Summary
Detta protokoll presenterar en 3D biomimetisk modell med medföljande fibrotic stromal fack. Förberedd med fysiologiskt relevanta hydrogeler i förhållanden som efterliknar de biofysiska egenskaperna hos den stromala extracellulära matrisen, en aktiv medlare av cellulära interaktioner, tumörtillväxt och metastasering.
Abstract
Hepatocellular carcinom (HCC) är en primär lever tumör utvecklas i kölvattnet av kronisk leversjukdom. Kronisk leversjukdom och inflammation leder till en fibrotisk miljö som aktivt stöder och driver hepatocarcinogenes. Insikt i hepatocarcinogenes när det gäller samspelet mellan tumör stroma mikro-miljö och tumör celler är därför av stor betydelse. Tredimensionella (3D) cellkulturmodeller föreslås som den saknade länken mellan nuvarande in vitro 2D-cellkulturmodeller och in vivo-djurmodeller. Vårt mål var att designa en ny 3D biomimetisk HCC-modell med tillhörande fibröst stromalt fack och vaskulatur. Fysiologiskt relevanta hydrogeler såsom kollagen och fibrinogen införlivades för att efterlikna de bio-fysiska egenskaperna hos tumör ECM. I denna modell såddes LX2- och HepG2-celler inbäddade i en hydrogelmatris på den inverterade transmembraninsatsen. HUVEC celler såddes sedan på motsatt sida av membranet. Tre formuleringar bestående av ECM-hydrogeler inbäddade med celler utarbetades och de bio-fysiska egenskaperna fastställdes av reologi. Cellens livskraft bestämdes av en cell viabilitetsanalys under 21 dagar. Effekten av det kemoterapeutiska läkemedlet doxorubicin utvärderades i både 2D-samkultur och vår 3D-modell under en period av 72h. Reologi resultat visar att bio-fysiska egenskaper hos en fibrotic, cirrhotic och HCC lever kan framgångsrikt efterliknas. Sammantaget tyder resultaten på att denna 3D-modell är mer representativ för in vivo-situationen jämfört med traditionella 2D-kulturer. Vår 3D tumör modell visade ett minskat svar på kemoterapeutiska, härma läkemedelsresistens vanligtvis sett i HCC patienter.
Introduction
Hepatocellulärt karcinom (HCC) omfattar 90% av alla primära levercancer1,2. Med 810 000 dödsfall och 854 000 nya fall rapporterade årligen rankas det för närvarande som den femte vanligaste cancern i världen med en av de högsta incidenserna avdödlighet 1. Utvecklingen av HCC tillskrivs främst inflammation i samband med kroniska leversjukdomar nämligen virushepatit, kroniskt överdrivet alkoholintag, metaboliskt syndrom, fetma och diabetes1,3,4. Inflammationen i samband med dessa patologiska tillstånd resulterar i hepatocytskada och utsöndring av olika cytokiner som aktiverar och rekryterar lever stellatceller och inflammatoriska celler för att initiera fibros5. Lever stellate celler är kända för sin nyckelroll i initiering, progression och regression av lever fibros. Vid aktivering skiljer de sig i myofibroblast som celler med kontraktila, proinflammatoriska och pro-fibrinogenic egenskaper6,7,8. Den resulterande fibrosen orsakar i sin tur dysregleringen av extracellulär matris ombyggnad enzymaktivitet, vilket skapar en miljö som kännetecknas av en övergripande ökad styvhet åtföljd av utsöndringen av tillväxtfaktorer, vilket ytterligare bidrar till HCC patogenes9,10. Det är denna kontinuerliga patogena återkopplingsslinga mellan hepatocyter och den stromala miljön, som driver cancerinitiering, epitelial till mesenchymala övergångar (EMT), angiogenes, metastaserad potential och förändrat läkemedelssvar11,12,13. Insikt i hepatocarcinogenes när det gäller samspelet mellan tumören och tumörmikromiljön är därför av stor betydelse inte bara ur ett mekanistiskt utan också ur ett behandlingsperspektiv.
Tvådimensionella (2D) in vitro-cellkulturmodeller används främst av 80% av cancercellsbiologerna14. Dessa modeller är dock inte representativa för den sanna tumörmikromiljön, vilket påverkar kemoterapeutiska svar14,15,16. För närvarande misslyckas 96% av kemoterapeutiska läkemedel under kliniska prövningar14. Denna höga incidens i läkemedelsmattningshastigheter kan hänföras till det faktum att tillgängliga in vitro-modeller före screening inte helt representerar vår nuvarande insikt och förståelse för HCC-komplexitet och mikromiljön16. Omvänt in vivo djurmodeller presenterar med komprometterade immunsystem och skillnader i interaktioner mellan tumören och mikromiljön jämfört med människor16,17. I genomsnitt kan endast 8% av resultaten från djurstudier översättas tillförlitligt från den prekliniska till den kliniskainställningen 16,17. Därför är det uppenbart att utvärderingen av HCC kräver utveckling av en in vitro-plattform som effektivt rekapitulerar komplexiteten hos inte bara tumören utan också mikromiljön. Plattformarna skulle komplettera de för närvarande tillgängliga prekliniska screeningmodellerna in vitro och minska mängden djurstudier iframtiden 7,14.
En sådan plattform är avancerade tredimensionella (3D) cellkulturmodeller. En mängd av dessa avancerade 3D-modeller för att studera HCC har dykt upp under det senaste decenniet och olika recensioner har publicerats. Tillgängliga 3D-modeller för att studera HCC inkluderar multicellulära sfäroider, organoider, ställningsbaserade modeller, hydrogeler, mikrofluidik och biotryck. Av dessa är multicellulära sfäroider en av de mest kända modellerna som används i studien av tumörutveckling. Sfäroider är en billig modell med låg teknisk svårighet samtidigt som de effektivt efterliknar in vivo tumörarkitektur18,19,20. Multicellulära sfäroider har bidragit till en mängd information om HCC17,21,22. Standardiserad kulturtid saknas dock eftersom multicellulära sfäroider hålls i kultur mellan 7 och 48 dagar. Ökad kulturtid är av stor betydelse. Eilenberger fann att skillnaderna i sfäroidålder i grunden påverkar Sorafenib (en kinashämmare som används för behandling av levercancer) diffusivitet ochtoxicitet 23. Medan Wrzesinski och Fey fann att 3D hepatocyt sfäroider kräver 18 dagar för att återupprätta viktiga fysiologiska leverfunktioner efter trypsinization och fortsätter att uppvisa den stabila funktionaliteten i upp till 24 dagar efter dennaåterhämtning 24,25.
Några av de mer avancerade 3D HCC-modellerna inkluderar användning av mänskliga decellulära leverställningar och biotryckta byggnadsställningar. Mazza och kollegor skapade en naturlig 3D-byggnadsställning för HCC-modellering med decellulerade mänskliga lever som inte är lämpliga för transplantation26. Dessa naturliga byggnadsställningar kunde framgångsrikt återbefolkas i 21 dagar med en samkultur av lever stellat och hepatoblastom celler, samtidigt upprätthålla uttrycket av viktiga extracellulära matris komponenter såsom kollagen typ I, III, IV och fibronectin. Förutom sjukdomsmodellering erbjuder denna modell också fördelen med funktionell organtransplantation och preklinisk läkemedels- och toxicitetsscreening26. Med framstegen inom 3D-biotryck kan 3D extracellulära matrisställningar nu också biotryckas. Ma och kollegor, biotryckta extracellulära matrisställningar med varierande mekaniska egenskaper och biomimetisk mikroarchitecture med hjälp av hydrogelingenjör från decellulär extracellulär matris27. Utan tvekan är dessa alla utmärkta 3D HCC-modeller. Men otillgängligheten av mänskliga lever och kostnaden för att förvärva nödvändig utrustning och material missgynnar dessa modeller. Dessutom är dessa metoder alla tekniskt avancerade vilket kräver omfattande utbildning som kanske inte är lätt tillgänglig för alla forskare.
Baserat på komplexiteten i HCC och för närvarande tillgängliga 3D-modeller strävade vi efter att utveckla en allomfattande 3D HCC-modell. Vi siktade på en modell som kan rekapitituera både premalignant och tumörmikromiljö genom att införliva justerbara hydrogelstyvhetsvärden. Dessutom inkluderade vi också hepatocellulära och stroma associerade cellinjer, som spelar en nyckelroll i patogenesen vid HCC. Dessa inkluderar endotelceller, lever stellatceller och maligna hepatocyter, odlade i en mikromiljö bestående av fysiologiskt relevanta hydrogeler. Med de valda hydrogelerna, kollagen typ I och fibrinogen, införlivas i förhållanden som är jämförbara med bio-fysiska förändringar sett i leverstelhet under initiering och progression av HCC. Dessutom siktade vi på en modell som kunde behållas i kulturen under en längre tidsperiod. Vi föreställde oss en modulär, kostnadseffektiv modell som kan ställas in med grundläggande utrustning, minimal träning och erfarenhet och lättillgängliga material.
Protocol
Bild 1: Grafiska skildringar av skapandet av 3D-biomimetisk HCC-modell Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Obs: Det övergripande arbetsflödet för detta protokoll anges i illustrationerna av figur 1
1. Beredning av fibrinogen stamlösning
- Förbered en 1 M kalciumklorid (CaCl2)stamlösning genom att väga 2,21 g CaCl2 och tillsätt den till 20 ml destillerat vatten (dH2O). Lagerlösning kan förvaras i rumstemperatur (RT).
- Förbered en 20 ml aprotininbuljonglösning (1218,75 KIU/ml) genom att väga 5 mg aprotinin och tillsätt den till 20 ml dH2O. Aliquot lagerlösning i 1 ml alikvoter och förvara den vid -20 °C.
- Förbered en 10 ml 80 mg/ml fibrinogen stamlösning.
- I ett 50 ml-rör tillsätt 7,849 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 2,051 ml aprotininlager (1218,75 KIU/ml) för en slutlig aprotininkoncentration på 250 KIU/ml och 100 μL CaCl2 (1M) för en slutlig CaCl2-koncentration på 10 mM.
- Väg 800 mg fibrinogen.
- Väg 200 mg natriumklorid (NaCl) för att stamlösningen ska innehålla 2% w/v NaCl.
- Tillsätt fibrinogenen och NaCl i steg till 50 ml-röret som innehåller PBS, aprotinin och CaCl2. Rör inte om eller skaka kraftigt eftersom detta resulterar i fibrinogengelering och klumpar som bildas i lösningen.
- Placera 50 ml-röret i fibrinogenbuljonglösningen horisontellt på en skakapparat och skaka med en låg inställning på 300 varv/min.
- När lösningen har lösts upp filtrerar du den med ett 0,22 μm sprutfilter eller ett flaskfilter beroende på volymen. Viktigt, inte autoklavera fibrinogenlösningen eftersom detta kommer att förstöra fibrinogenen.
OBS: Denna del av protokollet kan ta mellan 2 och 5 h beroende på mängden lagerlösning, den här gången bör beaktas under den experimentella installationen.
2. Beläggningsinsatser med kollagen innan hydrogelerna sås på skären
- I en laminär flödeshuv eller en vävnadskulturhuv, med steriliserade pincett, ta bort skär från plattan och placera inverterade på locket på plattan.
- Förbered en 100 ml 20 mM glacial ättiksyra stamlösning genom att tillsätta 115 μL glacial ättiksyra till 25 ml dH2O och justera till en slutlig volym på 100 ml med dH2O. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter. Lagerlösning kan lagras på RT.
- Bered 2 ml av en 100 μg/ml kollagenlösning från en 5 mg/ml kollagenlösning genom att tillsätta 40 μL av 5 mg/ml kollagenlösning till 1,960 ml av den 20 mM glaciala ättiksyralagerlösningen beredd i 2,2.
- Täck skären med 100 μg/ml kollagenlösning som bereds i 2.3 genom att pipetting 100 μL av lösningen på varje insats. Låt föra in luft torr i laminär flödeshuv eller vävnadskulturhuv i 2 till 3 timmar.
- När skären har torkat tvätta varje insats 3x med PBS. Tillsätt 1 ml PBS till varje brunn på en 12 brunnsplatta, placera inläggen med kollagenbeläggning vänd nedåt i brunnarna, ta bort PBS från brunnen och upprepa proceduren. Låt skären lufttorka i laminarflödeshuven 1 till 2 timmar.
VARNING: Ättiksyra är giftigt för celler och skär bör tvättas noggrant med PBS. - Tillsätt en anpassad 3D-utskriven distans över skären, detta kommer att vara nödvändigt när gelerna hänger från insatsen för att förhindra att de vidrör bottenbrunnen på plattan (Figur 2).
Bild 2: Anpassad 3D-utskriven distans Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Täck de inverterade skären med den nedre delen av plattan och placera i inkubatorn tills cellerna är inbäddade i hydrogelerna och redo att sås.
3. Såddceller inbäddade i hydrogeler på skär
OBS: Tabell 1 ger en beskrivning av 3 formuleringar med varierande koncentrationer fibrinogen som kommer att beredas. Formulering ett motsvarar levern under uppkomsten av fibros, två cirros och tre HCC, styvhet värdena för var och en av dessa formuleringar fastställdes med reologi under protokoll optimering.
| Formulering | Slutlig fibrinogenkoncentration (mg/ml) | Slutlig kollagenkoncentration (mg/ml) | Celler (LX2 + HepG2 Samkultur 1:1) | Leverstadiet | Litteratur lever styvhet värden (kPa) | Modell styvhet värde från reologi (kPa) | Formulering | Fibrinogen att lägga till (mL) | Kollagen att tillsätta (mL) | 10 % DMEM (ml) | Trombin (μL) | Referenss |
| 1 | 10 | 2 | 2 x 106 celler/ml | Fibros | ≥2 | 3 | 1 | 1 | 0.8 | 0.2 | 4 | 28; 29; 30 |
| 2 | 30 | 2 | 2 x 106 celler/ml | Cirros | 6 | 2 | 0.75 | 0.8 | 0.45 | 3 | ||
| 3 | 40 | 2 | 2 x 106 celler/ml | Hcc | ≥10 | 10 | 3 | 0.25 | 0.8 | 0.95 | 1 | 28; 31; 32 |
Tabell 1: Beskrivning av formuleringar för såddceller inbäddade i hydrogeler på skär
- Bered 1 M natriumhydroxidbuljonglösning genom att tillsätta 3,99 g NaOH till 100 ml dH2O. Lösningen kan sedan filtreras med ett 0,22 μm sprutfilter. Lagra lagerlösningen på RT.
- Placera 5 mg/ml kollagen och 10 ml 1 M NaOH på is.
- Förvärm 50 ml PBS, 15 ml trypsin, 70 ml 10% DMEM och fibrinogenbuljonglösning, beredd i avsnitt 1, till 37 °C i 20 min i ett vattenbad.
- Förbered cellupphängningen.
- Tvätta lever stellatceller (LX2) och leverkarcinom (HepG2) celler i T175 odling flaskor två gånger med 10 mL PBS.
- Trypsinize celler med 6 mL trypsin i 4 min vid 37 °C.
- Inaktivera trypsin med 6 ml 10% DMEM.
- Samla cellupphängningen i 15 ml rör och centrifugera i 3 min vid 300 x g.
- Efter centrifugation, aspirera supernatanten och återanvänd varje cellinje i 5 ml 10% DMEM.
- Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare: Lägg till 10 μL av varje cellupphängning i inventeringskammarens bild och sätt in bilden i cellräknaren. Cellantalet visas som celler/ml.
- Späd cellerna från varje cellinje till 1 x 106 celler per ml med cellantalet i steg 3.4.6 till tydligt märkta 15 ml-rör. Centrifugera utspädningarna i 3 min vid 300 x g.
- Efter centrifugation, aspirera supernatanten och tillsätt 10% DMEM till varje 15 ml rör enligt tabell 1, värden som anges i tabellen är för 2 ml av varje formulering.
- Neutralisera mängden kollagen med 10 μL/ml NaOH (1 M) och tillsätt det neutraliserade kollagenet till cellupphängningen, 10% DMEM-presenten blir gul, när suspensionen blandas noggrant genom pipetting med en skärspets blir den ljusrosa.
- Tillsätt fibrinogen till kollagencellsupphängningen enligt tabell 1, med hjälp av en skuren pipettspets, blanda suspensionen noggrant.
- Tillsätt slutligen trombin till kollagen-fibrinogen cell suspension, 0,1 KIU trombin för varje 10 mg fibrinogen.
- Ta bort de förbelagda inverterade skären som bereds i avsnitt 2 från inkubatorn och använd en skuren 200 μL pipettspets, pipett 200 μL av den beredda fjädringen på de avsedda skären. Låt gelerna korsa länken i 15 minuter i laminär flödeshuv.
- Efter 15 min, placera försiktigt den nedre delen av plattan över gelerna och flytta dem till inkubatorn så att gelerna kan korsa länken vid 37 °C i 45 min.
- När gelerna har korsat, vänd skären igen och tillsätt 2 ml 10% DMEM till var och en av plattans nedre brunnar.
4. Sådd av endotelceller
- Förvärm 25 ml hanks balanserad saltlösning (HBSS), 10 ml trypsin, 10 ml trypsinhämmare och 50 ml endoteltillväxtmedium, till 37 °C i 20 min i ett vattenbad .
- Förbered cellfjädringen (HUVEC).
- Tvätta HUVEC-celler i T175 odlingskolvar två gånger med 10 ml HBSS.
- Trypsinize celler med 6 mL trypsin i 4 min vid 37 °C. Inaktivera trypsin med 6 ml trypsinhämmare. Samla cellupphängningen i 15 ml rör och centrifuger i 3 min vid 200 x g.
- Efter centrifugation aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 5 ml endotel tillväxt medium.
- Räkna cellerna enligt beskrivningen i 3.4.6 med hjälp av en automatiserad cellräknare.
- Förbered såddtätheten 1,0 x 104 celler/ml i endoteltillväxtmedium med hjälp av cellräkningen från cellräknaren.
- Frö 500 μL av HUVEC-cellupphängningen i varje brunn i den övre delen av insatsen för att ha en slutlig volym på 5,0 x 103 celler per insats.
5. Underhåll
- Byt ut tillväxtmediet varannan dag, aspirera förbrukat tillväxtmedium från både brunnen och insatsen. Tillsätt 2 ml 10% DMEM till brunnarna som innehåller gelén och 0,5 ml endoteltillväxtmedium till de skär som innehåller HUVEC-cellerna.
- Underhåll modellen i 21 dagar före experimentet.
6. Reologi
- Mät lagringsmoduli av gelformuleringar för att indikera styvhetsvärden med hjälp av en reometer, genom att utföra frekvenssvepningar från 0,1-20 Hz vid 0,267% och 37 °C, med en konstant axiell kraft på 0,1N med en parallellplatta av rostfritt stål med 8 mm diameter.
7. Livskraft och drogrespons
- Bestäm läkemedlets respons och livskraft i 2D-samkulturer och 3D-modell.
- Frö HepG2 (5,0 x 103 celler/ml) och LX2 (5,0 x 103 celler/ml) celler i ett 1:1-förhållande för 2D-samkulturen till en svart klar botten 96-brunnsplattor med en såddtäthet på 1,0 x 104 celler/ml. Tillåt celler att fästa över natten.
- Ställ in 3D-modellen så att den motsvarar en cirrhotisk miljö med ett styvhetsvärde på 6 kPa. Behåll modellen i 21 dagar före Doxorubicin-behandlingen.
- Två timmar före doxorubicinbehandling, aspirera odlingsmediet från både 2D- och 3D-modellen. Tvätta båda modellerna två gånger med PBS. Tillsätt svältmediet (DMEM kompletterat med 1% v/v antimykotisk antibiotikalösning) till 2D-samkulturen (200 μL per brunn) och till 3D-modellen (2 ml till brunnarna som innehåller hydrogelen och 500 μL till insatsen).
- Administrera doxorubicin till både 2D- och 3D-modellen. Doser är följande: 0,5, 1 och 1,5 mM motsvarande IC25, 50 och 75 värden, respektive. Behandla båda modellerna i 72 h.
OBS: Doxorubicin, en topoisomeras II-hämmare, är en av de första kemoterapeutiska läkemedlen som används för HCC och är också ett av de mest aktiva kemoterapeutiska medlen vid behandling av HCC33,34. - Efter 72 h, aspirerade kulturmedium från både 2D- och 3D-modellen. Se till att eventuellt återstående odlingsmedium avlägsnas genom att tvätta båda modellerna två gånger med PBS.
- Förbered AlamarBlue enligt tillverkarens rekommendationer och lägg till brunnarna i 2D- och 3D-modellen. Tillsätt 150 μL per brunn för 2D-kulturen och 2 ml per brunn och 500 μL per skär för 3D-odling. Inkuberade över natten vid 37°C.
- Efter inkubationsöverföring 150 μL av AlamarBlue från varje brunn i 3D-installationen till en svart klar botten 96-brunnsplatta. AlamarBlue kan läsas direkt från plattan för 2D-modellen.
- Läs fluorescensen med en mikroplåtläsare vid excitationsvåglängd respektive utsläppsvåglängd på 485 respektive 550 nm.
- Beräkna cellens procentuella livskraft i båda modellerna med hjälp av följande formel:
Representative Results
Koncentrationsintervall och såddvolym
Protokolloptimering för att erhålla det slutliga fungerande protokollet inträffade enligt det schematiska diagram som presenteras i figur 3. Två fysiologiskt relevanta hydrogeler, kollagen typ I och Fibrinogen, identifierades genom en litteratursökning35,36. Från och med råtta svans kollagen typ I, såddes en rad koncentrationer (4, 3, 2 och 1 mg/mL) på inverterade skär för att bestämma deras förmåga att framgångsrikt hålla fast vid insatsen en gång inverterad igen. Alla koncentrationer inom detta intervall kunde bilda geler, men kollagengeler verkade tillplattade och hade olika luftbubblor fångade i sig på grund av hantering och pipetting, se figur 4 och figur 5. För att bestämma den optimala såddvolymen för att förbättra kvaliteten på kollagengelen såddes en rad såddvolymer (100, 150 och 200 μL) på inverterade skär, se figur 5. Såddvolymen hade ingen inverkan på gelens utseende eller närvaron av bubblor i gelén. Det beslutades därför att 200 μL var den optimala såddvolymen som gav de mest kompletta gelerna. Fibrinogen utvärderades också för sin förmåga att producera en gel som kunde hålla fast vid ett inlägg under en längre tidsperiod. Ett koncentrationsområde (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) förbereddes och såddes med en volym på 200 μL på locket på en 12-brunnsplatta, se figur 6. Inom 20 min efter sådd kunde alla koncentrationer framgångsrikt bilda en gel. Koncentrationerna 5 och 1 mg/ml uteslöts dock eftersom de geler som bildades hade en vätska som konsistens och hade börjat lossna från locket efter att ha hållits över natten vid 37 °C.
Bild 3: Schematiskt diagram över protokolloptimering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Kollagengeler 4 mg/ml innehållande 1,0 x 105 celler/ml sådda på skär som visar bubblor i gelén. Insatsen till vänster avgasades på is i 15 minuter, medan insatsen till höger inte har avgasats. Avgasning hade ingen effekt på de bubblor som finns i gelerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Kollagengeler 4 mg/ml innehållande 1,0 x 105 celler/ml sådda på skär i olika volymer. a) Sätt i 100 μL, mitten 150 μL och höger 200 μL till vänster direkt efter sådd. Bubblor i gelerna var fortfarande närvarande. B) Sätt i μL till vänster 200 μL, mitten av 150 μL och höger 100 μL efter 60 minuters korslänkning. Alla geler oavsett volym verkar fortfarande platta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Fibrinogen (200 μL) i ett koncentrationsområde från 70 till 1 mg/ml sådd på locket på en 12-brunnsplatta. A)Geler direkt efter sådd. B)Geler 20 min efter sådd. (C)Geler hålls över natten. Alla geler verkar väl rundade, 5 mg/ml och 1 mg/ml geler uteslöts eftersom de verkade ha en mer flytande konsistens 20 min efter sådd och hade börjat lossna från locket efter att ha hållits över natten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kombinationskollage och fibrinogen
Baserat på resultaten från kollagen- och fibrinogenkoncentrationen varierar effekten av att kombinera kollagen och fibrinogen utvärderades. Tre insatser var inställningarna med följande, 4 mg/ml kollagen, 20 mg/ml fibrinogen och en 1:1-ranson kollagen (4 mg/ml) och fibrinogen (20 mg/ml), se figur 7. Direkt efter sådd av hydrogelerna observerade vi att insatsen med kollagen ensam fortfarande hade ett platt utseende kombinerat med förekomsten av bubblor i gelén. Skären med fibrinogen producerade en hel och rundad gel, så gjorde insatsen med kombinationen av kollagen och fibrinogen. Efter korskoppling vid 37 °C i 60 min hade alla geler fästs på insatsen och förblev fastsatta efter inkubation över natten vid 37 °C.
Figur 7: Effekt av kombinationen av kollagen och fibrinogen. a)Kollagen 4 mg/ml sådd på insatsen till vänster, fibrinogen 20 mg/ml sådd på insats i mitten och kollagen 4 mg/ml, fibrinogen 20 mg/mL (1:1 ranson) sådd på insatsen till höger. Alla geler sådda på en volym av 200 μL innehållande 1,0 x 105 celler/ml, alla geler var korslänkade i 60 min vid 37 °C. (B) Kollagen 4 mg/ml 60 min efter korslänkning, gelen verkade platt och hade bubblor. (C) Sätt in på vänster fibrinogen 20 mg/ml, gelen verkar rundad, inga bubblor närvarande, sätt in på höger kollagen 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/ml gel, gel är väl rundad utan bubblor. (D) Kollagen 4 mg/ml gel efter att ha hållits över natten vid 37 °C, gel innehöll fortfarande en stor mängd bubblor, viss svullnad av gelén har inträffat. (E) Fibrinogen 20 mg/ml hålls över natten vid 37 °C.(F)Kollagen 4 mg/ml, fibrinogen 20 mg/ml gel hålls över natten vid 37 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bestämma cellfrötätheten
Baserat på tidigare erfarenhet av att arbeta med hydrogeler var ett experiment in konfigurerat för att bestämma den optimala cellfrötätheten (data visas inte)37. Cellerna inbäddade i en kombination av kollagen och fibrinogen i följande koncentrationsområde (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106,1,5 x 106 och 2,0 x 106 celler/ml), 2,0 x 106 celler/ml visade sig vara den optimala såddtätheten.
Reologi
Tio formuleringar av kombinationerna fibrinogen och kollagenhydrgel utvärderades med hjälp av reologi, se tabell 2. Syftet var att avgöra vilken av dessa formuleringar som kunde efterlikna leverstelhet sett under utvecklingen av HCC. Litteraturen gav kända leverstelhetsvärden för råttor, möss och människor under fibros, cirros och HCC och syftet var att komma så nära dessa värdensom möjligt 28,29,30,31,32. De tio formuleringarna i tabell 2 utarbetades i tre exemplar och lagringsmodulen för var och en fastställdes med hjälp av en reometer, enligt resultaten i figur 8.
| Formulering | Fibrinogen (mg/ml) | Kollagen (mg/ml) |
| 1 | 60 | 2 |
| 2 | 50 | 2 |
| 3 | 40 | 2 |
| 4 | 30 | 2 |
| 5 | 20 | 2 |
| 6 | 10 | 2 |
| 7 | 20 | 5 |
| 8 | 20 | 4 |
| 9 | 20 | 3 |
| 10 | 20 | 1 |
Tabell 2: Kollagen- och fibrinogenkombinationer i olika koncentrationer utvärderade med reologi för att bestämma stelhetsvärden
Figur 8: Hydrogelstelhetsvärden för kollagen- och fibrinogenkombinationer i olika koncentrationer utvärderade med reologi. Lagring modulus och förlust modulus fastställdes vid 37 °C och 1Hz med hjälp av en Discovery HR-2 Hybrid Rheometer (n = 3, Felstaplar = SD). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Av dessa tio formler valdes tre att gå vidare med. Dessa inkluderade 2 mg/ml kollagen typ I och 10 mg/mL fibrinogen motsvarande leverstelhetsvärden vid uppkomsten av fibros, 2 mg/ml kollagen typ I och 30 mg/mL fibrinogen motsvarande cirros och 2 mg/mL kollagen typ I och 40 mg/mL fibrinogen motsvarande HCC, se figur 9.
Figur 9: Hydrogelstelhetsvärden för olika fibrinogen/kollagenhydrgelformuleringar som valts att fortsätta med. Lagringsmodulus och förlustmodul bestämdes vid 37 °C och 1 Hz (n = 3, Felstaplar = SD). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Livskraft, läkemedelsrespons och metastaserad potential
Resultaten från AlamarBlue-analysen visade en övergripande minskad cell livskraft inom 2D-samkulturen, lägre än förväntat baserat på de kända rapporterade IC 25-, 50- och 75-värdena, jämfört med den obehandlade kontrollen, se figur 10. Detta kan hänföras till LX2-cellerna i vår samkultur som är mer känsliga för Doxorubicin behandling. Men i vår 3D-modell märkte vi och ökade doxorubicinresistens, vilket bekräftar minskningen av kemoterapeutisk potential som ofta ses i 3D-modellsystem. Statistisk signifikans jämfört med kontroller bedömdes med hjälp av Student T-testet (tvåstjärtat), med P<0,05 anses signifikant.
Figur 10: Procentuell cell livskraft för en 2D-samkulturmodell jämfört med 3D-modellen efter behandling med Doxorubicin vid olika koncentrationer under en period av 72h. Resultaten normaliserades i förhållande till den obehandlade kontrollen (n=3, felstaplar = SD) (* = p<0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Gelkonstruktionerna inspekterades visuellt dagligen med hjälp av ett lätt mikroskop för att följa celltillväxt inom olika koncentrationer av hydrogelerna. Celler fyllde hydrogelerna på ett homogent och kompakt sätt, från dag 7 började sfäroider monteras i matrisen.
Discussion
Detta protokoll beskriver utvecklingen av en metod för att skapa en biomimetisk modell för HCC. Ett tydligt arbetsflöde har upprättats och de kritiska stegen har identifierats. Dessa kritiska steg inkluderar beredning av fibrinogen stamlösningen, beläggning av skären med kollagen och sådd av cellerna inbäddade i hydrogelen. Under beredningen av fibrinogenlagerlösningen är det viktigt att tillsätta fibrinogenen i mindre steg vid högre koncentrationer. Detta kommer inte bara att minska den tid det tar för fibrinogen att lösas upp utan kommer också att förhindra fibrinogen från att gelling inkonsekvent och för tidigt som ses i figur 11. Beredningen av fibrinogengelen tar en betydande tid och detta kan påverka den övergripande experimentella framgången. Resultaten indikerar att när fibrinogengelen börjar gel inkonsekvent är det bäst att kassera den. Skären ska vara belagda med kollagen, tvättas med PBS och torkas i laminär flödeshuv innan cellerna bäddas in i hydrogeler. Om du inte ser till att skären är torra kommer hydrogelerna att spilla över skärets kanter, vilket resulterar i en ojämn gel. Gelens ojämnhet kommer i slutändan att påverka resultaten där diffusion är en faktor.
Figur 11: Beredning av fibrinogengel för fibrinogen/kollagenhydrgelformuleringar. (A) Fibrinogen gellösning som har bildat klumpar och börjat gel för tidigt med olöst fibrinogen som följer röret. (B) Fibrinogen gellösning som har lösts upp helt, lösningen är klar och något mer trögflytande. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Det rekommenderas att arbeta så snabbt som möjligt medan hydrogelcellsupphängningen sås på skären, eftersom fibrinogenkomponenten börjar korsa länken med tillsats av trombin. Förbered mindre arbetsvolymer i taget när du arbetar med gelupphängningar vid högre koncentrationer för att förhindra att gelén korsar länken under sådd. Den senare kommer att ha en effekt på fördelningen och mängden gel som sås på varje brunn. Ordningen för att lägga till komponenterna är avgörande, i det här protokollet tillhandahöll vi ett strömlinjeformat arbetsflöde för att förhindra geler från att korslänka i förtid. På grund av hydrogelgelgelens viskositet rekommenderas att arbeta med en skuren pipettspets under blandning och mätning. Vid blandning av suspensionen se till att detta görs snabbt och jämnt för att skapa en homogen suspension. Ojämn blandning resulterar i en heterogen gel som kommer att påverka resultaten negativt, se figur 12.
Bild 12: Kollagen/fibrinogengeler sådda på 12 brunnsplattor. Alla geler sådda på en volym av 200 μL innehållande 2 mg/ml kollagen och 20 mg/ml fibrinogen med 2,0 x 106 celler/ml. A)Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ojämn fördelning av hydrogelerna. B)Hydrogeler homogent blandade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Efter protokolloptimeringen utvärderades modellen för att bestämma modellernas biofysiska egenskaper. Reologidata visade att vår modell, bestående av fysiologiskt relevanta extracellulära matriskomponenter nämligen kollagen typ I och fibrinogen, kunde efterlikna de biofysiska egenskaperna hos en fibrotisk, cirryttisk och HCC lever28,29,30,31,32. Recapitulating leverstelhet i 3D-modeller för HCC är av stor betydelse och förbises ofta under modellutveckling. Ökad leverstelhet är relaterad till kemoterapeutisk resistens, spridning, migration och vilande inom HCC38. Medan aktiveringen av lever stellate celler i HCC är associerad med ökad extracellulär matris styvhet, med flera signalering vägar som är associerade med dessa lever stellate celler visar mekanosensitivitet39.
Införandet av stroma associerade celler såsom lever stellate celler och endotel cell i utvecklingen av 3D modeller för HCC har blivit alltmer relevant. Studier visar att multicellulära sfäroider bestående av lever stellat och HCC celler resulterade i ökad kemoterapeutisk resistens och invasiv migration, samtidigt härma HCC tumör utseende in vivo, jämfört med en PXT möss modell och mänskliga HCC vävnad prover17. En liknande studie av Jung et al., 2017 fann multicellulär sfäroid bestående av hepatocellulär carcinom (Huh-7) och endotelceller (HUVEC) främjade vaskularisering och aggressivitet22. Dessa sfäroider visade livskraft vid betydligt högre koncentrationer av doxorubicin och sorafenib jämfört med Huh-7 monokultur sfäroider22. Utvärderingen av vår modells livskraft och svar på doxorubicin, med styvhetsvärden som motsvarar HCC och införandet av stroma associerade celler (LX2 och HUVEC), visade en liknande minskning som svar på kemoterapeutiska medel jämfört med en 2D co-culture modell. Således, effektivt härma läkemedelsresistens som vanligtvis ses hos patienter och andra 3D HCC-modeller.
Eftersom detta är ett modulärt system kan modellen förstärkas genom tillsats av andra extracellulära matriskomponenter nämligen laminin och hyaluronsyra. Alternativt kan de nuvarande hydrogelerna som används inom denna modell ersättas med syntetiska hydrogeler som natriumalginat eller chitosan. Ytterligare modifieringar av den nuvarande modellen kan vara att ersätta cellinjerna med primära cellkulturer för att producera en ännu mer fysiologiskt relevant modell eller använda kombinationer av andra tumör- och stromalcellslinjer.
Vi har därmed framgångsrikt utvecklat en 3D-modell med tunable bio-fysiska egenskaper för att studera tumör-stroma interaktioner i HCC. Vi har funnit vår modell vara mer representativ för in vivo-situationen jämfört med traditionella 2D-kulturer som svar på doxorubicin. Det finns dock fortfarande mycket att göra, vi hoppas kunna karakterisera denna modell i stor utsträckning och utforska modellen som en möjlig metastaserad plattform för att svara på mer komplexa och brådskande frågor som finns kvar i studien HCC.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades genom bidrag från Cancerfonden, CAN2017/518), Svenska föreningen för medicinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons stiftelse och Olga Jönssons stiftelse. Dessa finansieringskällor var inte involverade i studiens utformning. Insamling, analys och tolkning av uppgifter. Skrivning av rapporten. och i beslutet att lämna in artikeln för publicering. 3D-utskrift av specialdesignade distanser som används i detta protokoll utfördes på U-PRINT: Uppsala universitets 3D-printinganläggning vid Disciplinområdet medicin och farmaci, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vill tacka Paul O'Callaghan för hans värdefulla bidrag till vårt projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
| Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
| CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
| Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
| Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
| Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
| Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
| Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
| Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
| Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
| Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
| Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
| Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
| TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
| TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
| Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |
References
- Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
- Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
- Balogh, J., et al.
- Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
- Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
- Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
- Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
- Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
- Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
- Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
- Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
- Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
- Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
- Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
- Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
- Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
- Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
- Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
- Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
- Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
- Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
- Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
- Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
- Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
- Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
- Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).
