Summary
Denne protokol præsenterer en 3D biomimetisk model med tilhørende fibrotisk stromal rum. Tilberedt med fysiologisk relevante hydrogels i nøgletal efterligner de bio-fysiske egenskaber af den stromale ekstracellulære matrix, en aktiv mægler af cellulære interaktioner, tumorvækst og metastaser.
Abstract
Hepatocellulær carcinom (HCC) er en primær levertumor udvikler sig i kølvandet på kronisk leversygdom. Kronisk leversygdom og betændelse fører til et fibrotisk miljø aktivt støtte og kørsel hepatocarcinogenesis. Indsigt i hepatocarcinogenese i form af samspillet mellem tumor stroma mikro-miljø og tumorceller er således af stor betydning. Tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller foreslås som den manglende forbindelse mellem nuværende in vitro 2D-cellekulturmodeller og in vivo-dyremodeller. Vores mål var at designe en ny 3D biomimetisk HCC-model med tilhørende fibrotisk stromal rum og vaskulatur. Fysiologisk relevante hydrogels såsom kollagen og fibrinogen blev indarbejdet for at efterligne de bio-fysiske egenskaber af tumorEN ECM. I denne model LX2 og HepG2 celler indlejret i en hydrogel matrix blev seedet på den omvendte transmembrane indsætte. HUVEC celler blev derefter seedet på den modsatte side af membranen. Tre formuleringer bestående af ECM-hydrogels indlejret med celler blev udarbejdet, og de bio-fysiske egenskaber blev bestemt af rheologi. Celle levedygtighed blev bestemt af en celle levedygtighed assay over 21 dage. Effekten af det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin blev evalueret i både 2D-co-kultur og vores 3D-model i en periode på 72 timer. Rheologi resultater viser, at bio-fysiske egenskaber af en fibrotisk, cirrhotic og HCC leveren med succes kan efterlignes. Samlet set viser resultaterne, at denne 3D-model er mere repræsentativ for in vivo-situationen sammenlignet med traditionelle 2D-kulturer. Vores 3D tumor model viste en nedsat reaktion på kemoterapeutik, efterligne resistens typisk ses hos HCC patienter.
Introduction
Hepatocellulær carcinom (HCC) omfatter 90% af alle primære leverkræft1,2. Med 810.000 dødsfald og 854.000 nye tilfælde rapporteret årligt er det i øjeblikket rangeret som den femte mest almindelige kræft på verdensplan med en af de højeste forekomster afdødelighed 1. Udviklingen af HCC tilskrives overvejende betændelse forbundet med kroniske leversygdomme, nemlig viral hepatitis, kronisk overdreven alkoholindtag, metabolisk syndrom, fedme og diabetes1,3,4. Betændelsen forbundet med disse patologiske tilstande resulterer i hepatocytskade og sekretion af forskellige cytokiner, der aktiverer og rekrutterer hepatisk stjerneceller og inflammatoriske celler til at indlede fibrose5. Hepatisk stellate celler er kendt for deres centrale rolle i indledningen, progression, og regression af leverfibrose. Ved aktivering differentierer de sig til myofibroblast som celler med kontraktile, proinflammatoriske og pro-fibrinogene egenskaber6,7,8. Den resulterende fibrose forårsager igen dysregulering af ekstracellulær matrix remodeling enzymaktivitet, hvilket skaber et miljø præget af en samlet øget stivhed ledsaget af udskillelsen af vækstfaktorer, hvilket yderligere bidrager til HCC patogenese9,10. Det er denne kontinuerlige patogene feedback loop mellem hepatocytter og det stromale miljø, som brændstoffer kræft indledning, epitel til mesenchymale overgange (EMT), angiogenese, metastatisk potentiale, og ændret lægemiddelrespons11,12,13. Indsigt i hepatocarcinogenese med hensyn til samspillet mellem tumoren og tumormikromiljøet er derfor af stor betydning ikke kun fra et mekanistisk, men også fra et behandlingsperspektiv.
To-dimensionelle (2D) in vitro cellekultur modeller er overvejende anvendes af 80% af kræft celle biologer14. Disse modeller er dog ikke repræsentative for det sande tumormikromiljø, som påvirker kemoterapeutiske reaktioner14,15,16. I øjeblikket 96% af kemoterapeutiske lægemidler mislykkes under kliniske forsøg14. Denne høje forekomst i narkotikaslidningsrater kan tilskrives det faktum, at tilgængelige in vitro-forscreeningsmodeller ikke fuldt ud repræsenterer vores nuværende indsigt og forståelse af HCC's kompleksitet og mikromiljøet16. Omvendt in vivo dyremodeller til stede med kompromitteret immunforsvar og forskelle i samspillet mellem tumor og mikromiljøet i forhold til mennesker16,17. I gennemsnit kan kun 8 % af resultaterne fra dyreforsøg oversættes pålideligt fra præklinisk til klinisk indstilling16,17. Derfor er det klart, at evalueringen af HCC kræver udvikling af en in vitro-platform, der effektivt opsummerer kompleksiteten af ikke kun tumoren, men også mikromiljøet. Platformene vil supplere de aktuelt tilgængelige in vitro prækliniske screeningmodeller og reducere mængden af dyreforsøg i fremtiden7,14.
En sådan platform er avancerede tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller. Et væld af disse avancerede 3D-modeller til at studere HCC er opstået i løbet af det sidste årti, og forskellige anmeldelser er blevet offentliggjort. Tilgængelige 3D-modeller til undersøgelse af HCC omfatter flercellede sfæroider, organoider, stilladsbaserede modeller, hydrogels, mikrofluidics og biotryk. Af disse er flercellede sfæroider en af de mest kendte modeller, der anvendes i studiet af tumorudvikling. Spheroids er en billig model med lave tekniske vanskeligheder, mens de samtidig effektivt efterligner in vivo tumorarkitektur18,19,20. Multicellulære sfæroider har bidraget til et væld af oplysninger om HCC17,21,22. Men, standardiseret kultur tid mangler som multicellulære sfæroider holdes i kultur mellem 7 til 48 dage. Øget kulturtid er af stor betydning. Eilenberger fandt, at forskellene i sfæroid alder dybt påvirker Sorafenib (en kinase hæmmer, der anvendes til behandling af leverkræft) diffusitet ogtoksicitet 23. Mens Wrzesinski og Fey fandt, at 3D hepatocyt sfæroider kræver 18 dage at genetablere vigtige fysiologiske leverfunktioner efter trypsinisering og fortsætter med at udvise den stabile funktionalitet i op til 24 dage efter denne genopretning24,25.
Nogle af de mere avancerede 3D HCC-modeller omfatter brugen af humane decellulariserede leverstilladser og biotrykte stilladser. Mazza og kolleger skabte et naturligt 3D stillads til HCC-modellering ved hjælp af decellulariserede humane lever, der ikke er egnede til transplantation26. Disse naturlige stilladser kunne med succes genbefolkes i 21 dage med en co-kultur af lever stellate og hepatoblastoma celler, samtidig med at udtrykket af centrale ekstracellulære matrix komponenter såsom kollagen type I, III, IV og fibronectin. Bortset fra sygdomsmodellering giver denne model også fordelen ved funktionel organtransplantation og præklinisk lægemiddel- og toksicitetsscreening26. Med fremskridt inden for 3D-biotryk kan 3D-ekstracellulære matrixstilladser nu også biotrykkes. Ma og kolleger, biotrykte ekstracellulære matrixstilladser med variable mekaniske egenskaber og biomimetisk mikroarkitektur ved hjælp af hydrogelingeniør fra decellulariseret ekstracellulær matrix27. Utvivlsomt disse er alle fremragende 3D HCC modeller. Men, utilgængelighed af menneskelige lever og de omkostninger, der er forbundet med at erhverve det nødvendige udstyr og materialer placerer disse modeller i en ulempe. Derudover er disse metoder alle teknisk avancerede, hvilket kræver omfattende uddannelse, som måske ikke er let tilgængelige for alle forskere.
Baseret på kompleksiteten af HCC og i øjeblikket tilgængelige 3D-modeller, vi forsøgte at udvikle en altomfattende 3D HCC model. Vi sigtede mod en model, der er i stand til at opsummere både det præmalignante og tumormikromiljø ved at inkorporere justerbare hydrogelstivhedsværdier. Desuden har vi også inkluderet hepatocellulære og stroma tilknyttede cellelinjer, der spiller en central rolle i patogenese af HCC. Disse omfatter endotelceller, leverinde stellate celler og ondartede hepatocytter, dyrket i et mikromiljø bestående af fysiologisk relevante hydrogels. Med de valgte hydrogels, kollagen type I og fibrinogen, indarbejdet i nøgletal, der kan sammenlignes med bio-fysiske ændringer set i leverstivhed under påbegyndelsen og progressionen af HCC. Derudover sigtede vi mod en model, der kunne holdes i kultur i en længere periode. Vi forestillede os en modulær, omkostningseffektiv model, der kan sættes op med grundlæggende udstyr, minimal træning og erfaring og let tilgængelige materialer.
Protocol
Figur 1: Grafiske skildringer af oprettelsen af 3D biomimetic HCC model Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: Den overordnede arbejdsgang for denne protokol er beskrevet i illustrationerne af figur 1
1. Fremstilling af fibrinogenbestandsopløsning
- Der fremstilles en lageropløsning på 1 M calciumchlorid (CaCl2)ved at veje 2,21 g CaCl2 og tilsætte den til 20 ml destilleret vand (dH2O). Lageropløsning kan opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Der fremstilles en 20 mL aprotinin-stamopløsning (1218,75 VIF/mL) ved at veje 5 mg aprotinin og tilsætte den til 20 ml dH2O. Aliquot-stamopløsning i 1 ml aliquots og opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles en 10 mll fibrinogenbestandopløsning på 80 mg/mL.
- I et 50 mL rør tilsættes 7,849 mL fosfat buffered saltvand (PBS), 2,051 mL aprotinin lager (1218,75 KIU /mL) for en endelig aprotininkoncentration på 250 KIU/mL og 100 μL CaCl2 (1M) for en endelig CaCl2 koncentration på 10 mM.
- Vejer 800 mg fibrinogen.
- Der afvejes 200 mg natriumchlorid (NaCl), for at stamopløsningen indeholder 2% w/v NaCl.
- Fibrinogen og NaCl tilsættes i intervaller til det 50 mL rør, der indeholder PBS, aprotinin og CaCl2. Rør ikke kraftigt eller ryst ikke kraftigt, da dette vil resultere i fibrinogengelering og klumper, der dannes i opløsningen.
- Placer fibrinogenlageropløsningens 50 ml rør vandret på en shaker, og ryst ved en lav indstilling på 300 omdrejninger i minuttet.
- Når opløsningen er opløst, filtreres den ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter eller et flasketopfilter afhængigt af lydstyrken. Vigtigere er det, ikke autoklave fibrinogen løsning, da dette vil ødelægge fibrinogen.
BEMÆRK: Denne del af protokollen kan tage mellem 2 og 5 timer afhængigt af mængden af lageropløsning, denne gang bør tages i betragtning under forsøgsopsætningen.
2. Coating skær med kollagen før såning hydrogels på indsatserne
- I en laminar flow hætte eller en vævskultur hætte, ved hjælp af steriliseret pincet, fjerne skær fra pladen og sted omvendt på låget af pladen.
- Der fremstilles en 100 ml 20 mM glacial eddikesyreopløsning ved at tilsætte 115 μL istidseddike til 25 ml dH2O og tilpasse sig et slutvolumen på 100 ml med dH2O. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter. Lagerløsning kan opbevares på RT.
- 2 ml af en 100 μg/mL kollagenopløsning fremstilles af en 5 mg/mL kollagenopløsning ved at tilsætte 40 μL af 5 mg/mL kollagenopløsningen til 1,960 ml af den 20 mM glaciale eddikesyreopløsning, der er fremstillet i 2.2.
- Indsatsen belægges med den 100 μg/mL kollagenopløsning, der er fremstillet i 2.3, ved at pipetter 100 μL af opløsningen på hvert skær. Lad skær lufttørre i laminar flow hætte eller væv kultur hætte i 2 til 3 timer.
- Når indsatserne har tørret vask hver indsætte 3x med PBS. Tilsæt 1 mL PBS til hver brønd af en 12 brøndplade, placer indsatserne med kollagenbelægning nedad i brøndene, fjern PBS fra brønden og gentag proceduren. Lad skær lufttørre i laminar flow hætten 1 til 2 timer.
ADVARSEL: Eddikesyre er giftig for celler, og skær skal vaskes grundigt med PBS. - Tilføj en brugerdefineret 3D-printet afstandsstykke over indsatserne, dette vil være nødvendigt, når gelerne hænger fra indsatsen for at forhindre dem i at røre den nederste brønd på pladen (Figur 2).
Figur 2: Brugerdefineret 3D-udskrevet afstandsstykke Klik her for at få vist en større version af figuren.
- Dæk de omvendte skær med den nederste del af pladen og læg dem i inkubatoren, indtil cellerne er indlejret i hydrogelerne og klar til at blive seedet.
3. Såning celler indlejret i hydrogels på skær
BEMÆRK: Tabel 1 indeholder en beskrivelse af 3 formuleringer med forskellige koncentrationer fibrinogen, der vil blive udarbejdet. Formulering en svarer til leveren under starten af fibrose, to skrumpelever og tre HCC, stivhed værdier for hver af disse formuleringer blev bestemt med reologi under protokollen optimering.
| Formulering | Endelig Fibrinogenkoncentration (mg/mL) | Endelig kollagenkoncentration (mg/mL) | Celler (LX2 + HepG2 Co-kultur 1:1) | Fase af leveren | Litteratur lever stivhed værdier (kPa) | Model Stivhed værdi fra Rheology (kPa) | Formulering | Fibrinogen at tilføje (mL) | Kollagen, der skal tilføjes (mL) | 10 % DMEM (mL) | Thrombin (μL) | References |
| 1 | 10 | 2 | 2 x 106 celler/mL | Fibrose | ≥2 | 3 | 1 | 1 | 0.8 | 0.2 | 4 | 28; 29; 30 |
| 2 | 30 | 2 | 2 x 106 celler/mL | Skrumpelever | 6 | 2 | 0.75 | 0.8 | 0.45 | 3 | ||
| 3 | 40 | 2 | 2 x 106 celler/mL | Hcc | ≥10 | 10 | 3 | 0.25 | 0.8 | 0.95 | 1 | 28; 31; 32 |
Tabel 1: Beskrivelse af formuleringer til såning af celler, der er indlejret i hydrogeler, på skær
- 1 M natriumhydroxidopløsning fremstilles ved tilsætning af 3,99 g NaOH til 100 ml dH2O. Opløsningen kan derefter filtreres ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter. Opbevar lagerløsningen hos RT.
- Placer 5 mg/mL kollagen og 10 mL af 1 M NaOH på is.
- Forvarm 50 ml PBS, 15 ml trypsin, 70 ml 10% DMEM og fibrinogenbestandsopløsning, tilberedt i afsnit 1, til 37 °C i 20 minutter i et vandbad.
- Gør celleophængene klar.
- Vask lever stellate celler (LX2) og leverkræft (HepG2) celler i T175 kultur kolber to gange med 10 mL PBS.
- Trypsinisere celler med 6 mL trypsin i 4 min ved 37 °C.
- Inaktiver trypsin med 6 mL på 10% DMEM.
- Celleaffjedringen opsamles i 15 mL rør og centrifuge i 3 min ved 300 x g.
- Efter centrifugering suges supernatanten og genbruges hver cellelinje i 5 mL på 10% DMEM.
- Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller: Tilføj 10 μL af hver celleophæng til optællingskammerdiaset, og indsæt diaset i celletælleren. Celleantal vises som celler/mL.
- Cellerne fortyndes fra hver cellelinje til 1 x 106 celler pr. mL ved hjælp af celletallet i trin 3.4.6 i tydeligt markerede 15 mL-rør. Centrifuge fortyndingerne i 3 min ved 300 x g.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten, og der tilsættes 10% DMEM til hvert 15 mL rør i henhold til tabel 1, værdierne i tabellen er for 2 mL af hver formulering.
- Neutralisere mængden af kollagen med 10 μL/mL NaOH (1 M), og tilsæt neutraliseret kollagen til cellen suspension, de 10% DMEM stede vil blive gul, når suspensionen er blandet grundigt ved pipettering med et snit spids det vil vende en lyserød.
- Tilsæt fibrinogen til kollagencelleophænget i henhold til tabel 1 ved hjælp af en skåret pipettespids, bland suspensionen grundigt.
- Endelig tilsættes thrombin til kollagen-fibrinogen celle suspension, 0,1 KIU thrombin for hver 10 mg fibrinogen.
- De forindlagte inverterede skær, der er fremstillet i punkt 2, fjernes fra inkubatoren og med et snit på 200 μL pipettespids, pipette 200 μL af den forberedte affjedring på de udpegede skær. Lad gelerne krydse i 15 minutter inden for laminar flow hætten.
- Efter 15 minutter anbringes forsigtigt den nederste del af pladen over gelerne, og de flyttes til inkubatoren, så gelerne kan krydse ved 37 °C i 45 minutter.
- Når gelerne er krydset, skal du vende indsatsen igen og tilføje 2 mL 10% DMEM til hver af pladens nederste brønde.
4. Såning af endotelceller
- Forvarm 25 ml afbalanceret saltopløsning (HBSS), 10 ml trypsin, 10 ml trypsinhæmmer og 50 ml endotelvækstmedium til 37°C i 20 minutter i et vandbad .
- Forbered endotel (HUVEC) celleaffjedring.
- Huvec-celler vaskes i T175-dyrkningskolber to gange med 10 mL HBSS.
- Trypsinisere celler med 6 mL trypsin i 4 min ved 37 °C. Inaktiver trypsin med 6 mL trypsin-hæmmer. Celleaffjedringen opsamles i 15 mL rør og centrifuge i 3 min ved 200 x g.
- Efter centrifugering suges supernatanten og suspenderer cellerne i 5 mL endotelvækstmedium.
- Tæl cellerne som tidligere beskrevet i 3.4.6 ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Brug celletallet fra celletælleren til at forberede seedingtætheden på 1,0 x 104 celler/mL i endotelvækstmediet.
- Frø 500 μL af HUVEC-celleophænget i hver brønd i den øverste del af indsatsen for at have et endeligt volumen på 5,0 x 103 celler pr. skær.
5. Vedligeholdelse
- Udskift vækstmediet hver anden dag, aspirat brugt vækstmedium fra både brønden og indsatsen. Der tilsættes 2 mL 10% DMEM til brøndene, der indeholder gelen, og 0,5 mL endotelvækstmedium til de skær, der indeholder HUVEC-cellerne.
- Vedligehold modellen i 21 dage før eksperimentering.
6. Rheologi
- Måle lagringsmoduli af gelformuleringer for at angive stivhedsværdier ved hjælp af et rheometer ved at udføre frekvensfejninger fra 0,1-20 Hz ved 0,267% og 37 °C med en konstant aksial kraft på 0,1 N ved hjælp af en 8 mm diameter parallelplade rustfri stålgeometri.
7. Levedygtighed og narkotikarespons
- Bestem lægemiddelrespons og levedygtighed i 2D-samkulturer og 3D-model.
- Frø HepG2 (5,0 x 103 celler / mL) og LX2 (5,0 x 103 celler / mL) celler i en 1:1 ratio for 2D co-kultur i en sort klar bund 96-godt plader på en såning tæthed på 1,0 x 104 celler / mL. Lad cellerne vedhæfte natten over.
- Opsæt 3D-modellen, så den svarer til et cirrhotisk miljø med en stivhedsværdi på 6 kPa. Vedligehold modellen i 21 dage før Doxorubicin behandling.
- To timer før doxorubicin behandling, indsug kulturmediet fra både 2D- og 3D-modellen. Vask begge modeller to gange med PBS. Udsultningsmediet (DMEM suppleret med 1% v/v antimycotisk antibiotisk opløsning) til 2D-samkulturen (200 μL pr. brønd) og til 3D-modellen (2 ml til brøndene indeholdende hydrogel og 500 μL til indsatsen).
- Administrere doxorubicin til både 2D- og 3D-modellen. Doser er som følger: 0,5, 1 og 1,5 mM svarende til henholdsvis IC25-, 50- og 75-værdierne. Behandl begge modeller i 72 timer.
BEMÆRK: Doxorubicin, en topoisomerase II-hæmmer, er et af de første kemoterapeutiske lægemidler, der anvendes til HCC og er også et af de mest aktive kemoterapeutiske midler til behandling af HCC33,34. - Efter 72 timer, indsugning kultur medium fra både 2D og 3D-modellen. Sørg for, at eventuelle resterende dyrkningsmedier fjernes ved at vaske begge modeller to gange med PBS.
- Forbered AlamarBlue i henhold til producentens anbefalinger og tilføj til brøndene i 2D- og 3D-modellen. Der tilsættes 150 μL pr. brønd til 2D-kulturen og 2 mL pr. brønd og 500 μL pr. skær for 3D-kultur. Inkuberes natten over ved 37 °C.
- Efter inkubationsoverførsel 150 μL af AlamarBlue fra hver brønd af 3D-opsætningen til en sort klar bund 96-brønd plade. AlamarBlue kan aflæses direkte fra pladen til 2D-modellen.
- Aflæs fluorescensen med en mikropladelæser ved excitationsbølgelængde og emissionsbølgelængde på henholdsvis 485 og 550 nm.
- Beregn den procentvise celleygtighed i begge modeller ved hjælp af følgende formel:
Representative Results
Koncentrationsområder og såvolumen
Protokoloptimering for at opnå den endelige funktionsprotokol fandt sted i overensstemmelse med det skematiske diagram, der er vist i figur 3. To fysiologisk relevante hydrogels, Kollagen type I og Fibrinogen, blev identificeret ved hjælp af en litteratur søgning35,36. Begyndende med rotte hale kollagen type I, en række koncentrationer (4, 3, 2 og 1 mg / mL) blev seedet på inverterede skær til at bestemme deres evne til at holde sig til indsatsen gang omvendt igen. Alle koncentrationer inden for dette område var i stand til at danne geler, men kollagen geler syntes fladtrykt og havde forskellige luftbobler fanget i dem på grund af håndtering og pipetter, se figur 4 og figur 5. For at bestemme det optimale såvolumen for at forbedre kvaliteten af kollagengelen blev en række såvolumener (100, 150 og 200 μL) seedet på omvendte skær, se figur 5. Såvolumenet havde ingen indflydelse på gelens udseende eller tilstedeværelsen af bobler i gelen. Det blev derfor besluttet, at 200 μL var det optimale såvolumen, der producerede de mest fyldige geler. Fibrinogen blev også evalueret for sin evne til at producere en gel, der kunne klæbe til en indsats i en længere periode. Et koncentrationsområde (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL) blev fremstillet og seedet i et volumen på 200 μL på låget på en 12-brønds plade, se figur 6. Inden for 20 minutter efter såning alle koncentrationer var i stand til at danne en gel. Koncentrationerne 5 og 1 mg/mL blev imidlertid udelukket, da de dannede geler havde en væskelignende konsistens og var begyndt at løsne sig fra låget efter at være blevet holdt natten over ved 37 °C.
Figur 3: Skematisk diagram over protokoloptimering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kollagengeler 4 mg/mL indeholdende 1,0 x 105 celler/mL seedet på skær, der viser bobler til stede i gelen. Sæt til venstre blevet afgasset på is i 15 minutter, mens indsatsen til højre ikke er blevet afgasset. Afgasning havde ingen effekt på de bobler, der var til stede i gelerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kollagengeler 4 mg/mL indeholdende 1,0 x 105 celler/mL seedet på skær i forskellige mængder. (A) Sæt til venstre 100 μL, mellem 150 μL og højre 200 μL direkte efter såningen. Bobler i gelerne var stadig til stede. (B) Sæt til venstre 200 μL, mellem 150 μL og højre 100 μL efter 60 minutters krydsning. Alle geler uanset volumen vises stadig fladt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fibrinogen (200 μL) i et koncentrationsområde fra 70 til 1 mg/mL seedet på låget på en 12-brønds plade. (A)Geler direkte efter såning. (B) Geler 20 minutter efter såning. (C)Geler opbevares natten over. Alle geler fremstår godt afrundede, 5 mg/mL og 1 mg/mL geler blev udelukket, da de syntes at have en mere flydende konsistens 20 minutter efter såning og var begyndt at løsne sig fra låget efter at være blevet holdt natten over. Klik her for at se en større version af dette tal.
Kombination kollagen og fibrinogen
Baseret på resultaterne fra kollagen og fibrinogen koncentration intervaller effekten af at kombinere kollagen og fibrinogen blev evalueret. Der blev sat tre skær op med følgende, 4 mg/mL kollagen, 20 mg/mL fibrinogen og en 1:1 ration kollagen (4 mg/mL) og fibrinogen (20 mg/mL), se figur 7. Umiddelbart efter såning af hydrogelerne observerede vi, at indsatsen med kollagen alene stadig havde et fladt udseende kombineret med forekomsten af bobler i gelen. Skær med fibrinogen produceret en fuld og afrundet gel, så gjorde indsatsen med kombinationen af kollagen og fibrinogen. Efter krydsforbindelse ved 37 °C i 60 minutter var alle geler fastgjort til indsatsen og forblev fastgjort efter nattens inkubation ved 37 °C.
Figur 7: Virkningen af kombinationen af kollagen og fibrinogen. (A) Kollagen 4 mg/mL seedet på skær til venstre, fibrinogen 20 mg/mL seedet på skær i midten og kollagen 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL (1:1 ration) seedet på skær til højre. Alle geler, der var seedet i et volumen på 200 μL indeholdende 1,0 x10 5 celler/mL, alle geler blev krydsblinket i 60 minutter ved 37 °C. (B) Kollagen 4 mg/mL 60 min efter crosslinking, gelen optrådte fladt og havde bobler. (C) Sæt på venstre fibrinogen 20 mg/mL, gelen fremstår afrundet, ingen bobler til stede, indsæt på højre kollagen 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel, gelen er godt afrundet uden bobler. (D) Kollagen 4 mg/mL gel efter at være blevet holdt natten over ved 37 °C, gel stadig indeholdt en stor mængde bobler, nogle hævelse af gelen har fundet sted. (E) Fibrinogen 20 mg/mL, der opbevares natten over ved 37 °C (F) Kollagen 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel, der opbevares natten over ved 37 °C. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Bestemmelse af cellesåningstæthed
På grundlag af de tidligere erfaringer med at arbejde med hydrogels blev der sat et eksperiment op til bestemmelse af den optimale cellesåningstæthed (data vist ikke)37. Celler blev indlejret i en kombination af kollagen og fibrinogen i følgende koncentrationsområde (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106, 1,5 x 106 og 2,0 x 106 celler/mL), blev det konstateret, at 2,0 x10 6 celler/mL var den optimale såfylde.
Reologi
Ti formuleringer af kombinationerne fibrinogen og kollagenhydrogel blev evalueret ved hjælp af reologi, se tabel 2. Målet var at afgøre, hvilke af disse formuleringer kunne efterligne leverstivhed set under udviklingen af HCC. Litteraturen gav kendte leverstivhedsværdier for rotter, mus og mennesker under fibrose, skrumpelever og HCC, og målet var at komme så tæt som muligt på disse værdier28,29,30,31,32. De ti formuleringer, der er anført i tabel 2, er udarbejdet i tre eksemplarer, og hver enkelt oplagringsmåde er blevet bestemt ved hjælp af et reometer, hvilket fremgår af figur 8.
| Formulering | Fibrinogen (mg/ml) | Kollagen (mg/ml) |
| 1 | 60 | 2 |
| 2 | 50 | 2 |
| 3 | 40 | 2 |
| 4 | 30 | 2 |
| 5 | 20 | 2 |
| 6 | 10 | 2 |
| 7 | 20 | 5 |
| 8 | 20 | 4 |
| 9 | 20 | 3 |
| 10 | 20 | 1 |
Tabel 2: Kollagen- og fibrinogenkombinationer i forskellige koncentrationer evalueret med rheologi for at bestemme stivhedsværdier
Figur 8: Hydrogel stivhedsværdier for kollagen- og fibrinogenkombinationer i forskellige koncentrationer evalueret med rheologi. Lagringsmodulus og tabsmodulus blev bestemt til 37 °C og 1Hz ved hjælp af et Discovery HR-2 Hybrid Rheometer (n = 3, Fejllinjer = SD). Klik her for at se en større version af dette tal.
Fra disse ti formler blev tre valgt til at fortsætte med. Disse omfattede 2 mg/mL kollagentype I og 10 mg/mL fibrinogen svarende til leverstivhedsværdier ved fibrosede, 2 mg/mL kollagentype I og 30 mg/mL fibrinogen svarende til skrumpelever og 2 mg/mL kollagentype I og 40 mg/mL fibrinogen svarende til HCC, se figur 9.
Figur 9: Hydrogel stivhed værdier for forskellige Fibrinogen / Kollagen hydrogel formuleringer valgt at fortsætte med. Lagringsmodulus og tabsmodulus blev bestemt ved 37 °C og 1 Hz (n = 3, Fejllinjer = SD). Klik her for at se en større version af dette tal.
Levedygtighed, lægemiddelrespons og metastatisk potentiale
Resultaterne fra AlamarBlue-analysen viste en samlet reduceret celleygtighed inden for 2D-cokulturen, lavere end forventet baseret på de kendte rapporterede IC 25-, 50- og 75-værdier sammenlignet med den ubehandlede kontrol, se figur 10. Dette kan tilskrives LX2 celler i vores co-kultur, der er mere følsomme over for Doxorubicin behandling. Men i vores 3D-model bemærkede vi og stigning i doxorubicin modstand, bekræfter faldet i kemoterapeutiske potentiale ofte ses i 3D-model systemer. Statistisk signifikans i forhold til kontroller blev vurderet ved hjælp af Student T-testen (tosidet), hvor P<0,05 blev anset for signifikant.
Figur 10: En 2D-cokulturmodels celleygtighed i procent sammenlignet med 3D-modellen efter behandling med Doxorubicin i forskellige koncentrationer i en periode på 72 timer. Resultaterne normaliseres i forhold til det ubehandlede kontrolelement (n=3, fejllinjer = SD) (* = p<0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Gelkonstruktionerne blev visuelt inspiceret dagligt ved hjælp af et let mikroskop for at følge cellevækst inden for forskellige koncentrationer af hydrogelerne. Celler fyldte hydrogelerne på en homogen og kompakt måde, fra dag 7 begyndte sfæroider at samle sig inden for matrixen.
Discussion
I denne protokol beskrives udviklingen af en metode til oprettelse af en biomimetisk model til HCC. Der er etableret en klar arbejdsgang, og de kritiske trin, der er involveret, er identificeret. Disse kritiske trin omfatter forberedelse af fibrinogenbestandsopløsningen, belægning af indsatserne med kollagen og såning af cellerne indlejret i hydrogelen. Under forberedelsen af fibrinogenbestandsopløsningen er det vigtigt at tilføje fibrinogen i mindre trin ved højere koncentrationer. Dette vil ikke blot reducere den tid, det tager for fibrinogen at opløse, men vil også forhindre fibrinogen i at gelere inkonsekvent og for tidligt som det ses i figur 11. Forberedelsen af fibrinogengelen tager lang tid, og dette kan påvirke den samlede eksperimentelle succes. Resultaterne viser, at når fibrinogen gel begynder at gel inkonsekvent er det bedst at kassere det. Indsatserne skal belægges med kollagen, vaskes med PBS og tørres i laminar flow hætten, før såning cellerne indlejret i hydrogels. Hvis det ikke sikres, at indsatsen er tør, vil hydrogelerne løbe ud over skærets kanter, hvilket resulterer i en ujævn gel. Ujævnhed af gelen vil i sidste ende påvirke resultaterne, hvor diffusion er en faktor.
Figur 11: Fremstilling af fibrinogengel til fibrinogen/kollagenhydrogelformuleringer. (A) Fibrinogen gelopløsning, der har dannet klumper og begyndte at gel for tidligt med uopløst fibrinogen klæber til røret. (B) Fibrinogen gelopløsning, der er opløst fuldstændigt, opløsningen er klar og lidt mere tyktflydende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det anbefales at arbejde så hurtigt som muligt, mens du sår hydrogelcelleaffjedringen på indsatserne, da fibrinogenkomponenten begynder at krydse med tilsætningen af thrombin. Forbered mindre arbejdsvolumener på et tidspunkt, hvor der arbejdes med gelaffjedringer ved højere koncentrationer for at forhindre gelen i at krydslinke under såning. Sidstnævnte vil have en effekt på fordelingen og mængden af gel seedet på hver brønd. Rækkefølgen af tilføjelse af komponenterne er kritisk, i denne protokol leverede vi en strømlinet arbejdsgang for at forhindre geler i at krydslinke for tidligt. På grund af viskositeten af hydrogelgelgelaffjedringen anbefales det at arbejde med en skåret pipettespids under blanding og måling. Ved blanding af suspensionen sikre, at dette gøres hurtigt og jævnt for at skabe en homogen suspension. Ujævn blanding vil resultere i en heterogen gel, som vil påvirke resultaterne negativt, se figur 12.
Figur 12: Kollagen/fibrinogen geler seedet på 12 brøndplader. Alle geler, der er seedet i et volumen på 200 μL, der indeholder 2 mg/mL kollagen og 20 mg/mL Fibrinogen med 2,0 x 106 celler/mL. (A) Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ujævn fordeling af hydrogelerne. (B) Hydrogels homogent blandet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter protokoloptimeringen blev modellen evalueret for at bestemme modellernes bio-fysiske egenskaber. Rheologidata viste, at vores model, der består af fysiologisk relevante ekstracellulære matrixkomponenter, nemlig kollagentype I og fibrinogen, var i stand til at efterligne de bio-fysiske egenskaber ved en fibrotisk, cirrhotisk og HCC-lever28,29,30,31,32. Rekapitulere leverstivhed i 3D-modeller for HCC er af stor betydning og overses ofte under modeludvikling. Øget leverstivhed er relateret til kemoterapeutisk resistens, spredning, migration og dvale inden for I HCC38. Mens aktiveringen af lever stellate celler i HCC er forbundet med øget ekstracellulær matrix stivhed, med flere signalering veje forbundet med disse lever stjernernes celler viser mekanosensitivitet39.
Inddragelsen af stroma associerede celler såsom lever stellate celler og endotelcelle i udviklingen af 3D-modeller til HCC er blevet mere og mere relevant. Undersøgelser viser, at multicellulære sfæroider bestående af lever stellate og HCC celler resulterede i øget kemoterapeutisk resistens og invasiv migration, mens efterligne HCC tumor udseende in vivo, sammenlignet med en PXT mus model og humane HCC vævsprøver17. En lignende undersøgelse foretaget af Jung et al., 2017 fandt multicellulære sfæroide bestående af hepatocellulær carcinom (Huh-7) og endotelceller (HUVEC) fremmet vaskularisering og aggressivitet22. Disse sfæroider viste levedygtighed ved betydeligt højere koncentrationer af doxorubicin og sorafenib sammenlignet med Huh-7 monokultur sfæroider22. Evalueringen af vores models levedygtighed og reaktion på doxorubicin, med stivhedsværdier svarende til HCC's og inddragelsen af stromarelaterede celler (LX2 og HUVEC), viste et lignende faldt som reaktion på kemoterapeutik sammenlignet med en 2D-cokulturmodel. Således effektivt efterligne resistens over for lægemidler typisk ses hos patienter og andre 3D HCC modeller.
Da dette er et modulært system modellen kan befæstes ved tilsætning af andre ekstracellulære matrix komponenter nemlig, laminin og hyaluronsyre. Alternativt kan de nuværende hydrogeler, der anvendes inden for denne model, erstattes af syntetiske hydrogeler som natriumalginat eller chitosan. Yderligere ændringer af den nuværende model kan være udskiftning af cellelinjerne med primære cellekulturer for at producere en endnu mere fysiologisk relevant model eller ved hjælp af kombinationer af andre tumor- og stromalcellelinjer.
Vi har således med succes udviklet en 3D-model med tunable bio-fysiske egenskaber til at studere tumor-stroma interaktioner i HCC. Vi har fundet vores model til at være mere repræsentativ for in vivo situationen i forhold til traditionelle 2D kulturer som reaktion på doxorubicin. Der er dog stadig meget at gøre, vi håber at kunne karakterisere denne model udførligt og udforske modellen som en mulig metastatisk platform til at besvare mere komplekse og presserende spørgsmål, der forbliver i undersøgelsen HCC.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret gennem tilskud fra Kræftfonden, Can2017/518, det svenske selskab for medicinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons fonden og Olga Jönssons fonden. Disse finansieringskilder var ikke involveret i udformningen af undersøgelsen; indsamling, analyse og fortolkning af data udarbejdelse af rapporten og i beslutningen om at forelægge artiklen til offentliggørelse. 3D-print af specialdesignede afstandsstykke, der anvendes i denne protokol blev udført på U-PRINT: Uppsala University's 3D-print facilitet på disciplinære domæne medicin og apotek, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vil gerne takke Paul O'Callaghan for hans værdifulde input til vores projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
| Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
| CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
| Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
| Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
| Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
| Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
| Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
| Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
| Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
| Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
| Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
| Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
| TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
| TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
| Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |
References
- Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
- Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
- Balogh, J., et al.
- Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
- Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
- Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
- Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
- Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
- Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
- Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
- Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
- Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
- Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
- Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
- Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
- Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
- Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
- Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
- Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
- Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
- Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
- Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
- Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
- Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
- Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
- Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).
