Summary
Aktiveringen af den multifunktionelle Ser /Thr kinase AURKA er hallmærket af sin autophosphorylation på Thr288. Fluorescerende sonder, der er afhængige af FRET, kan skelne mellem dets inaktive og aktiverede tilstande. Her illustrerer vi nogle strategier for sondeteknik sammen med en hurtig FRET-protokol til at følge kinaseaktivering gennem hele mitose.
Abstract
Epitelkræft er ofte hallmærket af overekspression af Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA er et multifunktionelt protein, der aktiveres ved sin autophosphorylation på Thr288. AURKA overflod toppe i mitose, hvor det styrer stabiliteten og troskaben af mitotisk spindel, og den samlede effektivitet af mitose. Selvom godt karakteriseret på det strukturelle niveau, mangler en konsekvent overvågning af aktiveringen af AURKA gennem hele cellecyklussen. En mulig løsning består i at bruge genetisk kodede Försters FRET-biosensorer (Resonance Energy Transfer) til at få indsigt i autophosphorylation af AURKA med tilstrækkelig spatiotemporal opløsning. Her beskriver vi en protokol til ingeniør FRET biosensorer, der registrerer Thr288 autophosphorylation, og hvordan man følger denne ændring under mitose. For det første giver vi et overblik over mulige donor/acceptor FRET-par, og vi viser mulige klonings- og indsættelsesmetoder af AURKA FRET biosensorer i pattedyrsceller. Derefter leverer vi en trinvis analyse til hurtige FRET-målinger ved fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) på en specialbygget opsætning. Denne protokol gælder dog også for alternative kommercielle løsninger, der er tilgængelige. Vi slutter med at overveje de mest hensigtsmæssige FRET-kontroller for en AURKA-baseret biosensor og ved at fremhæve potentielle fremtidige forbedringer for yderligere at øge følsomheden af dette værktøj.
Introduction
Aurora kinase A/AURKA er en multifunktionel serin/threonine kinase, aktiv i hele cellecyklussen og i forskellige subcellulære rum1. Forståelse af dens brede spatiotemporal aktivering er særlig vigtig i kræft, da AURKA ofte er overekspresseret i epitel og hæmatologiske maligniteter, hvor patienterne udviser dårlig lydhørhed over for de aktuelt tilgængelige behandlinger2.
Strukturelle undersøgelser viste, at AURKA gennemgår to trin for at konvertere fra en inaktiv til en aktiv kinase. For det første ændrer autophosphorylation af Thr288 kropsbygning af kinasens kinetiske lomme og aktiverer den3,4,5,6. Dette trin øger AURKA's katalytiske aktivitet i menneskelige celler og i Xenopus laevis3,6,7, priming kinase for fuld aktivitet. Når den er aktiveret, fremkalder AURKA's interaktion med målproteinet til Xklp2 (TPX2) en anden kropsbygningsændring5. Denne yderligere ændring gør det muligt for AURKA at nå fuld enzymatisk aktivitet mod sine substrater i cellen5,8,9,10.
I næsten to årtier blev indsigt i aktivering og aktivitet af AURKA opnået hovedsageligt gennem en kombination af biokemiske tilgange. Disse omfatter påvisning af fosforyleret Thr288 i celler eller in vivo som et kendetegn for AURKA aktivering, krystallografiske analyser, og in vitro eller i cellulo kinase assays at sonde aktiviteten af AURKA1. Imidlertid er den spatiotemporale løsning af disse tilgange dårlig eller fraværende, og der var behov for nye løsninger for at udvide kendskabet til dynamikken i disse to begivenheder.
Udviklingen af fluorescerende sonder i de sidste par år lettet overvågningen af AURKA i levende celler, så følgende af dens aktivering med større spatiotemporal opløsning. De mest specifikke sensorer til AURKA, der er udviklet indtil videre, er afhængige af FRET-princippet (Försters Resonans Energy Transfer)11 for at skelne mellem inaktive og aktive AURKA. Den første udviklede sensor var en substratbaseret biosensor af AURKA kinase aktivitet. Substratbaserede biosensorer udgøres af en kort aminoacidisk sekvens, der er målrettet af en given kinase til fosforylering, og indsættes i et donor/acceptor FRET-par og et bindende domæne, der genkender den fosforylerede rest, som hjælper foldningen af biosensoren til en effektiv FRET-proces12. For AURKA's vedkommende blev der indsat et 14-aminosyre fragment af KIF2C, der var mål for fosforylering, mellem en CFP-YFP-donor/acceptorpar13. Denne sensor har dog nogle store ulemper. For det første kan den KIF2C-sekvens, der anvendes i denne sonde, målrettes både af AURKA og den nært beslægtede kinase AURKB, hvorved specificiteten af denne biosensor reduceres. For det andet er sensoren afhængig af den endogene kinase til fosforylering. Fret-effektiviteten kan derfor være målbart eller ikke signifikant, hvis mængden af kinase er begrænsende (f.eks. i subcellulære rum eller cellecyklusfaser). For at overvinde disse begrænsninger blev der oprettet en ny klasse af AURKA-sensor kendt som "kropsbygningssensorer". I disse sonder blev AURKA's sekvens i fuld længde indsat i en donorfluoriort ved N-endestationen og en acceptorfluoriphe ved C-endestationen. Inaktive AURKA præsenterer en "åben" kropsbygning, som bringer N- og C-termini af kinase væk fra hinanden. Med en sådan afstand mellem de to termini (> 10 nm) er donor/acceptorparret i en ikke-eftergivende konfiguration for FRET. Tværtimod vedtager autophosphoryleret AURKA en "lukket" kropsbygning, med de to protein termini og de to fluorophorer i nærheden. Dette viste sig at gøre det muligt for FRET mellem donoren og acceptoren, som kan måles ved hjælp af variationerne i donorlevetiden14,15. Sådanne sonder giver flere fordele. For det første er de genetisk kodede, og de kan bruges til at erstatte den endogene kinase i cellen. For det andet redder de fænotyper forårsaget af knockdown af AURKA, hvilket indikerer, at de er funktionelle i cellen. For det tredje gør de det muligt at følge aktiveringen af kinasen på forskellige subcellulære rum og i hele cellecyklussen. Sonderne opdagede aktiveringen af AURKA på steder, hvor kinase er kendt for at være aktiveret (dvs. centrosomes og mitotisk spindel), og deltog også i at opdage aktiveringen af AURKA på mitokondrier16. Endelig tillod disse sensorer screeninger med højt indhold baseret på FRET/FLIM, hvor de kropslige ændringer af AURKA blev brugt til at identificere nye farmakologiske hæmmere17.
I dette arbejde beskriver vi en procedure til at visualisere AURKA aktivering i dyrkede celler. For det første vil vi få et indblik i potentielle fluorophorepar til FRET. Valget af den mest egnede donor / acceptor par vil blive foretaget i henhold til den tilgængelige mikroskop setup, eller en bestemt downstream ansøgning som multiplex FRET18,19. Derefter foreslår vi en rørledning til at udforske adfærden af biosensor (r) valgt i en hurtig FRET / FLIM mikroskop setup. Denne pipeline strækker sig fra cellekultur- og synkroniseringsprocedurer til FLIM-anskaffelse og dataanalyse. Endelig vil vi diskutere de potentielle fordele ved denne protokol, da en analog strategi for biosensordesign kan anvendes på andre kinaser, og det kan også bruges sammen med andre FRET-baserede billedsystemer.
Protocol
BEMÆRK: U2OS-celler, der anvendes i denne protokol, blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, HTB-96), og de blev testet fri for mycoplasma. Trin 2.1 til 2.7 skal udføres under en laminar flow hætte for at holde celler og reagenser sterile.
1. Valg af donor/acceptor FRET-par
- Se litteraturen for valget af de bedst egnede donor / acceptor FRET par. Nyttige eksempler kan findes i 20,21,22,23,24, selv om det endelige valg skal foretages i henhold til egenskaberne ved FRET / FLIM setup (tilgængelige laserlinjer, filtre osv.). Følgende er nogle overvejelser om, hvordan du vælger en donor / acceptor par.
- Valg af donor: Se FP-basen (https://www.fpbase.org/) for et komplet sæt oplysninger om de tilgængelige fluorescerende proteiner. Denne database opdateres konstant med alle de nyudviklede fluorophorer.
- Der henvises til fluorescerende biosensordatabase (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) for mere information om de biosensorer, der allerede findes i litteraturen, sammen med de respektive fluorescerende proteiner, der anvendes.
- Som et generelt udgangspunkt skal du vælge en lys donor fluorophore. Gode kandidater er cyan fluorescerende proteiner som mTFP1 eller ECFP, eller GFP varianter som EGFP eller mEGFP.
- Oligomerer kan påvirke protein lokalisering og / eller funktion25. Overvej at bruge monomeriske mutanter af den fælles fiskeripolitik som mTurquoise226, eller Aquamarine27,28. Disse varianter har også gode kvanteudbytte og udryddelseskoefficienter, hvilket gør dem til gode kandidater som FRET donorer.
- Giv fortrinsret til fluorescerende proteiner (både som donor eller acceptorer) ufølsom over for miljømæssige ændringer som intracellulære pH23, eller til photobleaching25, som FRET effektivitet kan blive stærkt påvirket af disse parametre29. I dag bruges fluorophorer som mTurquoise2 eller mTFP1 i vid udstrækning som donorer takket være deres gode fotostabilitet22,25,26.
- Valg af acceptor: cyandonorer parres ofte med YFP-varianter (Yellow Fluoresc) som mVenus, Citrine og YPet20,21,22,30. Det skal dog bemærkes, at disse proteiner har en meget større følsomhed over for pH og globalt viser en dårlig fotostabilitet.
- Overvej at bruge nyudviklede, pH-ufølsomme gule varianter af YFP som pH-Lemon31, grønne fluorophores som mNeonGreen23 eller røde fluorophores som mScarlet-I23,32 som tidligere validerede fluorescerende acceptorer til mTurquoise2.
- Alternativt kan du overveje at bruge ikke-fluorescerende/mørke derivater af YFP som ShadowG33 eller ShadowY34, som viste sig at opføre sig som gode acceptorer for cyan-fluorescerende donorer i FRET / FLIM eksperimenter.
- Hvis du bruger mEGFP som donor, overveje at bruge monomeriske røde acceptorer som mCherry.
- Kontroller de spektrale egenskaber for det valgte donor/acceptorpar ved hjælp af de værktøjer, der er tilgængelige på FP's basiswebsted. Se figur 1 for et eksempel på mEGFP/mCherry-parret.
- Vælg rullemenuen Funktioner på FP-basiswebstedet, og vælg Spectra-fremviser.
- I rullemenuerne skal du indtaste navnet på det fluorophorepar, der skal visualiseres (f.eks. mEGFP og mCherry).
- Simuler donor-/acceptorparrets egenskaber med en bestemt lyskilde ved at vælge en given laser i rullemenuen. Du kan også indtaste en bestemt laserbølgelængde ved at vælge Tilføj laser. Klik på Normalisere emission til denne mulighed for at justere fluorophore spektre til den ønskede bølgelængde. Her er bølgelængden, der bruges til at ophidse GFP, på 480 ± 10 nm.
- Klon det valgte donor/acceptorpar ved at tilføje en fluorophore ved N-endestationen i AURKA's sekvens i fuld længde og et ved C-endestationen. Følg retningslinjerne for den foretrukne kloningsmetode for at indsætte denne konstruktion i en pattedyrsudtryksvektor efter eget valg.
2. Cellekultur, transinfektion og synkronisering
- DAG 1. Forbered kulturmedium til U2OS-celler: Brug Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin og 1% L-Glutamin (herfra komplet vækstmedier). Alternativt kan DMEM med for suppleret L-Glutamin også anvendes.
- Hvis cellerne fryses, optøs et hætteglas mindst 8 dage før forsøg (dvs. fra punkt 2.5).
- Knyt celler i en inkubator dedikeret til pattedyrscellekulturer ved 37 °C og med 5% CO2. Rengør og steriliser inkubatoren regelmæssigt for at undgå forureninger.
- Når cellerne når ~80% sammenløb:
- Vask dem kortvarigt med steril 1x fosfatbuffer saltvand (PBS) uden Ca2+ og Mg2+.
- Trypsinize celler med sterile 0,05% Trypsin-EDTA i henhold til producentens protokol og ved at placere celler i inkubatoren i 1-3 min.
- Inaktivere trypsin ved at tilføje dobbelt så mange som komplette vækstmedier; bland godt.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 800 x g i 3-5 min.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og beregne passende fortynding for dem at være på ~ 70-80% sammenløb i kammer dias dagen efter. Alternativt kan lignende understøtninger til dynamisk cellebilleddannelse også bruges.
- Pipet den tilsvarende mængde af celler i den valgte levende celle imaging støtte, og placere celler tilbage i inkubatoren indtil dagen efter.
- DAG 2. Fortsæt med transfection. Følg retningslinjerne for den eller de foretrukne forbigående transfektionsmetoder for at opnå en optimal transfectioneffektivitet (~50/80 %). Der kræves ingen specifik transfektionsmetode. Bemærk, at transfection effektivitet kan variere alt efter den anvendte cellelinje. Inkuber i 48 timer.
BEMÆRK: Fremstil stabile kloner, der indeholder hver af de tre vektorer for at omgå behovet for forbigående transinfektioner. På nuværende tidspunkt bør der planlægges to typer kontroller. For det første kræves der en "donor-only"-kontrol for at kontrollere, at tilstedeværelsen af AURKA i fuld længde ikke forstyrrer levetiden for mTurquoise2 i sig selv. For det andet bør en biosensor med en kinasedød mutation anvendes som en negativ kontrol, hvor FRET afskaffes eller sænkes betydeligt. Alternativt til en kinase-død mutant, en kemisk hæmmer af AURKA aktivering som ATP analog MLN8237 kan bruges som en negativ kontrol.- Planlæg tre transfection betingelser, hver af dem i en uafhængig brønd:
Vektoren "kun donor" (f.eks. AURKA-mTurquoise2)
"Biosensoren" (f.eks. superYFP-AURKA-mTurquoise2)
En kinase-dead/"K162M" biosensor (f.eks. superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) eller alternativt en hæmmer af AURKA-aktivering (f.eks. MLN8237) - Udfør tre betingelser for hvert uafhængigt donor/acceptorpar, der skal sammenlignes.
- Overvej at fordoble antallet af transfected brønde, hvis man sammenligner ikkesynkroniserede og G2/M-synkroniserede celler (se trin 2.6).
- Planlæg tre transfection betingelser, hver af dem i en uafhængig brønd:
- DAG 3. Synkroniser celler i G2/M. Tilsæt 100 ng/mL nocodazol opløst i DMSO til hver transfected godt undgå lyseksponering og inkubere i 16 timer (helst natten over). Hvis du sammenligner ikke-synkroniserede og G2/M-synkroniserede celler, skal du behandle hver transinfektionstilstand med nocodazol eller med et tilsvarende volumen af DMSO. For at opnå en bedre synkroniseringseffektivitet skal du forberede engangs aliquots af nocodazol i DMSO, opbevare dem ved -20 °C og kassere dem efter brug.
BEMÆRK: Effektiviteten af cellesynkronisering kan variere fra cellelinje til cellelinjer. Den optimale koncentration af nocodazol og inkubationstiden bør eksperimentelt bestemmes ved flowcytometritilgange forud for FRET/FLIM-forsøg. For statistisk relevante FRET/FLIM-analyser anbefaler vi en synkroniseringseffektivitet i G2/M på mindst 50% af den samlede cellepopulation. - DAG 4. Nocodazol udvaskning og FRET/FLIM billeddannelse på mitotiske celler
- Fjern kulturmediet med en pipette og udskift det med forvarmet, steril PBS. Undgå lyseksponering, hvis det er muligt. Sten forsigtigt pladen.
- Gentag vaskeproceduren, og undgå altid lyseksponering.
- Fjern den anden PBS vask og erstatte det med forvarmet, steril Leibovitz L-15 medium, suppleret med 20% føtalt kvæg serum (FBS) og 1% Penicillin-Streptomycin (herfra på, billedbehandling medier).
BEMÆRK: Billedmedier bør købes uden pH-indikatorer (f.eks. phenolrød) og mellemstore komponenter som riboflavin. Disse stoffer er en kilde til autofluorescence, der kan forstyrre levetid værdier. - Fortsæt med FRET/FLIM-billeddannelse. Minimer hurtige temperaturændringer, og fortsæt til billedtrinnet (trin 3) så hurtigt som muligt. Overvej at beskytte prøven mod lys, mens du transporterer den til mikroskopopsætningen (dvs. ved at pakke den ind i en aluminiumsfolie eller placere den i en kasse).
3. FRET/FLIM-opkøb
BEMÆRK: FRET/FLIM-anskaffelser i denne protokol blev udført på en specialbygget opsætning, beskrevet i 35 og udstyret med en kontrolløsning som i 15,17 (figur 2). Opsætningen er nu kommercialiseret af Inscoper, og det er lavet af en spinning-disk mikroskop med en hvid laser til pulserende excitation, og en høj hastighed tid-gated intensiverer foran kameraet. Tidsmæssige porte på 2 ns i et tidsvindue på 10 ns bruges sekventielt til at opnå en stak med fem tidsvinduede billeder. Disse billeder bruges derefter til at beregne den gennemsnitlige fluorescenslevetid pixel for pixel i henhold til følgende ligning: τ = ΣΔti • Ιi/ΣΙi, hvor Δti svarer til forsinkelsestiden for den ith-port, mens jeg angiver pixel-for-pixel tidsbehegnet intensitetsbillede35,36 . Denne metode sikrer hurtige FLIM-målinger: Der kræves ingen monterings- eller placeringstrin, og levetiden kan beregnes i en onlinetilstand med minimalt fotonbudget. Systemet præsenterer også en brugervenlig softwaregrænseflade. Det samme eksperiment kan dog udføres under enhver anden kommerciel mikroskopopsætning, der er udstyret til FLIM-målinger.
- For at sikre en optimal frigivelse af celler fra G2/M-blokken til mitose skal der udføres forsøg ved 37 °C. Hvis det er muligt, skal du udføre FRET/FLIM-eksperimenter med mikroskopopsætninger, der er udstyret med et termostatkammer.
- Tænd mikroskopets termostatkammer mindst 30 min til 1 time før forsøget.
- Tænd for laseren, kameraet, mikroskopopsætningen og billedsoftwaren (figur 2).
- Vælg de relevante excitations- og emissionsbølgelængder til donorfluoriorten. Praktiske bølgelængder muligheder er: λex 440/10 nm og λem 483/35 nm for mTurquoise2 (Figur 3A); λex 488/10 nm og λem 525/50 nm for GFP) (Figur 3B).
- Angiv eksponeringstiden, normalt mellem 30 og 100 ms (figur 3). Pas på, at overdreven laserkraft kan resultere i inducerede fototoksiske virkninger som fotobleaching, hvilket igen kan ændre fluorescens levetid37. På opsætningen skal du validere fraværet af fotobleachinghændelser ved at overvåge fluorescensintensiteten af den første port under tidsforskudskøb. Hvis variationer i fluorescensintensiteten kan observeres, skal du kassere anskaffelsen og justere lasereffekten.
BEMÆRK: I opsætningen her skal du vælge en eksponeringstid, der tillader mindst 3000 grå niveauer i den første port. ellers beregner softwaren ikke donorlevetiden. Denne grå niveauværdi svarer til det minimale fotonbudget, der er nødvendigt for at opnå relevante levetidsværdier. - Før fret/FLIM-anskaffelser startes, skal du sikre dig, at cellerne er kommet ind i mitose ved at vente til udseendet af den bipolare spindel (~20/30 min i U2OS-celler). Da mitotisk AURKA lokaliserer hovedsageligt ved denne struktur, kontrollere mitotisk progression ved at screene dannelsen af spindlen i celler direkte under mikroskopet, med en ekstern lyskilde (Figur 1). Bemærk, at den tid, der kræves til mitotisk progression, kan variere afhængigt af den anvendte cellelinje.
- Hvis behandlingen med MLN8237 er planlagt, skal cellerne placeres under mikroskopet og give dem mulighed for at nå metafase (ca. 20 min efter nocodazol udvaskning). Tilsæt 250 nM MLN8237 opløst i DMSO både til celler, der udtrykker donorkonstruktionen, og til celler, der udtrykker biosensoren.
- Kontroller denne tilstand på celler, der er transfected som ovenfor og inkuberer med et tilsvarende volumen af DMSO. For en bedre AURKA hæmning, forberede engangsbrug aliquots af MLN8237 i DMSO, gemme dem på -80 °C. Optø dem ved at placere aliquots på is, og kassere dem efter brug.
- Inkuber i 10 min. Efter denne periode vil den mitotiske spindel krympe, og der er kun en enkelt, intens prik tilbage. En lignende fænotype observeres, når K162M mutanter anvendes.
- For en bedre opløsning af mitotisk spindel skal du bruge mindst et 63x-mål (figur 3).
- Når du har fundet en celle i metafase (se figur 4 som et eksempel på en celle i metafase), skal du justere xyzkoordinater for at placere den i midten af synsfeltet.
- Hvis du vil have hurtigere billeder, skal du vælge et enkelt z-plan . Vælg det plan, hvor den mitotiske spindel er mere synlig eller intens.
- Start optagelsen. Anskaffelsestiden kan variere afhængigt af den anvendte FLIM-opsætning (fra få sekunder til min). De fleste af de kommercielle opsætninger til rådighed på markedet vil udarbejde både fluorescens mikrograf og pixel-for-pixel levetid kort. Gem begge billeder.
- Erhverve mindst 10 uafhængige billeder fra hver transfekt og / eller behandling tilstand.
4. Beregning af ΔLifetime og sammenligning af FLIM-værdier mellem donor-/acceptorpar
- Udtræk levetidsværdier fra hele pixel-for-pixel-levetidskortet (dvs. hele mitotisk spindel), eller vælg områder af interesse (ROI), der svarer til bestemte underområder.
BEMÆRK: I henhold til den anvendte FRET/FLIM-opsætning kan levetidsberegninger udføres direkte på anskaffelsessoftwaren eller udtrækkes med generiske billedbehandlingsløsninger (f.eks. Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/). Software, der direkte beregner levetidsværdier (også kendt som onlinetilstand) tilbyder en mere brugervenlig løsning, som er velegnet til begyndere og til mikroskopibrugere, der ikke er fuldt fortrolige med FRET / FLIM. Tværtimod kræver udvindingen af levetidsværdier efter erhvervelse ofte en passende procedure. Denne mulighed er mindre tilgængelig for begyndere, da nogle tidligere viden om matematiske modeller af montering er nødvendig. - Når det er visualiseret eller udvundet, beregnes den gennemsnitlige levetid for de celler, der udtrykker "donor-only" vektoren (f.eks AURKA-mTurquoise2), hermed donor levetid.
- Træk hver uafhængig levetidsværdi, der beregnes i trin 4.1, fra den gennemsnitlige donorlevetid. Hvis du gentager dette trin for alle celler under alle analyserede forhold, får ΔLifetime for hver betingelse.
- Sammenlign ΔLifetime-værdierne for "kun donor", "biosensoren" og "K162M", eller DMSO- og MLN8237-betingelserne.
BEMÆRK: For betingelsen "kun donor", bør ΔLifetime resultere i værdier tæt på nul og svarende til de eksperimentelle udsving i levetid værdier. For betingelsen "biosensor" skal ΔLifetime-værdierne give nettoforskellen mellem de to konstruktioner (se figur 4 for et illustreret eksempel). - Sammenlign ΔLifetime-værdier mellem forskellige donor-/acceptorpar.
- Sammenlign "biosensor" betingelser: viser de lignende ΔLifetime?
- Viser "K162M" eller MLN8237-betingelserne lignende ΔLifetime blandt dem? Er deres ΔLifetime ligner "donor-only" betingelse?
Representative Results
Vi fulgte den ovenfor beskrevne procedure for at registrere autophosphorylation af AURKA på Thr288 ved hjælp af to biosensorer med forskellige spektrale egenskaber. Vi sammenlignede den oprindelige GFP-AURKa-mCherry probe14 med to biosensorer med forskellige spektrale egenskaber. Disse to sonder er afhængige af fluorescerende donor mTurquoise2 og på en ikke-fluorescerende acceptor (ShadowG) i et tilfælde, eller en gul acceptor (superYFP) i et andet tilfælde. Vi indsatte derefter sekvensen af AURKA i fuld længde inden for hvert donor/acceptorpar. For at have en negativ kontrol for AURKA aktivering, to strategier kan forfølges. For det første forstyrrer brugen af en lille ATP-analog (MLN8237) bindingen af ATP i kinasens kinetiske lomme og forhindrer aktivering38. For det andet skaber mutationen af Lys162 i Met (K162M) en kinasedød version af hver biosensor ude af stand til at aktivere14,15,39. Denne mutation fremkalder forstyrrelser af en saltbro, der normalt er etableret mellem Lys162 og Glu181, hvilket resulterer i en stabil åbning af kinasens kinetiske lomme og udløser dens samlede inaktivering40. Som en negativ kontrol for FRET brugte vi en acceptor-devoid konstruktion (GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2).
Efter at have synkroniseret celler i G2/M og frigivet dem til mitose målte vi levetiden for alle de transfected konstruktioner ved mitotisk spindel (figur 4). Bemærk, at denne struktur blev betragtet som en helhed, og ingen ROI'er i spindlen blev analyseret. Vi beregnede derefter ΔLifetime for alle betingelser. Som forventet var levetiden for GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2 ("kun donorbetingelserne" tæt på 0, hvilket indikerer, at de målte værdier for disse konstruktioner svingede omkring middelværdien (figur 4A,4B). Omvendt var ΔLifetime-værdierne for GFP-AURKA-mCherry statistisk forskellige fra tilstanden, der kun er donor, med ΔLifetime-stigning på ~ 130 ps (Figur 4A). Lignende observationer blev gjort for shadowG-AURKA-mTurquoise2 og for superYFP-AURKA-mTurquoise2, med ΔLifetime stigende på ~ 150 og ~ 220 ps fra donor-only betingelse, henholdsvis (Figur 4B, 4C). Disse data kan nemt visualiseres i enkelte celler med en pseudofarve opslagstabel (LUT). I dette tilfælde er værdierne i ΔLifetime omkring 0 pseudofarveret gul, mens mere signifikante forskelle er pseudofarvede rød / lilla. Faktisk var pixel-for-pixel LUT tættere på gul i celler, der udtrykker donor-only konstruktioner, mens det var mere i den røde / lilla spektrum i celler, der udtrykker enten biosensor (Figur 4A,4B). Dette blev også observeret, da GFP-AURKA-mCherry biosensoren blev behandlet med den farmakologiske hæmmer MLN8237.
Vi analyserede derefter ΔLifetime af kinase-døde biosensorer. Disse konstruktioner viste mellemliggende ΔLifetime værdier: ΔLifetime var betydeligt højere i forhold til donor-only betingelse (Figur 4B,4C), men det var også betydeligt lavere end deres normale kolleger (Figur 4B,4D). Sammenligninger med celler, der behandles med MLN8237 eller udtrykker kinasedøde biosensorer, er nødvendige for at vurdere, om ΔLifetime-variationer for hvert donor/acceptorpar udelukkende er knyttet til aktiveringen af AURKA. I tilfælde af GFP-AURKA-mCherry afskaffes ΔLifetime-variationer, når der anvendes en AURKA-specifik hæmmer. Omvendt er ΔLifetime-variationer for det meste, men ikke udelukkende knyttet til AURKA-aktivering i tilfælde af shadowG-AURKA-mTurquoise2 og superYFP-AURKA-mTurquoise2.
Figur 1: GFP (donor) og mCherry (acceptor) excitation og emission spektre.
Spektre blev opnået og tilpasset fra FP base hjemmeside (https://www.fpbase.org/), og justeret til en 480 nm laser excitation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billede af det eksperimentelle arbejdsområde.
1) Kontrolløsningen 2) hvid laserkilde (3) CCD-kamera 4) opsætning af mikroskoper 5) ekstern lyskilde/lygte til okulær screening af prøven. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af softwaren til FLIM-erhvervelse.
(A, B) 1) excitations- og emissionsparametre for donoren (FFP i A eller GFP i B) 2) eksponeringstid 3) udvælgelse af målet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative billeder af AURKA FRET biosensorer og deres negative kontroller.
(A) (Mikrografer) Fluorescens (grøn kanal) og tilsvarende pixel-for-pixel ΔLifetime (kun donor – biosensor) af U2OS-celler, der udtrykker GFP-AURKA eller GFP-AURKA-mCherry, synkroniseret ved G2/M, frigives indtil den bipolare spindel er synlig og derefter behandlet med DMSO eller med MLN8237. ΔLifetime er illustreret med en pseudofarveskala ("Fire"-opslagstabel). (Graf) Tilsvarende kvantificering og tovejs ANOVA-analyse for de angivne betingelser. (B) (Mikrografer) Fluorescens (cyan kanal) og tilsvarende pixel-for-pixel ΔLifetime (kun donor – biosensor) af U2OS celler udtrykker shadowG-AURKA-mTurquoise2 (øverste panel) eller superYFP-AURKA-mTurquoise2 (lavere panel), synkroniseret på G2/M og frigivet indtil den bipolare spindel er synlig. ΔLifetime er illustreret med en pseudofarveskala ("Fire"-opslagstabel). (Graf) Tilsvarende kvantificering og envejs ANOVA analyse af forhold repræsenteret i ovenstående mikrografer. (C) (Mikrografer) Billeder af AURKA-mTurquoise2 (øverste panel), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (mellempanel) og superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 erhvervet og repræsenteret som i mikrograferne. (Graf) Tovejs ANOVA-analyse for de angivne transinfektionsforhold. Baren i boxplots repræsenterer medianen; knurhår strækker sig fra min til max. n = 10 celler pr. tilstand af et repræsentativt eksperiment (af tre). Individuelle værdier repræsenteres som prikker. Skalastang: 10 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mod hver angivet betingelse i (A) betingelsen "AURKA-mTurquoise2" i (B) og mod hver angivet tilstand i (C). NS: ikke signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Genetisk kodede FRET biosensorer er pålidelige værktøjer til at måle aktiveringen af enkelte proteiner eller af hele signalveje41. Især AURKA FRET biosensor udgør en præference måde at udforske aktiveringen af kinase i tid og rum. Nogle elementer fortjener dog særlig opmærksomhed, når de designer eller optimerer en FRET biosensor, ikke kun generelt, men mere specifikt til AURKA.
For det første kan arten og den relative position af donor / acceptor FRET par tilpasses til specifikke funktioner i denne kinase. AURKA er stærkt beriget på mitotisk spindel under mitose, men det er til stede i hele cellecyklussen og på forskellige subcellulære steder (f.eks centrosomes, kernen og mitokondrier)1,2. Hvis biosensoren skal anvendes i bestemte rum som mitokondrier, som kan nå sur pH, skal valget af et pH-ufølsomt donor-acceptor FRET-par som mTurquoise2/shadowG foretages. Desuden kunne placere FRET donor på C-endestationen tillade en bedre visualisering af biosensor på denne subcellulære rum, og potentielt endda optimere FRET detektion givet, at AURKA N-endestation viste sig at delvist kløve ud på mitokondrier16,42.
For det andet ville en endnu uudforsket måde at optimere AURKA FRET biosensoren kræve et mere omhyggeligt design af linkere mellem AURKA i fuld længde og donor/acceptorparret. Ikke kun afstanden mellem det fluorescerende par, men også egenskaberne af linkeren selv viste sig at være nøglefaktorer for at forbedre FRET-effektiviteten43,44,45,46. I dette lys kan en forøgelse af linkerens stivhed eller fleksibilitet enten være til skade for FRET's effektivitet eller yderligere forbedre den.
For det tredje er det kendt, at overekspression af AURKA inducerer mitotisk spindel abnormiteter i en betydelig del af cellerne2. Det ville være interessant at sammenligne ΔLifetime opnået ved at udtrykke den samme FRET konstruktion under en stærk promotor som cytomegalovirus (CMV) - en af de mest almindelige initiativtagere findes i pattedyr udtryk vektorer - eller under AURKA minimal promotor sekvens (CTTCCGG)14,47. Denne promotor blev tidligere vist at redde monopolar eller multipolar spindler opstår efter knock-down af kinase, og dens anvendelse ikke fremkalde celle cyklus forstyrrelser per se14,47. Selv om FLIM er ufølsom over for proteinudtryksniveauer og relative koncentrationer i cellen11, vil en grundig sammenligning af de to initiativtagere på samme biosensoropsætning udvide forståelsen af puljen af aktiveret AURKA på et givet sted. Derudover vil det give ny indsigt i, hvordan AURKA-aktivering kan ændre sig ved overekspression, hvilket er relevant for epitel- og hæmatologiske kræftparadigmer.
Endelig bør der også tages hensyn til FRET-ansøgningen i det efterfølgende omsætningsled. Et fremtidigt perspektiv inden for AURKA ville være at cumulate kinase conformational biosensor med en substratbaseret biosensor. Analyse af FRET adfærd af to biosensorer samtidigt - en proces kendt som multiplex FRET - kræver en mørk acceptor på den første biosensor for at undgå spektral blødning igennem i den anden donorkanal. I forbindelse med AURKA ville dette åbne op for det spændende nye perspektiv at opdage aktiveringen af kinase med den første biosensor og dens enzymatiske aktivitet mod et givet substrat med det andet. Den seneste udvikling inden for multiplexing gør det nu muligt at kumulere op til tre biosensorer ad gangen48. Anvendelse af en lignende metode i forbindelse med AURKA kunne repræsentere en meget lovende strategi ikke kun for at teste aktiveringsaktivitetsinterplayet af kinase, men også for at udforske AURKA-signalering kaskader med hidtil uset spatiotemporal opløsning.
Afslutningsvis er FRET/FLIM en bekvem måde at uddybe viden om proteinaktivitet på. På den ene side gør det muligt at visualisere lokaliseringen af et givet protein i levende celler takket være mindst en fluorescerende moiety. På den anden side kan det optrævle proteinkonformationelle ændringer, som kunne være informative om proteinaktivering og / eller aktivitet. Derfor har FRET/FLIM og kropsbygning FRET biosensorer potentiale til at blive udbredte metoder til at følge signalveje i levende celler og med udsøgt spatiotemporal opløsning.
Disclosures
G.B. udførte eksperimenterne, skrev og gennemgik manuskriptet og ydede finansiering, M.T. gennemgik manuskriptet og ydede støtte. M.T. er videnskabelig rådgiver og aktionær i Inscoper-virksomheden (Frankrig), som producerer løsningerne til hurtige FLIM-målinger, der er vist i dette manuskript. Inscoper delvist støttet Open Access offentliggørelse af manuskriptet. Inscoper var ikke involveret i eksperimentelt design, datahåndtering eller i manuskriptets skrivning.
Acknowledgments
Vi takker ingeniørerne i Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrig) for rådgivning og hjælp, og især X. Pinson for kritisk læsning af manuskriptet. MRic er medlem af den nationale infrastruktur France-BioImaging støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04). Dette arbejde blev støttet af Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère og Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) til G.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
| L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
| LabTek | Nunc | 2515380 | |
| Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |
References
- Bertolin, G., Tramier, M. Insights into the non-mitotic functions of Aurora kinase A: more than just cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Nikonova, A. S., Astsaturov, I., Serebriiskii, I. G., Dunbrack, R. L., Golemis, E. A. Aurora A kinase (AURKA) in normal and pathological cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (4), 661-687 (2013).
- Walter, A. O., Seghezzi, W., Korver, W., Sheung, J., Lees, E. The mitotic serine/threonine kinase Aurora2/AIK is regulated by phosphorylation and degradation. Oncogene. 19 (42), 4906-4916 (2000).
- Cheetham, G. M. T. Crystal Structure of Aurora-2, an Oncogenic Serine/Threonine Kinase. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42419-42422 (2002).
- Bayliss, R., Sardon, T., Vernos, I., Conti, E. Structural basis of Aurora-A activation by TPX2 at the mitotic spindle. Molecular Cell. 12 (4), 851-862 (2003).
- Zhang, Y., et al. Identification of the auto-inhibitory domains of Aurora-A kinase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 357 (2), 347-352 (2007).
- Littlepage, L. E., Wu, H., Andresson, T., Deanehan, J. K., Amundadottir, L. T., Ruderman, J. V. Identification of phosphorylated residues that affect the activity of the mitotic kinase Aurora-A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15440-15445 (2002).
- Kufer, T. A., et al. Human TPX2 is required for targeting Aurora-A kinase to the spindle. The Journal of Cell Biology. 158 (4), 617-623 (2002).
- Eyers, P. A., Erikson, E., Chen, L. G., Maller, J. L. A novel mechanism for activation of the protein kinase Aurora A. Current Biology. 13 (8), 691-697 (2003).
- Brunet, S., et al. Characterization of the TPX2 Domains Involved in Microtubule Nucleation and Spindle Assembly in Xenopus Egg Extracts. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5318-5328 (2004).
- Padilla-Parra, S., Tramier, M. FRET microscopy in the living cell: Different approaches, strengths and weaknesses. BioEssays. 34 (5), 369-376 (2012).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Fuller, B. G., et al. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453 (7198), 1132-1136 (2008).
- Bertolin, G., et al. A FRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells. Nature Communications. 7, 12674 (2016).
- Bertolin, G., et al. Optimized FRET Pairs and Quantification Approaches To Detect the Activation of Aurora Kinase A at Mitosis. ACS Sensors. 4 (8), 2018-2027 (2019).
- Bertolin, G., et al. Aurora kinase A localises to mitochondria to control organelle dynamics and energy production. eLife. 7, (2018).
- Sizaire, F., Le Marchand, G., Pécréaux, J., Bouchareb, O., Tramier, M. Automated screening of AURKA activity based on a genetically encoded FRET biosensor using fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2), 024006 (2020).
- Demeautis, C., et al. Multiplexing PKA and ERK1&2 kinases FRET biosensors in living cells using single excitation wavelength dual colour FLIM. Scientific Reports. 7, 41026 (2017).
- Ringer, P., et al. Multiplexing molecular tension sensors reveals piconewton force gradient across talin-1. Nature Methods. 14 (11), 1090-1096 (2017).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
- Fritz, R. D., et al. A Versatile Toolkit to Produce Sensitive FRET Biosensors to Visualize Signaling in Time and Space. Science Signaling. 6 (285), (2013).
- Mastop, M., et al. Characterization of a spectrally diverse set of fluorescent proteins as FRET acceptors for mTurquoise2. Scientific Reports. 7 (1), 11999 (2017).
- vander Krogt, G. N. M., Ogink, J., Ponsioen, B., Jalink, K. A Comparison of Donor-Acceptor Pairs for Genetically Encoded FRET Sensors: Application to the Epac cAMP Sensor as an Example. PLoS ONE. 3 (4), 1916 (2008).
- Cranfill, P. J., et al.
- Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3 (1), (2012).
- Mérola, F., et al. Newly engineered cyan fluorescent proteins with enhanced performances for live cell FRET imaging. Biotechnology Journal. 9 (2), 180-191 (2014).
- Erard, M., et al. Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging. Molecular BioSystems. 9 (2), 258-267 (2013).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. C., Masse, M. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determination by fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microscopy Research and Technique. 69 (11), 933-939 (2006).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative Comparison of Different Fluorescent Protein Couples for Fast FRET-FLIM Acquisition. Biophysical Journal. 97 (8), 2368-2376 (2009).
- Burgstaller, S., et al. pH-Lemon, a Fluorescent Protein-Based pH Reporter for Acidic Compartments. ACS Sensors. , (2019).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2016).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 15334 (2015).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E. ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement. Scientific Reports. 7 (1), 6791 (2017).
- Leray, A., Padilla-Parra, S., Roul, J., Héliot, L., Tramier, M. Spatio-Temporal Quantification of FRET in living cells by fast time-domain FLIM: a comparative study of non-fitting methods [corrected]. PloS One. 8 (7), 69335 (2013).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95 (6), 2976-2988 (2008).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 68 (6), 2588-2600 (1995).
- Manfredi, M. G., et al. Characterization of Alisertib (MLN8237), an investigational small-molecule inhibitor of aurora A kinase using novel in vivo pharmacodynamic assays. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 17 (24), 7614-7624 (2011).
- Katayama, H., et al. Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm2-mediated destabilization and inhibition of p53. Nature Genetics. 36 (1), 55-62 (2004).
- Nowakowski, J., et al. Structures of the Cancer-Related Aurora-A, FAK, and EphA2 Protein Kinases from Nanovolume Crystallography. Structure. 10 (12), 1659-1667 (2002).
- Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
- Grant, R., et al. Constitutive regulation of mitochondrial morphology by Aurora A kinase depends on a predicted cryptic targeting sequence at the N-terminus. Open Biology. 8 (6), 170272 (2018).
- Shimozono, S., Miyawaki, A. Engineering FRET Constructs Using CFP and YFP. Methods in Cell Biology. 85, 381-393 (2008).
- Komatsu, N., et al. Development of an optimized backbone of FRET biosensors for kinases and GTPases. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4647-4656 (2011).
- Schifferer, M., Griesbeck, O. A Dynamic FRET Reporter of Gene Expression Improved by Functional Screening. Journal of the American Chemical Society. 134 (37), 15185-15188 (2012).
- Peroza, E. A., Boumezbeur, A. H., Zamboni, N. Rapid, randomized development of genetically encoded FRET sensors for small molecules. Analyst. 140 (13), 4540-4548 (2015).
- Reboutier, D., et al. Aurora A is involved in central spindle assembly through phosphorylation of Ser 19 in P150Glued. The Journal of Cell Biology. 201 (1), 65-79 (2013).
- Mo, G. C. H., Posner, C., Rodriguez, E. A., Sun, T., Zhang, J. A rationally enhanced red fluorescent protein expands the utility of FRET biosensors. Nature Communications. 11 (1), 1848 (2020).
