Summary
Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.
Abstract
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is een primaire levertumor die zich ontwikkelt in het kielzog van chronische leverziekte. Chronische leverziekte en ontsteking leidt tot een fibrotische omgeving die hepatocarcinogenese actief ondersteunt en aans drijft. Inzicht in hepatocarcinogenese in termen van het samenspel tussen de tumor stroma micro-omgeving en tumorcellen is dus van groot belang. Driedimensionale (3D) celkweekmodellen worden voorgesteld als de ontbrekende schakel tussen de huidige in vitro 2D-celkweekmodellen en in vivo diermodellen. Ons doel was om een nieuw 3D biomimetisch HCC-model te ontwerpen met bijbehorend fibroom stromaal compartiment en vasculatuur. Fysiologisch relevante hydrogels zoals collageen en fibrinogeen werden opgenomen om de bio-fysische eigenschappen van de tumor ECM na te bootsen. In dit model werden LX2- en HepG2-cellen ingebed in een hydrogelmatrix gezaaid op de omgekeerde transmembrane-insert. HUVEC-cellen werden vervolgens aan de andere kant van het membraan gezaaid. Drie formuleringen bestaande uit ECM-hydrogels ingebed met cellen werden bereid en de biofysische eigenschappen werden bepaald door de reologie. De levensvatbaarheid van de cel werd bepaald door een cel levensvatbaarheidstest gedurende 21 dagen. Het effect van het chemotherapeutische medicijn doxorubicine werd geëvalueerd in zowel 2D-cocultuur als ons 3D-model gedurende een periode van 72 uur. Rheologie resultaten tonen aan dat bio-fysische eigenschappen van een fibrotische, cirrhotic en HCC lever met succes kunnen worden nagebootst. Over het algemeen geven de resultaten aan dat dit 3D-model representatiever is voor de in vivo situatie in vergelijking met traditionele 2D-culturen. Ons 3D-tumormodel toonde een verminderde respons op chemotherapie, wat de resistentie van geneesmiddelen nabootste die meestal wordt gezien bij HCC-patiënten.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) omvat 90% van alle primaire leverkankers1,2. Met 810.000 sterfgevallen en 854.000 nieuwe gevallen die jaarlijks worden gemeld, wordt het momenteel gerangschikt als de vijfde meest voorkomende kanker wereldwijd met een van de hoogste incidenties vanmortaliteit 1. De ontwikkeling van HCC wordt voornamelijk toegeschreven aan ontstekingen geassocieerd met chronische leverziekten, namelijk virale hepatitis, chronische overmatige alcoholinname, metabool syndroom, obesitas en diabetes1,3,4. De ontsteking geassocieerd met deze pathologische aandoeningen resulteert in hepatocytenletsel en afscheiding van verschillende cytokinen die lever stellate cellen en ontstekingscellen activeren en rekruteren om fibrose te initiëren5. Lever stellate cellen staan bekend om hun sleutelrol in de initiatie, progressie en regressie van leverfibrose. Bij activering onderscheiden ze zich in myofibroblastachtige cellen met contractiele, pro-inflammatoire en pro-fibrinogene eigenschappen6,7,8. De resulterende fibrose veroorzaakt op zijn beurt de dysregulatie van de activiteit van extracellulaire matrixremodelleringsenzym, waardoor een omgeving ontstaat die wordt gekenmerkt door een algehele verhoogde stijfheid vergezeld van de afscheiding van groeifactoren, wat verder bijdraagt aan HCC pathogenese9,10. Het is deze continue pathogene feedbacklus tussen hepatocyten en de stromale omgeving, die kankerinitiatie, epitheel tot mesenchymale overgangen (EMT), angiogenese, gemetastaseerd potentieel en veranderde geneesmiddelrespons11,12,13voedt. Inzicht in hepatocarcinogenese in termen van het samenspel tussen de tumor en de micro-omgeving van de tumor is daarom van groot belang, niet alleen vanuit een mechanistisch, maar ook vanuit een behandelperspectief.
Tweedimensionale (2D) in vitro celkweekmodellen worden voornamelijk gebruikt door 80% van de kankercelbiologen14. Deze modellen zijn echter niet representatief voor de echte tumormicromilieu, die chemotherapeutische reactiesbeïnvloedt 14,15,16. Momenteel faalt 96% van de chemotherapeutische geneesmiddelen tijdens klinische studies14. Deze hoge incidentie in de attritiepercentages van geneesmiddelen kan worden toegeschreven aan het feit dat beschikbare in vitro prescreeningmodellen niet volledig ons huidige inzicht en begrip van HCC-complexiteit en het micromilieuvertegenwoordigen 16. Omgekeerd vertonen in vivo diermodellen een aangetast immuunsysteem en discrepanties in interacties tussen de tumor en het micromilieu in vergelijking met de mens16,17. Gemiddeld kan slechts 8% van de resultaten uit dierproeven betrouwbaar worden vertaald van preklinisch naar klinisch16,17. Daarom is het duidelijk dat de evaluatie van HCC de ontwikkeling vereist van een in vitro platform dat effectief de complexiteit van niet alleen de tumor, maar ook het micromilieu samenvat. De platforms zouden een aanvulling vormen op de momenteel beschikbare in vitro preklinische screeningmodellen en de hoeveelheid dierstudies in de toekomst verminderen7,14.
Een dergelijk platform zijn geavanceerde driedimensionale (3D) celcultuurmodellen. Een veelheid van deze geavanceerde 3D-modellen om HCC te bestuderen zijn de afgelopen tien jaar naar voren gekomen en er zijn verschillende beoordelingen gepubliceerd. Beschikbare 3D-modellen om HCC te bestuderen zijn meercellige sferoïden, organoïden, steigermodellen, hydrogels, microfluïdica en bioprinten. Hiervan zijn meercellige sferoïden een van de bekendste modellen die worden gebruikt bij de studie van tumorontwikkeling. Sferoïden zijn een goedkoop model met lage technische moeilijkheidsgraad en bootsen tegelijkertijd effectief in vivo tumorarchitectuur18,19,20na. Meercellige sferoïden hebben bijgedragen tot een schat aan informatie over HCC17,21,22. Gestandaardiseerde cultuurtijd ontbreekt echter omdat meercellige sferoïden tussen 7 en 48 dagen in cultuur worden gehouden. Meer cultuurtijd is van groot belang. Eilenberger stelde vast dat de verschillen in sferoïde leeftijd de diffusiviteit entoxiciteitvan Sorafenib (een kinaseremmer die wordt gebruikt voor de behandeling van leverkanker) diepgaand beïnvloedt. Terwijl Wrzesinski en Fey ontdekten dat 3D-hepatocytenferoïden 18 dagen nodig hebben om belangrijke fysiologische leverfuncties na trypsinisatie te herstellen en de stabiele functionaliteit tot 24 dagen na dit herstel blijven vertonen24,25.
Enkele van de meer geavanceerde 3D HCC-modellen omvatten het gebruik van menselijke gedecellulariseerde leversteigers en bio-geprinte steigers. Mazza en collega's creëerden een natuurlijke 3D-steiger voor HCC-modellering met behulp van gedecellulariseerde menselijke levers die niet geschikt zijn voor transplantatie26. Deze natuurlijke steigers konden met succes gedurende 21 dagen opnieuw worden bevolkt met een co-cultuur van lever stellate en hepatoblastoomcellen, met behoud van de expressie van belangrijke extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen type I, III, IV en fibronectine. Afgezien van ziektemodellering biedt dit model ook het voordeel van functionele orgaantransplantatie en preklinische geneesmiddelen- en toxiciteitsscreening26. Met de vooruitgang in 3D bioprinten kunnen 3D extracellulaire matrixsteigers nu ook bioprinten. Ma en collega's, bio-geprinte extracellulaire matrix steigers met variabele mechanische eigenschappen en biomimetische microarchitectuur met behulp van hydrogels engineer van gedecellulariseerde extracellulaire matrix27. Ongetwijfeld zijn dit allemaal uitstekende 3D HCC-modellen. Echter, onbeschikbaarheid van menselijke levers en de kosten die gepaard gaan met het verwerven van de benodigde apparatuur en materialen plaatst deze modellen in het nadeel. Bovendien zijn deze methoden allemaal technisch geavanceerd en vereisen ze uitgebreide training die mogelijk niet direct beschikbaar is voor alle onderzoekers.
Op basis van de complexiteit van HCC en de momenteel beschikbare 3D-modellen hebben we geprobeerd een allesomvattend 3D HCC-model te ontwikkelen. We streefden naar een model dat zowel de premalignant- als tumormicromilieu kan herkapitaliseren door instelbare hydrogelstijfheidswaarden op te nemen. Verder hebben we ook hepatocellulaire en stroma geassocieerde cellijnen opgenomen, die een sleutelrol spelen in de pathogenese van HCC. Deze omvatten endotheelcellen, lever stellate cellen en kwaadaardige hepatocyten, gekweekt in een micromilieu bestaande uit fysiologisch relevante hydrogels. Met de gekozen hydrogels, collageen type I en fibrinogeen, opgenomen in verhoudingen vergelijkbaar met bio-fysieke veranderingen gezien in leverstijfheid tijdens de initiatie en progressie van HCC. Daarnaast streefden we naar een model dat voor langere tijd in de cultuur gehouden kon worden. We bedachten een modulair, kosteneffectief model dat kan worden opgezet met basisuitrusting, minimale training en ervaring en direct beschikbare materialen.
Protocol
Figuur 1: Grafische afbeeldingen van de creatie van het 3D biomimetische HCC model Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: De algemene workflow van dit protocol is uiteengezet in de illustraties van figuur 1
1. Bereiding van fibrinogeen voorraadoplossing
- Bereid een 1 M calciumchloride (CaCl2) bouillonoplossing voor door 2,21 g CaCl2 te wegen en toe te voegen aan gedestilleerd water van 20 ml (dH2O). Voorraadoplossing kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT).
- Bereid een 20 ml aprotinine-voorraadoplossing (1218,75 KIU/ml) voor door 5 mg aprotinine te wegen en toe te voegen aan 20 ml dH2O. Aliquot-voorraadoplossing in 1 ml aliquots en bewaren bij -20 °C.
- Bereid een voorraadoplossing van 10 ml 80 mg/ml fibrinogeen.
- Voeg in een buis van 50 ml 7,849 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe, 2.051 ml aprotininevoorraad (1218,75 KIU/ml) voor een uiteindelijke aprotinineconcentratie van 250 KIU/ml en 100 μL CaCl2 (1M) voor een uiteindelijke CaCl2-concentratie van 10 mM.
- Weeg 800 mg fibrinogeen.
- Weeg 200 mg natriumchloride (NaCl) af om de stamoplossing 2% w/v NaCl te laten bevatten.
- Voeg het fibrinogeen en de NaCl in stappen toe aan de buis van 50 ml met pbs, aprotinine en CaCl2. Roer of schud niet krachtig, want dit zal resulteren in fibrinogeengeling en klonten die zich in de oplossing vormen.
- Plaats de 50 ml buis van de fibrinogeen bouillonoplossing horizontaal op een shaker en schud bij een lage stand van 300 tpm.
- Zodra de oplossing is opgelost, filtert u deze met een spuitfilter van 0,22 μm of een flessentopfilter, afhankelijk van het volume. Belangrijk is dat u de fibrinogeenoplossing niet autoclaveren, omdat dit het fibrinogeen zal vernietigen.
OPMERKING: Dit deel van het protocol kan tussen 2 en 5 uur duren, afhankelijk van de hoeveelheid voorraadoplossing, deze keer moet rekening worden gehouden tijdens de experimentele installatie.
2. Coating inzetstukken met collageen voordat de hydrogels op de inserts worden gezaaid
- Verwijder in een laminaire stroomkap of een weefselkweekkap met een gesteriliseerd pincet inserts van de plaat en plaats omgekeerd op het deksel van de plaat.
- Bereid een 100 ml glaciaal azijnzuuroplossing van 20 mM door 115 μL glaciaal azijnzuur toe te voegen aan 25 ml dH2O en pas aan op een eindvolume van 100 ml met dH2O. Filter de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm. Voorraadoplossing kan worden opgeslagen bij RT.
- Bereid 2 ml van een collageenoplossing van 100 μg/ml uit een collageenoplossing van 5 mg/ml door 40 μL van de 5 mg/ml collageenoplossing toe te voegen aan 1,960 ml van de 20 mM glaciale azijnzuurvoorraadoplossing bereid in 2,2.
- Bedek de inserts met de 100 μg/ml collageenoplossing bereid in 2.3 door 100 μL van de oplossing op elke insert te pipetten. Laat het inbrengen van de lucht gedurende 2 tot 3 uur drogen in de laminaire stroomkap of weefselkweekkap.
- Zodra de inzetstukken zijn gedroogd, wast u elk inzetstuk 3x met PBS. Voeg 1 ml PBS toe aan elke put van een plaat met 12 putten, plaats de inzetstukken met collageencoating naar beneden in de putten, verwijder PBS uit de put en herhaal de procedure. Laat de plaatsen 1 tot 2 uur aan de laminaire afzuigkap drogen.
LET OP: Azijnzuur is giftig voor cellen en inserts moeten grondig worden gewassen met PBS. - Voeg een aangepaste 3D-geprinte afstandsruimte over de inzetstukken toe, dit is nodig zodra de gels aan het inzetstuk hangen om te voorkomen dat ze de bodemput van de plaat raken (figuur 2).
Figuur 2: Aangepaste 3D-geprinte afstandsruimte Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bedek de omgekeerde wisselplaten met het onderste deel van de plaat en plaats ze in de incubator totdat cellen in de hydrogels zijn ingebed en klaar zijn om te worden gezaaid.
3. Zaaicellen ingebed in hydrogels op inserts
OPMERKING: Tabel 1 geeft een beschrijving van 3 formuleringen met verschillende concentraties fibrinogeen die zullen worden bereid. Formulering één komt overeen met de lever tijdens het begin van fibrose, twee cirrose en drie HCC, de stijfheidswaarden voor elk van deze formuleringen werden bepaald met reologie tijdens de protocoloptimalisatie.
| Formulering | Uiteindelijke Fibrinogeenconcentratie (mg/ml) | Uiteindelijke collageenconcentratie (mg/ml) | Cellen (LX2 + HepG2 Co-cultuur 1:1) | Stadium van de lever | Literatuur leverstijfheidswaarden (kPa) | Model Stijfheidswaarde van Rheology (kPa) | Formulering | Fibrinogeen toe te voegen (ml) | Collageen toe te voegen (ml) | 10 % DMEM (ml) | Trombine (μL) | Referenties |
| 1 | 10 | 2 | 2 x 106 cellen/ml | Fibrose | ≥2 | 3 | 1 | 1 | 0.8 | 0.2 | 4 | 28; 29; 30 |
| 2 | 30 | 2 | 2 x 106 cellen/ml | Cirrose | 6 | 2 | 0.75 | 0.8 | 0.45 | 3 | ||
| 3 | 40 | 2 | 2 x 106 cellen/ml | Hcc | ≥10 | 10 | 3 | 0.25 | 0.8 | 0.95 | 1 | 28; 31; 32 |
Tabel 1: Beschrijving van formuleringen voor zaaicellen ingebed in hydrogels op wisselplaten
- Bereid 1 M natriumhydroxidevoorraadoplossing door 3,99 g NaOH toe te voegen aan 100 ml dH2O. De oplossing kan vervolgens worden gefilterd met een spuitfilter van 0,22 μm. Bewaar de voorraadoplossing bij RT.
- Plaats het collageen van 5 mg/ml en 10 ml van 1 M NaOH op ijs.
- Verwarm 50 ml PBS, 15 ml trypsine, 70 ml 10% DMEM en fibrinogeenvoorraadoplossing, bereid in sectie 1, voor op 37 °C gedurende 20 minuten in een waterbad.
- Bereid de celsuspensies voor.
- Was lever stellate cellen (LX2) en levercarcinoom (HepG2) cellen in T175 kweekkolven tweemaal met 10 ml PBS.
- Probeer cellen met 6 ml trypsine gedurende 4 minuten bij 37 °C.
- Activeer trypsine met 6 ml van 10% DMEM.
- Verzamel de celsuspensie in 15 ml buis en centrifugeer gedurende 3 min bij 300 x g.
- Na centrifugatie, aspirateer de supernatant en resuspend elke cellijn in 5 ml van 10% DMEM.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller: Voeg 10 μL van elke celophanging toe aan de dia van de telkamer en plaats de dia in de celteller. Het aantal cellen wordt weergegeven als cellen/ml.
- Verdun de cellen van elke cellijn tot 1 x 106 cellen per ml met behulp van het aantal cellen in stap 3.4.6 in duidelijk gemarkeerde buizen van 15 ml. Centrifugeer de verdunningen gedurende 3 min bij 300 x g.
- Na centrifugatie, aspirateer de supernatant en voeg 10% DMEM toe aan elke 15 ml buis volgens tabel 1,waarden in de tabel is voor 2 ml van elke formulering.
- Neutraliseer de hoeveelheid collageen met 10 μL/ml NaOH (1 M) en voeg het geneutraliseerde collageen toe aan de celsuspensie, de aanwezige 10% DMEM wordt geel, zodra de suspensie grondig wordt gemengd door met een gesneden punt te pipetten, wordt het felroze.
- Voeg fibrinogeen toe aan de collageencelsuspensie volgens tabel 1, meng met behulp van een gesneden pipettip de suspensie grondig.
- Voeg ten slotte trombine toe aan collageen-fibrinogeencelsuspensie, 0,1 KIU-trombine voor elke 10 mg fibrinogeen.
- Verwijder de voorgecoate omgekeerde inzetstukken die in deel 2 zijn voorbereid uit de incubator en gebruik een gesneden pipettip van 200 μL, pipet 200 μL van de voorbereide suspensie op de daarvoor bestemde inzetstukken. Laat de gels 15 minuten kruisen in de laminaire stroomkap.
- Plaats na 15 minuten voorzichtig het onderste gedeelte van de plaat over de gels en verplaats ze naar de incubator om de gels gedurende 45 minuten bij 37 °C te laten kruisen.
- Zodra de gels zijn gekruist, keert u de inzetstukken opnieuw om en voegt u 2 ml van 10% DMEM toe aan elk van de onderste putten van de plaat.
4. Endotheelcellen zaaien
- Verwarm 25 ml hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 10 ml trypsine, 10 ml trypsineremmer en 50 ml endotheelgroeimedium voor 20 minuten in een waterbad tot 37 °C.
- Bereid de endotheelcelsuspensie (HUVEC) voor.
- Was HUVEC-cellen in T175-kweekkolven tweemaal met 10 ml HBSS.
- Probeer cellen met 6 ml trypsine gedurende 4 minuten bij 37 °C. Inactiveer trypsine met 6 ml trypsineremmer. Verzamel de celsuspensie in 15 ml buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g.
- Na centrifugatie aspirateer de supernatant en schortel de cellen in 5 ml endotheel groeimedium.
- Tel de cellen zoals eerder beschreven in 3.4.6 met behulp van een geautomatiseerde celteller.
- Bereid met behulp van het aantal cellen uit de celteller de zaaidichtheid van 1,0 x 104 cellen/ml voor in het endotheelgroeimedium.
- Zaad 500 μL van de HUVEC celsuspensie in elke put van het bovenste deel van de insert om een eindvolume van 5,0 x 103 cellen per insert te hebben.
5. Onderhoud
- Vervang het groeimedium elke tweede dag, aspirate besteed groeimedium van zowel de put als de insert. Voeg 2 ml 10% DMEM toe aan de putten die de gel en 0,5 ml endotheelgroeimedium bevatten aan de inserts die de HUVEC-cellen bevatten.
- Onderhoud het model gedurende 21 dagen voorafgaand aan het experiment.
6. Reologie
- Meet opslagmoduli van gelformuleringen om stijfheidswaarden aan te geven met behulp van een rijmmeter, door frequentiecontroles uit te voeren van 0,1-20 Hz bij 0,267% en 37 °C, met een constante axiale kracht van 0,1N met behulp van een parallelplaat roestvrijstalen geometrie met een diameter van 8 mm.
7. Levensvatbaarheid en respons op geneesmiddelen
- Bepaal de respons en levensvatbaarheid van geneesmiddelen in 2D-coculturen en 3D-model.
- Zaad HepG2 (5,0 x 103 cellen/ml) en LX2 (5,0 x 103 cellen/ml) cellen in een verhouding van 1:1 voor de 2D-co-cultuur in een zwarte heldere bodem 96-put platen bij een zaaidichtheid van 1,0 x 104 cellen/ml. Laat cellen 's nachts hechten.
- Stel het 3D-model in op een cirrhotische omgeving met een stijfheidswaarde van 6 kPa. Onderhoud het model gedurende 21 dagen voorafgaand aan de behandeling met Doxorubicine.
- Twee uur voor de behandeling met doxorubicine, aspirateer het kweekmedium van zowel het 2D- als het 3D-model. Was beide modellen twee keer met PBS. Voeg het hongermedium (DMEM aangevuld met 1% v/v antimycotische antibioticumoplossing) toe aan de 2D-cocultuur (200 μL per put) en aan het 3D-model (2 ml aan de putten met de hydrogel en 500 μL aan het inzetstuk).
- Dien doxorubicine toe aan zowel het 2D- als het 3D-model. Doseringen zijn als volgt: 0,5, 1 en 1,5 mM overeenkomend met de IC25, 50 en 75 waarden, respectievelijk. Behandel beide modellen gedurende 72 uur.
OPMERKING: Doxorubicine, een topoisomerase II-remmer, is een van de eerste chemotherapeutische geneesmiddelen die voor HCC worden gebruikt en is ook een van de meest actieve chemotherapeutische middelen bij de behandeling van HCC33,34. - Na 72 uur, aangezogen kweekmedium van zowel het 2D- als het 3D-model. Zorg ervoor dat het resterende kweekmedium wordt verwijderd door beide modellen twee keer te wassen met PBS.
- Bereid AlamarBlue voor volgens de aanbevelingen van de fabrikant en voeg toe aan de putten van het 2D- en 3D-model. Voeg 150 μL per put toe voor de 2D-cultuur en 2 ml per put en 500 μL per insert voor 3D-cultuur. 's Nachts geïncubeerd bij 37°C.
- Na incubatieoverdracht 150 μL van de AlamarBlue uit elke put van de 3D-opstelling in een zwarte heldere bodemplaat van 96 putten. AlamarBlue kan direct vanaf de plaat worden afgelezen voor het 2D-model.
- Lees de fluorescentie met een microplaatlezer bij excitatiegolflengte en emissiegolflengte van respectievelijk 485 en 550 nm.
- Bereken de levensvatbaarheid van de procentuele cel in beide modellen met behulp van de volgende formule:
Representative Results
Concentratiebereiken en zaaivolume
Protocoloptimalisatie om het uiteindelijke functionerende protocol te verkrijgen, vond plaats volgens het schematische diagram in figuur 3. Twee fysiologisch relevante hydrogels, Collageen type I en Fibrinogeen, werden geïdentificeerd door middel van een literatuuronderzoek35,36. Beginnend met rattenstaartcollageen type I, werd een reeks concentraties (4, 3, 2 en 1 mg/ml) op omgekeerde inserts gezaaid om hun vermogen te bepalen om zich met succes aan de insert te hechten zodra deze opnieuw was omgekeerd. Alle concentraties binnen dit bereik waren in staat om gels te vormen, maar collageengels leken afgeplat en hadden verschillende luchtbellen erin opgesloten vanwege hantering en pipetten, zie figuur 4 en figuur 5. Om het optimale zaaivolume te bepalen om de kwaliteit van de collageengel te verbeteren, werd een reeks zaaivolumes (100, 150 en 200 μL) op omgekeerde wisselplaten gezaaid, zie figuur 5. Het zaaivolume had geen invloed op het uiterlijk van de gel of de aanwezigheid van bubbels in de gel. Daarom werd besloten dat 200 μL het optimale zaaivolume was dat de volste gels produceerde. Fibrinogeen werd ook geëvalueerd op zijn vermogen om een gel te produceren die gedurende een langere periode aan een insert kon hechten. Een concentratiebereik (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) werd bereid en gezaaid met een volume van 200 μL op het deksel van een plaat met 12 putten, zie figuur 6. Binnen 20 minuten na het zaaien konden alle concentraties met succes een gel vormen. De concentraties 5 en 1 mg/ml werden echter uitgesloten omdat de gevormde gels een vloeistofachtige consistentie hadden en van het deksel waren losgekomen nadat ze 's nachts bij 37 °C waren bewaard.
Figuur 3: Schematisch diagram van protocoloptimalisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Collageengels 4 mg/ml met 1,0 x 105 cellen/ml gezaaid op inserts met bellen in de gel. Insert aan de linkerkant is ontgast op ijs gedurende 15 minuten, terwijl het inzetstuk aan de rechterkant niet is ontgast. Ontgassen had geen effect op de bubbels in de gels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Collageengels 4 mg/ml met 1,0 x 105 cellen/ml gezaaid op inserts in verschillende volumes. (A) Plaats aan de linkerkant 100 μL, midden 150 μL en rechts 200 μL, direct na het zaaien. Bubbels in de gels waren nog aanwezig. (B) Plaats aan de linkerkant 200 μL, midden 150 μL en rechts 100 μL, na 60 minuten crosslinken. Alle gels, ongeacht het volume, lijken nog steeds plat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fibrinogeen (200 μL) in een concentratiebereik van 70 tot 1 mg/ml gezaaid op het deksel van een plaat met 12 putten. (A) Gels direct na het zaaien. (B) Gels 20 minuten na het zaaien. (C) Gels 's nachts bewaard. Alle gels lijken goed afgerond, de gels van 5 mg/ml en 1 mg/ml waren uitgesloten omdat ze 20 minuten na het zaaien een meer vloeiende consistentie leken te hebben en na een nacht van het deksel waren losgekomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Combinatie collageen en fibrinogeen
Op basis van de resultaten van de collageen- en fibrinogeenconcentratie werd het effect van de combinatie van collageen en fibrinogeen geëvalueerd. Er werden drie inserts opgezet met het volgende, 4 mg/ml collageen, 20 mg/ml fibrinogeen en een 1:1 rantsoen collageen (4 mg/ml) en fibrinogeen (20 mg/ml), zie figuur 7. Direct na het zaaien van de hydrogels merkten we op dat de insert met collageen alleen nog een plat uiterlijk had in combinatie met het optreden van bubbels in de gel. De inserts met fibrinogeen produceerden een volle en afgeronde gel, net als de insert met de combinatie van collageen en fibrinogeen. Na kruiskoppeling bij 37 °C gedurende 60 minuten, waren alle gels aan het inzetstuk bevestigd en bleven bevestigd na nachtelijke incubatie bij 37 °C.
Figuur 7: Effect van de combinatie van collageen en fibrinogeen. (A) Collageen 4 mg/ml gezaaid op insert aan de linkerkant, fibrinogeen 20 mg/ml gezaaid op insert in het midden en collageen 4 mg/ml, fibrinogeen 20 mg/ml (1:1 rantsoen) gezaaid op insert aan de rechterkant. Alle gels gezaaid met een volume van 200 μL met 1,0 x 105 cellen/ml, alle gels werden gedurende 60 minuten gekruist bij 37 °C. (B) Collageen 4 mg/ml 60 minuten na crosslinking, gel leek plat en had bubbels. (C) Insert op de linker fibrinogeen 20 mg/ml, gel lijken afgerond, geen bubbels aanwezig, insert op het rechter collageen 4 mg/ml, fibrinogeen 20 mg/ml gel, gel is goed afgerond zonder bubbels. (D) Collageen 4 mg/ml gel na een nacht bij 37 °C te zijn bewaard, gel bevatte nog steeds een grote hoeveelheid bubbels, er is enige zwelling van de gel opgetreden. (E) Fibrinogeen 20 mg/ml 's nachts bewaard bij 37 °C. (F) Collageen 4 mg/ml, fibrinogeen 20 mg/ml gel 's nachts bewaard bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Celzaaidichtheid bepalen
Op basis van de eerdere ervaring met het werken met hydrogels werd een experiment opgezet om de optimale celzaaidichtheid te bepalen (gegevens niet getoond)37. Cellen werden ingebed in een combinatie van collageen en fibrinogeen in het volgende concentratiebereik (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106,1,5 x 106 en 2,0 x 106 cellen/ml), 2,0 x 106 cellen/ml bleek de optimale zaaidichtheid te zijn.
Reologie
Tien formuleringen van de combinaties fibrinogeen en collageenhydrogel werden geëvalueerd door middel van reologie, zie tabel 2. Het doel was om te bepalen welke van deze formuleringen leverstijfheid konden nabootsen die tijdens de ontwikkeling van HCC werd gezien. Literatuur leverde bekende leverstijfheidswaarden voor ratten, muizen en mensen tijdens fibrose, cirrose en HCC en het doel was om zo dicht mogelijk bij deze waarden te komen28,29,30,31,32. De tien formuleringen in tabel 2 werden in drievoud bereid en de opslagmodulus van elk werd bepaald met behulp van een reometer, resultaten weergegeven in figuur 8.
| Formulering | Fibrinogeen (mg/ml) | Collageen (mg/ml) |
| 1 | 60 | 2 |
| 2 | 50 | 2 |
| 3 | 40 | 2 |
| 4 | 30 | 2 |
| 5 | 20 | 2 |
| 6 | 10 | 2 |
| 7 | 20 | 5 |
| 8 | 20 | 4 |
| 9 | 20 | 3 |
| 10 | 20 | 1 |
Tabel 2: Collageen- en fibrinogeencombinaties in verschillende concentraties geëvalueerd met Rheology om stijfheidswaarden te bepalen
Figuur 8: Hydrogelstijfheidswaarden voor collageen- en fibrinogeencombinaties in verschillende concentraties geëvalueerd met rheologie. Opslagmodulus en verliesmodulus werden bepaald bij 37 °C en 1Hz door middel van een Discovery HR-2 Hybrid Rheometer (n = 3, Foutbalken = SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Uit deze tien formules werd drie gekozen om mee door te gaan. Deze omvatten 2 mg/ml collageen type I en 10 mg/ml fibrinogeen overeenkomend met de leverstijfheidswaarden bij het begin van fibrose, 2 mg/ml collageen type I en 30 mg/ml fibrinogeen overeenkomend met cirrose en 2 mg/ml collageen type I en 40 mg/ml fibrinogeen overeenkomend met HCC, zie figuur 9.
Figuur 9: Hydrogelstijfheidswaarden voor verschillende Fibrinogeen/Collageen hydrogel formuleringen gekozen om mee door te gaan. Opslagmodulus en verliesmodulus werden bepaald bij 37 °C en 1 Hz (n = 3, Foutbalken = SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Levensvatbaarheid, geneesmiddelrespons en gemetastaseerd potentieel
De resultaten van de AlamarBlue-test toonden een algehele verminderde levensvatbaarheid van cellen binnen de 2D-cocultuur, lager dan verwacht op basis van de bekende gerapporteerde IC 25-, 50- en 75-waarden, in vergelijking met de onbehandelde controle, zie figuur 10. Dit kan worden toegeschreven aan de LX2-cellen in onze co-cultuur die gevoeliger zijn voor doxorubicinebehandeling. In ons 3D-model merkten we echter en verhoogden we de doxorubicineresistentie, wat de afname van chemotherapeutisch potentieel bevestigt die vaak wordt gezien in 3D-modelsystemen. Statistische significantie in vergelijking met controles werd beoordeeld met behulp van de Student T-test (tweezijdig), waarbij P<0,05 als significant werd beschouwd.
Figuur 10: Percentage cel levensvatbaarheid van een 2D co-cultuur model in vergelijking met het 3D model na behandeling met Doxorubicine in verschillende concentraties gedurende een periode van 72h. Resultaten genormaliseerd ten opzichte van het onbehandelde besturingselement (n=3, foutbalken = SD) (* = p<0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gelconstructies werden dagelijks visueel geïnspecteerd met behulp van een lichtmicroscoop om de celgroei binnen verschillende concentraties van de hydrogels te volgen. Cellen vulden de hydrogels op een homogene en compacte manier, vanaf dag 7 begonnen sferoïden zich in de matrix te assembleren.
Discussion
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een methode om een biomimetisch model voor HCC te maken. Er is een duidelijke workflow tot stand gebracht en de betrokken kritieke stappen zijn geïdentificeerd. Deze kritieke stappen omvatten, voorbereiding van de fibrinogeen voorraadoplossing, het coaten van de inserts met collageen en het zaaien van de cellen die in de hydrogel zijn ingebracht. Tijdens de bereiding van de fibrinogeen stamoplossing is het belangrijk om het fibrinogeen in kleinere stappen bij hogere concentraties toe te voegen. Dit zal niet alleen de tijd verkorten die nodig is om het fibrinogeen op te lossen, maar zal ook voorkomen dat het fibrinogeen inconsistent en voortijdig geleert, zoals te zien is in figuur 11. De bereiding van de fibrinogeengel kost veel tijd en dit kan het algehele experimentele succes beïnvloeden. De resultaten geven aan dat zodra de fibrinogeengel inconsistent begint te gelen, het het beste is om het weg te gooien. De inzetstukken moeten worden bedekt met collageen, gewassen met PBS en gedroogd in de laminaire stroomkap voordat de cellen in hydrogels worden gezaaid. Als u er niet voor zorgt dat de wisselplaten droog zijn, zullen de hydrogels over de randen van het inzetstuk morsen, wat resulteert in een ongelijkmatige gel. Oneffenheden van de gel zullen uiteindelijk de resultaten beïnvloeden waar diffusie een factor is.
Figuur 11: Bereiding van fibrinogeengel voor fibrinogeen/collageenhydrogelformuleringen. (A) Fibrinogeengeloplossing die klonten heeft gevormd en voortijdig begon te geleren met onopgelost fibrinogeen dat zich aan de buis hechtte. (B) Fibrinogeen geloplossing die volledig is opgelost, oplossing is helder en iets stroperiger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het wordt aanbevolen om zo snel mogelijk te werken tijdens het zaaien van de hydrogelcelsuspensie op de inserts, omdat de fibrinogeencomponent begint te kruisen met de toevoeging van trombine. Bereid kleinere werkvolumes tegelijk voor bij het werken met gelsuspensies in hogere concentraties om te voorkomen dat de gel tijdens het zaaien kruist. Dit laatste heeft invloed op de verdeling en de hoeveelheid gel die op elke put wordt gezaaid. De volgorde van het toevoegen van de componenten is van cruciaal belang, in dit protocol hebben we een gestroomlijnde workflow geleverd om te voorkomen dat gels voortijdig crosslinken. Vanwege de viscositeit van de hydrogelgel wordt het werken met een gesneden pipettip geadviseerd tijdens het mengen en meten. Zorg er bij het mengen van de suspensie voor dat dit snel en gelijkmatig gebeurt om een homogene suspensie te creëren. Ongelijkmatig mengen zal resulteren in een heterogene gel die de resultaten negatief zal beïnvloeden, zie figuur 12.
Figuur 12: Collageen/fibrinogeen gels gezaaid op 12 putplaten. Alle gels gezaaid met een volume van 200 μL met 2mg/ml collageen en 20 mg/ml Fibrinogeen met 2,0 x 106 cellen/ml. (A) Hydrogelgel met heterogene consistentie, zichtbare ongelijkmatige verdeling van de hydrogels. (B) Hydrogels homogeen gemengd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na de protocoloptimalisatie werd het model geëvalueerd om de biofysische eigenschappen van de modellen te bepalen. Rheologiegegevens toonden aan dat ons model, samengesteld uit fysiologisch relevante extracellulaire matrixcomponenten, namelijk collageen type I en fibrinogeen, in staat was om de biofysische eigenschappen van een fibrotische, cirrhotische en HCC-lever na te bootsen28,29,30,31,32. Het samenvatten van leverstijfheid in 3D-modellen voor HCC is van groot belang en wordt vaak over het hoofd gezien tijdens de ontwikkeling van het model. Verhoogde leverstijfheid is gerelateerd aan chemotherapeutische resistentie, proliferatie, migratie en sluimerstand binnen in HCC38. Terwijl de activering van lever stellate cellen in HCC wordt geassocieerd met verhoogde extracellulaire matrix rigiditeit, met verschillende signaleringsroutes geassocieerd met deze lever stellate cellen die mechanosensitiviteittonen 39.
De opname van stroma geassocieerde cellen zoals lever stellate cellen en endotheelcel in de ontwikkeling van 3D-modellen voor HCC is steeds relevanter geworden. Studies tonen aan dat meercellige sferoïden bestaande uit lever stellate en HCC cellen resulteerden in verhoogde chemotherapeutische resistentie en invasieve migratie, terwijl het nabootsen van HCC tumor uiterlijk in vivo, in vergelijking met een PXT muizen model en menselijke HCC weefsel monsters17. Een vergelijkbare studie van Jung et al., 2017 vond meercellige sferoïde bestaande uit hepatocellulair carcinoom (Huh-7) en endotheel (HUVEC) cellen bevorderd vascularisatie en agressiviteit22. Deze sferoïden toonden levensvatbaarheid bij significant hogere concentraties doxorubicine en sorafenib in vergelijking met Huh-7 monocultuur sferoïden22. De evaluatie van de levensvatbaarheid en respons van ons model op doxorubicine, met stijfheidswaarden die overeenkomen met die van HCC en de opname van stroma-geassocieerde cellen (LX2 en HUVEC), vertoonde een vergelijkbare afname als reactie op chemotherapie in vergelijking met een 2D-cocultuurmodel. Dus effectief nabootsen van geneesmiddelresistentie meestal gezien bij patiënten en andere 3D HCC-modellen.
Omdat dit een modulair systeem is, kan het model worden versterkt door de toevoeging van andere extracellulaire matrixcomponenten, namelijk laminine en hyaluronzuur. Als alternatief kunnen de huidige hydrogels die binnen dit model worden gebruikt, worden vervangen door synthetische hydrogels zoals natriumalginaat of chitosan. Verdere wijzigingen in het huidige model kunnen de vervanging van de cellijnen door primaire celculturen zijn om een nog fysiologisch relevanter model te produceren of combinaties van andere tumor- en stromale cellijnen te gebruiken.
Zo hebben we met succes een 3D-model ontwikkeld met afstembare bio-fysische eigenschappen voor het bestuderen van tumor-stroma interacties in HCC. We hebben ontdekt dat ons model representatiever is voor de in vivo situatie in vergelijking met traditionele 2D-culturen als reactie op doxorubicine. Er is echter nog veel te doen, we hopen dit model uitgebreid te karakteriseren en het model te verkennen als een mogelijk gemetastaseerd platform om complexere en prangende vragen te beantwoorden die in de studie HCC blijven.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Zweedse Kankerstichting (Cancerfonden, CAN2017/518), de Zweedse vereniging voor medisch onderzoek (SSMF, S17-0092), de O.E. och Edla Johanssons foundation en de Olga Jönssons foundation. Deze financieringsbronnen waren niet betrokken bij het studieontwerp; verzameling, analyse en interpretatie van gegevens; het schrijven van het rapport; en in het besluit om het artikel ter publicatie voor te leggen. 3D-printen van op maat ontworpen afstandhouders die in dit protocol worden gebruikt, werd uitgevoerd bij U-PRINT: uppsala University's 3D-printing facility at the Disciplinary Domain of Medicine and Pharmacy, U-PRINT@mcb.uu.se. We willen Paul O'Callaghan bedanken voor zijn waardevolle inbreng in ons project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
| Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
| CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
| Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
| Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
| Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
| Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
| Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
| Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
| Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
| Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
| Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
| Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
| TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
| TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
| Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |
References
- Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
- Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
- Balogh, J., et al.
- Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
- Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
- Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
- Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
- Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
- Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
- Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
- Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
- Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
- Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
- Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
- Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
- Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
- Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
- Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
- Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
- Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
- Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
- Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
- Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
- Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
- Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
- Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).
