Summary
Этот протокол предоставляет методы визуализации бактериальных клеток и полисахаридного локуса синтеза полисахаридов (Psl) полисахарида в мокроте пациентов с муковисцидозом.
Abstract
Раннее выявление и эрадикация синегнойной палочки в легких пациентов с муковисцидозом может снизить вероятность развития хронической инфекции. Развитие хронических инфекций, вызванных P. aeruginosa, связано со снижением функции легких и повышением заболеваемости. В связи с этим существует большой интерес к выяснению причин невозможности эрадикации P. aeruginosa с помощью антибиотикотерапии, которая встречается примерно у 10-40% пациентов детского возраста. Одним из многих факторов, которые могут повлиять на клиренс P. aeruginosa и чувствительность к антибиотикам, являются вариации в пространственной организации (например, агрегация или образование биопленки) и продукция полисахаридов. Поэтому нам было интересно визуализировать in situ характеристики P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом. Метод очистки тканей был применен к образцам мокроты после встраивания образцов в гидрогелевую матрицу для сохранения 3D-структур относительно клеток-хозяев. После очистки тканей были добавлены флуоресцентные метки и красители, чтобы обеспечить визуализацию. Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили для визуализации бактериальных клеток, связывание флуоресцентно меченных анти-Psl-антител для визуализации экзополисахарида и окрашивание DAPI для окрашивания клеток-хозяев для получения структурного понимания. Эти методы позволили получить высокоразрешающую визуализацию P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Introduction
В данном исследовании были разработаны эксперименты по визуализации in vivo структуры Pseudomonas aeruginosa в мокроте детей с муковисцидозом (МВ). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, становятся хроническими у 30-40% детей с муковисцидозом; После того, как хронические инфекции укореняются, их практически невозможно устранить1. Изоляты P. aeruginosa, полученные от пациентов с ранней инфекцией, как правило, более восприимчивы к противомикробным препаратам, поэтому их лечат антисинегнойными антибиотиками для предотвращения развития хронической инфекции2. К сожалению, не все изоляты P. aeruginosa эффективно выводятся из легких после антибиотикотерапии. Точные механизмы, связанные с недостаточностью антибиотиков, до конца не выяснены. Предыдущие исследования показали, что вариации плотности клеток биопленки, агрегации и продукции полисахаридов могут влиять на эффективность антибиотиков3. P. aeruginosa продуцирует три внеклеточных полисахарида: Pel, Psl и альгинат4. Большинство штаммов P. aeruginosa обладают генетической способностью экспрессировать каждый из экзополисахаридов, хотя часто экспрессируетсяпреимущественно один тип полисахаридов 5. Экзополисахарид альгинат ассоциирован с хроническими инфекциями в легких при муковисцидозе, что приводит к мукоидному фенотипу 6,7. Полисахариды Pel и Psl выполняют множество функций, включая помощь в первоначальном прикреплении и поддержании структуры биопленки, а также обеспечение устойчивости к антибиотикам8.
Методы, направленные на визуализацию in vivo структур тканей, разработаны для различных типов образцов 9,10,11. Совсем недавно они были адаптированы для визуализации микробных сообществ in vivo в мокроте пациентов с муковисцидозом12. Оптимизация протокола очищения тканей специально для идентификации микробных сообществ в мокроте была разработана DePas et al., 201612. Термин MiPACT, который расшифровывается как microbial iидентификация после Passive CLARITY technique, был придуман для очищения мокроты CF11,12. При использовании методов очистки тканей образцы сначала фиксируются, а затем становятся прозрачными, оставляя при этом присущую им архитектуру нетронутой для окрашивания и микроскопической визуализации11. Фиксация и очистка образцов мокроты CF позволяют исследователям ответить на вопросы, связанные со структурой биопленки, плотностью бактериальных клеток, полимикробными ассоциациями и ассоциациями между патогенами и клетками-хозяевами. Преимущество непосредственного исследования бактерий, сохранившихся в мокроте, заключается в том, что они могут быть проанализированы и визуализированы в контексте, специфичном для хозяина. Несмотря на то, что выращивание in vitro клинических изолятов в лаборатории для экспериментов может быть очень информативным, такие методы не могут полностью воссоздать среду легких при муковисцидозе, что приводит к разрыву между лабораторными результатами и исходами пациентов.
Методы, представленные здесь, могут быть использованы для фиксации и очищения мокроты для визуализации бактерий, будь то у пациентов с муковисцидозом или у пациентов с другими респираторными инфекциями. Специфическим типом окрашивания и микроскопического анализа, описанным в настоящем документе, является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с последующим связыванием анти-Psl-антител в гидрогеле и последующим анализом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). После очищения тканей могут быть применены другие методы иммуногистохимии и микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для сбора и хранения образцов мокроты, взятых у людей, требуется одобрение Совета по этике исследований (REB). Исследования, представленные здесь, были одобрены Больницей для больных детей REB#1000058579.
1. Сбор мокроты
- Отхаркивающую мокроту хранить в стерильном стаканчике для сбора и немедленно хранить при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч до фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком длительное оставление мокроты при температуре 4 °C без фиксации может привести к клеточной деградации, особенно к деградации белых кровяных телец. Предпочтительна фиксация как можно скорее. - Переложите образцы мокроты в стерильную пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте равный объем 4% параформальдегида (PFA) к образцам мокроты. Например, если образец мокроты составляет 0,5 мл, добавьте 0,5 мл 4% PFA. Перемешайте путем мягкой инверсии.
- Инкубируйте мокроту в течение ночи при температуре 4 °C.
- Промойте образец, добавив 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) на каждые 2 мл фиксированной мокроты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа промывки не требуется центрифугирование. - Осторожно удалите надосадочную жидкость пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте всасывания мокроты пипеткой, направляя кончик в сторону от мокроты и очень медленно отсасывая поверхностную жидкость. Этап промывки не включает центрифугирование, чтобы не нарушить структурную целостность мокротных пробок. - Повторите шаги 1.6-1.7 еще два раза.
- Ресуспендируйте гранулу в 2-кратном объеме PBS с 0,01 % (по массе) азида натрия.
- Мокроту хранить при температуре 4 °C.
2. MiPACT (техника очищения тканей) обработка мокроты
- Дегазируйте гидрогелевые компоненты (30% акриламид 29:1: бис-акриламид, отвердитель и PBS) в герметичном контейнере, содержащем анаэробную упаковку, в течение 72 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анаэробная упаковка и герметичный контейнер необходимы, потому что кислород ингибирует полимеризацию акриламида. В качестве альтернативы кислород можно удалить, выполнив этот этап в анаэробном колпаке, применив вакуум к герметичному контейнеру или продувая газ N2 через смесь акриламида.- Добавьте 2 мл 30% раствора акриламид:бис-акриламид 29:1 в пробирку объемом 15 мл со снятой крышкой внутри герметичного анаэробного контейнера.
- Приготовьте концентрированный бульон из 10% отвердителя, добавив 0,5 г отвердителя к 5 мл PBS в пробирке объемом 15 мл. Снимите крышку с тюбика и храните в герметичном анаэробном контейнере.
- Оставьте несколько мл стерильного PBS в пробирке со снятой крышкой внутри анаэробного контейнера.
- Делают 5 мл раствора гидрогеля с конечной концентрацией 0,2% отвердителя и 4% акриламид:бис-акриламид 29:1 в ПБС в пробирке 15 мл. Перемешать инверсией и процедить, стерилизовать.
- Извлеките образцы мокроты из холодильника, затем нарежьте их небольшими кусочками (примерно 5 мм в диаметре) в стерильных условиях с помощью скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мокрота довольно жидкая, то этот шаг все еще можно выполнить, однако требуется больше терпения и практики, чтобы удалить мокроту из раствора для хранения пинцетом перед использованием скальпеля для разделения желаемых фракций. - Срезанные образцы мокроты помещают в лунку 8-камерного предметного стекла.
- Добавьте 300 мкл стерилизованного фильтрующим раствором гидрогеля с этапа 2.2 в каждую лунку, содержащую мокроту.
- Поместите 8-камерное покровное стекло в герметичный контейнер с анаэробным пакетом на 3 ч при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После полимеризации гидрогель с вкрапленной мокротой должен иметь консистенцию твердого геля. - Переложите образцы затвердевшей гидрогелевой мокроты в культуральную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл 8% додецилсульфата натрия (SDS), pH 8, и дайте образцам очиститься в течение 3-14 дней при 37 °C (с встряхиванием или без него), пока мокрота не станет прозрачной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время очищения зависит от состава мокроты и, как правило, может быть уменьшено при встряхивании. Однако следите за тем, чтобы скорость встряхивания не нарушила целостность образца. Более богатые ДНК образцы требуют больше времени для очистки по сравнению с образцами, богатыми слизью. - Сцедите 8%-ный раствор SDS в контейнер для сбора отходов. С помощью стерильного пинцета перенесите каждый образец, погруженный в гидрогель, в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл PBS в каждую из конических пробирок объемом 50 мл, чтобы промыть гидрогели, и дайте раствору постоять от 30 минут до 1 ч перед декантацией. Повторите это еще 2 раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап промывки не включает центрифугирование. Лишнюю жидкость и надосадочную жидкость осторожно удаляют пипеткой. - Хранят промытые образцы в PBS с 0,01% (по массе) азида натрия и 1x ингибитором РНКазы при 4 °C.
3. Протокол гидрогелевой флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)
- Извлеките образцы гидрогеля из раствора для хранения с помощью стерильного пинцета и поместите образцы на стерильную поверхность (например, предметное стекло или чашку Петри).
- С помощью стерильного скальпеля нарежьте гидрогели ломтиками толщиной ~ 1 мм.
- Поместите кусочки гидрогеля диаметром 1 мм в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
- Готовят 1 мл гибридизационного буфера (25% формамида, 0,9 М NaCl, 20 мМ Tris-HCl [рН 7,6], 0,01% SDS, очищенного и деионизированного H2O) в пробирке объемом 1,5 мл.
- Добавьте флуоресцентно меченый зонд PseaerA (150,7 нМ12) в буфер гибридизации и перемешайте путем инверсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор формалина следует хранить вдали от открытого огня. Буфер для гибридизации может быть приготовлен заранее и храниться в аликвотах при -20 °C13. - Добавьте 200-500 мкл гибридизационного буфера на каждый участок гидрогеля ~1 мм и убедитесь, что весь образец гидрогеля погружен в воду.
- Дайте зонду PseaerA гибридизироваться с образцами гидрогеля, поместив их в темноту на ~ 18-24 ч при 46 °C, не встряхивая.
- Сцедите буфер гибридизации в контейнер для сбора отходов.
- Промойте образцы один раз стерилизованным промывочным буфером (337,5 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) [pH 7,2], 0,01% SDS и очищенный и деионизированный H2O), добавив 1 мл промывочного буфера в каждую из пробирок объемом 1,5 мл, а затем удалите его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для промывки можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре (RT). - Добавьте в пробирки 1 мл свежего буфера для промывки, затем инкубируйте образцы в темноте в течение 6 ч при 48 °C, не встряхивая.
4. Связывание гидрогеля и антител Psl0096
- Стерильно удалите буфер для промывки с помощью пипеттора объемом 1 мл.
- Промойте образцы 2%-ным раствором BSA (w/v) в растворе PBS, добавив и удалив 1 мл 2%-ного раствора BSA.
- Добавьте 500 мкл 2% раствора BSA/PBS к образцам гидрогеля, чтобы заблокировать неспецифическое связывание с белками. Затем инкубируют образцы в течение ночи, в темноте, при РТ, не встряхивая.
- Стерильно удалить блокирующий раствор с помощью пипетки объемом 1 мл.
- Приготовьте раствор антител Psl0096-Texas Red, разбавив антитело до конечной концентрации 0,112 мкг/мл в 500 мкл свежего 2% BSA/PBS.
- Добавляют раствор антител 500 мкл к образцам гидрогеля и инкубируют их при РТ в течение 6 ч, защищенные от света, без встряхивания.
5. Окрашивание DAPI (4′,6′-диамидино-2-фенилиндол)
- Приготовьте раствор для согласования показателя преломления (RIMS), добавив 40 г неионогенной среды градиента плотности, 30 мкл Tween20, 3 мкг азида натрия и 30 мл PBS в колбу, содержащую магнитную мешалку. Перемешивайте раствор в течение 15 мин на магнитной мешалке или до полного растворения.
- Фильтр стерилизуют раствор в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью шприца объемом 10 мл и стерильного фильтра 0,2 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев. - Удалить раствор антител Psl0096-Texas Red стерильной пипеткой объемом 1 мл.
- Промойте образцы гидрогеля, добавив, а затем удалив 1 мл PBS.
- Инкубируют образцы гидрогеля с 250 мкл раствора RIMS и 10 мкг/мл DAPI при RT при легком встряхивании, в темноте, в течение ночи.
- Перед проведением конфокальной визуализации образцы помещают в перфузионные камеры диаметром 0,9 мм или 1,7 мм и запечатывают стеклянным покровным стеклом.
ПРИМЕЧАНИЕ: После FISH и/или иммуногистохимии и перед погружением в RIMS можно применять флуоресцентные лектиновые красители, если требуется визуализация слизистой мокроты12.
6. Визуализация
- Выполняйте конфокальную лазерную сканирующую микроскопию с использованием стандартных методов с 25-кратным, 40-кратным, 63-кратным или 100-кратным увеличением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий план эксперимента представлен на рисунке 1 и рисунке 2. На рисунке 1 представлена краткая информация о протоколах обработки мокроты и ее очищения. Обработка и выведение мокроты может занять до 17 дней. Тем не менее, протокол может быть остановлен, и образцы могут быть сохранены после фиксации PFA (2-й день) или после очищения тканей (5-17-й день в зависимости от времени очистки). На рисунке 2 обобщены протоколы связывания FISH и антител. Протоколы FISH и окрашивания антителами занимают 4 дня, но должны быть завершены, а конфокальные снимки сделаны после начала. Используя вышеуказанные протоколы, можно получить 3D-изображения клеток P. aeruginosa с высоким разрешением с визуализацией их структуры in situ в мокроте.
Очищение мокроты и последующее нанесение флуоресцентных красителей, используемых в этом протоколе, позволяет детально визуализировать P. aeruginosa в образцах. Образцы мокроты, показанные на рисунках 3 и 4 , были взяты у детского пациента с муковисцидозом (17 лет) с впервые возникшей инфекцией P. aeruginosa. На рисунке 3А в образце мокроты была видна совокупность клеток; Появление желтовато-зеленых стержней было обусловлено перекрытием всех трех флуорофоров. Несмотря на то, что у нас нет данных о количестве клеток для этого образца мокроты, мы обнаружили, что предел обнаружения зондом составляет10,4 клетки/мл (см. дополнительный рисунок 1). На рисунке 3B зеленым цветом были выделены отдельные палочки, полученные в результате видоспецифического связывания зонда PseaerA-488 с клетками P. aeruginosa. Антитело Psl0096-Texas Red, показанное красным цветом, показывает, где псевдомональный экзополисахарид был расположен в мокроте; в этом случае антитело Psl0096, по-видимому, в основном перекрывалось с клетками P. aeruginosa (рис. 3C). Этот метод также позволил визуализировать псевдомональные клетки в мокроте по отношению к другим бактериальным клеткам и структурам хозяина. На рисунке 4 было видно скопление клеток P. aeruginosa , фагоцитозированное внутри эукариотической клетки, а также другие небольшие скопления кокковых клеток поблизости. Было продемонстрировано, что антитело Psl0096 также может связываться с Psl, продуцируемой планктонной формой P. aeruginosa (см. дополнительный рисунок 2).
Рисунок 1: Блок-схема, иллюстрирующая обработку мокроты и протоколы MiPACT.
Таким образом, мокрота фиксируется перед тем, как быть помещенной в раствор полиакриламида. После очистки гидрогель можно хранить при температуре 4 °C или использовать с протоколом связывания FISH и антител. Этот образ был создан с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Блок-схема, обозначающая протоколы флуоресцентной гибридизации in situ и окрашивания антителами.
После того, как мокрота полностью очистится в гидрогелевом матриксе, можно применять методы окрашивания. Этот образ был создан с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентное изображение образца мокроты, взятого у пациента с ранней инфекцией P. aeruginosa, встроенной в гидрогелевую матрицу.
Образец гидрогеля был гибридизирован с зондом PsearA-Alexa488 (зеленый), антителом Psl0096-Texas Red (красный) и DAPI (синий). (A) образец мокроты, просматриваемый по всем 3 каналам, (B) мокрота только под зеленым каналом, указывающим место, где связывается зонд PseaerA-488, и (C) мокрота только под красным каналом, где произошло красное связывание Psl0096-Texas. Снимки были сделаны при 100-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунофлуоресцентное изображение образца мокроты, взятого у пациента с ранней инфекцией P. aeruginosa, встроенной в гидрогелевый матрикс.
Образец гидрогеля был гибридизирован с зондом PsearA-Alexa488 (зеленый), антителом Psl0096-Texas Red (красный) и DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Флуоресцентная гибридизация in situ планктонной культуры PAO1 с зондом PseaerA-488. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.
Дополнительный рисунок 2: P. aeruginosa , окрашенный DAPI и антителом Psl0096-Texas Red. (A) штамм PAO1-Δpsl и (B) штамм PAO1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого протокола – дать представление об организации клеток P. aeruginosa in situ в мокроте пациентов с муковисцидозом. Образцы мокроты следует хранить при температуре 4 °C до обработки, если они не могут быть немедленно зафиксированы. Было продемонстрировано, что количество клеток P. aeruginosa в мокроте существенно не изменяется при обработке в течение 1 ч, 24 ч или 48 ч при хранении при 4 °C, хотя если оставить при 25 °C в течение 24 или 48 ч, количество бактериальных клеток значительно увеличится в результате роста бактерий14. Для этого исследования образцы мокроты хранили при температуре 4 °C максимум до 24 ч после отхаркивания. Следует отметить, что количество воспалительных клеток уменьшается в мокроте, если ее оставить при температуре 4 °C и обработать более чем через 9 ч15. Поэтому при принятии решения о времени отсечки для обработки образца важно учитывать конкретные клетки и маркеры, которые необходимо визуализировать в мокроте.
Обработка образцов в этом методе начинается с фиксации образцов мокроты в 4 % PFA. Параформальдегид сшивает бактериальные клетки и их внеклеточный матрикс, сохраняя их структуры для микроскопической визуализации и анализа11,16. К сожалению, если цель состоит в том, чтобы получить общее количество клеток определенных воспалительных клеток в мокроте, было показано, что PFA снижает количество этих клеток, поэтомуследует рассмотреть другие фиксаторы. Еще одним ограничением этого исследования является то, что оно может занять много времени и может занять более двух недель. Таким образом, он может не подходить для развития в диагностический метод, требующий принятия срочных решений о лечении. Кроме того, для понимания общего микробного разнообразия в образцах мокроты этот метод не подходит, но может сочетаться с другими высокопроизводительными методами обнаружения микробов, такими как кПЦР.
Состав акриламидного гидрогеля может быть изменен в зависимости от типа ткани и области применения11. Для нестабильных образцов, таких как мокрота CF, необходимо обеспечить структурную поддержку смесью акриламида:бис-акриламида в соотношении 29:1 (вместо просто акриламида). Включение параформальдегида в гидрогель может еще больше стабилизировать структуру, при этом более длительное время инкубации позволяет диффузить зонды и антитела9. Добавление формальдегида в гидрогель также может предотвратить отек тканей в процессе очистки, если этот эффект нежелателен11.
Современный метод целенаправленно воздействует на клетки P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом. Альтернативные методы и модификации этого протокола могут быть рассмотрены для оптимизации визуализации других бактерий. С помощью видоспецифичных и родоспецифичных зондов FISH и гибридизационной цепной реакции (HCR) можно идентифицировать другие возбудители муковисцидоза, такие как Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. и Achromobacter xylosoxidans 12. В нашем исследовании мы нацелились на псевдомональный экзополисахарид Psl. Другие мишени, включая альгинат или Pel, могут быть исследованы с помощью флуоресцентных антител, специфичных для этих экзополисахаридов, в будущих экспериментах. Применение метода MiPACT вместе с FISH и окрашиванием антителами для CLSM занимает пару недель. Если исследовательский вопрос не касается трехмерной пространственной визуализации мокроты, существуют более быстрые методы визуализации присутствующих бактерий. Предыдущие методы, используемые для визуализации бактерий в образцах мокроты, используют тонкие срезы или мазки и включают: FISH18, окрашивание по Граму и методы иммуногистохимии, которые применяют первичные антитела и контркрасители, чтобы обеспечить визуализацию экзополисахаридов биопленки и бактериальных клеток19,20.
Существует несколько потенциальных будущих применений этих методов визуализации. Способность визуализировать различные бактериальные организмы и их взаимодействие с клетками хозяина, такими как фагоциты, может способствовать нашему пониманию того, почему некоторые штаммы P. aeruginosa эффективно очищаются из дыхательных путей при муковисцидозе, а другие штаммы — нет. Визуализация бактерий в образцах из дыхательных путей также может быть использована в качестве меры антимикробной эффективности и в качестве результата исследования новых антибиопленочных препаратов21. Кроме того, визуализация пространственных отношений между P. aeruginosa и другими организмами в пределах микробиома легких при муковисцидозе, такими как Staphylococcus aureus, может помочь прояснить роль коинфекции/колонизации в патогенезе легочных обострений и их ответе на лечение антибиотиками. Визуализация бактерий in vivo может быть применена и к другим инфекциям, в том числе к инфекциям с ИВЛ-ассоциированными пневмониями или хроническими раневыми инфекциями22. Таким образом, полученные знания могут быть использованы для руководства будущими терапевтическими разработками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Фонду муковисцидоза, который предоставил финансирование для этого исследования, и компании MedImmune за их щедрое пожертвование антител против Psl0096. Для этого исследования визуализация была выполнена в центре визуализации CAMiLoD в Университете Торонто.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
