Summary
Denne protokollen presenterer en metode for avbildning av nevron populasjonsaktivitet med encellet oppløsning i ikke-transgene hvirvelløse arter ved hjelp av absorbansspenningssensitive fargestoffer og en fotodiodematrise. Denne tilnærmingen muliggjør en rask arbeidsflyt, der avbildning og analyse kan forfølges i løpet av en enkelt dag.
Abstract
Utviklingen av transgene hvirvelløse preparater der aktiviteten til spesifiserbare sett med nevroner kan registreres og manipuleres med lys representerer et revolusjonerende fremskritt for studier av det nevrale grunnlaget for atferd. Imidlertid er en ulempe med denne utviklingen dens tendens til å fokusere undersøkere på et svært lite antall "designer" organismer (f.eks. C. elegans og Drosophila), potensielt negativ innvirkning på jakten på komparative studier på tvers av mange arter, noe som er nødvendig for å identifisere generelle prinsipper for nettverksfunksjon. Den nåværende artikkelen illustrerer hvordan optisk opptak med spenningssensitive fargestoffer i hjernen til ikke-transgene gastropodarter kan brukes til raskt (dvs. innen enkelteksperimenter) avslører funksjoner i den funksjonelle organiseringen av deres nevrale nettverk med encellet oppløsning. Vi skisserer i detalj disseksjons-, fargings- og registreringsmetodene som brukes av laboratoriet vårt for å oppnå handlingspotensiale spor fra dusinvis til ~ 150 nevroner under atferdsrelevante motorprogrammer i CNS av flere gastropodarter, inkludert en ny til nevrovitenskap - nudibranch Berghia stephanieae. Avbildning utføres med absorbansspenningssensitive fargestoffer og en 464-element fotodiode array som prøver på 1600 bilder / sekund, raskt nok til å fange opp alle handlingspotensialer generert av de registrerte nevronene. Flere flerminutters opptak kan oppnås per tilberedning med liten eller ingen signalbleking eller fototoksisitet. De rå optiske dataene som samles inn gjennom metodene som er beskrevet, kan deretter analyseres gjennom en rekke illustrerte metoder. Vår optiske registreringstilnærming kan lett brukes til å sondere nettverksaktivitet i en rekke ikke-transgene arter, noe som gjør den godt egnet for komparative studier av hvordan hjerner genererer atferd.
Introduction
Utviklingen av transgene linjer av hvirvelløse dyr som Drosophila og C. elegans har gitt kraftige systemer der nevrale baser av atferd kan bli optisk forhørt og manipulert. Imidlertid kan disse spesielle preparatene ha ulempen med å redusere entusiasme for nevrale kretsstudier av ikke-transgene arter, spesielt med hensyn til innføring av nye arter i nevrovitenskapelig forskning. Å fokusere utelukkende på ett eller to modellsystemer er skadelig for søket etter generelle prinsipper for nettverksfunksjon, fordi komparative studier representerer en viktig rute der slike prinsipper oppdages1,2,3,4. Vårt mål her er å demonstrere en storskala bildemetode for å oppnå rask innsikt i den funksjonelle strukturen til gastropod nevrale nettverk, i et forsøk på å lette komparative studier av nevral nettverksfunksjon.
Gastropodmollusker som Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea og andre har lenge blitt brukt til å undersøke prinsipper for nevral nettverksfunksjon, i stor grad fordi deres oppførsel er mediert av store, ofte individuelt identifiserbare nevroner plassert på overflaten av ganglia, noe som gjør dem lett tilgjengelige for opptaksteknikker5. På 1970-tallet ble spenningsfølsomme fargestoffer (VSDs) som kan integreres i plasmamembranen utviklet som snart aktiverte de første elektrodefrie opptakene av handlingspotensialene generert av flere nevroner6. Her demonstrerer vi vår bruk av VSDer for å undersøke nettverksaktivitet i flere arter av gastropoder, inkludert en ny til nevrovitenskap, Berghia stephanieae. Bildeenheten er en kommersielt tilgjengelig 464-element fotodiodematrise (PDA) som tar prøver ved 1600 bilder/sekund (figur 1), som, når den brukes med rask absorbans VSDs, avslører virkningspotensialene til alle registrerte nevroner7. Signalene registrert av alle dioder vises umiddelbart etter oppkjøp og legges på et bilde av ganglion i PDA-oppkjøpsprogramvaren, noe som gjør det mulig å undersøke nevroner av interesse med skarpe elektroder i samme forberedelse8,9.
I de rå PDA-dataene registrerer mange dioder overflødig de større nevronene, og mange inneholder også blandede signaler fra flere nevroner. Et vendepunkt var utviklingen av en automatisert spike-sorteringsmetode ved hjelp av uavhengig komponentanalyse for raskt å behandle hvert rå 464-kanals PDA-datasett til et nytt sett med spor, der hver innspilte nevron vises i et eget spor som bare inneholder handlingspotensialene10,11.
I denne artikkelen skisserer vi de viktigste trinnene som er involvert i å skaffe store action potensielle opptak fra gastropodnervesystemer med en fotodiodematrise og raske absorbering VSDer. Vi illustrerer videre analytiske metoder som kan brukes til klynging og kartlegging av optisk innspilte nevroner med hensyn til deres funksjonelle ensembler, og for å karakterisere funksjoner på befolkningsnivå som ofte ikke er tydelige gjennom enkel inspeksjon av avfyringssporene12,13.
Protocol
MERK: Arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor, er oppsummert i figur 2.
1. Minimer vibrasjoner
- Hvis det er mulig, sørg for at riggen er i første etasje, og bruk et fjærbasert isolasjonsbord, som demper et bredere spekter av vibrasjonsfrekvenser enn luftbord.
- Hvis du bruker et fjærbasert bord, må du sørge for at det flyter (det må justeres hver gang man legger til eller tar noe av bordet).
- Reduser vibrasjonsbasert støy i bilderommet så mye som mulig, selv i den grad luftstrømmen stenges av under bildebehandling om nødvendig. Minimer eventuelle vibrasjoner som stammer fra væsketurbulens i perfusjonssystemer.
MERK: Det nevrale preparatet må ikke bevege seg under oppkjøpet. Bevegelser av noe slag gir skift av kontrastkanter over diodene, noe som fører til artefaktuelle signaler. Hvis prosedyren innebærer en stimulus under oppkjøpet, må den ikke indusere forberedelsesbevegelse.
2. Kjør en pinhole-test for å muliggjøre riktig justering av ganglion-bilder med PDA-dataene
- Legg et stykke aluminiumsfolie med 3 små hull stikket i den på et mikroskopsklie. Ta et bilde av de tre hullene med det digitale kameraet montert på den parfokale fotoporten.
- Bruk bildeprogramvaren som følger med PDA, og skaff deg en kort fil (f.eks. 5 s). Delvis gjennom oppkjøpet, trykk på bordet for å indusere vibrasjonsartefakter som vil være svært synlige rundt kantene på hullene, slik at bildet av pinholes kan justeres nøyaktig med de optiske dataene.
- Bruk Superimpose-funksjonen i bildebehandlingsprogramvaren, som du finner i menypunktet "Display | Sidelegge | Overliggende sporinger m/ekstern | Legg bildeover bildet for å legge diodedataene over bildet av hull, og juster deretter x-, y- og forstørrelsesinnstillingene for bildet på nytt til flagghullene sitter rett oppå hullartefaktene i diodedataene.
- Lagre disse tallene for å justere forberedelsesbilder tatt med kameraet med diodedataene i fremtidige eksperimenter.
MERK: Pinhole justering av PDA trenger bare å utføres en gang etter at PDA er montert på mikroskopet, til den roteres eller fjernes, på hvilket tidspunkt det må gjøres igjen.
- Lagre disse tallene for å justere forberedelsesbilder tatt med kameraet med diodedataene i fremtidige eksperimenter.
3. Disseksjoner for tre marine gastropodarter
- For arter som vokser til stor størrelse, som Tritonia og Aplysia, start med mindre individer, som har tynnere, mindre ugjennomsiktig ganglia, letter å oppnå tilstrekkelig lys for optimal signal-til-støy.
- Ha klart filtrert kunstig sjøvann som skal brukes som saltvann til disseksjoner og bildeforsøk.
MERK: I alle påfølgende trinn i protokollen betegner "saltvann" kunstig sjøvann. - Disseksjon av Tritonia diomedea
- Plasser et dyr i kjøleskapet i ca 20 min for å bedøve det.
- For større dyr, eksponer hjernen ved å holde dyret i den ene hånden, la hodet ende drapert over pekefingeren for å avsløre "nakken". For mindre dyr, fest dem dorsal side opp i en voksforet disseksjonsfat før du utsetter hjernen.
- Ved hjelp av disseksjonssaks, lag et 3-4 cm midtlinje snitt på dyrets dorsale side, over bukkalmassen (som kan føles gjennom kroppsveggen).
MERK: Den nødvendige delen av CNS, bestående av smeltet, bilateral cerebropleural og pedal ganglia, er oransje og tydelig i utseende fra det omkringliggende vevet; Det ligger umiddelbart bakre til rhinoforene og på toppen av bukkalmassen. - Excise CNS ved å kutte disse nervene innervating dyrets kropp ved hjelp av tang og mikrodissection saks, holde intakt alle disse nervene forbinder den sentrale ganglia. La en lang lengde på pedalnerven 3 (PdN3), eller hvilken nerve som skal stimuleres.
- Bruk minutienpinner til å feste CNS til bunnen av en saltvannsfylt elastomerforet tallerken for videre disseksjon. Oppretthold tilberedningstemperaturen ved 11 °C ved å perfusere fatet med saltvann levert med et feedback-kontrollert, in-line Peltier kjølesystem ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
- Bruk tang og mikrodesisseksjonssaks, fjern forsiktig det løst festende laget av bindevevet fra rundt CNS. Overlat den fine hylsen tett til ganglia.
- Kort (~ 10 s) dypp ganglia i en løsning på 0,5% glutaraldehyd i saltvann. Legg gangliaen tilbake i saltvannsforet elastomerforet tallerken, slik at saltvann kan vaske bort glutaraldehydet før du begynner VSD-farging.
MERK: Denne lysfiksen av bindevevet og dets iboende muskler vil bidra til å forhindre bevegelse under avbildning.
- Disseksjon av Aplysia californica
- Bedøv et ca. 40 g dyr ved å injisere ~20 ml 350 mM MgCl2 i kroppen gjennom den ventrale overflaten (foten).
- Bruk pinner til å plassere dyrets ventrale side opp i en voksforet disseksjonsfat.
- Bruk disseksjonssaks, lag et 2-3 cm midtlinje snitt langs den mest fremre delen av foten. Fest ned klaffene på foten på hver side av snittet for å avsløre en del av CNS og bukkal masse.
MERK: Den nødvendige delen av CNS, bestående av smeltet cerebral ganglia, og tett apposed, bilateral pleural og pedal ganglia, er gul-oransje og tydelig i utseende fra det omkringliggende vevet; den sitter dorsal og posterolateral til den pæreformede muskulære bukkale massen. - Bruk tang og disseksjon saks for å forsiktig dissekere bort buccal massen, avslører cerebral ganglia.
- Excise CNS ved å kutte disse nervene innervating dyrets kropp ved hjelp av tang og mikrodissection saks, holde intakt alle disse nervene forbinder den sentrale ganglia. La en lang lengde på pedalnerven 9 (PdN9), eller hvilken nerve som skal stimuleres.
- Bruk minutienpinner til å plassere CNS i en saltvannsfylt elastomerforet tallerken. Oppretthold tilberedningstemperaturen ved 15-16 °C ved å perfusere fatet med saltvann som passerer gjennom en Peltier kjøleenhet.
- Bruk tang og mikrodisseksjon saks, fjern overdreven bindevev fra CNS, og disseker bort en overfladisk del av hylsen på ganglion eller ganglia som skal avbildes. Vær forsiktig under denne prosessen for ikke å lage et hull i hylsen, noe som vil føre til at nevroner søler ut innenfra.
- Kort (~ 20 s) dypp ganglia i en løsning på 0,5% glutaraldehyd i saltvann. Legg gangliaen tilbake i saltvannsforet elastomerforet tallerken, slik at saltvann kan vaske bort glutaraldehydet før du begynner VSD-farging.
- Disseksjon av Berghia stephanieae
- Plasser et dyr i kjøleskapet i ca 20 min for å bedøve det.
- Bruk en elastomerforet tallerken fylt med saltvann i romtemperatur, plasser minutienpinner i både hode og hale.
- Bruk mikrodisseksjon saks, gjør en 5-7 mm dorsal snitt overfladisk til CNS.
MERK: Øynene, mørke flekker som ligger i dyret ved siden av CNS, markerer beleilig posisjonen til den nødvendige delen CNS, som består av bilateralt smeltet cerebropleural og pedal ganglia og sitter på toppen av bukkalmassen. - Excise CNS ved å kutte disse nervene innervating dyrets kropp ved hjelp av tang og mikrodissection saks. La nervene stimuleres tilstrekkelig lenge til en sugeelektrode.
4. Flekk preparatet med et spenningssensitivt fargestoff
- Forbered lagerløsninger for enten RH155 (også kjent som NK3041) eller RH482 (også kjent som NK3630 eller JPW1132).
- RH155: Løs opp 5,4 mg fast fargestoff i 1 ml 100% EtOH, pipettering 29 μL i hvert av 34 mikrocentrifuge rør. Med innholdet i hvert rør utsatt for luften, la dem tørke over natten i mørket. Hette og plasser de resulterende faste aliquots av RH155, som hver inneholder 0,15 mg, i en -20 °C fryser.
- RH482: Løs opp 2 mg fast fargestoff i 100 μL DMSO, del oppløsningen i 20 aliquots på 5 μL, hver inneholder 0,1 mg RH482, og oppbevar i en -20 °C fryser.
MERK: For Tritonia og Aplysiakan enten badekarperfusjon eller trykkapplikasjon brukes til å laste VSD RH155 inn i membranene til nevronene i preparatet. Trykkapplikasjon har fordelen av å utsette bare ganglion blir avbildet til VSD.
- For badeperfusjon, tilsett 5 ml saltvann til hver av de to ovennevnte aliquots av solid RH155 og virvel i oppløsning, og produserer en kombinert løsning på 10 ml som inneholder 0,03 mg / ml RH155.
- Perfuse i mørket (for å unngå fotobleking) i 1 til 1,5 timer ved 11 °C for Tritonia og ved 16 °C for Aplysia. Oppretthold temperaturen ved å sende perfusjonsløsningen gjennom et Peltier kjølesystem.
- For trykkpåføring, tilsett 500 μL saltvann til ett aliquot av RH155, og virvel for å produsere en fargekonsentrasjon på 0,3 mg / ml.
- Trekk ca. 200 μL av oppløsningen inn i polyetylenrør ved hjelp av en håndholdt mikrodispenser, og sørg for at det er en god match mellom rørdiameteren og diameteren på ganglionen som skal farges.
- Bruk en mikromanipulator til forsiktig å plassere enden av røret over mål ganglion, senke den til den danner en tett forsegling på ganglion. Bruk den typen kjølesystem som er beskrevet ovenfor for å holde ganglia ved ønsket temperatur.
- Demp romlysene for å unngå fotobleking og drei mikrodispenserapplikatorknappen hvert 5.
- Kontroller ved 30 min for å bekrefte at det er god farging, og fortsett deretter i en total fargingstid på ca. 1 time.
- For farging i Berghia, tilsett 1 ml saltvann til en frossen aliquot av RH482, og virvel som skal oppløses.
- Overfør 200 μL av denne oppløsningen til et mikrocentrifugerør som inneholder 800 μL saltvann og virvel til oppløsning, og produserer en endelig fargingsoppløsning på 0,02 mg/ ml RH482 i saltvann med 0,1% DMSO.
- Plasser hele CNS i mikrocentrifugerøret, pakk røret i aluminiumsfolie for å unngå fotobleaching, og rist for hånd hver 5-6 min i ca. 1 time. Oppbevar de resterende 800 μL av den første løsningen i kjøleskapet, og bruk i opptil 3 dager for å flekke etterfølgende preparater.
5. Flat ut preparatet og sett opp for nervestimulering
MERK: Trinnene i denne delen bør utføres under minimal belysning eller med grønt lys for å minimere fotobleking.
- Etter farging, senk CNS i saltvann i bildekammeret og legg under et dissekeringsmikroskop.
- Plasser biter av silikon (for Tritonia eller Aplysia) eller blobs av petroleum gelé (for Berghia) til venstre og høyre for ganglion / ganglia som skal avbildes.
- Trykk et passende stort stykke glass- eller plastdeksler ned på preparatet for å flate det ut. Trykk fast, men ikke så hardt som å skade nevronene.
MERK: Sammenslåing av den konvekse overflaten av preparatet på denne måten vil gjøre et større antall nevroner parfokale, og dermed øke antall nevroner registrert, og vil videre bidra til å immobilisere preparatet under avbildning. - Hvis du stimulerer en nerve til å fremkalle et fiktivt motorprogram, lag en sugeelektrode hvis fremre spiss er omtrent like bred som nervediameteren. Oppnå dette ved å forsiktig smelte et segment av PE-100 polyetylenrør over en flamme mens du forsiktig trekker i begge ender av rørsegmentet og deretter kutter den resulterende konen på ønsket punkt.
- Tegn et lite volum saltvann gjennom den koniske enden av en polyetylen sugeelektrode, etterfulgt av enden av nerven som skal stimuleres, ved å feste en lengde med tykkveggede, fleksible polymerrør til baksiden av elektroden og bruke munnsuging for å påføre negativt trykk.
- Kontroller at saltvannsvæsken i elektroden mangler bobler som kan avbryte elektrisk ledning.
6. Forberedelse og optimalisering for avbildning
- Flytt kammeret til bilderiggen. Start saltvannsperfusjonen gjennom opptakskammeret og plasser temperatursonden i nærheten av preparatet. Still inn temperaturregulatoren for ønsket temperatur for arten som skal avbildes (for Tritonia, 11 °C, for Aplysia, 15-16 °C, eller for Berghia, 26–27 °C).
- Plasser en klorid sølvtråd ned sugeelektroden, sørg for at den kommer i kontakt med saltvannet i elektroden, og sett den andre Ag-AgCl-ledningen (returbanen) inn i badesallinen, nær sugeelektroden.
- Senk vann nedsenkningslinsen ned i saltvannet. Lukk grunnmembranen, og hev eller senk deretter substagekondensatoren og juster fokuset til kantene på membranen er i skarpt fokus, noe som skaper Köhler-belysning.
- Fokuser på området for forberedelsen som skal avbildes. Bias med fokus på mindre nevroner over større, da optiske signaler som stammer fra større nevroner, er mer sannsynlig enn mindre å bli registrert selv om de er litt ute av fokus.
- Ta et bilde av ganglion som skal avbildes med det parfokale digitale kameraet.
- Når forsterkningsbryteren for kontrollpanelet er satt til 1x, inspiserer du hvilelysintensiteten (RLI) i bildebehandlingsprogramvaren ved å klikke på "RLI"-knappen og sjekke gjennomsnittlig RLI for diodene. Juster spenningsnivået som sendes fra en stimulator til LED-lampens strømforsyning, og fortsett å kontrollere det gjennomsnittlige RLI-nivået til det er i ønsket område (vanligvis rundt 3-4 V).
MERK: Høye RLIer, som tilsvarer ca. 3-4 V på PDA, er ønskelige. Jo høyere lys, jo bedre signal-til-støy-forholdet til de optiske signalene, men dette må balanseres mot en raskere fotobleaching ved høyere RLIer. Denne risikoen minimeres ved å bruke objektive objektiver med høy NA. De objektive linsene for vann nedsenking er 10x/0,6 NA, 20x/0,95 NA, 40x/0,8 NA og 40x/1,15 NA.
- Sett forsterkningsbryteren på kontrollpanelet til 100x for innspillingen.
- Hvis du stimulerer en nerve, still inn ønsket spenning, frekvens og varighet på en separat stimulator fra den som brukes til å stille inn lysnivået. Kontroller at TTL-utløseren mellom kontrollpanelet og stimulatoren er riktig konfigurert.
MERK: Prøve nerve stimulus parametere i hver art er som følger: Tritonia PdN3, 2 s, 10 Hz puls tog på 5 ms, 10 V pulser; Aplysia PdN9, 2,5 s, 20 Hz pulstog på 5 ms, 8 V pulser; en Berghia pedal nerve, 2 s, 10 Hz puls tog på 5 ms, 5 V pulser. - Dobbeltsjekk at fjæren eller luftbordet flyter.
7. Optisk opptak
- Slå av eller demp romlysene, inkludert fluorescerende belysning.
- Angi ønsket filvarighet, bane og filnavn, og klikk deretter tadatai bildebehandlingsprogramvaren for å hente filer opp til kapasiteten til datamaskinens tilgjengelige RAM. Forbli stille under den optiske innspillingen, da små vibrasjoner kan introdusere store artefakter i de optiske opptaksdataene.
MERK: For oppkjøp som vil overstige datamaskinens tilgjengelige RAM, er et skreddersydd C ++ oppkjøpsprogram tilgjengelig gjennom Dr. Jian-unge Wu fra Georgetown University. - Hvis du vil vise data umiddelbart etter oppkjøpet, bruker du Superimpose -funksjonen i bildebehandlingsprogramvaren til å legge dataene som samles inn av alle de 464 diodene, over bildet av ganglionen som ble tatt tidligere avforberedelsen 7. Klikk på en av diodene som er representert i programvaren for å utvide det de spilte inn på en egen sporingsskjerm.
- Oppnå nøyaktig justering av diodene med hensyn til preparatet ved å gå inn i x-, y- og forstørrelsesfaktorene som tidligere bestemt av pinhole-testen.
- For å maksimere handlingspotensialets synlighet og forbedre nevronutbyttet for etterfølgende spike-sortering14, pålegg et bandpass Butterworth-filter med 5 Hz og 100 Hz cutoffs (tilgjengelig i bildebehandlingsprogramvare) for å fjerne både lav- og høyfrekvent støy.
- Hvis du vil lagre filtrerte optiske data som en tekstfil for videre analyse i en vitenskapelig dataplattform, merker du først av for" TP-filter" like underskjermbildetSide " i bildebehandlingsprogramvaren. Velg deretterLagre side som ASCIIfra kategorienUtdata, og skriv inn ønsket filnavn i dialogboksen som vises.
Representative Results
Tritoni
Hudkontakt med sin seastar rovdyr utløser Tritonia diomedea rømningssvømming, bestående av en rytmisk serie av helkroppsfleksjoner som driver den bort i sikkerhet (Figur 3A). I isolerte hjernepreparater fremkaller en kort stimulans til pedalnerven 3 (PdN3) det rytmiske svømmemotorprogrammet (SMP) for denne oppførselen, som er lett gjenkjennelig i optiske opptak fra pedal ganglia. Figur 3B viser utformingen av et VSD-bildebehandlingseksperiment designet for å registrere avfyringsaktiviteten til nevroner på den dorsale overflaten til venstre Tritonia pedal ganglion, som PDA ble plassert over, som en stimulans til den kontralaterale (høyre) PdN3 fremkaller SMP. Rå og filtrerte data (bandpass Butterworth-filter, 5 og 100 Hz cutoffs) fra 20 dioder som registrerer aktivitet før, under og etter stimulering av PdN3, vises i henholdsvis figur 3C,D. Nerve stimulansen ble levert 20 s inn i 2 min fil. Umiddelbart etter oppkjøpet kan signalene målt ved alle de 464 diodene i innspillingsmatrisen vises topografisk over et bilde av preparatet i bildebehandlingsprogramvaren (Figur 3E). På dette tidspunktet inneholder mange spor pigger registrert overflødig fra de samme nevronene, og noen spor inneholder pigger fra mer enn en nevron. Spike-sortering av de filtrerte diodesporene med ICA ga 53 unike nevronspor, hvorav 30 er vist i figur 3F. Kinetikken til individuelle pigger kan verdsettes i figur 3G, som utvider et utdrag av fire spor fra figur 3F (rød boks); Nøyaktigheten til ICA-spike-sorteringsalgoritmen ble tidligere verifisert ved hjelp av samtidige skarpe elektrodeopptak, som viste at alle pigger i de sorterte sporene tilsvarer intracellulært registrerte pigger fra individuelle nevroner11,14.
Aplysia
En sterkt aversiv hale stimulus til Aplysia californica fremkaller en stereotyp todelt rytmisk fluktrespons15. Den første fasen av responsen er en galopp av flere sykluser av hode lunger og hale trekker som beveger dyret raskt fremover. Dette etterfølges vanligvis av en periode med kryping, som involverer gjentatte bølger av hode-til-hale muskelsammentrekninger som driver dyret fremover med lavere hastighet i flere minutter (Figur 4A). For å fange disse fluktmotorprogrammene i optiske opptak, var PDA fokusert på den dorsale overflaten av høyre pedal ganglion i en isolert hjerneforberedelse, og en sugeelektrode ble plassert på den kontralaterale (venstre) pedalnerven 9 (PdN9; Figur 4B). Ett minutt inn i en kontinuerlig 20 min optisk opptak (Figur 4C), PdN9 ble stimulert til å fremkalle galopp-crawl motor programsekvensen. De probabilistiske gaussiske romlige fordelingene av signalene fra alle de 81 registrerte nevronene ble kartlagt på ganglion (Figur 4D). Dimensjonalitetsreduksjonen som ble brukt på hele opptaket, viste at galopp- (cyan) og krypefasen (mørkeblå) i rømningsprogrammet okkuperte forskjellige områder og dannet forskjellige baner, henholdsvis spiral- og løkkelignende, i hovedkomponentrommet (Figur 4E).
Tre videoer basert på Aplysia-opptaket avbildet i figur 4 viser flere typer analyser som kan utføres på slike datasett. Video 1 animerer avfyringen av alle innspilte nevroner over hele varigheten av innspillingen. Den første poststimulatoriske perioden for escape motor-programmet var preget av en galopp, hvor aktiviteten i ganglion var preget av vekslende sprengning av forskjellige funksjonelle klynger (Video 2). Galoppen gikk deretter over til et kryp, hvor aktiviteten på tvers av nevronklynger forble bredt fasisk, men antok en rotasjonsbane mot klokken i ganglion (Video 3). De to sistnevnte videoene inneholder også konsensusklynger, som avslører avfyring og plassering av de forskjellige funksjonelle ensemblene for galopp- og krypefasene i rømningsresponsen separat. Legg merke til at mange nevroner tildelt den samme klyngen i både galopp- og krypefasene viste fysisk nærhet til hverandre i ganglion, i samsvar med tidligere funn12.
Berghia
Den aeolid nudibranch Berghia stephanieae (Figur 5A) representerer et nytt modellsystem for nevrovitenskap. Bildeoppsettet for et typisk Berghia-eksperiment vises i figur 5B. For å fremkalle bredskala nevronaktivitet ble en sugeelektrode plassert på den mest fremtredende venstre pedalnerven, og en nerve stimulans ble levert 30 s inn i en 2 min opptak. ICA-bearbeidede spor avslørte både spontan og stimulus-fremkalt aktivitet hos 55 nevroner (Figur 5C). Fellesskapsdeteksjon via konsensusklynge identifiserte ti distinkte funksjonelle ensembler, som er avbildet i figur 5D i en nettverksgraf og i figur 5E, som omorganiserer sporene som vises i figur 5C basert på deres klyngeoppgaver. Gaussiske fordelinger av signalene fra alle registrerte nevroner legges over et bilde av preparatet i figur 5F for å indikere posisjonene til alle de 55 registrerte nevronene.
Figur 1: Visninger av den optiske bilderiggen og fotodiodematrisen (PDA). (A) Den optiske bilderiggen, med PDA, digitalt kamera, mikroskop og scene. (B) Den interne utformingen av PDA, der fiberoptikk forbinder bildeåpningen til 464 fotodioder. En rad med forsterkere ligger over fotodiodene. (C) Det sekskantede ansiktet på bildeåpningen, som området som avbildes på, er fokusert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et flytskjema som illustrerer den essensielle arbeidsflyten for å skaffe optiske opptak. De viktigste trinnene i VSD-bildebehandlingsprotokollen, fra disseksjon og farging gjennom detaljene i avbildning, er avbildet i dette flytskjemaet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resultater fra Tritonia diomedea, som illustrerer rå, filtrerteog spike-sorterte data. (A) Tritonia rømmer fra den rovviltnemnden Pycnopodia helianthoides gjennom svømmeturen, som består av vekslende dorsale og ventrale bøyninger i kroppen. (B) Skjematisk for bildeoppsettet. Ce = cerebral lobe av cerebropleural ganglion; Pl = pleural lobe av cerebropleural ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) Rådata fra 20 fotodioder, som viser aktivitet i venstre pedal ganglion til stimulering av den kontralaterale PdN3 (stimulus indikert av pilen). (D) Filtrerte data fra de samme diodene som i C (5 og 100 Hz bandpass Butterworth filter). (E) Bildebehandling programvareutgang der komprimerte spor samlet inn av alle 464 dioder er lagt topografisk over et bilde av preparatet. Posisjonene til de 20 diodene hvis spor er vist i C og D, er uthevet i rødt. (F) Tretti utvalgte single-neuron spor generert av spike-sortering via ICA. (G) En utvidet visning av fire spor med én neuron, som tilsvarer den røde boksen i F, viser handlingspotensialene med høyere temporal oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Resultater fra Aplysia californica, som illustrerer registrering med lang varighet, signalkartlegging og reduksjon av dimensjonalitet. (A) De to fasene av Aplysias sekvensielle escape motor program, galopp og kryp. (B) Skjematisk for bildeoppsettet. Ce = cerebral ganglion; Pl = pleural ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) En 20 min opptak av 81 nevroner i høyre pedal ganglion reagerer på en stimulus til den kontralaterale PdN9 (indikert av pilen). Grønne, cyan og mørkeblå stenger under sporene indikerer henholdsvis pre-stimulusperioden, galoppen og krypefasene til escape motor-programmet. (D) Et bilde av preparatet med kartlagte probabilistiske gaussiske distribusjoner av plasseringene til alle de 81 nevronsignalkildene identifisert av ICA. Den grønne omrisset representerer posisjonen til PDA-ens sekskantede ansikt med hensyn til ganglion. Tallene på hver gaussisk tilsvarer sporingsnumrene i C. (E) Dimensjonalitetsreduksjon ved hjelp av hovedkomponentanalyse som plotter de tre første hovedkomponentene mot hverandre i løpet av 20 min-filen. Den prestimulatoriske grunnlinjen, galoppen og kravlesøke epokene vises i henholdsvis grønn, cyan og mørk blå. Se videoer 1-3 for animasjoner av nevronal avfyring som tilsvarer dette opptaket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Resultater fra Berghia stephanieae, en ny art for nevrovitenskap, illustrerende nettverksgrafering, funksjonell klyngerog bilateral signalkartlegging. (A) En Berghia prøve. (B) Skjematisk for bildeoppsettet. Ce = cerebral lobe av cerebropleural ganglion; Pl = pleural lobe av cerebropleural ganglion; Pd = pedal ganglion; Rh = rhinophore ganglion. (C) Spor som viser spontan og stimulus-fremkalt aktivitet av 55 bilaterale nevroner i cerebropleural ganglia (levering av stimulansen er indikert av pilen). (D) Et nettverksdiagram som viser de ti funksjonelle ensemblene, som hver er tilordnet en unik farge, identifisert gjennom konsensusklynger. Noder i dette plottet representerer nevroner, hvor avstand i nettverksrommet representerer graden av avfyringskorrelasjon i og mellom ensembler. (E) Sporene i C omorganiseres og fargekodes (etter fargevalget D) til funksjonelle ensembler. (F) Et bilde av preparatet som viser de kartlagte plasseringene til signalene fra hver registrerte nevron, og spornumrene i C og E som de tilsvarer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Animasjon av hele, 20-minutters Aplysia escape locomotor program. Tettheten av de hvite formene som overliggende 81 individuelle nevroner i høyre pedal ganglion (venstre panel) ble drevet av de tilsvarende nevronsporene (høyre panel) og varierte lineært som en funksjon av gjennomsnittlig pigghastighet (binned per hver 0,61 s sanntid i opptaket). For hver nevron ble full opasitet normalisert til maksimal avfyringshastighet i løpet av registreringens varighet. Et sekund av forløpt tid i videoen representerer 12.2 s av sanntid. Skalalinjen tilsvarer sanntid, med de grønne, cyan og mørkeblå linjene under sporene som indikerer henholdsvis pre-stimulus baseline, galopp og crawl faser av escape locomotor-programmet. De gule boksene rundt galoppfasen og en del av gjennomsøkingsfasen angir innspillingsutdragene som brukes til å generere animasjonene i Videoer 2 og 3. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Animasjon av galoppfasen av Aplysia escape locomotor-programmet. Konsensusklynge ble utført på alle 81 registrerte nevroner i bare galoppfasen av motorprogrammet for å utlede de funksjonelle ensemblene, ved hjelp av tilnærmingen og programvaren som er beskrevet og gjort tilgjengelig i ref.12. Nevronale ensembler som i stor grad viste toniske eller uregelmessige avfyringsmønstre i denne fasen av rømningsprogrammet, ble utelatt fra denne videoen. Handlingspotensialene til nevronene som tilhører de svarte og olivengrønne ensemblene, kan høres i lydsporet til videoen, med de tilsvarende nevronene og sporene uthevet. Gjennomsnittlige økningshastigheter ble normalisert som i video 1 og med tilsvarende tidsbinding; 1 s forløpt tid i videoen tilsvarer 6,1 s sanntid. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3: Animasjon av krypefasen av Aplysia escape locomotor-programmet. Konsensusklynge ble utført på alle 81 registrerte nevroner i bare krypefasen av motorprogrammet for å utlede de funksjonelle ensemblene. Ensembler som i stor grad viste tonic eller uregelmessige avfyringsmønstre i denne fasen av motorprogrammet ble utelatt fra denne videoen. Gjennomsnittlige økningshastigheter ble normalisert som i videoer 1 og 2 og med tilsvarende tidsskuffning; 1 s forløpt tid i videoen tilsvarer omtrent 12,2 s sanntid. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
En av de viktigste detaljene i implementeringen av vår store VSD-bildemetode er å minimere vibrasjoner, noe som gir bevegelser av kontrastkanter over diodene, noe som resulterer i store artefaktuelle signaler. Fordi absorbans VSDs produserer svært små prosentvise endringer i lysintensitet med virkningspotensialer, kan vibrasjonsartefakter, hvis de ikke forhindres, skjule de nevronale signalene av interesse. Vi bruker flere metoder for å minimere vibrasjonsartefakter. For det første ligger bilderommet vårt i første etasje, som isolerer preparatet fra vibrasjoner knyttet til bygging av luftbehandlingsutstyr og mange andre kilder. For det andre ble det brukt et fjærbasert isolasjonsbord, som andre PDA-brukere har bekreftet gir bedre vibrasjonsdemping enn det vanligste luftbordet16. For det tredje ble det brukt vanninnlevelsesmål, noe som eliminerer bildesvingninger som oppstår fra overflate krusninger. For det fjerde ble preparatet som ble avbildet lett presset mellom kammerdekslene og et coverlipfragment presset ned ovenfra som holdes på plass av silikonplugger eller petroleumjell, noe som ytterligere stabiliserer preparatet. Dette flater også ut den konvekse overflaten av ganglion eller ganglia som blir avbildet, noe som resulterer i flere nevroner i fokusplanet til målet, noe som øker antall nevroner som er registrert.
For å maksimere signal-til-støy-forholdet for de svært små endringene i graden av VSD-lysabsorbering som følge av et handlingspotensial, er det viktig å oppnå nesten mettende lys gjennom forberedelsen til PDA, samtidig som fotobleaching av fargestoffet minimeres. For dette formål jobber vi vanligvis med 3-4 V hvilelysintensitet, målt med PDA-kontrollpanelets forsterkningsbryter i 1x-posisjon (PDAs 464 forsterkere metter ved 10 V lys). Under datainnsamlingen endres denne gevinstfaktoren til 100x. Å få tilstrekkelig lys til å nå 3-4 V målt ved PDA kan oppnås på flere måter. Bruk først en ultrabright LED-lyskilde som leverer en bølgelengde som passer til absorpsjonsegenskapene til absorbansfargen som er i bruk. Følgelig ble det brukt en 735 nm LED-kollatert lampe, som overlapper med de optimale absorpsjonsbølgelengdene til RH155 og RH482. For det andre, om nødvendig, bruk en flip-top substage kondensator som konsentrerer lyset fra LED-lyskilden til et mindre område. For det tredje justerer du kondensatorhøyden for å oppnå Köhler-belysning, noe som sikrer høy, jevn lysstyrke og maksimal bildekvalitet. For det fjerde, sørg for at det ikke er varmefiltre i den optiske banen, noe som kan dempe LED-lampens bølgelengde på 735 nm. For det femte, fjern diffusorer, hvis mer lys er nødvendig, fra den optiske banen. For det sjette, bruk høye NA-mål, som gir høy romlig oppløsning, og la tilstrekkelige lysnivåer nå PDA ved lavere lampeintensiteter. Dette har gjort det mulig for oss å minimere fotobleaching i den grad vi kan få flere oppkjøpsfiler på 10-20 min varighet per forberedelse ved hjelp av samme lysintensitet på tvers av alle filer og uten betydelig tap av signalamplitude eller behovet for gjenfarging. Avgjørende, hvis eksperimentet ønsker å spore nevroner over disse lengre filene, må du sørge for at fokusplanet ikke endres, og at preparatet ikke beveger seg. Til slutt er en ekstra måte å rute tilstrekkelig lys til PDA å bruke yngre dyr, som har tynnere, og dermed mindre ugjennomsiktig ganglia.
Fra tid til annen finner vi at signal-til-støy-forholdet mellom de optiske signalene forverres og/ eller motorprogramrytmene er suboptimale (f.eks. sakte eller unormale). Når dette begynner å skje konsekvent, blander vi ferske løsninger av VSD. Aliquots av VSD forblir vanligvis levedyktig i ca 6 måneder i en -20 °C fryser. Relatert er det verdt å merke seg at for Berghiaer de beste resultatene så langt oppnådd med absorbansen VSD RH482. Siden RH482 er mer lipofil enn RH155, kan det bedre flekke Berghiasrelativt mindre nevroner eller forbli i nevronmembranene mer effektivt ved høyere registrerings saltvannstemperatur som brukes til denne tropiske arten.
En begrensning ved PDA-basert avbildning av nevral aktivitet er knyttet til vekselstrømskoblingen av spenningssignalene i maskinvare før 100x preamplifiseringstrinnet: Selv om dette representerer en nødvendig funksjon for å fjerne den store DC-forskyvningen produsert av det høye hvilelysnivået som kreves av denne teknikken, utelukker AC-koblingen iboende til PDA måling av langsomme endringer i membranpotensialet, for eksempel de som er forbundet med synaptiske innganger. Hvis det ønskes å registrere potensielle endringer i langsom eller steady-state, kan et DC-koblet CMOS-kameraavbildningssystem brukes til å fange opp subthreshold-aktivitet. Byrne og kollegene brukte nylig et slikt oppsett med RH155 for å avbilde aktiviteten til nevroner i den bukkale ganglion av Aplysia17,18. Vi har brukt begge systemene og funnet ut at CMOS-kameraet, på grunn av sin mye høyere tetthet av detektorer (128 x 128), genererer 50 ganger større datafiler for samme bildetid7. PDAs mindre filer muliggjør raskere behandling og analyse. Dette muliggjør også utvidede opptak med én prøve (figur 4) og studier av læring, der data fra flere forsøk settes sammen til én stor fil før toppsortering, slik at nettverksorganisasjonen kan spores etter hvert som læring utviklerseg 19.
I andre kamerabaserte undersøkelser har fluorescerende VSDer blitt brukt av Kristan og kolleger til å undersøke nettverksfunksjonen i segmentet ganglia i leech. I en innflytelsesrik studie førte dette til identifisering av en nevron involvert i dyrets beslutning om å svømme eller å krype20. I en annen studie undersøkte Kristan et al. i hvilken grad leechs svømming og krypende oppførsel er drevet av multifunksjonelle vs. dedikerte kretser21. Mer nylig brukte Wagenaar og kolleger et tosidig mikroskop for spenningsavbildning som gjør at de kan registrere fra nesten alle nevroner i en leech segmental ganglion22. I motsetning til mange kamerabaserte bildemetoder er en fordel med vår PDA-baserte bildemetode rask og objektiv spike-sortering av ICA, en form for blind kildeseparasjon som ikke innebærer noen beslutninger om nevronale grenser for resultatbehandling.
Med hensyn til valg av VSDs, en fordel med absorbans fargestoffer RH155 og RH482 er den lille til ingen fototoksisitet forbundet med dem23,24, noe som muliggjør lengre opptakstider enn det som er typisk for fluorescerende VSDer. Videre er de raske absorbans VSDene vi bruker godt egnet til å registrere de overskytende somatiske virkningspotensialene i gastropodpreparater, som vanligvis er 80 mV i amplitude. Som vist i figur 3G, kan vår optiske metode registrere handlingspotensiale undershoots (ingen av opptakene våre er sporgjennomsnittet): Dette antyder at VSD-ene vi bruker skal kunne skjelne handlingspotensialer i andre modellsystemer som til en viss grad demper og dermed ikke overskyter når de når soma. Likevel er vår optiske tilnærming kanskje ikke ideell for arter som er kjent for å vise svært svekkede virkningspotensialer når de registreres i soma.
Mye aktuell forskning på nevrale nettverk er fokusert på et lite antall designertransgene arter. Imidlertid drar nevrovitenskap nytte av studiet av et bredt utvalg av fylogentisk distinkte arter. Å studere mange forskjellige arter gir innsikt i hvordan kretser utvikler seg25,26, og belyser prinsipper for nettverksfunksjon som kan være vanlige på tvers av phyla1,2,3,4,27. Vi har så langt brukt vår bildemetode på en rekke gastropodarter, inkludert Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (upubliserte data), og senest Berghia stephanieae (Figur 5). En appell til denne tilnærmingen er at den lett kan brukes på mange arter, uten behov for transgene dyr. Vi ønsker å erkjenne at vår bruk av VSD-avbildning med raske absorbansfargestoffer og en PDA følger i fotsporene til banebrytende arbeid som oppnådde dette i semi-intakte, oppføre seg Navanax29 og Aplysia30 preparater. Vår vektlegging av hurtigheten i vår tilnærming er delvis et svar på bekymringer om at mange etterforskere kan bli stadig mer motvillige til å initiere nettverksstudier i nye arter på grunn av frykt for at mange års studier vil være nødvendige for å karakterisere grunnleggende nettverksorganisasjon før de kan utforske vitenskapelige spørsmål av stor interesse for nevrovitenskap31. Derfor er målet vårt her å demonstrere en teknikk som i stor grad fremskynder prosessen – til det punktet at betydelig innsikt samme dag i nettverksorganisasjonen kan fås fra enkeltforberedelser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF 1257923 og NIH 1U01NS10837. Forfatterne ønsker å anerkjenne Jean Wangs hjelp i laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
| Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
| Digital camera | Optronics | S97808 | |
| Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
| Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
| Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
| Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
| Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
| Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
| Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
| Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
| NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
| Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
| PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
| Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
| Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
| Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
| RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
| RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
| Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
| Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |
References
- Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
- Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
- Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
- Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
- Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
- Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
- Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
- Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
- Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
- Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
- Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
- Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
- Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
- Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
- Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
- Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
- Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
- Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
- Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
- Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
- Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
- Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
- London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
- Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
- Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).
