Summary
Denne protokollen presenterer en 3D biomimetisk modell med tilhørende fibrotisk stromal rom. Tilberedt med fysiologisk relevante hydrogeler i forhold som etterligner de biofysiske egenskapene til den stromale ekstracellulære matrisen, en aktiv mediator for cellulære interaksjoner, tumorvekst og metastase.
Abstract
Hepatocellulært karsinom (HCC) er en primær leversvulst som utvikler seg i kjølvannet av kronisk leversykdom. Kronisk leversykdom og betennelse fører til et fibrotisk miljø som aktivt støtter og driver hepatocarcinogenese. Innsikt i hepatocarcinogenese når det gjelder samspillet mellom tumors stroma mikromiljø og tumorceller er dermed av betydelig betydning. Tredimensjonale (3D) cellekulturmodeller foreslås som den manglende koblingen mellom dagens in vitro 2D-cellekulturmodeller og in vivo dyremodeller. Vårt mål var å designe en ny 3D biomimetisk HCC-modell med tilhørende fibrotisk stromalt rom og vaskulatur. Fysiologisk relevante hydrogeler som kollagen og fibrinogen ble innlemmet for å etterligne de biofysiske egenskapene til svulsten ECM. I denne modellen ble LX2- og HepG2-celler innebygd i en hydrogelmatrise seeded på den inverterte transmembraneinnsatsen. HUVEC-celler ble deretter sådd på motsatt side av membranen. Tre formuleringer bestående av ECM-hydrogeler innebygd med celler ble utarbeidet og de biofysiske egenskapene ble bestemt av revologi. Celle levedyktighet ble bestemt av en celle levedyktighet analyse over 21 dager. Effekten av det kjemoterapeutiske legemidlet doksorubicin ble evaluert i både 2D-co-kultur og vår 3D-modell i en periode på 72h. Reologi resultater viser at bio-fysiske egenskaper av en fibrotisk, cirrhotic og HCC leveren kan bli etterlignet. Samlet sett indikerer resultatene at denne 3D-modellen er mer representativ for in vivo-situasjonen sammenlignet med tradisjonelle 2D-kulturer. Vår 3D tumormodell viste en redusert respons på kjemoterapi, etterligner legemiddelresistens vanligvis sett hos HCC-pasienter.
Introduction
Hepatocellulært karsinom (HCC) utgjør 90% av alle primære leverkreft1,2. Med 810.000 dødsfall og 854.000 nye tilfeller rapportert årlig er det for tiden rangert som den femte vanligste kreften over hele verden med en av de høyeste forekomstene avdødelighet 1. Utviklingen av HCC er hovedsakelig tilskrevet betennelse forbundet med kroniske leversykdommer nemlig viral hepatitt, kronisk overdreven alkoholinntak, metabolsk syndrom, fedme og diabetes1,3,4. Betennelsen forbundet med disse patologiske forholdene resulterer i hepatocyteskade og sekresjon av ulike cytokiner som aktiverer og rekrutterer lever stellateceller og inflammatoriske celler for å initiere fibrose5. Lever stellate celler er kjent for sin nøkkelrolle i initiering, progresjon, og regresjon av leverfibrose. Ved aktivering skiller de seg til myofibroblast som celler med kontraktile, proinflammatoriske og pro-fibrinogeneegenskaper 6,7,8. Den resulterende fibrose i sin tur forårsaker dysregulering av ekstracellulær matrise remodeling enzymaktivitet, og skaper et miljø preget av en generell økt stivhet ledsaget av sekresjon av vekstfaktorer, noe som ytterligere bidrar til HCC patogenese9,10. Det er denne kontinuerlige patogene tilbakemeldingssløyfen mellom hepatocytter og detstromale miljøet, som driver kreftinitiering, epitel til mesenchymale overganger (EMT), angiogenese, metastatisk potensial og endret legemiddelrespons11,12,13. Innsikt i hepatocarcinogenese når det gjelder samspillet mellom svulsten og tumormikromiljøet er derfor av betydelig betydning, ikke bare fra et mekanistisk, men også fra et behandlingsperspektiv.
Todimensjonale (2D) in vitro celle kultur modeller er hovedsakelig brukt av 80% av kreftcellebiologer14. Disse modellene er imidlertid ikke representative for det sanne tumormikromiljøet, noe som påvirker kjemoterapeutiske responser14,15,16. For tiden svikter 96% av kjemoterapeutiske legemidler under kliniske studier14. Denne høye forekomsten i legemiddelatrisjonsrater kan tilskrives det faktum at tilgjengelige in vitro pre-screening modeller ikke fullt ut representerer vår nåværende innsikt og forståelse av HCC kompleksitet og mikromiljø16. Omvendt in vivo dyremodeller tilstede med kompromittert immunforsvar og avvik i interaksjoner mellom svulsten og mikromiljøet sammenlignet med mennesker16,17. I gjennomsnitt kan bare 8% av resultatene fra dyrestudier pålitelig oversettes fra preklinisk til klinisk innstilling16,17. Derfor er det klart at evalueringen av HCC krever utvikling av en in vitro-plattform som effektivt rekafulerer kompleksiteten til ikke bare svulsten, men også mikromiljøet. Plattformene vil supplere de tilgjengelige in vitro prekliniske screeningmodellene og redusere mengden dyrestudier i fremtiden7,14.
En slik plattform er avanserte tredimensjonale (3D) cellekulturmodeller. En rekke av disse avanserte 3D-modellene for å studere HCC har dukket opp i løpet av det siste tiåret, og ulike vurderinger har blitt publisert. Tilgjengelige 3D-modeller for å studere HCC inkluderer flercellede sfæroider, organoider, stillasbaserte modeller, hydrogeler, mikrofluidiker og bio-printing. Av disse er flercellede sfæroider en av de mest kjente modellene som brukes i studien av tumorutvikling. Sfæroider er en billig modell med lav teknisk vanskelighetsgrad samtidig effektivt etterligne in vivo tumor arkitektur18,19,20. Flercellede sfæroider har bidratt til et vell av informasjon om HCC17,21,22. Imidlertid mangler standardisert kulturtid som flercellede sfæroider holdes i kultur mellom 7 og 48 dager. Økt kulturtid er av stor betydning. Eilenberger fant at forskjellene i sfæroid alder dypt påvirker Sorafenib (en kinasehemmer som brukes til behandling av leverkreft) diffusivitetog toksisitet 23. Mens Wrzesinski og Fey fant at 3D hepatocyte sfæroider krever 18 dager for å re-etablere viktige fysiologiske leverfunksjoner etter trypsinisering og fortsetter å vise stabil funksjonalitet i opptil 24 dager etter denneutvinningen 24,25.
Noen av de mer avanserte 3D HCC-modellene inkluderer bruk av menneskelige decellulariserte leverstillas og biotrykte stillas. Mazza og kolleger skapte et naturlig 3D-stillas for HCC-modellering ved hjelp av decellulariserte menneskelige lever som ikke er egnet fortransplantasjon 26. Disse naturlige stillasene kunne med hell befolkes i 21 dager med en co-kultur av hepatisk stellate og hepatoblastomceller, samtidig som uttrykket for viktige ekstracellulære matrisekomponenter som kollagen type I, III, IV og fibronectin opprettholdes. Annet enn sykdomsmodellering, tilbyr denne modellen også fordelen av funksjonell organtransplantasjon og preklinisk legemiddel- og toksisitetsscreening26. Med fremskrittene innen 3D-bioutskrift kan 3D ekstracellulære matrisestillas nå også skrives ut. Ma og kolleger, bio-trykte ekstracellulære matrise stillas med variable mekaniske egenskaper og biomimetisk mikroarkitektur ved hjelp av hydrogels ingeniør fra decellularized ekstracellulær matrise27. Utvilsomt er disse alle gode 3D HCC-modeller. Imidlertid plasserer utilgjengelighet av menneskelige lever og kostnadene involvert i å anskaffe nødvendig utstyr og materialer disse modellene på en ulempe. I tillegg er disse metodene alle teknisk avanserte som krever omfattende opplæring som kanskje ikke er lett tilgjengelig for alle forskere.
Basert på kompleksiteten til HCC og for tiden tilgjengelige 3D-modeller, forsøkte vi å utvikle en altomfattende 3D HCC-modell. Vi siktet på en modell som kunne rekasitere både premalignant og tumor mikromiljø ved å innlemme justerbare hydrogelstivhetsverdier. Videre inkluderte vi også hepatocellulære og stroma tilknyttede cellelinjer, som spiller en nøkkelrolle i patogenesen av HCC. Disse inkluderer endotelceller, lever stellateceller og ondartede hepatocytter, dyrket i et mikromiljø bestående av fysiologisk relevante hydrogeler. Med de valgte hydrogelene, kollagen type I og fibrinogen, innlemmet i forhold som kan sammenlignes med bio-fysiske endringer sett i leverstivhet under initiering og progresjon av HCC. I tillegg siktet vi på en modell som kunne holdes i kultur i en lengre tidsperiode. Vi så for oss en modulær, kostnadseffektiv modell som kan settes opp med grunnleggende utstyr, minimal trening og erfaring, og lett tilgjengelige materialer.
Protocol
Figur 1: Grafiske skildringer av opprettelsen av 3D biomimetisk HCC-modellen Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Merk: Den generelle arbeidsflyten for denne protokollen er angitt i illustrasjonene av figur 1
1. Utarbeidelse av fibrinogen lagerløsning
- Forbered en 1 M kalsiumklorid (CaCl2) lagerløsning, ved å veie 2,21 g CaCl2 og legge den til 20 ml destillert vann (dH2O). Lagerløsning kan oppbevares ved romtemperatur (RT).
- Forbered en 20 ml aprotinin lagerløsning (1218,75 KIU/ml) ved å veie 5 mg aprotinin og tilsett den til 20 ml dH2O. Aliquot lagerløsning i 1 ml aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered en 10 ml 80 mg/ml fibrinogen lagerløsning.
- I et 50 ml rør tilsett 7,849 ml fosfat bufret saltvann (PBS), 2,051 ml aprotinin (1218,75 KIU /ml) for en endelig aprotininkonsentrasjon på 250 KIE/ml og 100 μL CaCl2 (1M) for en endelig CaCl2-konsentrasjon på 10 mM.
- Vei 800 mg fibrinogen.
- Vei 200 mg natriumklorid (NaCl) for at lageroppløsningen skal inneholde 2 % w/v NaCl.
- Legg fibrinogen og NaCl i trinn til 50 ml-røret som inneholder PBS, aprotinin og CaCl2. Ikke rør eller rist kraftig, da dette vil resultere i fibrinogen gelling og klumper som dannes i løsningen.
- Plasser 50 ml røret til fibrinogen lagerløsningen horisontalt på en shaker og rist ved en lav innstilling på 300 o/min.
- Når oppløsningen er oppløst, filtrerer du den med et 0,22 μm sprøytefilter eller et flaskefilter avhengig av volumet. Viktigere, ikke autoklav fibrinogen løsningen som dette vil ødelegge fibrinogen.
MERK: Denne delen av protokollen kan ta mellom 2 og 5 timer, avhengig av mengden lagerløsning, denne gangen bør tas i betraktning under det eksperimentelle oppsettet.
2. Belegginnsatser med kollagen før smøring av hydrogelene på innsatsene
- I en laminær strømningshette eller en vevskulturhette, ved hjelp av steriliserte pinsett, fjern innsatser fra platen og plasser invertert på lokket på platen.
- Forbered en 100 ml 20 ml glacial eddiksyrelagerløsning ved å tilsette 115 μL glacial eddiksyre til 25 ml dH2O og juster til et endelig volum på 100 ml med dH2O. Filtrer oppløsningen ved hjelp av et 0,22 μm sprøytefilter. Lagerløsning kan lagres på RT.
- Forbered 2 ml av en 100 μg/ml kollagenoppløsning fra en 5 mg/ml kollagenoppløsning ved å tilsette 40 μL av 5 mg/ml kollagenoppløsning til 1,960 ml av 20 mM glacial acetic acid stock-løsningen tilberedt i 2,2.
- Coat innsatsene med 100 μg / ml kollagenoppløsning tilberedt i 2,3 ved å pipettering 100 μL av oppløsningen på hver innsats. La setter luften tørke i laminær strømningshette eller vevskulturhette i 2 til 3 timer.
- Når innsatsene har tørket, vask hver innsats 3x med PBS. Tilsett 1 ml PBS til hver brønn av en 12-brønnplate, plasser innsatsene med kollagenbelegg vendt ned i brønnene, fjern PBS fra brønnen og gjenta prosedyren. La lufttørke i laminærstrømhetten 1 til 2 timer.
FORSIKTIG: Eddiksyre er giftig for celler og innsatser skal vaskes grundig med PBS. - Legg til en tilpasset 3D-trykt avstandss avstand over innsatsene, dette vil være nødvendig når gelene henger fra innsatsen for å hindre dem i å berørebunnbrønnenpå platen ( figur 2 ).
Figur 2: Tilpasset 3D-trykt avstandss avstandssmør Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Dekk de inverterte innsatsene med den nederste delen av platen og plasser i inkubatoren til cellene er innebygd i hydrogelene og klar til å bli sådd.
3. Seeding celler innebygd i hydrogeler på innsatser
MERK: Tabell 1 gir en beskrivelse av 3 formuleringer med varierende konsentrasjoner fibrinogen som vil bli utarbeidet. Formulering tilsvarer leveren under utbruddet av fibrose, to skrumplever og tre HCC, stivhetsverdiene for hver av disse formuleringene ble bestemt med revologi under protokolloptimaliseringen.
| Formulering | Endelig fibrinogenkonsentrasjon (mg/ml) | Endelig kollagenkonsentrasjon (mg/ml) | Celler (LX2 + HepG2 Co-kultur 1:1) | Stadium av leveren | Litteratur leverstivhet verdier (kPa) | Modellstivhetsverdi fra Rheology (kPa) | Formulering | Fibrinogen å legge til (ml) | Kollagen å legge til (ml) | 10 % DMEM (ml) | Trombin (μL) | Referanses |
| 1 | 10 | 2 | 2 x 106 celler / ml | Fibrose | ≥ 2 | 3 | 1 | 1 | 0.8 | 0.2 | 4 | 28; 29; 30 |
| 2 | 30 | 2 | 2 x 106 celler / ml | Skrumplever | 6 | 2 | 0.75 | 0.8 | 0.45 | 3 | ||
| 3 | 40 | 2 | 2 x 106 celler / ml | Hcc | ≥ 10. | 10 | 3 | 0.25 | 0.8 | 0.95 | 1 | 28; 31; 32 |
Tabell 1: Beskrivelse av formuleringer for såingsceller innebygd i hydrogeler på innsatser
- Forbered 1 M natriumhydroksidlagerløsning ved å tilsette 3,99 g NaOH til 100 ml dH2O. Oppløsningen kan deretter filtreres med et sprøytefilter på 0,22 μm. Lagre lagerløsningen på RT.
- Plasser 5 mg/ml kollagen og 10 ml 1 M NaOH på is.
- Forvarm 50 ml PBS, 15 ml trypsin, 70 ml 10% DMEM, og fibrinogen lagerløsning, tilberedt i avsnitt 1, til 37 ° C i 20 min i et vannbad.
- Forbered cellesuspensjonene.
- Vask lever stellateceller (LX2) og leverkarsinomceller (HepG2) i T175 kulturflasker to ganger med 10 ml PBS.
- Trypsinize celler med 6 ml trypsin i 4 min ved 37 °C.
- Inaktiver trypsin med 6 ml 10 % DMEM.
- Samle cellefjæringen i 15 ml rør og sentrifuge i 3 min ved 300 x g.
- Etter sentrifugering aspirerer du overnatanten og bruker hver cellelinje på nytt i 5 ml på 10% DMEM.
- Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller: Legg til 10 μL av hver cellesuspensjon i tellekammerlysbildet og sett lysbildet inn i celletelleren. Celletall vises som celler/ml.
- Fortynn cellene fra hver cellelinje til 1 x 106 celler per ml ved hjelp av celletallet i trinn 3.4.6 til tydelig merkede 15 ml rør. Sentrifuger fortynningene i 3 min ved 300 x g.
- Etter sentrifugering, aspirerer supernatanten og legger til 10% DMEM til hvert 15 ml rør i henhold til tabell 1, er verdiene i tabellen for 2 ml av hver formulering.
- Nøytraliser mengden kollagen med 10 μL/ml NaOH (1 M), og tilsett nøytralisert kollagen til cellefjæringen, vil 10% DMEM tilstede bli gul, når suspensjonen blandes grundig ved å pipettering med en kuttspiss, vil det bli en lys rosa.
- Tilsett fibrinogen til kollagencellesuspensjonen i henhold til tabell 1, ved hjelp av en kuttpipettespiss, bland suspensjonen grundig.
- Til slutt tilsett trombin til kollagenfibrinogencellesuspensjon, 0,1 KIU trombin for hver 10 mg fibrinogen.
- Fjern de forhåndsbelagte inverterte innsatsene som er klargjort i del 2 fra inkubatoren og bruk en kuttrørsspiss på 200 μL, pipette 200 μL av den tilberedte suspensjonen på de angitte innsatsene. La gelene kryssbinde i 15 min innenfor laminærstrømningshetten.
- Etter 15 min, legg forsiktig den nederste delen av platen over gelene og flytt dem til inkubatoren for å la gelene kryssbinde ved 37 °C i 45 min.
- Når gelene har krysset, inverter innsatsene igjen og tilsett 2 ml 10% DMEM til hver av de nederste brønnene på platen.
4. Seeding endotelceller
- Forvarm 25 ml hanks balansert saltløsning (HBSS), 10 ml trypsin, 10 ml trypsinhemmer og 50 ml endotelvekstmedium, til 37 ° C i 20 min i et vannbad .
- Klargjør endotelcellens (HUVEC) cellefjæring.
- Vask HUVEC-celler i T175-kulturflasker to ganger med 10 ml HBSS.
- Trypsinize celler med 6 ml trypsin i 4 min ved 37 °C. Inaktiver trypsin med 6 ml trypsinhemmer. Samle cellefjæringen i 15 ml rør og sentrifuge i 3 min ved 200 x g.
- Etter sentrifugering aspirerer supernatanten og suspenderer cellene i 5 ml endotelvekstmedium.
- Telle cellene som tidligere beskrevet i 3.4.6 ved hjelp av en automatisert celle teller.
- Ved hjelp av celletallet fra celletelleren, forberede seeding tetthet på 1,0 x 104 celler / ml i endotelvekst medium.
- Frø 500 μL av HUVEC celle suspensjon i hver brønn av den øverste delen av innsatsen for å ha et endelig volum på 5,0 x 103 celler per innsats.
5. Vedlikehold
- Erstatt vekstmedium annenhver dag, aspirere brukt vekst medium fra både brønnen og innsatsen. Tilsett 2 ml 10% DMEM til brønnene som inneholder gelen og 0,5 ml endotelvekstmedium til innsatsene som inneholder HUVEC-cellene.
- Oppretthold modellen i 21 dager før eksperimentering.
6. Revologi
- Mål lagringsmoduli av gelformuleringer for å indikere stivhetsverdier ved hjelp av et reometer, ved å utføre frekvensfeier fra 0,1-20 Hz ved 0,267 % og 37 °C, med en konstant aksial kraft på 0,1N ved hjelp av en 8 mm diameter parallell plate geometri i rustfritt stål.
7. Levedyktighet og legemiddelrespons
- Bestem legemiddelresponsen og levedyktigheten i 2D-kokulturer og 3D-modell.
- Seed HepG2 (5,0 x 103 celler/ ml) og LX2 (5,0 x 103 celler / ml) celler i et 1:1-forhold for 2D-kokulturen til en svart klar bunn 96-brønnplater med en såetetthet på 1,0 x 104 celler / ml. La cellene festes over natten.
- Sett opp 3D-modellen slik at den tilsvarer et cirrhotisk miljø med en stivhetsverdi på 6 kPa. Oppretthold modellen i 21 dager før behandling med Doksorubicin.
- To timer før doksorubicinbehandling aspirerer kulturmediet fra både 2D- og 3D-modellen. Vask begge modellene to ganger med PBS. Tilsett sultmediet (DMEM supplert med 1% v / v antimykotisk antibiotikaløsning) til 2D-kokulturen (200 μL per brønn) og til 3D-modellen (2 ml til brønnene som inneholder hydrogelen og 500 μL til innsatsen).
- Administrer doksorubicin til både 2D- og 3D-modellen. Doser er som følger: henholdsvis 0,5, 1 og 1,5 mM tilsvarende IC25, 50 og 75 verdier. Behandle begge modellene i 72 timer.
MERK: Doksorubicin, en topoisomerase II-hemmer, er en av de første kjemoterapeutiske legemidlene som brukes til HCC og er også et av de mest aktive kjemoterapeutiske midlene ved behandling av HCC33,34. - Etter 72 timer, aspirert kulturmedium fra både 2D og 3D-modellen. Sørg for at eventuelle gjenværende kulturmedium fjernes ved å vaske begge modellene to ganger med PBS.
- Forbered AlamarBlue i henhold til produsentens anbefalinger og legg til brønnene til 2D- og 3D-modellen. Tilsett 150 μL per brønn for 2D-kulturen og 2 ml per brønn og 500 μL per innsats for 3D-kultur. Ruges over natten ved 37 °C.
- Etter inkubasjonsoverføring 150 μL av AlamarBlue fra hver brønn av 3D-oppsettet til en svart, klar bunn 96-brønnsplate. AlamarBlue kan leses direkte fra platen for 2D-modellen.
- Les fluorescensen med en mikroplateleser ved eksitasjonsbølgelengde og utslippsbølgelengde på henholdsvis 485 og 550 nm.
- Beregn prosentcelle levedyktigheten i begge modellene ved hjelp av følgende formel:
Representative Results
Konsentrasjonsområder og såingsvolum
Protokolloptimalisering for å få tak i den endelige fungerende protokollen oppstod i henhold til det skjematiske diagrammet som presenteres i figur 3. To fysiologisk relevante hydrogeler, kollagen type I og Fibrinogen, ble identifisert ved hjelp av et litteratursøk35,36. Fra og med kollagen type I ble en rekke konsentrasjoner (4, 3, 2 og 1 mg/ml) seedet på inverterte innsatser for å bestemme deres evne til å holde seg til innsatsen når den er invertert igjen. Alle konsentrasjoner innenfor dette området var i stand til å danne geler, men kollagengeler dukket flatt og hadde ulike luftbobler fanget i dem på grunn av håndtering og pipettering, se figur 4 og figur 5. For å bestemme det optimale såingsvolumet for å forbedre kvaliteten på kollagengelen, ble en rekke såingsvolumer (100, 150 og 200 μL), seeded på inverterte innsatser, se figur 5. Såingsvolumet hadde ingen innflytelse på gelens utseende eller tilstedeværelsen av bobler i gelen. Derfor ble det besluttet at 200 μL var det optimale såingsvolumet som produserte de fulle gelene. Fibrinogen ble også evaluert for sin evne til å produsere en gel som kunne følge en innsats i en lengre periode. Et konsentrasjonsområde (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) ble forberedt og sådd med et volum på 200 μL på lokket på en 12-brønns plate, se figur 6. Innen 20 min etter såing alle konsentrasjonene var i stand til å danne en gel. Konsentrasjonene 5 og 1 mg/ml ble imidlertid ekskludert da gelene som ble dannet hadde en væske som konsistens og hadde begynt å løsne fra lokket etter å ha blitt holdt over natten ved 37 °C.
Figur 3: Skjematisk diagram over protokolloptimalisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kollagengeler 4 mg/ml som inneholder 1,0 x 105 celler/ml seeded på innsatser som viser bobler tilstede i gelen. Innsatsen til venstre er avgasset på is i 15 min, mens innsatsen til høyre ikke er avgasset. Avgassing hadde ingen effekt på boblene som er tilstede i gelene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kollagengeler 4 mg/ml som inneholder 1,0 x 105 celler/ml seeded på innsatser i varierende volumer. (A) Sett inn på venstre 100 μL, midtre 150 μL og høyre 200 μL, rett etter såing. Bobler i gelene var fortsatt til stede. (B) Sett inn på venstre 200 μL, midtre 150 μL og høyre 100 μL, etter 60 min krysskobling. Alle geler uavhengig av volum vises fortsatt flate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fibrinogen (200 μL) i et konsentrasjonsområde fra 70 til 1 mg/ml seeded på lokket på en 12-brønns plate. Gelerrett etter såing. (B) Gels 20 min etter såing. Gelerholdes over natten. Alle geler ser godt avrundet ut, 5 mg/ml og 1 mg/ml geler ble utelukket da de syntes å ha en mer flytende konsistens 20 min etter såing og hadde begynt å løsne fra lokket etter å ha blitt holdt over natten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kombinert kollagen og fibrinogen
Basert på resultatene fra kollagen og fibrinogenkonsentrasjonen varierer effekten av å kombinere kollagen og fibrinogen ble evaluert. Tre innsatser ble satt opp med følgende, 4 mg/ml kollagen, 20 mg/ml fibrinogen og en 1:1 rasjon av kollagen (4 mg/ml) og fibrinogen (20 mg/ml), se figur 7. Rett etter såing av hydrogelene observerte vi at innsatsen med kollagen alene fortsatt hadde et flatt utseende kombinert med forekomsten av bobler i gelen. Innsatsene med fibrinogen produserte en full og avrundet gel, så gjorde innsatsen med kombinasjonen av kollagen og fibrinogen. Etter krysskobling ved 37 °C i 60 min, hadde alle geler festet til innsatsen og forble festet etter inkubasjon over natten ved 37 °C.
Figur 7: Effekten av kombinasjonen av kollagen og fibrinogen. (A) Kollagen 4 mg / ml seeded på innsatsen til venstre, fibrinogen 20 mg / ml seeded på innsats i midten og kollagen 4 mg / ml, fibrinogen 20 mg / ml (1:1 rasjon) seeded på innsatsen til høyre. Alle geler seeded med et volum på 200 μL som inneholder 1,0 x 105 celler / ml, alle geler ble krysset i 60 min ved 37 °C. (B) Kollagen 4 mg/ml 60 min etter krysskobling, gel dukket opp flatt og hadde bobler. (C) Sett inn på venstre fibrinogen 20 mg / ml, gel vises avrundet, ingen bobler til stede, sett inn på høyre kollagen 4 mg / ml, fibrinogen 20 mg / ml gel, gel er godt avrundet uten bobler. (D) Kollagen 4 mg / ml gel etter å ha blitt holdt over natten ved 37 ° C, gel fortsatt inneholdt en stor mengde bobler, noen hevelse i gelen har skjedd. (E)Fibrinogen 20 mg/ml holdes over natten ved 37 °C. (F) Kollagen 4 mg/ml, fibrinogen 20 mg/ml gel holdt over natten ved 37 °C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bestemme celleseedetthet
Basert på den tidligere erfaringen med å jobbe med hydrogeler ble et eksperiment satt opp for å bestemme den optimale celleseedettheten (data som ikke vises)37. Cellene ble innebygd i en kombinasjon av kollagen og fibrinogen i følgende konsentrasjonsområde (7,5 x 105,8,5 x 105,9,5 x 105,1,0 x 106,1,5 x 106 og 2,0 x 106 celler /ml), 2,0 x 106 celler / ml ble funnet å være den optimale såetettheten.
Revologi
Ti formuleringer av fibrinogen- og kollagenhydrogelkombinasjonene ble evaluert ved hjelp av revologi, se tabell 2. Målet var å avgjøre hvilke av disse formuleringene som kunne etterligne leverstivhet sett under utviklingen av HCC. Litteratur ga kjente leverstivhetsverdier for rotter, mus og mennesker under fibrose, skrumplever og HCC, og målet var å komme så nær disse verdiene28,29,30,31,32. De ti formuleringene som angitt i tabell 2 ble utarbeidet i triplikate og lagringsmodulen til hver ble bestemt ved hjelp av en reometer, resultater vist i figur 8.
| Formulering | Fibrinogen (mg/ml) | Kollagen (mg/ml) |
| 1 | 60 | 2 |
| 2 | 50 | 2 |
| 3 | 40 | 2 |
| 4 | 30 | 2 |
| 5 | 20 | 2 |
| 6 | 10 | 2 |
| 7 | 20 | 5 |
| 8 | 20 | 4 |
| 9 | 20 | 3 |
| 10 | 20 | 1 |
Tabell 2: Kollagen- og fibrinogenkombinasjoner i ulike konsentrasjoner evaluert med revologi for å bestemme stivhetsverdier
Figur 8: Hydrogelstivhetsverdier for kollagen- og fibrinogenkombinasjoner i ulike konsentrasjoner evaluert med revologi. Modulus for lagring og tap ble bestemt ved 37 °C og 1 Hz ved hjelp av en Discovery HR-2 Hybrid Rheometer (n = 3, Feillinjer = SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fra disse ti formlene ble tre valgt å fortsette med. Disse inkluderte 2 mg/ml kollagen type I og 10 mg/ml fibrinogen tilsvarende leverstivhetsverdier ved utbruddet av fibrose, 2 mg/ml kollagentype I og 30 mg/ml fibrinogen tilsvarende skrumplever og 2 mg/ml kollagen type I og 40 mg/ml fibrinogen tilsvarende HCC, se figur 9.
Figur 9: Hydrogelstivhetsverdier for ulike fibrinogen/kollagenhydrogelformuleringer valgt å fortsette med. Modulus for lagring og tap ble bestemt ved 37 °C og 1 Hz (n = 3, Feilfelt = SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Levedyktighet, legemiddelrespons og metastatisk potensial
Resultatene fra AlamarBlue-analysen viste en samlet redusert celle levedyktighet innenfor 2D-kokulturen, lavere enn forventet basert på de kjente rapporterte IC 25, 50 og 75-verdiene, sammenlignet med den ubehandlede kontrollen, se figur 10. Dette kan tilskrives LX2-cellene i vår co-kultur som er mer følsomme for Doksorubicinbehandling. Men i vår 3D-modell la vi merke til og øker i doksorubicinresistens, noe som bekrefter nedgangen i kjemoterapeutisk potensial ofte sett i 3D-modellsystemer. Statistisk signifikans sammenlignet med kontroller ble vurdert ved hjelp av Student T-testen (to-tailed), med P<0,05 ansett som signifikant.
Figur 10: Prosentcelle levedyktighet av en 2D-kokulturmodell sammenlignet med 3D-modellen etter behandling med Doksorubicin ved ulike konsentrasjoner i en periode på 72 timer. Resultatene normaliseres i forhold til den ubehandlede kontrollen (n=3, feilfelt = SD) (* = p<0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Gelkonstruksjonene ble visuelt inspisert daglig ved hjelp av et lett mikroskop for å følge cellevekst innenfor forskjellige konsentrasjoner av hydrogelene. Celler fylte opp hydrogelene på en homogen og kompakt måte, fra dag 7 sfæroider begynte å montere i matrisen.
Discussion
Denne protokollen beskriver utviklingen av en metode for å lage en biomimetisk modell for HCC. Det er opprettet en klar arbeidsflyt og de kritiske trinnene som er identifisert. Disse kritiske trinnene inkluderer, utarbeidelse av fibrinogen lagerløsningen, belegg innsatsene med kollagen og såing cellene imbedded inn i hydrogelen. Under utarbeidelsen av fibrinogen lagerløsningen er det viktig å legge til fibrinogen i mindre trinn ved høyere konsentrasjoner. Dette vil ikke bare redusere tiden det tar for fibrinogen å oppløse, men vil også hindre fibrinogen fra gelling inkonsekvent og for tidlig som sett i figur 11. Utarbeidelsen av fibrinogengelen tar en betydelig mengde tid, og dette kan påvirke den generelle eksperimentelle suksessen. Resultatene indikerer at når fibrinogengelen begynner å gele inkonsekvent, er det best å kaste den. Innsatsene skal være belagt med kollagen, vaskes med PBS og tørkes i laminærstrømningshetten før de sår cellene som er innebygd i hydrogeler. Hvis du ikke sikrer at innsatsene er tørre, vil hydrogelene søle over kantene på innsatsen, noe som resulterer i en ujevn gel. Ujevnhet i gelen vil til slutt påvirke resultater der diffusjon er en faktor.
Figur 11: Tilberedning av fibrinogengel for fibrinogen/kollagenhydrogelformuleringer. (A) Fibrinogen gel løsning som har dannet klumper og begynte å gele for tidlig med uløst fibrinogen følge røret. (B) Fibrinogen gel løsning som er oppløst helt, oppløsningen er klar og litt mer viskøs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det anbefales å jobbe så fort som mulig mens du så hydrogel celle suspensjon på innsatsene, som fibrinogen komponenten vil begynne å kryssbinde med tillegg av trombin. Forbered mindre arbeidsvolumer om gangen når du arbeider med gelsuspensjoner ved høyere konsentrasjoner for å hindre at gelen kryssbinder under såing. Sistnevnte vil ha en effekt på fordelingen og mengden gel seeded på hver brønn. Rekkefølgen på å legge til komponentene er kritisk, i denne protokollen ga vi en strømlinjeformet arbeidsflyt for å hindre geler fra å krysslinke for tidlig. På grunn av viskositeten til hydrogelgelfjæringen anbefales det å arbeide med en kuttpipettespiss under blanding og måling. Ved blanding av suspensjonen må du sørge for at dette gjøres raskt og jevnt for å skape en homogen suspensjon. Ujevn blanding vil resultere i en heterogen gel som vil påvirke resultatene negativt, se figur 12.
Figur 12: Kollagen/fibrinogengeler seeded på 12 brønnplater. Alle geler seeded med et volum på 200 μL som inneholder 2mg / ml kollagen og 20 mg / ml Fibrinogen med 2,0 x 106 celler / ml. (A)Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ujevn fordeling av hydrogelene. (B)Hydrogels homogent blandet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter protokolloptimaliseringen ble modellen evaluert for å bestemme modellenes biofysio fysiske egenskaper. Reologidata viste at vår modell, bestående av fysiologisk relevante ekstracellulære matrisekomponenter nemlig kollagen type I og fibrinogen, var i stand til å etterligne de biofysiske egenskapene til en fibrotisk, cirrhotic og HCC lever28,29,30,31,32. Rekapituerende leverstivhet i 3D-modeller for HCC er av betydelig betydning og blir ofte oversett under modellutvikling. Økt leverstivhet er relatert til kjemoterapeutisk resistens, spredning, migrasjon og dvalen i HCC38. Mens aktiveringen av lever stellate celler i HCC er forbundet med økt ekstracellulær matrisestivhet, med flere signalveier forbundet med disse lever stellate cellene som viser mekanosensitivitet39.
Inkluderingen av stroma tilknyttede celler som lever stellate celler og endotelcelle i utviklingen av 3D-modeller for HCC har blitt stadig mer relevant. Studier viser at flercellede sfæroider bestående av hepatisk stellate og HCC-celler resulterte i økt kjemoterapeutisk resistens og invasiv migrasjon, mens etterlignet HCC tumor utseende in vivo, sammenlignet med en PXT mus modell og menneskelige HCC vevsprøver17. En lignende studie av Jung et al., 2017 fant multicellulær sfæroid bestående av hepatocellulært karsinom (Huh-7) og endotelceller (HUVEC) celler fremmet vaskularisering og aggressivitet22. Disse sfæroidene viste levedyktighet ved signifikant høyere konsentrasjoner av doksorubicin og sorafenib sammenlignet med Huh-7 monokultur spheroider22. Evalueringen av vår modells levedyktighet og respons på doksorubicin, med stivhetsverdier som tilsvarer HCC og inkludering av stromarelaterte celler (LX2 og HUVEC), viste en lignende reduksjon som svar på kjemoterapeutiske midler sammenlignet med en 2D-kokulturmodell. Dermed, effektivt etterligne narkotikaresistens vanligvis sett hos pasienter og andre 3D HCC modeller.
Siden dette er et modulært system kan modellen befestes ved tilsetning av andre ekstracellulære matrisekomponenter nemlig laminin og hyaluronsyre. Alternativt kan de nåværende hydrogelene som brukes i denne modellen erstattes av syntetiske hydrogeler som natriumlginat eller chitosan. Ytterligere endringer i den nåværende modellen kan være substitusjon av cellelinjene med primære cellekulturer for å produsere en enda mer fysiologisk relevant modell eller ved hjelp av kombinasjoner av andre tumor- og stromale cellelinjer.
Vi har dermed utviklet en 3D-modell med justerbare biofysiske egenskaper for å studere tumor-stroma interaksjoner i HCC. Vi har funnet vår modell å være mer representativ for in vivo situasjonen sammenlignet med tradisjonelle 2D kulturer som svar på doxorubicin. Det er imidlertid fortsatt mye å gjøre, vi håper å i stor grad karakterisere denne modellen og utforske modellen som en mulig metastatisk plattform for å svare på mer komplekse og presserende spørsmål som gjenstår i studien HCC.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert gjennom tilskudd fra Kreftfonden, CAN2017/518), det svenske samfunnet for medisinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons foundation og Olga Jönssons foundation. Disse finansieringskildene var ikke involvert i studiedesignen; innsamling, analyse og tolkning av data; skriving av rapporten; og i beslutningen om å sende inn artikkelen for publisering. 3D-utskrift av spesialdesignede avstandssedler som brukes i denne protokollen ble utført ved U-PRINT: Uppsala Universitetets 3D-printing anlegg ved Disiplinærdomene for medisin og apotek, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vil gjerne takke Paul O'Callaghan for hans verdifulle innspill på prosjektet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
| Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
| CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
| Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
| Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
| Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
| Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
| Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
| Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
| Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
| Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
| Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
| Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
| TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
| TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
| Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |
References
- Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
- Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
- Balogh, J., et al.
- Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
- Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
- Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
- Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
- Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
- Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
- Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
- Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
- Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
- Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
- Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
- Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
- Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
- Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
- Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
- Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
- Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
- Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
- Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
- Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
- Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
- Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
- Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).
