Summary
Aktiveringen av den multifunksjonelle Ser/Thr kinase AURKA er preget av autofosforylering på Thr288. Fluorescerende sonder som er avhengige av FRET, kan diskriminere mellom inaktive og aktiverte tilstander. Her illustrerer vi noen strategier for sondeteknikk, sammen med en rask FRET-protokoll for å følge kinaseaktiveringen gjennom mitose.
Abstract
Epitelkreft er ofte preget av overekspresjon av Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA er et multifunksjonelt protein som aktiverer ved autofosforylering på Thr288. AURKA overflod topper i mitose, hvor det styrer stabiliteten og troskapen til den mitotiske spindelen, og den generelle effektiviteten av mitose. Selv om det er godt karakterisert på strukturelt nivå, mangler en konsistent overvåking av aktiveringen av AURKA gjennom hele cellesyklusen. En mulig løsning består i å bruke genetisk kodede Försters Resonance Energy Transfer (FRET) biosensorer for å få innsikt i autofosforylering av AURKA med tilstrekkelig romlig oppløsning. Her beskriver vi en protokoll for å konstruere FRET biosensorer som oppdager Thr288 autofosforylering, og hvordan du følger denne modifikasjonen under mitose. For det første gir vi en oversikt over mulige donor/akseptor FRET par, og vi viser mulige klonings- og innsettingsmetoder for AURKA FRET biosensorer i pattedyrceller. Deretter tilbyr vi en trinnvis analyse for raske FRET-målinger ved fluorescenslevetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) på et spesialbygget oppsett. Denne protokollen gjelder imidlertid også for alternative kommersielle løsninger som er tilgjengelige. Vi avslutter med å vurdere de mest hensiktsmessige FRET-kontrollene for en AURKA-basert biosensor, og ved å fremheve potensielle fremtidige forbedringer for å øke følsomheten til dette verktøyet ytterligere.
Introduction
Aurora kinase A/AURKA er en multifunksjonell serin/treonin kinase, aktiv gjennom hele cellesyklusen og ved forskjellige subcellulære rom1. Å forstå den brede romlige aktiveringen er spesielt viktig i kreft, da AURKA ofte er overekspressert i epitel- og hematologiske maligniteter, med pasienter som viser dårlig respons på dagens tilgjengelige terapier2.
Strukturelle studier viste at AURKA gjennomgår to trinn for å konvertere fra en inaktiv til en aktiv kinase. For det første endrer autofosforylering av Thr288 konformasjonen av kinasens kinetiske lomme og aktiverer den3,4,5,6. Dette trinnet øker den katalytiske aktiviteten til AURKA i menneskelige celler og i Xenopus laevis3,6,7, og grunner kinase for full aktivitet. Når den er aktivert, induserer samspillet mellom AURKA og målproteinet for Xklp2 (TPX2) en ny konformasjonsendring5. Denne videre modifikasjonen gjør at AURKA kan nå full enzymatisk aktivitet mot sine substrater i cellen5,8,9,10.
I nesten to tiår ble innsikt i aktivering og aktivitet av AURKA oppnådd hovedsakelig gjennom en kombinasjon av biokjemiske tilnærminger. Disse inkluderer påvisning av fosforert Thr288 i celler eller in vivo som et kjennetegn på AURKA-aktivering, krystallografiske analyser og in vitro eller i cellulo kinase analyser for å sondere aktiviteten til AURKA1. Imidlertid er den romlige oppløsningen av disse tilnærmingene dårlig eller fraværende, og nye løsninger var nødvendige for å utvide kunnskapen om dynamikken i disse to hendelsene.
Utviklingen av fluorescerende sonder de siste årene forenklet overvåkingen av AURKA i levende celler, slik at følgende aktivering med større romlig oppløsning. De mest spesifikke sensorene for AURKA utviklet så langt er avhengige av FRET-prinsippet (Förster's Resonance Energy Transfer)11 for å diskriminere mellom inaktiv og aktiv AURKA. Den første sensoren som ble utviklet var en substratbasert biosensor av AURKA kinase aktivitet. Substratbaserte biosensorer består av en kort aminoacidisk sekvens målrettet av en gitt kinase for fosforylering, og settes inn i et donor/ akseptor FRET-par og et bindende domene som gjenkjenner fosforylerte rester, noe som hjelper folding av biosensoren for en effektiv FRET-prosess12. Når det gjelder AURKA, ble et 14-aminoacid fragment av KIF2C målrettet av fosforylering satt inn mellom en CFP-YFP donor / akseptorpar13. Denne sensoren har imidlertid noen store ulemper. For det første kan KIF2C-sekvensen som brukes i denne sonden målrettes både av AURKA og den nært beslektede kinase AURKB, og dermed redusere spesifisiteten til denne biosensoren. For det andre er sensoren avhengig av endogene kinase for fosforylering. Derfor kan FRET-effektiviteten være uoppdagelig eller ikke signifikant hvis mengden av kinasen begrenser (f.eks. i subcellulære rom eller cellesyklusfaser). For å overvinne disse begrensningene ble en ny klasse AURKA-sensor opprettet kjent som "konformasjonssensorer". I disse sondene ble sekvensen av AURKA i full lengde satt inn i en donorfluofor ved N-terminus, og en akseptorfluofor ved C-terminus. Inaktiv AURKA presenterer en "åpen" konformasjon, som bringer kinasens N- og C-termini bort fra hverandre. Med en slik avstand mellom de to terminiene (> 10 nm) er donor/akseptorparet i en ikke-tillatt konfigurasjon for FRET. Tvert imot vedtar autofosforert AURKA en "lukket" konformasjon, med de to protein termini og de to fluoroforene i nærheten. Dette viste seg å tillate FRET mellom giveren og akseptoren, som kan måles ved hjelp av variasjonene i donorlevetiden14,15. Slike sonder presenterer flere fordeler. For det første er de genetisk kodet, og de kan brukes til å erstatte den endogene kinasen i cellen. For det andre redder de fenotypene som er indusert av nedslag av AURKA, noe som indikerer at de er funksjonelle i cellen. For det tredje tillater de å følge aktiveringen av kinase ved forskjellige subcellulære rom og gjennom hele cellesyklusen. Sondene oppdaget aktiveringen av AURKA på steder der kinase er kjent for å være aktivert (dvs. sentrosomer og den mititotiske spindelen), og deltok også i å oppdage aktiveringen av AURKA ved mitokondriene16. Til slutt tillot disse sensorene screeninger med høyt innhold basert på FRET/FLIM, der konformasjonsendringene til AURKA ble brukt til å identifisere nye farmakologiske hemmere17.
I det nåværende arbeidet beskriver vi en prosedyre for å visualisere AURKA-aktivering i dyrkede celler. Først vil vi gi et innblikk i potensielle fluoroforpar for FRET. Valget av det mest passende donor/akseptorparet vil bli gjort i henhold til det tilgjengelige mikroskopoppsettet, eller en bestemt nedstrømsapplikasjon som multiplex FRET18,19. Deretter foreslår vi en rørledning for å utforske oppførselen til biosensoren (e) som er valgt i et raskt FRET / FLIM mikroskopoppsett. Denne rørledningen vil strekke seg fra cellekultur og synkroniseringsprosedyrer til FLIM-innsamling og dataanalyse. Til slutt vil vi diskutere de potensielle fordelene ved denne protokollen, da en analog strategi for biosensordesign kan brukes på andre kinaser, og den kan også brukes med andre FRET-baserte bildesystemer.
Protocol
MERK: U2OS-celler som brukes i denne protokollen ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, HTB-96), og de ble testet fri for mykoplasma. Trinn 2.1 til 2.7 bør utføres under en laminær strømningshette for å holde celler og reagenser sterile.
1. Velge donor/akseptor FRET-par
- Se litteraturen for valg av de mest egnede donor/akseptor FRET par. Nyttige eksempler finnes i20,21,22,23,24, selv om det endelige valget må gjøres i henhold til egenskapene til FRET / FLIM-oppsettet (tilgjengelige laserlinjer, filtre, etc.). Nedenfor finner du noen hensyn til hvordan du velger et donor-/akseptorpar.
- Velge donor: se FP-basen (https://www.fpbase.org/) for et komplett sett med informasjon om tilgjengelige fluorescerende proteiner. Denne databasen oppdateres kontinuerlig med alle nyutviklede fluoroforer.
- Se Fluorescent Biosensor Database (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) for mer informasjon om biosensorene som allerede er tilgjengelige i litteraturen, sammen med de respektive fluorescerende proteinene som brukes.
- Som et generelt utgangspunkt, velg en lys donor fluorofor. Gode kandidater er cyan fluorescerende proteiner som mTFP1 eller ECFP, eller GFP-varianter som EGFP eller mEGFP.
- Oligomerer kan påvirke proteinlokalisering og/eller funksjon25. Vurder å bruke monomeriske mutanter av CFP som mTurquoise226, eller Aquamarine27,28. Disse variantene har også gode kvanteutbytte og utryddelseskoeffisienter, noe som gjør dem til gode kandidater som FRET-givere.
- Gi preferanse til fluorescerende proteiner (både som donor eller akseptorer) ufølsomme for miljøendringer som intracellulær pH23, eller til fotobleaching25, da FRET-effektivitet kan påvirkes sterkt av disse parametrene29. I dag brukes fluoroforer som mTurquoise2 eller mTFP1 mye som donorer, takket være deres gode fotostabilitet22,25,26.
- Velge akseptor: cyan donorer er ofte forbundet med Yellow Fluorescent Protein (YFP) varianter, som mVenus, Citrine, og YPet20,21,22,30. Det skal imidlertid bemerkes at disse proteinene har en mye større følsomhet for pH, og globalt viser en dårlig fotostabilitet.
- Vurder å bruke nyutviklede, pH-ufølsomme gule varianter av YFP som pH-Lemon31, grønne fluoroforer som mNeonGreen23 eller røde fluoroforer som mScarlet-I23,32 som tidligere validerte fluorescerende akseptorer for mTurquoise2.
- Alternativt kan du vurdere å bruke ikke-fluorescerende/mørke derivater av YFP som ShadowG33 eller ShadowY34, som viste seg å oppføre seg som gode akseptorer for cyan-fluorescerende donorer i FRET/FLIM-eksperimenter.
- Hvis du bruker mEGFP som donor, bør du vurdere å bruke monomeriske røde akseptorer som mCherry.
- Kontroller spektralegenskapene til det valgte donor-/akseptorparet ved hjelp av verktøyene som er tilgjengelige på FP-basisnettstedet. Se figur 1 for et eksempel på mEGFP/mCherry-paret.
- Velg rullegardinmenyen Verktøy på FP-basisnettstedet, og velg Spectra-visningsprogram.
- I rullegardinmenyene skriver du inn navnet på fluoroforparet for å visualisere (f.eks. mEGFP og mCherry).
- Simuler egenskapene til donor-/akseptorparet med en bestemt lyskilde ved å velge en gitt laser i rullegardinmenyen. Alternativt kan du angi en bestemt laserbølgelengde ved å velge Legg til laser. Klikk på Normaliser utslipp til dette alternativet for å justere fluoroforspektraet til ønsket bølgelengde. Her er bølgelengden som brukes til å begeistre GFP på 480 ± 10 nm.
- Klone det valgte donor/akseptorparet ved å tilsette en fluorofor ved N-terminus av full lengde sekvens av AURKA, og en på C-terminus. Følg retningslinjene for den foretrukne kloningsmetoden for å sette inn denne konstruksjonen i en pattedyr uttrykk vektor av valg.
2. Cellekultur, transfeksjon og synkronisering
- DAG 1. Forbered kulturmedium for U2OS-celler: bruk Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin og 1% L-Glutamine (herfra, Komplett vekstmedier). Alternativt kan DMEM med forhåndssupplert L-Glutamine også brukes.
- Hvis cellene er frosset, tiner du et hetteglass minst 8 dager før eksperimenter (dvs. fra punkt 2.5 på).
- Vokse celler i en inkubator dedikert til pattedyr celle kulturer ved 37 °C og med 5% CO2. Rengjør og steriliser inkubatoren regelmessig for å unngå forurensninger.
- Når cellene når ~ 80% samløp:
- Vask dem kort med steril 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) uten Ca2+ og Mg2+.
- Prøv celler med sterile 0,05% Trypsin-EDTA i henhold til produsentens protokoll og ved å plassere celler i inkubatoren i 1-3 min.
- Deaktiver trypsin ved å legge til dobbelt så mye som volumet av komplette vekstmedier. bland godt.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 800 x g i 3-5 min.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og beregn riktig fortynning for at de skal være på ~ 70-80% samløp i kammersklier dagen etter. Alternativt kan lignende støtter for levende celleavbildning også brukes.
- Rør det tilsvarende volumet av celler i den valgte live celleavbildningsstøtten, og plasser cellene tilbake i inkubatoren til dagen etter.
- DAG 2. Fortsett med transfeksjon. Følg retningslinjene for de foretrukne forbigående transfeksjonsmetodene for å oppnå optimal transfeksjonseffektivitet (~50/80%). Ingen spesifikk transfeksjonsmetode er nødvendig. Vær oppmerksom på at transfeksjonseffektiviteten kan variere avhengig av cellelinjen som brukes. Inkuber i 48 timer.
MERK: Produser stabile kloner som inneholder hver av de tre vektorene for å omgå behovet for forbigående transfeksjoner. På dette stadiet bør to typer kontroller planlegges. For det første er det nødvendig med en "kun donor"-kontroll for å bekrefte at tilstedeværelsen av AURKA i full lengde ikke forlenger levetiden til mTurquoise2 i seg selv. For det andre bør en biosensor med en kinase-død mutasjon brukes som en negativ kontroll der FRET avskaffes eller senkes betydelig. Alternativt til en kinase-død mutant, kan en kjemisk hemmer av AURKA-aktivering som ATP-analog MLN8237 brukes som en negativ kontroll.- Planlegg tre transfeksjonsbetingelser fremover, hver av dem i en uavhengig brønn:
"Donor-only"-vektoren (f.eks.
"Biosensoren" (f.eks. superYFP-AURKA-mTurquoise2)
En kinase-død/"K162M" biosensor (f.eks. superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) eller alternativt en hemmer av AURKA-aktivering (f.eks. MLN8237) - Utfør tre betingelser for hvert uavhengig donor/akseptorpar som skal sammenlignes.
- Vurder å doble antall transfiserte brønner hvis du sammenligner usynkroniserte og G2/M-synkroniserte celler (se trinn 2.6).
- Planlegg tre transfeksjonsbetingelser fremover, hver av dem i en uavhengig brønn:
- DAG 3. Synkroniser celler i G2/M. Tilsett 100 ng/ml nokodazol oppløst i DMSO til hver transfekterte brønn unngå lyseksponering og inkuber i 16 timer (helst over natten). Hvis du sammenligner usynkroniserte og G2/M-synkroniserte celler, behandler du hver transfeksjonsbetingelse med nokodazol eller med et likt volum DMSO. For bedre synkroniseringseffektivitet, lag engangs aliquots av nocodazol i DMSO, lagre dem ved -20 °C og kast dem etter bruk.
MERK: Cellesynkroniseringseffektiviteten kan variere mellom cellelinjer. Den optimale konsentrasjonen av nokodazol og dens inkubasjonstid bør eksperimentelt bestemmes av strømningscytometri tilnærminger før FRET / FLIM eksperimenter. For statistisk relevante FRET/FLIM-analyser anbefaler vi en synkroniseringseffektivitet i G2/M på minst 50 % av den totale cellepopulasjonen. - DAG 4. Nokodazolvask og FRET/FLIM-avbildning på mititotiske celler
- Fjern kulturmediet med en pipette og erstatt det med forvarmet, steril PBS. Unngå lyseksponering hvis mulig. Gyng platen forsiktig.
- Gjenta vaskeprosedyren, unngå alltid lyseksponering.
- Fjern den andre PBS-vasken og erstatt den med forvarmet, steril Leibovitz L-15 medium, supplert med 20% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% Penicillin-Streptomycin (herfra, bildemedier).
MERK: Bildemedier bør kjøpes uten pH-indikatorer (f.eks. fenolrøde) og mellomstore komponenter som riboflavin. Disse stoffene er en kilde til autofluorescence som kan perturb levetidsverdier. - Fortsett med FRET/FLIM-avbildning. Minimer raske temperaturendringer og fortsett til bildetrinnet (trinn 3) så raskt som mulig. Vurder å beskytte prøven mot lys mens du transporterer den til mikroskopoppsettet (dvs. ved å pakke den inn i en aluminiumsfolie eller plassere den i en boks).
3. FRET/FLIM oppkjøp
MERK: FRET/FLIM-anskaffelser i denne protokollen ble utført på et spesialbygd oppsett, beskrevet i 35 og utstyrt med en kontrollløsning som i15,17 (figur 2). Oppsettet kommersialiseres nå av Inscoper, og det er laget av et spinnende diskmikroskop med en hvit laser for pulserende eksitasjon, og en høy hastighet tidsportert forsterker foran kameraet. Temporale porter på 2 ns i et tidsvindu på 10 ns brukes sekvensielt for å få en stabel med fem tidsinngjerdede bilder. Disse bildene brukes deretter til å beregne piksel-for-piksel gjennomsnittlig fluorescens levetid i henhold til følgende ligning: τ = ΣΔti • Ιi / ΣΙi, hvor Δti tilsvarer forsinkelsestiden for den ith porten mens jeg indikerer piksel-for-piksel tid-inngjerdet intensitet bilde35,36 . Denne metoden sikrer raske FLIM-målinger: Ingen monterings- eller binning-trinn er nødvendig, og levetiden kan beregnes i en online modus, med minimalt fotonbudsjett. Systemet presenterer også et brukervennlig programvaregrensesnitt. Det samme eksperimentet kan imidlertid utføres under alle andre kommersielle mikroskopoppsett utstyrt for FLIM-målinger.
- For å sikre en optimal frigjøring av celler fra G2/M-blokken til mitose, utfør eksperimenter ved 37 °C. Hvis det er mulig, utfør FRET/FLIM eksperimenter med mikroskopoppsett utstyrt med et termostatkammer.
- Slå på mikroskopets termostatkammer minst 30 min til 1 time før eksperimentet.
- Slå på laseren, kameraet, mikroskopoppsettet og bildebehandlingsprogramvaren (figur 2).
- Velg de riktige eksitasjons- og utslippsbølgelengdene for donorfluoreore. Praktiske bølgelengder alternativer er: λex 440/10 nm og λem 483/35 nm for mTurquoise2 (Figur 3A); λex 488/10 nm og λem 525/50 nm for GFP) (figur 3B).
- Angi eksponeringstiden, vanligvis mellom 30 og 100 ms (figur 3). Vær oppmerksom på at overdreven laserkraft kan føre til induserte fototoksiske effekter som fotobleking, noe som igjen kan endre fluorescenslevetiden37. På oppsettet validerer du fraværet av fotobleaching hendelser ved å overvåke fluorescensintensiteten til den første porten under tidsforløp oppkjøp. Hvis variasjoner i fluorescensintensiteten er observerbare, kast bort oppkjøpet og juster laserkraften.
MERK: I oppsettet her velger du en eksponeringstid som tillater minst 3000 grå nivåer i den første porten; Ellers vil programvaren ikke beregne donorlevetid. Denne grå nivåverdien tilsvarer det minimale fotonbudsjettet som er nødvendig for å oppnå relevante levetidsverdier. - Før du starter FRET/ FLIM-oppkjøp, må du sørge for at cellene har kommet inn i mitose ved å vente til utseendet på den bipolare spindelen (~ 20/30 min i U2OS-celler). Siden mititotisk AURKA hovedsakelig lokaliserer ved denne strukturen, verifiserer du mititotisk progresjon ved å screene dannelsen av spindelen i celler direkte under mikroskopet, med en ekstern lyskilde (figur 1). Vær oppmerksom på at tiden som kreves for mititotisk progresjon, kan variere avhengig av cellelinjen som brukes.
- Hvis behandling med MLN8237 er planlagt, plasser cellene under mikroskopet og la dem nå metafase (ca. 20 min etter nokodazolvask). Tilsett 250 nM MLN8237 oppløst i DMSO både i celler som uttrykker donorkonstruksjonen og til celler som uttrykker biosensoren.
- Kontroller denne tilstanden på celler som er transfektert som ovenfor, og inkuber med et likt volum DMSO. For en bedre AURKA-hemming, lag engangs aliquots av MLN8237 i DMSO, lagre dem ved -80 °C. Tin dem ved å plassere aliquots på is, og kast dem etter bruk.
- Inkuber i 10 min. Etter denne perioden vil den mitotiske spindelen krympe og bare en enkelt, intens prikk er igjen. En lignende fenotype observeres når K162M mutanter brukes.
- Hvis du vil ha en bedre oppløsning av den mititotiske spindelen, bruker du minst 63x objektiv (figur 3).
- Når du har funnet en celle i metafase (se figur 4 som et eksempel på en celle i metafase), justerer du xyz-koordinatene for å plassere den midt i synsfeltet.
- Hvis du vil ha raskere bilder, velger du ett enkelt z-plan . Velg planet der den mitotiske spindelen er mer synlig eller intens.
- Start innspillingen. Anskaffelsestiden kan variere avhengig av FLIM-oppsettet som brukes (fra få sek til min). De fleste kommersielle oppsettene som er tilgjengelige på markedet, vil utdype både fluorescensmikrografen og pixel-by-pixel-levetidskartet. Lagre begge bildene.
- Skaff minst 10 uavhengige bilder fra hver transfeksjons- og/eller behandlingstilstand.
4. Beregning av ΔLifetime og sammenligning av FLIM-verdier blant donor/akseptorpar
- Trekk ut levetidsverdier fra hele piksel-for-piksel-levetidskartet (dvs. hele den mititotiske spindelen), eller velg interesseområder (ROIer) som tilsvarer bestemte underregioner.
MERK: I henhold til FRET/FLIM-oppsettet som brukes, kan levetidsberegninger utføres direkte på anskaffelsesprogramvaren, eller trekkes ut med generiske bildebehandlingsløsninger (f.eks. Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/). Programvare som direkte beregner levetidsverdier (også kjent som online-modus) tilbyr en mer brukervennlig løsning, som passer for nybegynnere og for mikroskopibrukere som ikke er fullt kjent med FRET / FLIM. Tvert imot krever utvinning av levetidsverdier etter oppkjøp ofte en monteringsprosedyre. Dette alternativet er mindre tilgjengelig for nybegynnere, da noe tidligere kunnskap om matematiske modeller for montering er nødvendig. - Når den er visualisert eller ekstrahert, beregner du gjennomsnittlig levetid for cellene som uttrykker "donor-only"-vektoren (f.eks.
- Trekk hver uavhengige levetidsverdi beregnet i trinn 4.1 fra gjennomsnittlig giverlevetid. Å gjenta dette trinnet for alle celler under alle analyserte forhold vil gi ΔLifetime for hver tilstand.
- Sammenlign ΔLifetime-verdier for "donor-only", "biosensor" og "K162M", eller DMSO- og MLN8237-forholdene.
MERK: For tilstanden "kun donor" skal ΔLifetime resultere i verdier nær null og tilsvare de eksperimentelle svingningene i levetidsverdier. For tilstanden "biosensor" skal ΔLifetime-verdier gi nettoforskjellen mellom de to konstruksjonene (se figur 4 for et illustrert eksempel). - Sammenlign ΔLifetime-verdier mellom forskjellige donor-/akseptorpar.
- Sammenlign "biosensor" forholdene: viser de lignende ΔLifetime?
- Viser forholdene "K162M" eller MLN8237 lignende ΔLifetime blant dem? Ligner deres ΔLifetime på den "donor-only" tilstanden?
Representative Results
Vi fulgte prosedyren beskrevet ovenfor for å registrere autofosforylering av AURKA på Thr288 ved hjelp av to biosensorer med forskjellige spektralegenskaper. Vi sammenlignet den første GFP-AURKa-mCherry-sonden14 med to biosensorer med forskjellige spektralegenskaper. Disse to sondene er avhengige av fluorescerende donor mTurquoise2 og på en ikke-fluorescerende akseptor (ShadowG) i ett tilfelle, eller en gul akseptor (superYFP) i et annet tilfelle. Deretter satte vi inn AURKA-sekvensen i full lengde i hvert donor-/akseptorpar. For å ha en negativ kontroll for AURKA-aktivering, kan to strategier forfølges. For det første forstyrrer bruken av en liten ATP-analog (MLN8237) bindingen av ATP i kinasens kinetiske lomme og forhindrer aktiveringen38. For det andre skaper mutasjonen av Lys162 til Met (K162M), en kinase-død versjon av hver biosensor som ikke er i stand til å aktivere14,15,39. Denne mutasjonen induserer forstyrrelsen av en saltbro som normalt er etablert mellom Lys162 og Glu181, noe som resulterer i en stabil åpning av kinasens kinetiske lomme og utløser den generelle inaktiveringen40. Som en negativ kontroll for FRET brukte vi en akseptor-blottet konstruksjon (GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2).
Etter å ha synkronisert celler i G2/M og sluppet dem ut i mitose, målte vi levetiden til alle de transfiserte konstruksjonene ved den mititotiske spindelen (figur 4). Vær oppmerksom på at denne strukturen ble ansett som en helhet, og ingen ROIer i spindelen ble analysert. Deretter beregnet vi ΔLifetime for alle forhold. Som forventet var levetiden til GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2 (de "kun donor"-forholdene) nær 0, noe som indikerer at verdiene målt for disse konstruksjonene svingte rundt gjennomsnittsverdien (figur 4A,4B). På den annen side var ΔLifetime-verdiene for GFP-AURKA-mCherry statistisk forskjellig fra donor-tilstanden, med ΔLifetime som økte på ~ 130 ps (figur 4A). Lignende observasjoner ble gjort for shadowG-AURKA-mTurquoise2 og for superYFP-AURKA-mTurquoise2, med ΔLifetime økende på henholdsvis ~ 150 og ~ 220 ps fra donor-tilstanden (figur 4B,4C). Disse dataene kan enkelt visualiseres i enkeltceller med en pseudofargeoppslagstabell (LUT). I dette tilfellet er verdiene til ΔLifetime rundt 0 pseudofarget gule, mens mer signifikante forskjeller er pseudofarget rød / lilla. Faktisk var pixel-by-pixel LUT nærmere gult i celler som uttrykker donorkonstruksjonene, mens det var mer i det røde / lilla spekteret i celler som uttrykte enten biosensor (figur 4A,4B). Dette ble også observert da GFP-AURKA-mCherry biosensor ble behandlet med den farmakologiske hemmeren MLN8237.
Vi analyserte deretter ΔLifetime av kinase-døde biosensorer. Disse konstruksjonene viste mellomliggende ΔLifetime-verdier: ΔLifetime var betydelig høyere sammenlignet med donor-tilstanden (figur 4B,4C), men den var også betydelig lavere enn deres normale kolleger (figur 4B,4D). Sammenligningene med celler behandlet med MLN8237 eller uttrykk for kinase-døde biosensorer er nødvendige for å estimere om ΔLifetime-variasjoner for hvert donor/akseptorpar utelukkende er knyttet til aktiveringen av AURKA. Når det gjelder GFP-AURKA-mCherry, avskaffes ΔLifetime-variasjoner når en AURKA-spesifikk hemmer brukes. Derimot er ΔLifetime-variasjoner for det meste, men ikke utelukkende knyttet til AURKA-aktivering når det gjelder shadowG-AURKA-mTurquoise2 og superYFP-AURKA-mTurquoise2.
Figur 1: GFP (donor) og mCherry (akseptor) eksitasjons- og utslippsspektra.
Spectra ble innhentet og tilpasset fra FP-basens nettside (https://www.fpbase.org/), og justert til en 480 nm-lasereksitasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilde av det eksperimentelle arbeidsområdet.
(1) Kontrollløsningen; (2) hvit laserkilde; (3) CCD-kamera; (4) mikroskop oppsett; (5) ekstern lyskilde/lampe for okulær screening av prøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av programvaren for FLIM-anskaffelse.
(A, B) (1) eksitasjons- og utslippsparametere for giveren (CFP i A, eller GFP i B); (2) eksponeringstid; (3) valg av målsetting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av AURKA FRET biosensorer og deres negative kontroller.
(A) (Mikrografer) Fluorescens (grønn kanal) og tilsvarende pixel-by-pixel ΔLifetime (kun donor – biosensor) av U2OS-celler som uttrykker GFP-AURKA eller GFP-AURKA-mCherry, synkronisert ved G2/M, utgitt til den bipolare spindelen er synlig og deretter behandlet med DMSO eller med MLN8237. ΔLifetime er illustrert med en pseudofargeskala («Brann»-oppslagstabell). (Graf) Tilsvarende kvantifisering og toveis ANOVA-analyse for de angitte forholdene. (B) (Mikrografer) Fluorescens (cyan kanal) og tilsvarende pixel-by-pixel ΔLifetime (kun donor – biosensor) av U2OS-celler som uttrykker shadowG-AURKA-mTurquoise2 (øvre panel) eller superYFP-AURKA-mTurquoise2 (nedre panel), synkronisert ved G2/M og utgitt til den bipolare spindelen er synlig. ΔLifetime er illustrert med en pseudofargeskala («Brann»-oppslagstabell). (Graf) Tilsvarende kvantifisering og enveis ANOVA-analyse av forhold representert i de ovennevnte mikrografene. (C) (Mikrografer) Bilder av AURKA-mTurquoise2 (øvre panel), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (mellompanel) og superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 ervervet og representert som i mikrografene. (Graf) Toveis ANOVA-analyse for de angitte transfeksjonsbetingelsene. Linjen i boxplots representerer medianen. whiskers strekker seg fra min til maks. n = 10 celler per tilstand av ett representativt eksperiment (av tre). Enkeltverdier representeres som prikker. Skalastang: 10 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mot hver indikert tilstand i (A) tilstanden "AURKA-mTurquoise2" i (B), og mot hver tilstand angitt i (C). NS: ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Genetisk kodede FRET biosensorer er pålitelige verktøy for å måle aktivering av enkeltproteiner eller hele signalveier41. Spesielt utgjør AURKA FRET biosensor en fortrinnsrett måte å utforske aktiveringen av kinase i tid og rom. Noen elementer fortjener imidlertid spesiell oppmerksomhet når du designer eller optimaliserer en FRET biosensor, ikke bare generelt, men mer spesifikt for AURKA.
For det første kan donor/akseptor FRET-parets natur og relative posisjon tilpasses for spesifikke funksjoner i denne kinase. AURKA er sterkt beriket ved den mititotiske spindelen under mitose, men den er til stede gjennom hele cellesyklusen og på forskjellige subcellulære steder (f.eks. sentrosomer, kjernen og mitokondriene) 1,2. Hvis biosensoren skal brukes i spesifikke rom som mitokondrier, som kan nå sur pH, bør valget av et pH-ufølsomt donor-akseptor FRET-par som mTurquoise2 / shadowG gjøres. Videre kan plassering av FRET-donoren ved C-terminus tillate en bedre visualisering av biosensoren ved dette subcellulære rommet, og potensielt til og med optimalisere FRET-deteksjon gitt at AURKA N-terminus ble vist å delvis spalte av ved mitokondrier16,42.
For det andre vil en ennå uutforsket måte å optimalisere AURKA FRET biosensor kreve en mer forsiktig design av linkers mellom full lengde AURKA og donor / akseptorparet. Ikke bare avstanden mellom det fluorescerende paret, men også egenskapene til linkeren selv viste seg å være nøkkelfaktorer for å forbedre FRET-effektiviteten43,44,45,46. I dette lyset kan det å øke stivheten eller fleksibiliteten til koblingen enten være skadelig for FRET-effektiviteten, eller forbedre den ytterligere.
For det tredje er det kjent at overekspressjonen av AURKA induserer mititotiske spindelavvik i en betydelig andel av cellene2. Det ville være interessant å sammenligne ΔLifetime oppnådd ved å uttrykke den samme FRET-konstruksjonen under en sterk promotor som cytomegalovirus (CMV) - en av de vanligste promotørene som finnes i pattedyruttrykksvektorer - eller under AURKA minimal promotorsekvens (CTTCCGG) 14,47. Denne promotoren ble tidligere vist å redde monopol eller multipolare spindler som oppsto etter nedslag av kinase, og bruken induserte ikke cellesyklusperturbasjoner per se14,47. Selv om FLIM er ufølsom for proteinuttrykksnivåer og relative konsentrasjoner i celle11, vil det å dra nytte av en grundig sammenligning av de to promotorene på samme biosensoroppsett utvide forståelsen av bassenget med aktivert AURKA til enhver tid. I tillegg vil det gi ny innsikt i hvordan AURKA-aktivering kan endres ved overekspression, noe som er relevant for epitel- og hematologiske kreftparadigmer.
Til slutt bør også nedstrøms FRET-applikasjonen tas i betraktning. Et fremtidig perspektiv innen AURKA ville være å kumulere kinase konformasjonsbiosensoren med en substratbasert biosensor. Å analysere FRET-oppførselen til to biosensorer samtidig – en prosess kjent som multiplex FRET – krever en mørk akseptor på den første biosensoren for å unngå spektralblødning gjennom i den andre giverkanalen. I sammenheng med AURKA ville dette åpne opp det spennende nye perspektivet for å oppdage aktiveringen av kinase med den første biosensoren, og dens enzymatiske aktivitet mot et gitt substrat med den andre. Den siste utviklingen i multipleksing gjør det nå mulig å kumulere opptil tre biosensorer om gangen48. Å bruke en lignende metode i sammenheng med AURKA kan representere en svært lovende strategi, ikke bare for å teste kinasens aktiveringsaktivitetsinterplay, men også for å utforske AURKA-signalkaskader med enestående romlig løsning.
Avslutningsvis er FRET/FLIM en praktisk måte å utdype kunnskapen om proteinaktivitet på. På den ene siden gjør det mulig å visualisere lokaliseringen av et gitt protein i levende celler, takket være minst en fluorescerende moiety. På den annen side kan det avdekke proteinkonformasjonsendringer, noe som kan være informativt om proteinaktivering og / eller aktivitet. Derfor har FRET / FLIM og konforme FRET biosensorer potensial til å bli utbredte metoder for å følge signalveier i levende celler, og med utsøkt romlig oppløsning.
Disclosures
G.B. utførte eksperimentene, skrev og gjennomgikk manuskriptet, og ga finansiering, M.T. gjennomgikk manuskriptet og ga støtte. M.T. er vitenskapelig rådgiver og aksjonær i Inscoper-selskapet (Frankrike), som produserer løsningene for raske FLIM-målinger vist i dette manuskriptet. Inscoper støttet delvis Open Access-publikasjonen av manuskriptet. Inscoper var ikke involvert i eksperimentell design, datahåndtering eller i skrivingen av manuskriptet.
Acknowledgments
Vi takker ingeniørene ved Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, France) for råd og hjelp, og spesielt X. Pinson for kritisk lesning av manuskriptet. MRic er medlem av den nasjonale infrastrukturen France-BioImaging støttet av Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-10-INBS-04). Dette arbeidet ble støttet av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère, og Foreningen pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) til G.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
| L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
| LabTek | Nunc | 2515380 | |
| Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |
References
- Bertolin, G., Tramier, M. Insights into the non-mitotic functions of Aurora kinase A: more than just cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Nikonova, A. S., Astsaturov, I., Serebriiskii, I. G., Dunbrack, R. L., Golemis, E. A. Aurora A kinase (AURKA) in normal and pathological cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (4), 661-687 (2013).
- Walter, A. O., Seghezzi, W., Korver, W., Sheung, J., Lees, E. The mitotic serine/threonine kinase Aurora2/AIK is regulated by phosphorylation and degradation. Oncogene. 19 (42), 4906-4916 (2000).
- Cheetham, G. M. T. Crystal Structure of Aurora-2, an Oncogenic Serine/Threonine Kinase. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42419-42422 (2002).
- Bayliss, R., Sardon, T., Vernos, I., Conti, E. Structural basis of Aurora-A activation by TPX2 at the mitotic spindle. Molecular Cell. 12 (4), 851-862 (2003).
- Zhang, Y., et al. Identification of the auto-inhibitory domains of Aurora-A kinase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 357 (2), 347-352 (2007).
- Littlepage, L. E., Wu, H., Andresson, T., Deanehan, J. K., Amundadottir, L. T., Ruderman, J. V. Identification of phosphorylated residues that affect the activity of the mitotic kinase Aurora-A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15440-15445 (2002).
- Kufer, T. A., et al. Human TPX2 is required for targeting Aurora-A kinase to the spindle. The Journal of Cell Biology. 158 (4), 617-623 (2002).
- Eyers, P. A., Erikson, E., Chen, L. G., Maller, J. L. A novel mechanism for activation of the protein kinase Aurora A. Current Biology. 13 (8), 691-697 (2003).
- Brunet, S., et al. Characterization of the TPX2 Domains Involved in Microtubule Nucleation and Spindle Assembly in Xenopus Egg Extracts. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5318-5328 (2004).
- Padilla-Parra, S., Tramier, M. FRET microscopy in the living cell: Different approaches, strengths and weaknesses. BioEssays. 34 (5), 369-376 (2012).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Fuller, B. G., et al. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453 (7198), 1132-1136 (2008).
- Bertolin, G., et al. A FRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells. Nature Communications. 7, 12674 (2016).
- Bertolin, G., et al. Optimized FRET Pairs and Quantification Approaches To Detect the Activation of Aurora Kinase A at Mitosis. ACS Sensors. 4 (8), 2018-2027 (2019).
- Bertolin, G., et al. Aurora kinase A localises to mitochondria to control organelle dynamics and energy production. eLife. 7, (2018).
- Sizaire, F., Le Marchand, G., Pécréaux, J., Bouchareb, O., Tramier, M. Automated screening of AURKA activity based on a genetically encoded FRET biosensor using fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2), 024006 (2020).
- Demeautis, C., et al. Multiplexing PKA and ERK1&2 kinases FRET biosensors in living cells using single excitation wavelength dual colour FLIM. Scientific Reports. 7, 41026 (2017).
- Ringer, P., et al. Multiplexing molecular tension sensors reveals piconewton force gradient across talin-1. Nature Methods. 14 (11), 1090-1096 (2017).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
- Fritz, R. D., et al. A Versatile Toolkit to Produce Sensitive FRET Biosensors to Visualize Signaling in Time and Space. Science Signaling. 6 (285), (2013).
- Mastop, M., et al. Characterization of a spectrally diverse set of fluorescent proteins as FRET acceptors for mTurquoise2. Scientific Reports. 7 (1), 11999 (2017).
- vander Krogt, G. N. M., Ogink, J., Ponsioen, B., Jalink, K. A Comparison of Donor-Acceptor Pairs for Genetically Encoded FRET Sensors: Application to the Epac cAMP Sensor as an Example. PLoS ONE. 3 (4), 1916 (2008).
- Cranfill, P. J., et al.
- Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3 (1), (2012).
- Mérola, F., et al. Newly engineered cyan fluorescent proteins with enhanced performances for live cell FRET imaging. Biotechnology Journal. 9 (2), 180-191 (2014).
- Erard, M., et al. Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging. Molecular BioSystems. 9 (2), 258-267 (2013).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. C., Masse, M. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determination by fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microscopy Research and Technique. 69 (11), 933-939 (2006).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative Comparison of Different Fluorescent Protein Couples for Fast FRET-FLIM Acquisition. Biophysical Journal. 97 (8), 2368-2376 (2009).
- Burgstaller, S., et al. pH-Lemon, a Fluorescent Protein-Based pH Reporter for Acidic Compartments. ACS Sensors. , (2019).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2016).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 15334 (2015).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E. ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement. Scientific Reports. 7 (1), 6791 (2017).
- Leray, A., Padilla-Parra, S., Roul, J., Héliot, L., Tramier, M. Spatio-Temporal Quantification of FRET in living cells by fast time-domain FLIM: a comparative study of non-fitting methods [corrected]. PloS One. 8 (7), 69335 (2013).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95 (6), 2976-2988 (2008).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 68 (6), 2588-2600 (1995).
- Manfredi, M. G., et al. Characterization of Alisertib (MLN8237), an investigational small-molecule inhibitor of aurora A kinase using novel in vivo pharmacodynamic assays. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 17 (24), 7614-7624 (2011).
- Katayama, H., et al. Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm2-mediated destabilization and inhibition of p53. Nature Genetics. 36 (1), 55-62 (2004).
- Nowakowski, J., et al. Structures of the Cancer-Related Aurora-A, FAK, and EphA2 Protein Kinases from Nanovolume Crystallography. Structure. 10 (12), 1659-1667 (2002).
- Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
- Grant, R., et al. Constitutive regulation of mitochondrial morphology by Aurora A kinase depends on a predicted cryptic targeting sequence at the N-terminus. Open Biology. 8 (6), 170272 (2018).
- Shimozono, S., Miyawaki, A. Engineering FRET Constructs Using CFP and YFP. Methods in Cell Biology. 85, 381-393 (2008).
- Komatsu, N., et al. Development of an optimized backbone of FRET biosensors for kinases and GTPases. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4647-4656 (2011).
- Schifferer, M., Griesbeck, O. A Dynamic FRET Reporter of Gene Expression Improved by Functional Screening. Journal of the American Chemical Society. 134 (37), 15185-15188 (2012).
- Peroza, E. A., Boumezbeur, A. H., Zamboni, N. Rapid, randomized development of genetically encoded FRET sensors for small molecules. Analyst. 140 (13), 4540-4548 (2015).
- Reboutier, D., et al. Aurora A is involved in central spindle assembly through phosphorylation of Ser 19 in P150Glued. The Journal of Cell Biology. 201 (1), 65-79 (2013).
- Mo, G. C. H., Posner, C., Rodriguez, E. A., Sun, T., Zhang, J. A rationally enhanced red fluorescent protein expands the utility of FRET biosensors. Nature Communications. 11 (1), 1848 (2020).
