल व्यवहार्यता 21 दिनों में एक सेल व्यवहार्यता परख द्वारा निर्धारित किया गया था । कीमोथैरेप्टिक दवा डॉक्सोरुबिसिन के प्रभाव का मूल्यांकन 2डी सह-संस्कृति और हमारे 3 डी मॉडल दोनों में 72h की अवधि के लिए किया गया था। रियोलॉजी के परिणाम बताते हैं कि फाइब्रोटिक, सिरोटिक और एचसीसी लिवर के जैव-भौतिक गुणों की सफलतापूर्वक नकल की जा सकती है। कुल मिलाकर, परिणाम इंगित करते हैं कि यह 3D मॉडल पारंपरिक 2D संस्कृतियों की तुलना में वीवो स्थिति में अधिक प्रतिनिधि है। हमारे 3 डी ट्यूमर मॉडल कीमोथेरेपी के लिए एक कम प्रतिक्रिया दिखाया, दवा प्रतिरोध आम तौर पर एचसीसी रोगियों में देखा नकल उतार ।
Introduction
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) में सभी प्राथमिक यकृत कैंसर का 90% शामिल है1,2। सालाना 810,000 मौतों और 854,000 नए मामलों की रिपोर्ट के साथ यह वर्तमान में दुनिया भर में पांचवें सबसे आम कैंसर के रूप में स्थान पर है, जिसमें मृत्यु दर1की सबसे अधिक घटनाओं में से एक है। एचसीसी के विकास के लिए मुख्य रूप से पुरानी जिगर की बीमारियों से जुड़ी सूजन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जैसे वायरल हेपेटाइटिस, क्रोनिक अत्यधिक अल्कोहल का सेवन, मेटाबोलिक सिंड्रोम, मोटापा और मधुमेह1,3,4। इन रोगों से जुड़ी सूजन के परिणामस्वरूप हेपेटोसिटे चोट और विभिन्न साइटोकिन्स का स्राव होता है जो फाइब्रोसिस5शुरू करने के लिए हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं और भड़काऊ कोशिकाओं को सक्रिय और भर्ती करते हैं। हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं को हेपेटिक फाइब्रोसिस की दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है। सक्रियण पर वे मिओफिबोब्रोब्लास्ट जैसे संकुचन, समर्थक भड़काऊ और प्रो-फिब्रिनोजेनिक गुणों के साथ कोशिकाओं की तरह अंतर करते हैं6,7,8। परिणामस्वरूप फाइब्रोसिस के परिणामस्वरूप एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स रिमॉडलिंग एंजाइम गतिविधि के डिस्रेलेशन का कारण बनता है, जिससे विकास कारकों के स्राव के साथ समग्र वृद्धि की कठोरता की विशेषता वाला वातावरण बनता है, जो एचसीसी रोगजनन9,10में आगे योगदान देता है। यह हेपेटोसाइट्स और स्ट्रोमल वातावरण के बीच यह निरंतर रोगजनक प्रतिक्रिया लूप है, जो कैंसर दीक्षा को ईंधन देता है, मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी), एंजियोजेनेसिस, मेटास्टैटिक क्षमता और परिवर्तित दवा प्रतिक्रिया11,12,13के लिए एपिथेलियल। ट्यूमर और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण के बीच परस्पर क्रिया के संदर्भ में हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस में अंतर्दृष्टि, इसलिए, न केवल एक मशीनी से बल्कि उपचार के नजरिए से भी काफी महत्व की है।
दो आयामी (2डी) इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल मुख्य रूप से कैंसर सेल जीवविज्ञानियों के 80% द्वारा उपयोग किए जाते हैं14। हालांकि, ये मॉडल सच्चे ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण के प्रतिनिधि नहीं हैं, जो कीमोथैरेपी प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है14,15,16। वर्तमान में 96% कीमोथैरेप्टिक दवाएं नैदानिक परीक्षणों के दौरान विफल हो जाती हैं14. दवा उदासीनता दरों में इस उच्च घटना को इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि इन विट्रो प्री-स्क्रीनिंग मॉडल पूरी तरह से एचसीसी जटिलता और माइक्रोएनवायरमेंट16की हमारी वर्तमान अंतर्दृष्टि और समझ का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसके विपरीत वीवो पशु मॉडल में16,17मनुष्यों की तुलना में ट्यूमर और माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत में समझौता प्रतिरक्षा प्रणाली और विसंगतियों के साथ मौजूद हैं । पशु अध्ययन से प्राप्त औसतन केवल 8% परिणामों का पूर्व-नैदानिक से नैदानिक सेटिंग16,17तक मज़बूती से अनुवाद किया जा सकता है। इसलिए, यह स्पष्ट है कि एचसीसी के मूल्यांकन के लिए एक इन विट्रो मंच के विकास की आवश्यकता होती है जो न केवल ट्यूमर बल्कि माइक्रोएनवायरमेंट की जटिलता को प्रभावी ढंग से पुनः कृत करता है। यह प्लेटफॉर्म वर्तमान में विट्रो प्री-क्लीनिकल स्क्रीनिंग मॉडल में उपलब्ध पूरक होंगे और भविष्य में7,14में पशु अध्ययन की मात्रा को कम करेंगे।
ऐसा ही एक मंच उन्नत त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल है। एचसीसी का अध्ययन करने के लिए इन उन्नत 3 डी मॉडलों की एक भीड़ पिछले दशक में उभरी है और विभिन्न समीक्षाएं प्रकाशित की गई हैं। एचसीसी का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध 3 डी मॉडल में बहुकोशिकीय स्फेरॉइड, ऑर्गेनॉइड, पाड़ आधारित मॉडल, हाइड्रोगेल, माइक्रोफ्लुइडिक्स और बायो-प्रिंटिंग शामिल हैं। इनमें से, बहुकोशिकीय स्फेरॉइड ट्यूमर विकास के अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सबसे प्रसिद्ध मॉडलों में से एक हैं। स्पेरोइड एक सस्ता मॉडल है जिसमें तकनीकी कठिनाई कम होती है , जबकि साथ ही वीवो ट्यूमर आर्किटेक्चर 18,19,20में प्रभावीरूपसे नकल करते हैं । बहुकोशिकीय स्फेरॉइड ने एचसीसी17 , 21,22के बारे में जानकारी के धन में योगदान दियाहै। हालांकि, मानकीकृत संस्कृति समय की कमी है क्योंकि बहुकोशिकीय स्फेरॉइड को 7 से 48 दिनों के बीच संस्कृति में रखा जाता है। संस्कृति के समय में वृद्धि का काफी महत्व है । Eilenberger ने पाया कि स्फेरॉइड उम्र में अंतर सोराफेनिब (जिगर के कैंसर के इलाज के लिए उपयोग किया जाने वाला एक किनेज़ अवरोधक) को गहराई से प्रभावित करताहै। जबकि Wrzesinski और Fey ने पाया कि 3 डी हेपेटोसाइट स्पेरोइड्स को ट्राइपिनाइजेशन के बाद प्रमुख शारीरिक यकृत कार्यों को फिर से स्थापित करने के लिए 18 दिनों की आवश्यकता होती है और इस वसूली24, 25के बाद 24 दिनों तक स्थिर कार्यक्षमता का प्रदर्शन करना जारी रखता है।
कुछ अधिक उन्नत 3 डी एचसीसी मॉडल में मानव डिसेलुलराइज्ड लिवर मचान और बायो-मुद्रित मचान का उपयोग शामिल है। मज़्ज़ा और उनके सहयोगियों ने एचसीसी मॉडलिंग के लिए एक प्राकृतिक 3डी पाड़ बनाया, जिसमें डिसेलुलरीकृत मानव यकृत का उपयोग करके प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं है26. इन प्राकृतिक मचानों को सफलतापूर्वक 21 दिनों के लिए हेपेटिक स्टेलेट और हेपेटोब्लास्टोमा कोशिकाओं की सह-संस्कृति के साथ फिर से आबाद किया जा सकता है, जबकि कोलेजन टाइप I, III, IV और फाइब्रोनेक्टिन जैसे प्रमुख बाह्य मैट्रिक्स घटकों की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हैं। रोग मॉडलिंग के अलावा, यह मॉडल कार्यात्मक अंग प्रत्यारोपण और पूर्व-नैदानिक दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग26का लाभ भी प्रदान करता है। 3डी बायो-प्रिंटिंग में प्रगति के साथ, 3डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मचान अब बायो-प्रिंटेड भी हो सकते हैं। एमए और सहयोगियों, जैव मुद्रित एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मचान वेरिएबल मैकेनिकल गुणों और बायोमिमेटिक माइक्रोआर्किटचर के साथ डिसेलुलराइज्ड एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स27से हाइड्रोगेल्स इंजीनियर का उपयोग कर रहे हैं । निस्संदेह ये सभी उत्कृष्ट 3 डी एचसीसी मॉडल हैं। हालांकि, मानव यकृत की अनुपलब्धता और आवश्यक उपकरण और सामग्री प्राप्त करने में शामिल लागत इन मॉडलों को नुकसान में रखती है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों सभी तकनीकी रूप से व्यापक प्रशिक्षण है कि सभी शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता उन्नत कर रहे हैं ।
एचसीसी की जटिलता और वर्तमान में उपलब्ध 3डी मॉडल के आधार पर, हमने एक सर्वव्यापी 3डी एचसीसी मॉडल विकसित करने का प्रयास किया। हम समायोज्य हाइड्रोगेल कठोरता मूल्यों को शामिल करके दोनों प्रीमैचेंडेंट और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से पूंजीपूंज करने में सक्षम मॉडल के लिए लक्षित हैं। इसके अलावा, हमने हेपेटोसेलुलर और स्ट्रोमा से जुड़ी सेल लाइनें भी शामिल कीं, जो एचसीसी के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इनमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं और घातक हेपेटोसाइट्स शामिल हैं, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल्स से बने माइक्रोएनवायरमेंट में उगाए जाते हैं। चुने हुए हाइड्रोगेल, कोलेजन प्रकार I और फाइब्रिनोजेन के साथ, एचसीसी की दीक्षा और प्रगति के दौरान जिगर की कठोरता में देखे गए जैव-शारीरिक परिवर्तनों के तुलनीय अनुपात में शामिल किया गया। इसके अतिरिक्त, हम एक मॉडल है कि संस्कृति में एक लंबे समय तक अवधि के लिए रखा जा सकता है के लिए उद्देश्य । हमने एक मॉड्यूलर, लागत प्रभावी मॉडल की कल्पना की जिसे बुनियादी उपकरणों, न्यूनतम प्रशिक्षण और अनुभव और आसानी से उपलब्ध सामग्रियों के साथ सेटअप किया जा सकता है।
Protocol
चित्रा 1: 3 डी बायोमिमेटिक एचसीसी मॉडल के निर्माण का ग्राफिकल चित्रण कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल का समग्र कार्यप्रवाह चित्र 1 के चित्रों में निर्धारित किया गया है
1. फिब्रिनोजेन स्टॉक समाधान की तैयारी
- 2.21 ग्राम सीएसीएल2का वजन करके और इसे 20 एमएल डिस्टिल्ड पानी (डीएच2 ओ) में जोड़कर 1 एम कैल्शियम क्लोराइड (सीएसीएल2)स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। स्टॉक समाधान कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 5 मिलीग्राम एप्रोटिनिन का वजन करके 20 एमएल एप्रोटिनिन स्टॉक सॉल्यूशन (1218.75 केयू/एमएल) तैयार करें और इसे 20 एमएल डीएच2ओ अलीकोट स्टॉक सॉल्यूशन में 1 एमएल एलिकोट में जोड़कर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 80 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन स्टॉक सॉल्यूशन का 10 एमएल तैयार करें।
- एक 50 एमएल ट्यूब में जोड़ें 7.849 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), 2.051 एमएल एप्रोटिनिन स्टॉक (1218.75 KIU /एमएल) 10 एमएम की अंतिम सीएसीएल 2 एकाग्रता के लिए २५० KIU/mL और १०० μL CaCl2 (1M) की अंतिम एप्रोटिनिन एकाग्रता के लिए ।
- 800 मिलीग्राम फाइब्रिनोजेन का वजन करें।
- स्टॉक समाधान के लिए 200 मिलीग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) का वजन 2% डब्ल्यू/वी एनएसीएल को शामिल करने के लिए।
- पीबीएस, एप्रोटिनिन और सीएसीएल2युक्त 50 एमएल ट्यूब में वेतन वृद्धि में फाइब्रिनोजेन और एनएसीएल जोड़ें। इसमें फाइब्रिनोजेन जेलिंग और समाधान में गांठ ें पैदा होंगी, इसलिए जोर-शोर से हिलाएं या हिलाएं।
- फाइब्रिनोजेन स्टॉक सॉल्यूशन की 50 एमएल ट्यूब को एक शेकर पर क्षैतिज रूप से रखें और 300 आरपीएम की कम सेटिंग पर हिलाएं।
- एक बार समाधान भंग हो जाने के बाद, वॉल्यूम के आधार पर 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर या बोतल टॉप फ़िल्टर का उपयोग करके इसे फ़िल्टर करें। महत्वपूर्ण बात यह है कि फाइब्रिनोजेन समाधान को ऑटोक्लेव न करें क्योंकि इससे फाइब्रिनोजन नष्ट हो जाएगा।
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा स्टॉक समाधान की मात्रा के आधार पर 2 से 5 घंटे के बीच ले जा सकता है, इस बार प्रायोगिक सेटअप के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए।
2. आवेषण पर हाइड्रोगेल बोने से पहले कोलेजन के साथ कोटिंग आवेषण
- एक लैमिनार प्रवाह हुड या ऊतक संस्कृति हुड में, निष्फल चिमटी का उपयोग करके, प्लेट से आवेषण हटा दें और प्लेट के ढक्कन पर उल्टे रखें।
- 20 मिलियन हिमनदों एसिटिक एसिड स्टॉक समाधान के 100 एमएल को तैयार करें, जिसमें 25 एमएल में हिमनदों का एसिटिक एसिड 25 एमएल में मिलाकर और 100 मिलीएल की अंतिम मात्रा में डीएच2ओ के साथ समायोजित करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर सिरिंज का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें। स्टॉक समाधान आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 2.2 में तैयार 20 मिलीग्राम हिमाश एसिटिक एसिड स्टॉक समाधान के 1.960 एमएल में 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन समाधान के 40 माइक्रोन जोड़कर 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन समाधान से 100 μg/एमएल कोलेजन समाधान के 2 एमएल तैयार करें।
- प्रत्येक सम्मिलन पर समाधान के 100 माइक्रोन μL द्वारा 2.3 में तैयार 100 μg/एमएल कोलेजन समाधान के साथ आवेषण कोट करें। 2 से 3 घंटे के लिए लेमिनार फ्लो हुड या ऊतक संस्कृति हुड के भीतर हवा सूखी डालें।
- एक बार आवेषण सूखे धोने प्रत्येक PBS के साथ 3x डालें। 12 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें, कोलेजन कोटिंग के साथ आवेषण को कुओं में नीचे का सामना करना पड़ रहा है, अच्छी तरह से PBS को हटा दें और प्रक्रिया को दोहराएं। लैमिनार प्रवाह हुड 1 से 2 घंटे के भीतर हवा को सूखा होने दें।
सावधानी: एसीटिक एसिड कोशिकाओं के लिए विषाक्त है और आवेषण पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। - आवेषण पर एक कस्टम 3 डी मुद्रित स्पेसर जोड़ें, यह आवश्यक होगा एक बार जैल डालने से लटक रहे हैं उन्हें थाली के नीचे अच्छी तरह से छूने से रोकने के लिए(चित्रा 2)।
चित्रा 2: कस्टम 3डी मुद्रित स्पेसर कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- उल्टे आवेषण को प्लेट के नीचे के हिस्से के साथ कवर करें और इनक्यूबेटर में तब तक रखें जब तक कि कोशिकाएं हाइड्रोगेल में एम्बेडेड न हों और वरीयता प्राप्त होने के लिए तैयार न हों।
3. आवेषण पर हाइड्रोगेल्स में एम्बेडेड सीडिंग कोशिकाएं
नोट: तालिका 1 अलग-अलग सांद्रता फिब्रिनोजन के साथ 3 योगों का विवरण प्रदान करता है जो तैयार किया जाएगा। फॉर्मूलेशन एक फाइब्रोसिस, दो सिरोसिस और तीन एचसीसी की शुरुआत के दौरान जिगर से मेल खाता है, इनमें से प्रत्येक फॉर्मूलेशन के लिए कठोरता मूल्य प्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान रीलॉजी के साथ निर्धारित किए गए थे।
| निर्माण | अंतिम फिब्रिनोजेन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) | अंतिम कोलेजन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) | कोशिकाएं (LX2 + HepG2 सह संस्कृति 1:1) | जिगर की अवस्था | साहित्य जिगर कठोरता मूल्यों (kPa) | Rheology से मॉडल कठोरता मूल्य (kPa) | निर्माण | फिब्रिनोजेन जोड़ने के लिए (एमएल) | कोलेजन जोड़ने के लिए (एमएल) | 10% डीएमईएम (एमएल) | थ्रोम्बिन (μL) | संदर्भ |
| 1 | 10 | 2 | 2 x 106 कोशिकाएं/एमएल | फाइब्रोसिस | ≥2 | 3 | 1 | 1 | 0.8 | 0.2 | 4 | 28; 29; 30 |
| 2 | 30 | 2 | 2 x 106 कोशिकाएं/एमएल | सिरोसिस | 6 | 2 | 0.75 | 0.8 | 0.45 | 3 | ||
| 3 | 40 | 2 | 2 x 106 कोशिकाएं/एमएल | एचसीसी | ≥10 | 10 | 3 | 0.25 | 0.8 | 0.95 | 1 | 28; 31; 32 |
तालिका 1: आवेषण पर हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाओं के बोने के लिए योगों का विवरण
- 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड स्टॉक समाधान तैयार करें 3.99 ग्राम नाओएच को 100 एमएल डीएच2ओ से जोड़कर। समाधान तो एक 0.22 μm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जा सकता है। स्टॉक समाधान को आरटी पर स्टोर करें।
- बर्फ पर 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन और 1 एम नाओएच का 10 एमएल रखें।
- पहले से गरम 50 मिलीएल पीबीएस, 15 एमएलए ट्राइप्सिन, 70 एमएल 10% डीएमईएम, और फाइब्रिनोजेन स्टॉक सॉल्यूशन, सेक्शन 1 में तैयार किया गया, पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक।
- सेल सस्पेंशन तैयार करें।
- T175 संस्कृति में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं (एलएक्स2) और लिवर कार्सिनोमा (हेपजी2) कोशिकाओं को पीबीएस के 10 एमएल के साथ दो बार फ्लास्क करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 6 एमएल ट्राइपसिन के साथ कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें।
- 10% डीएमईएम के 6 एमसीएल के साथ निष्क्रिय ट्राइपसिन।
- 300 x g पर 3 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में सेल सस्पेंशन ले लीजिए।
- अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और प्रत्येक सेल लाइन को 10% डीएमईएम के 5 एमएल में फिर से खर्च करें।
- एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें: प्रत्येक सेल निलंबन के 10 माइक्रोन को गिनती कक्ष स्लाइड में जोड़ें और स्लाइड को सेल काउंटर में डालें। सेल काउंट कोशिकाओं/एमएल के रूप में प्रदर्शित किया जाता है ।
- प्रत्येक सेल लाइन से कोशिकाओं को पतला करने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल चरण 3.4.6 में सेल गिनती का उपयोग कर स्पष्ट रूप से चिह्नित 15 एमएल ट्यूबों में। 300 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए कमजोर पड़ने को सेंट्रलाइज करें।
- अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और तालिका1 के अनुसार प्रत्येक 15 एमएल ट्यूब में 10% डीएमईएम जोड़ें, तालिका में प्रदान किए गए मूल्य प्रत्येक फॉर्मूलेशन के 2 एमएल के लिए हैं।
- 10 μL/mL NaOH (1 एम) के साथ कोलेजन की मात्रा बेअसर, और सेल निलंबन के लिए बेअसर कोलेजन जोड़ें, 10% DMEM मौजूद पीला हो जाएगा, एक बार निलंबन अच्छी तरह से एक कट टिप के साथ pipetting द्वारा मिलाया जाता है यह एक उज्ज्वल गुलाबी बदल जाएगा ।
- टेबल 1 के अनुसार कोलेजन सेल सस्पेंशन में फाइब्रिनोजन जोड़ें, एक कट पिपेट टिप का उपयोग करके, निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।
- अंत में कोलेजन-फाइब्रिनोजेन सेल सस्पेंशन में थ्रोम्बिन जोड़ें, प्रत्येक 10 मिलीग्राम फाइब्रिनोजेन के लिए 0.1 केयू थ्रोम्बिन।
- इनक्यूबेटर से सेक्शन 2 में तैयार प्री-लेपित उल्टे आवेषण को हटा दें और एक कट 200 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके, निर्धारित आवेषण पर तैयार निलंबन के पिपेट 200 माइक्रोन का उपयोग करें। जेल को लैमिनार फ्लो हुड के भीतर 15 मिनट के लिए क्रॉसलिंक करने की अनुमति दें।
- 15 मिनट के बाद, धीरे-धीरे प्लेट के निचले भाग को जैल के ऊपर रखें और उन्हें इनक्यूबेटर में ले जाएं ताकि जैल को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रॉसलिंक करने की अनुमति मिल सके।
- एक बार जैल क्रॉसलिंक हो जाने के बाद, आवेषण फिर से उलटा करें और प्लेट के प्रत्येक नीचे वाले कुओं में 10% डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें।
4. सीडिंग एंडोथेलियल कोशिकाएं
- पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए 25 एमएल हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस), 10 एमएलए ट्राइप्सिन, 10 एमएलए ट्राइप्सिन अवरोधक और 50 एमएल एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम, 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
- एंडोथेलियल (एचयूवीईसी) सेल सस्पेंशन तैयार करें।
- T175 संस्कृति में HUVEC कोशिकाओं को धोएं 10 एमएल एचबीएसएस के साथ दो बार फ्लैक्स करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 6 एमएल ट्राइपसिन के साथ कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें। 6 एमएलए ट्राइप्सिन अवरोधक के साथ निष्क्रिय ट्राइप्सिन। 200 x g पर 3 मिनट के लिए ट्यूब और सेंट्रलाइज के 15 एमएल में सेल सस्पेंशन ले लीजिए।
- अपकेंद्रित्र के बाद सुपरनेट को बढ़ा दें और 5 एमएल एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम में कोशिकाओं को निलंबित करें।
- स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके पहले 3.4.6 में वर्णित कोशिकाओं की गणना करें।
- सेल काउंटर से सेल काउंट का उपयोग करके, एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम में 1.0 x10 4 सेल/एमएल का सीडिंग घनत्व तैयार करें।
- डालने के शीर्ष भाग के प्रत्येक कुएं में HUVEC सेल निलंबन के बीज 500 μL प्रति डालने के लिए 5.0 x 103 कोशिकाओं की अंतिम मात्रा है।
5. रखरखाव
- विकास माध्यम हर दूसरे दिन बदलें, एस्पिरेट ने अच्छी तरह से और डालने दोनों से विकास माध्यम खर्च किया। एचयूवीईसी कोशिकाओं वाले आवेषण में जेल और 0.5 एमएल एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम वाले कुओं में 2 मिलीएल 10% डीएमईएम जोड़ें।
- प्रयोग से पहले 21 दिनों के लिए मॉडल बनाए रखें।
6. रियोलॉजी
- 8 मिमी व्यास समानांतर प्लेट स्टेनलेस स्टील ज्यामिति का उपयोग करके 0.1-20 हर्ट्ज से 0.267% और 37 डिग्री सेल्सियस पर आवृत्ति स्वीप करके, एक रियोमीटर का उपयोग करके कठोरता मूल्यों को इंगित करने के लिए जेल योगों के भंडारण मॉड्यूली को मापें।
7. व्यवहार्यता और दवा प्रतिक्रिया
- 2डी सह-संस्कृतियों और 3डी मॉडल में दवा प्रतिक्रिया और व्यवहार्यता निर्धारित करें।
- बीज HepG2 (५.० x10 3 कोशिकाओं/एमएल) और LX2 (५.० x10 3 कोशिकाओं/एमएल) कोशिकाओं में एक काले स्पष्ट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में 2डी सह संस्कृति के लिए एक काले स्पष्ट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में १.० x १०४ कोशिकाओं/mL के एक बीज घनत्व पर । कोशिकाओं को रातोंरात संलग्न करने की अनुमति दें।
- सेटअप 3 डी मॉडल 6 kPa के एक कठोरता मूल्य के साथ एक सिरोटिक वातावरण के अनुरूप करने के लिए। डॉक्सोरुबिन उपचार से पहले 21 दिनों के लिए मॉडल बनाए रखें।
- डॉक्सोरुबिसिन उपचार से दो घंटे पहले, 2डी और 3डी मॉडल दोनों से संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें। पीबीएस के साथ दो बार दोनों मॉडलों को धोएं। भुखमरी माध्यम (डीएमईएम 1% v/v एंटीमाइकोटिक एंटीबायोटिक समाधान के साथ पूरक) को 2D सह-संस्कृति (200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह) और 3डी मॉडल (हाइड्रोगेल युक्त कुओं में 2 एमएल और डालने के लिए 500 माइक्रोन) में जोड़ें।
- 2डी और 3डी मॉडल दोनों को डॉक्सोरुबिकिन का प्रशासन करें। खुराक इस प्रकार हैं: क्रमशः आईसी25, 50 और 75 मानों के अनुरूप 0.5, 1 और 1.5 m m M। 72 घंटे के लिए दोनों मॉडलों का इलाज करें।
नोट: Doxorubicin, एक topoisomerase द्वितीय अवरोधक, एचसीसी के लिए इस्तेमाल किया पहली कीमोथैरेपी दवाओं में से एक है और यह भी एचसीसी३३, ३४के उपचार में सबसे सक्रिय कीमोथैरेप्टिक एजेंटों में से एक है । - 72 घंटे के बाद, 2डी और 3डी मॉडल दोनों से एस्पिरेटेड कल्चर मीडियम। सुनिश्चित करें कि किसी भी शेष संस्कृति माध्यम पीबीएस के साथ दो बार दोनों मॉडलों को धोने से हटा दिया जाता है ।
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार अलामारब्लू तैयार करें और 2डी और 3डी मॉडल के कुओं में जोड़ें। 2डी संस्कृति के लिए 150 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से जोड़ें और 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से और 3 डी संस्कृति के लिए प्रति डालने 500 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड ।
- इनक्यूबेशन के बाद 3 डी सेटअप के प्रत्येक कुएं से अलामारब्लू के 150 माइक्रोन को ब्लैक क्लियर बॉटम 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। अलामारब्लू को 2डी मॉडल के लिए सीधे प्लेट से पढ़ा जा सकता है।
- क्रमशः 485 और 550 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य में एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ फ्लोरेसेंस पढ़ें।
- निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके दोनों मॉडलों में प्रतिशत सेल व्यवहार्यता की गणना करें:
Representative Results
एकाग्रता पर्वतमाला और सीडिंग मात्रा
अंतिम कार्य प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन चित्र 3में प्रस्तुत योजनाबद्ध आरेख के अनुसार हुआ । दो शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल, कोलेजन टाइप I और फिब्रिनोजेन को साहित्य खोज35,36के माध्यम से पहचाना गया था। चूहा पूंछ कोलेजन प्रकार मैं के साथ शुरू, सांद्रता की एक श्रृंखला (4, 3, 2 और 1 मिलीग्राम/ इस सीमा के भीतर सभी सांद्रता जैल बनाने में सक्षम थे, हालांकि कोलेजन जैल चपटा दिखाई दिया और हैंडलिंग और पाइपिंग के कारण उनके भीतर विभिन्न हवा के बुलबुले फंस गए थे, चित्रा 4 और चित्रा 5देखें। कोलेजन जेल की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए, सीडिंग वॉल्यूम (100, 150 और 200 माइक्रोन) की एक श्रृंखला, उल्टे आवेषण पर वरीयता प्राप्त की गई थी, चित्रा 5देखें। सीडिंग वॉल्यूम का जेल की उपस्थिति या जेल के भीतर बुलबुले की उपस्थिति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। तदनुसार, यह निर्णय लिया गया कि 200 माइक्रोन इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम था जो पूर्ण जैल का उत्पादन करता था। फिब्रिनोजेन का मूल्यांकन एक जेल का उत्पादन करने की क्षमता के लिए भी किया गया था जो लंबे समय तक एक डालने का पालन कर सकता था। एक एकाग्रता रेंज (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 मिलीग्राम/ सभी सांद्रता बोने के बाद 20 मिनट के भीतर सफलतापूर्वक एक जेल बनाने में सक्षम थे। हालांकि, सांद्रता 5 और 1 मिलीग्राम/एमएल को बाहर रखा गया था क्योंकि गठित जैल में स्थिरता की तरह तरल पदार्थ था और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखे जाने के बाद ढक्कन से अलग होना शुरू हो गया था।
चित्रा 3: प्रोटोकॉल अनुकूलन का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: कोलेजन जैल 4 मिलीग्राम/एमएल युक्त १.० x १०५ कोशिकाओं/एमएल जेल में मौजूद बुलबुले दिखा आवेषण पर वरीयता प्राप्त । बाईं ओर डालें 15 मिनट के लिए बर्फ पर degassed किया गया है, जबकि सही पर डालने के लिए degassed नहीं किया गया है । डेगासिंग का जैल में मौजूद बुलबुले पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: कोलेजन जैल 4 मिलीग्राम/एमएल युक्त १.० x १०५ कोशिकाओं/एमएल अलग मात्रा में आवेषण पर वरीयता प्राप्त । (A)सीडिंग के बाद सीधे लेफ्ट 100 माइक्रोल, मिडिल 150 माइक्रोल और राइट 200 माइक्रोल पर डालें। जैल में बुलबुले अभी भी मौजूद थे। (ख)60 मिनट क्रॉसलिंकिंग के बाद बाएं 200 माइक्रोल, मिडिल 150 माइक्रोल और राइट 100 माइक्रोल पर डालें। मात्रा की परवाह किए बिना सभी जैल अभी भी फ्लैट दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: एक एकाग्रता सीमा में Fibrinogen (२०० μL) एक 12 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन पर वरीयता प्राप्त ७० से 1 मिलीग्राम/एमएल । (A)सीडिंग के बाद सीधे जैल। (ख)सीडिंग के बाद जैल 20 मिनट । (ग)जैल रात भर रखा । सभी जैल अच्छी तरह से गोल दिखाई देते हैं, 5 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल जैल को बाहर रखा गया था क्योंकि वे सीडिंग के बाद 20 मिनट अधिक तरल पदार्थ स्थिरता दिखाई देते थे और रात भर रखे जाने के बाद ढक्कन से अलग होना शुरू कर दिया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
कॉम्बिनेशन कोलेजन और फाइब्रिनोजेन
कोलेजन और फाइब्रिनोजन एकाग्रता के परिणामों के आधार पर कोलेजन और फाइब्रिनोजन के संयोजन के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। निम्नलिखित के साथ तीन आवेषण सेटअप किए गए थे, 4 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन, 20 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन और कोलेजन का 1:1 राशन (4 मिलीग्राम/एमएल) और फाइब्रिनोजेन (20 मिलीग्राम/एमएल), चित्रा 7देखें । सीधे हाइड्रोगेल बोने के बाद, हमने देखा कि अकेले कोलेजन के साथ डालने में अभी भी जेल के भीतर बुलबुले की घटना के साथ एक फ्लैट उपस्थिति थी। फाइब्रिनोजेन के साथ आवेषण ने एक पूर्ण और गोलाकार जेल का उत्पादन किया, इसलिए कोलेजन और फाइब्रिनोजेन के संयोजन के साथ सम्मिलित किया। 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रॉस लिंकिंग के बाद, सभी जैल डालने से जुड़े थे और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन रात भर के बाद जुड़े रहे।
चित्रा 7: कोलेजन और फाइब्रिनोजन के संयोजन का प्रभाव। (क)कोलेजन 4 मिलीग्राम/एमएल वरीयता प्राप्त बाईं ओर डालने पर वरीयता प्राप्त, फाइब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल बीच में डालने पर वरीयता प्राप्त और कोलेजन 4 मिलीग्राम/एमएल, फाइब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल (1:1 राशन) दाईं ओर डालने पर वरीयता प्राप्त । 1.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल युक्त 200 माइक्रोन की मात्रा में वरीयता प्राप्त सभी जैल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए क्रॉसलिंक किया गया था।(बी)कोलेजन 4 मिलीग्राम/एमएल 60 मिनट क्रॉसलिंकिंग के बाद, जेल सपाट दिखाई दिया और बुलबुले थे। (ग)बाएं फाइब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल पर डालें, जेल गोल दिखाई देता है, कोई बुलबुले मौजूद नहीं होते हैं, दाएं कोलेजन पर डालें 4 मिलीग्राम/एमएल, फाइब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल जेल, जेल बिना बुलबुले के अच्छी तरह गोल होता है । (घ)कोलेजन 4 मिलीग्राम/एमएल जेल रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखे जाने के बाद जेल में अभी भी बड़ी मात्रा में बुलबुले होते हैं, जेल की कुछ सूजन हुई है। (ई)फिब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया।(एफ)कोलेजन 4 मिलीग्राम/एमएल, फिब्रिनोजेन 20 मिलीग्राम/एमएल जेल 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
सेल सीडिंग घनत्व का निर्धारण
हाइड्रोगेल्स के साथ काम करने के पिछले अनुभव के आधार पर इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व (डेटा नहीं दिखाया गया)37निर्धारित करने के लिए एक प्रयोग स्थापित किया गया था। कोशिकाओं को निम्नलिखित एकाग्रता सीमा में कोलेजन और फाइब्रिनोजन के संयोजन में एम्बेडेड किया गया था (7.5 x 105,8.5 x10 5,9.5 x 105,1.0 x 106,1.5 x10 6 और 2.0 x10 6 कोशिकाएं/एमएल), 2.0 x10 6 कोशिकाएं/एमएल इष्टतम बीज घनत्व पाया गया।
रियोलॉजी
फाइब्रिनोजेन और कोलेजन हाइड्रोजेल संयोजनों के दस योगों का मूल्यांकन रीटोलॉजी के माध्यम से किया गया था, तालिका 2देखें। इसका उद्देश्य यह निर्धारित करना था कि इनमें से कौन से योग एचसीसी के विकास के दौरान देखे गए यकृत कठोरता की नकल कर सकते हैं। साहित्य ने फाइब्रोसिस, सिरोसिस और एचसीसी के दौरान चूहों, चूहों और मनुष्यों के लिए ज्ञात यकृत कठोरता मूल्य प्रदान किए और इसका उद्देश्य इन मूल्यों28, 29,30,31, 32के रूप में संभव हो सके। तालिका 2 में निर्धारित दस फॉर्मूलेशन ट्रिपलिटी में तैयार किए गए थे और प्रत्येक के भंडारण मॉड्यूलस को एक रियोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, परिणाम चित्र 8में दिखाए गए थे।
| निर्माण | फिब्रिनोजेन (मिलीग्राम/मिलीलीटर) | कोलेजन (मिलीग्राम/मिलीलीटर) |
| 1 | 60 | 2 |
| 2 | 50 | 2 |
| 3 | 40 | 2 |
| 4 | 30 | 2 |
| 5 | 20 | 2 |
| 6 | 10 | 2 |
| 7 | 20 | 5 |
| 8 | 20 | 4 |
| 9 | 20 | 3 |
| 10 | 20 | 1 |
तालिका 2: कठोरता मूल्यों को निर्धारित करने के लिए रियोलॉजी के साथ मूल्यांकन विभिन्न सांद्रता में कोलेजन और फाइब्रिनोजेन संयोजन
चित्रा 8: रियोलॉजी के साथ मूल्यांकन किए गए विभिन्न सांद्रता में कोलेजन और फाइब्रिनोजेन संयोजनों के लिए हाइड्रोजेल कठोरता मूल्य। डिस्कवरी एचआर-2 हाइब्रिड रियोमीटर (एन = 3, एरर बार = एसडी) के माध्यम से स्टोरेज मॉड्यूलस और लॉस मोडुलस का निर्धारण 37 डिग्री सेल्सियस और 1Hz पर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इन दस सूत्रों में से तीन के साथ आगे बढ़ने के लिए चुना गया था । इनमें फाइब्रोसिस की शुरुआत में लिवर कठोरता मूल्यों के अनुरूप 2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन टाइप I और 10 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन शामिल थे, 2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन टाइप I और 30 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन सिरोसिस और 2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन टाइप I और एचसीसी के अनुरूप ४० मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनजेनजेन, फिगर 9देखें ।
चित्रा 9: विभिन्न फिब्रिनोजेन/कोलेजन हाइड्रोगेल योगों के लिए हाइड्रोजेल कठोरता मूल्यों को जारी रखने के लिए चुना गया । स्टोरेज मॉड्यूलस और लॉस मॉड्यूलस 37 डिग्री सेल्सियस और 1 हर्ट्ज (एन = 3, एरर बार = एसडी) पर निर्धारित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
व्यवहार्यता, दवा प्रतिक्रिया और मेटास्टेटिक क्षमता
अलामारब्लू परख के परिणामों ने 2D सह-संस्कृति के भीतर एक समग्र कम सेल व्यवहार्यता दिखाई, जो अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में ज्ञात रिपोर्ट आईसी 25, 50 और 75 मूल्यों के आधार पर उम्मीद से कम है, चित्रा 10देखें। यह हमारी सह-संस्कृति में एलएक्स 2 कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो डॉक्सोरुबिन उपचार के प्रति अधिक संवेदनशील हैं। हालांकि, हमारे 3 डी मॉडल में हमने देखा और डॉक्सोरुबिक प्रतिरोध में वृद्धि, कीमोथेरेपिक क्षमता में कमी की पुष्टि अक्सर 3 डी मॉडल सिस्टम में देखा । नियंत्रण की तुलना में सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन छात्र टी परीक्षण (दो पूंछ) का उपयोग करके किया गया था, जिसमें पीएंडटी;0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता है।
चित्रा 10: 72h की अवधि के लिए विभिन्न सांद्रता पर Doxorubicin के साथ उपचार के बाद 3 डी मॉडल की तुलना में एक 2 डी सह-संस्कृति मॉडल की प्रतिशत सेल व्यवहार्यता। अनुपचारित नियंत्रण (एन = 3, त्रुटि सलाखों = एसडी) (* = पी एंड एलटी;0.0001) के सापेक्ष परिणाम सामान्यीकृत किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
हाइड्रोगेल की विभिन्न सांद्रता के भीतर सेल विकास का पालन करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जेल निर्माणों का दैनिक निरीक्षण किया गया था। कोशिकाओं ने हाइड्रोगेल को एक सजातीय और कॉम्पैक्ट तरीके से भरा, दिन से 7 स्फेरॉइड मैट्रिक्स के भीतर इकट्ठा होने लगे।
Discussion
यह प्रोटोकॉल एचसीसी के लिए बायोमिमेटिक मॉडल बनाने की विधि के विकास का वर्णन करता है। एक स्पष्ट कार्यप्रवाह की स्थापना की गई है और इसमें शामिल महत्वपूर्ण कदमों की पहचान की गई है । इन महत्वपूर्ण चरणों में फिब्रिनोजेन स्टॉक समाधान की तैयारी, कोलेजन के साथ आवेषण कोटिंग और हाइड्रोगेल में शामिल कोशिकाओं को सीडिंग करना शामिल है। फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान की तैयारी के दौरान उच्च सांद्रता पर छोटे वेतन वृद्धि में फाइब्रिनोजन जोड़ना महत्वपूर्ण है। इससे न केवल फाइब्रिनोजन के घुलने में लगने वाले समय में कमी आएगी बल्कि फिब्रिनोजन को लगातार और समय से पहले जेलिंग करने से भी रोका जा सकेगा जैसा कि चित्र 11में देखा गया है । फाइब्रिनोजेन जेल की तैयारी में काफी समय लगता है और यह समग्र प्रयोगात्मक सफलता को प्रभावित कर सकता है। परिणाम इंगित करता है कि एक बार फाइब्रिनोजेन जेल लगातार जेल शुरू हो जाता है तो इसे त्यागना सबसे अच्छा होता है। आवेषण को कोलेजन से लेपित किया जाना चाहिए, पीबीएस से धोया जाना चाहिए और हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाओं को बोने से पहले लेमिनार प्रवाह हुड के भीतर सूख जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने में विफलता कि आवेषण सूखे हैं, इसके परिणामस्वरूप हाइड्रोगेल डालने के किनारों पर फैल जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप एक असमान जेल होगा। जेल की असमानता अंततः परिणामों को प्रभावित करेगी जहां प्रसार एक कारक है।
चित्रा 11: फाइब्रिनोजेन/कोलेजन हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन के लिए फिब्रिनोजेन जेल की तैयारी। (A)फिब्रिनोजेन जेल समाधान जिसने झुरमुट बना लिए हैं और ट्यूब का पालन करने वाले अविचलित फाइब्रिनोजेन के साथ समय से पहले जेल करना शुरू कर दिया है। (ख)फिब्रिनोजेन जेल समाधान जो पूरी तरह से भंग हो गया है, समाधान स्पष्ट और थोड़ा अधिक चिपचिपा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
आवेषण पर हाइड्रोगेल सेल निलंबन को सीडिंग करते समय जितनी जल्दी हो सके काम करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि फाइब्रिनोजेन घटक थ्रोम्बिन के अलावा क्रॉसलिंक करना शुरू कर देगा। सीडिंग करते समय जेल को क्रॉसलिंकिंग से रोकने के लिए उच्च सांद्रता पर जेल निलंबन के साथ काम करते समय एक समय में छोटे काम की मात्रा तैयार करें। उत्तरार्द्ध वितरण और प्रत्येक अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त जेल की मात्रा पर प्रभाव पड़ेगा। घटकों को जोड़ने का क्रम महत्वपूर्ण है, इस प्रोटोकॉल में हमने जैल को समय से पहले क्रॉसलिंकिंग से रोकने के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रदान किया। मिश्रण और मापने के दौरान एक कट पिपेट टिप के साथ काम करने वाले हाइड्रोगेल जेल निलंबन की चिपचिपाहट के कारण सलाह दी जाती है। निलंबन को मिलाते समय यह सुनिश्चित करें कि यह एक समरूप निलंबन बनाने के लिए जल्दी और समान रूप से किया जाता है। असमान मिश्रण के परिणामस्वरूप एक विषम जेल होगा जो परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा, चित्रा 12देखें।
चित्रा 12: कोलेजन/फाइब्रिनोजेन जैल 12 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त । सभी जैल 2.0 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ 20 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन युक्त 200 माइक्रोन की मात्रा में वरीयता प्राप्त करते हैं। (A)विषम स्थिरता के साथ हाइड्रोजेल जेल, हाइड्रोगेल का दृश्य असमान वितरण। (ख)हाइड्रोगेल्स समरूप रूप से मिश्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रोटोकॉल अनुकूलन के बाद, मॉडल जैव भौतिक गुणों का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया गया था। रियोलॉजी डेटा से पता चला है कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक बाह्य मैट्रिक्स घटकों अर्थात् कोलेजन टाइप I और फाइब्रिनोजेन से बना हमारा मॉडल फाइब्रोटिक, सिरोटिक और एचसीसीलिवर28, 29,30,31,32के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने में सक्षम था। एचसीसी के लिए 3 डी मॉडल में जिगर की जकड़न का काफी महत्व है और अक्सर मॉडल विकास के दौरान अनदेखी की जाती है। बढ़ी हुई जिगर की कठोरता एचसीसी38में कीमोथैरेप्ट्यूटिक प्रतिरोध, प्रसार, प्रवासन और निद्रा से संबंधित है। जबकि एचसीसी में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं की सक्रियता बढ़ी हुई बाह्राश मैट्रिक्स कठोरता से जुड़ी हुई है, इन हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं से जुड़े कई सिग्नलिंग रास्ते के साथ मैकेनोसेंसिटिविटी39दिखाते हैं।
एचसीसी के लिए 3डी मॉडल के विकास में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं और एंडोथेलियल सेल जैसी स्ट्रोमा से जुड़ी कोशिकाओं को शामिल करना तेजी से प्रासंगिक हो गया है। अध्ययनों से पता चलता है कि हेपेटिक स्टेलेट और एचसीसी कोशिकाओं से बना बहुकोशिक गोलाकार गोलाकार के परिणामस्वरूप कीमोथैरेप्टिक प्रतिरोध और आक्रामक प्रवास में वृद्धि हुई, जबकि वीवो में एचसीसी ट्यूमर उपस्थिति की नकल उतारते हुए, जब एक PXT चूहों मॉडल और मानव एचसीसी ऊतक नमूनों की तुलना में17। जंग एट अल द्वारा इसी तरह के एक अध्ययन, २०१७ में हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (हुह-7) और एंडोथेलियल (HUVEC) कोशिकाओं से मिलकर बहुकोशिकीय गोलाकार पाया गया, जिसने संवहनी और आक्रामकता22को बढ़ावा दिया । इन स्फेरॉइड ने हुह-7 मोनोकल्चर स्फेरॉइड22की तुलना में डॉक्सोरुबिकिन और सोराफेनिब की काफी अधिक सांद्रता पर व्यवहार्यता दिखाई। हमारे मॉडल की व्यवहार्यता और डॉक्सोरुबिकिन के प्रति प्रतिक्रिया का मूल्यांकन, एचसीसी के अनुरूप कठोरता मूल्यों और स्ट्रोमा से जुड़ी कोशिकाओं (एलएक्स2 और एचयूवीईसी) को शामिल करने के साथ, 2 डी सह-संस्कृति मॉडल की तुलना में कीमोथेरेपी के जवाब में इसी तरह की कमी दिखाई दी। इस प्रकार, प्रभावी रूप से दवा प्रतिरोध आमतौर पर रोगियों और अन्य 3 डी एचसीसी मॉडल में देखा नकल उतार।
चूंकि यह एक मॉड्यूलर प्रणाली है, इसलिए मॉडल को अन्य बाह्य मैट्रिक्स घटकों अर्थात् लेमिनिन और हायलूरोनिक एसिड के अलावा मजबूत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस मॉडल के भीतर उपयोग किए जाने वाले वर्तमान हाइड्रोगेल को सोडियम एल्गिनेट या चिटोसन जैसे सिंथेटिक हाइड्रोगेल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। वर्तमान मॉडल में और संशोधन प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ सेल लाइनों का प्रतिस्थापन हो सकता है ताकि और भी अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का उत्पादन किया जा सके या अन्य ट्यूमर और स्ट्रोमल सेल लाइनों के संयोजन का उपयोग किया जा सके।
इस प्रकार हमने एचसीसी में ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ट्यूनेबल बायो-फिजिकल गुणों के साथ एक 3 डी मॉडल सफलतापूर्वक विकसित किया है। डॉक्सोरुबिसिन के जवाब में पारंपरिक 2डी संस्कृतियों की तुलना में हमने अपने मॉडल को वीवो स्थिति में अधिक प्रतिनिधि पाया है। हालांकि, अभी भी बहुत कुछ किया जाना है, हम बड़े पैमाने पर इस मॉडल की विशेषता और एक संभव मेटास्टैटिक मंच के रूप में मॉडल का पता लगाने के लिए और अधिक जटिल और दबाने सवाल है कि अध्ययन HCC में रहने का जवाब देने की उंमीद है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध स्वीडिश कैंसर फाउंडेशन (Cancerfonden, CAN2017/518), चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्वीडिश सोसायटी (SSMF, S17-0092), O.E. Och Edla जोहानसंस फाउंडेशन और ओल्गा Jönssons फाउंडेशन से प्राप्त अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था । ये फंडिंग स्रोत अध्ययन डिजाइन में शामिल नहीं थे; डेटा का संग्रह, विश्लेषण और व्याख्या; रिपोर्ट का लेखन; और प्रकाशन के लिए लेख प्रस्तुत करने के निर्णय में। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कस्टम डिज़ाइन किए गए स्पेसर्स की 3डी प्रिंटिंग यू-प्रिंट में की गई थी: U-PRINT@mcb.uu.se, मेडिसिन और फार्मेसी के अनुशासनात्मक डोमेन में उपसाला विश्वविद्यालय की 3डी-प्रिंटिंग सुविधा। हम अपनी परियोजना पर अपने मूल्यवान इनपुट के लिए पॉल ओ Callaghan शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
| Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
| CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
| Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
| Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
| Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
| Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
| Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
| Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
| Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
| Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
| Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
| Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
| TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
| TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
| Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |
References
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